BR112019020461A2

BR112019020461A2 - variantes de aldeído desidrogenase e métodos de uso

Info

Publication number: BR112019020461A2
Application number: BR112019020461A
Authority: BR
Inventors: Shah Amit; Cara Tracewell Ann; Warner Joseph; Hoff Kevin; Chan Kui; Noble Michael
Original assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2020-06-09
Also published as: CN110730820A; CA3058219A1; WO2018183664A1; US11299716B2; KR20240033193A; JP2020515255A; KR102645531B1; AU2018244459A1; JP2022159411A; EP3601546A1; US20200040312A1; KR20190134706A; US20220325254A1

Abstract

a invenção fornece polipeptídeos e ácidos nucleicos codificadores de variantes de aldeído desidrogenase. a invenção também fornece células que expressam variantes de aldeído desidrogenase. a invenção fornece ainda métodos para a produção de 3-hidroxibutiraldeído (3-hbal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-bdo), ou um éster ou amida deste, compreendendo células de cultura que expressam uma variante de aldeído desidrogenase ou usando lisados dessas células. a invenção ainda fornece métodos para a produção de 4-hidroxibutiraldeído (4-hbal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4-bdo), ou um éster ou amida deste, compreendendo células de cultura que expressam uma variante de aldeído desidrogenase ou usando lisados dessas células.

Description

VARIANTES DE ALDEÍDO DESIDROGENASE E MÉTODOS DE USO

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0001] Este pedido de patente reivindica o beneficio da prioridade dos Estados Unidos pedido de patente provisório número de série 62/480,194, depositado em 31 de março de 2017, o conteúdo completo que é incorporado na presente invenção a titulo de referência.

[0002] Referência é feita aos seguintes pedidos de patente provisório e internacionais, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade: (1) Pedido de patente provisório U.S. No. 62/480,208 com o titulo 3HYDROXYBUTYRYL-COA DEHYDROGENASE VARIANTS AND METHODS OF USE, depositado em 31 de março de 2017; (2) Pedido de patente provisório U.S. No. 62/480,270 com o titulo PROCESS AND SYSTEMS FOR OBTAINING 1,3-BUTANEDIOL FROM FERMENTATION BROTHS, depositado em 31 de março de 2017; (3) Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2018/025086 com o titulo ”3HYDROXYBUTYRYL-COA DEHYDROGENASE VARIANTS AND METHODS OF USE, depositado na mesma data que o presente; e (4) Pedido Internacional de Patente PCT/US2018/025068 intitulado, PROCESS AND SYSTEMS FOR OBTAINING 1,3-BUTANEDIOL FROM FERMENTATION BROTHS, depositado na mesma data que o presente.

[0003] Este pedido incorpora aqui por referência uma listagem de sequência como arquivo de texto ASCII intitulado 12956-408-228_Sequence_Listing.txt criado

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2/204 em 27 de março de 2018, e com tamanho de 498,061 bytes é incorporado aqui por referência.

[0004] A presente invenção se refere de modo geral aos organismos manipulados para produzir produtos desejados, enzimas manipuladas que facilitam a produção de um produto desejado e, mais especificamente, a enzimas e células que produzem produtos desejados, como 3hidroxibutiraldeido, 1,3-butanodiol, 4-hidroxibutiraldeido, 1,4-butanodiol e produtos relacionados e produtos derivados destes.

[0005] Vários produtos quimicos de commodities são usados para fazer produtos desejados para uso comercial. Muitos dos produtos quimicos de commodities são derivados do petróleo. Tais produtos quimicos de commodities têm vários usos, incluindo o uso de solventes, resinas, precursores de polímeros e produtos quimicos especiais. Os produtos quimicos desejados de commodities incluem moléculas de 4carbono, como 1,4-butanodiol e 1,3-butanodiol, precursores a montante e produtos a jusante. É desejável desenvolver métodos para a produção de produtos quimicos de commodities, a fim de fornecer fontes renováveis para produtos à base de petróleo e fornecer menos processos intensivos em termos da relação custo e beneficio.

[0006] Assim, existe a necessidade de métodos que facilitem a produção dos produtos desejados. A presente invenção satisfaz esta necessidade e fornece também vantagens relacionadas.

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] A invenção fornece polipeptídeos e ácidos nucleicos codificadores de variantes de aldeído desidrogenase. A invenção também fornece células que expressam variantes de aldeído desidrogenase. A invenção fornece ainda métodos para a produção de 3hidroxibutiraldeido (3-HBal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-BDO), ou um éster ou amida deste, compreendendo células de cultura que expressam uma variante de aldeído desidrogenase ou usando lisados dessas células. A invenção adicional fornece métodos para a produção de 4-hidroxibutiraldeído (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4-BDO), ou um éster ou amida deste, compreendendo células de cultura que expressam uma variante de aldeído desidrogenase ou usando lisados dessas células.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0008] A Figura 1 mostra uma via exemplificativa de 1,3-butanodiol (1,3-BDO) que compreende uma enzima aldeído desidrogenase. A Figura 1 mostra vias de acetoacetil-CoA para 1,3-butanodiol. As enzimas são: (A) acetoacetil-CoA redutase (dependente de CoA, formadora de aldeído); (B) 3-oxobutiraldeído redutase (redutora de cetona); (C) 3-hidroxibutiraldeído redutase, também aqui referida como 1,3-butanodiol desidrogenase; (D) acetoacetilCoA redutase (dependente de CoA, formadora de álcool); (E) 3-oxobutiraldeído redutase (redutora de aldeído); (F) 4hidroxi, 2-butanona redutase; (G) acetoacetil-CoA redutase (redutora de cetona); (H) 3-hidroxibutiril-CoA redutase

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4/204 (formadora de aldeido), também aqui referida como 3hidroxibutiraldeido desidrogenase; e (I) 3-hidroxibutirilCoA redutase (formadora de álcool).

[0009] A Figura 2 mostra uma via exemplificativa de 1, 4-butanodiol (1,4-BDO) que compreende uma aldeido desidrogenase. As enzimas que catalisam as reações biossintéticas são: (1) succinil-CoA sintetase; (2) semialdeido desidrogenase succinica independente de CoA; (3) α-cetoglutarato desidrogenase; (4) glutamato: succinato de semialdeido transaminase; (5) glutamato descarboxilase; (6) semialdeido desidrogenase succinica dependente de CoA; (7) 4-hidroxibutanoato desidrogenase (também referida como 4hidroxibutirato desidrogenase); (8) a-cetoglutarato descarboxilase; (9) 4-hidroxibutiril CoA: acetil-CoA transferase; (10) butirato-quinase (também referido como 4hidroxibutirato-quinase); (11) fosfotransbutirilase (também referida como fosfo-trans-4-hidroxibutirilase); (12) aldeido desidrogenase (também conhecida como 4-hidroxibutiril-CoA redutase); (13) álcool desidrogenase (também referida como 4-hidroxibutanal redutase ou 4-hidroxibutiraldeido redutase).

[0010] A Figura 3 mostra um alinhamento de sequência de ALD-1, ALD-2 e ALD-3. As sequências correspondem à SEQ ID NOS: 1, 2 e 3, respectivamente. Sublinhadas na figura são 2 regiões de alça, a primeira designada A, a segunda B, ambas envolvidas na especificidade do substrato e na especificidade do enantiômero, conforme aqui determinado. A alça A em ALD-1 é a sequência LQKNNETQEYSINKKWVGKD (SEQ ID NO: 124), em ALD-2 é a

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5/204 sequência IGPKGAPDRKFVGKD (SEQ ID NO: 125) e em ALD-3 é a sequência ITPKGLNRNCVGKD (SEQ ID NO: 126). A alça B no ALD-1 é a sequência SFAGVGYEAEGFTTFTIA (SEQ ID NO: 127), no ALD-2 é sequência TYCGTGVATNGAHSGASALTIA (SEQ ID NO: 128) e em ALD-3 é a sequência SYAAIGFGGEGFCTFTIA (SEQ ID NO: 12 9) . A sequência e o comprimento da alça de especificidade do substrato A e B de ALD2 diferem dos de ALD-1 e ALD-3; no entanto, o alinhamento mostra conservação suficiente para facilitar a identificação das posições correspondentes para substituição, como descrito aqui, e especialmente se combinado com a modelagem 3D, como mostrado na Figura 6. O ALD-3 foi usado como modelo para a modelagem da estrutura cristalina; veja a Figura 6 que mostra as duas regiões de alça interagindo para afetar a especificidade do substrato e a especificidade do enantiômero, especialmente quando modificadas com substituições exemplificativas, como descrito aqui. ALD-1 e ALD-3 são 51,9% idênticos. ALD-1 e ALD-2 são 35,9% idênticos. ALD-3 e ALD-2 são 40% idênticos. Um consenso para a alça A baseado no alinhamento de ALD-1, ALD-2 e ALD-3 é IXPKG — ---XXNRKXVGKD (SEQ ID NO: 5) . Um consenso para a alça B baseado no alinhamento de ALD-1, ALD-2 e ALD-3 é SYAGXGXXXE ---GFXTFTIA (SEQ ID NO: 6) . Entende-se que os aminoácidos especificamente identificados nas sequências de consenso são resíduos conservados, enquanto as posições marcadas com X são variáveis e podem corresponder a qualquer aminoácido, conforme desejado e divulgado aqui. Entende-se ainda que ---- pode corresponder à presença ou ausência de um número variável de resíduos de aminoácidos. Um exemplo desse número variável de resíduos de aminoácidos é mostrado nas Figuras 3 e 4A-4C. Além

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6/204 disso, entende-se que os resíduos conservados na sequência de consenso podem ser substituídos, por exemplo, por aminoácidos conservativos, como aqui descrito (ver, por exemplo, Figuras 4A4C) .

[0011] As Figuras 4A-4C mostram alinhamentos de aldeído desidrogenases exemplificativos (ALD), cujos alinhamentos representativos demonstram posições de identificação em ALDs que correspondem a posições na sequência ALD do modelo representativo, onde podem ser feitas substituições da invenção. Como na Figura 3, são sublinhadas 2 regiões de alça, a primeira designada A, a segunda B, ambas envolvidas na especificidade do substrato e na especificidade do enantiômero, conforme aqui determinado. A Figura 4A mostra um alinhamento de sequências ALD exemplif icat ivas com um ponto de corte de 40 a 55% em comparação com ALD-1. As sequências correspondem à SEQ ID NOS: 1 (ALD-1), 13, 20 e 24, como indicado na Figura 4A. A Figura 4B mostra um alinhamento de sequências ALD exemplif icat ivas com um ponto de corte de 75 a 90% em comparação com ALD-1. As sequências correspondem à SEQ ID NOS: 1 (ALD-1), 30, 33 e 37, como indicado na Figura 4B. As alças A e B estão sublinhadas. A Figura 4C mostra um alinhamento de sequências ALD exemplificativas com um ponto de corte de 90% em comparação com ALD-1. As sequências correspondem à SEQ ID NOS: 1 (ALD-1), 38, 40 e 44, como indicado na Figura 4C. ALD-1 é 99%, 97% e 95% idênticas à SEQ ID NOS: 38, 40 e 44, respectivamente. As Figuras 4A-4C demonstram que as posições correspondentes para

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7/204 substituições aqui ensinadas podem ser identificadas em ALDs que têm pelo menos 40% da identidade com ALD-1, especialmente as regiões de alça A e B, e especialmente a região de alça B bem conservada.

[0012] As Figuras 5A e 5B mostram atividades enzimáticas de várias aldeido desidrogenases exemplificativas. A Figura 5A mostra a atividade especifica das variantes ALD-2, ALD-1 e ALD-1 em 3 hidróxi-(R)butiraldeido (barra esquerda no conjunto de barras) e 3 hidróxi-(S)-butiraldeido (barra direita no conjunto de barras). A Figura 5B mostra a razão de atividade com a forma R para S do 3-hidroxibutiraldeido.

[0013] As Figuras 6A-6C mostram diagramas de fita da estrutura da aldeido desidrogenase 959. Os diagramas mostram acoplamento de 3-hidroxi-(R)-butiraldeido (Figura 6A) ou 3-hidroxi-(S)-butiraldeido (Figura 6B) na estrutura de 959. A Figura 6C mostra a mesma orientação que 3-hidroxi(R)-butiraldeido (R3HB).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0014] A invenção se refere a variantes enzimáticas que possuem propriedades desejáveis e são úteis para a produção de produtos desejados. Em uma modalidade particular, a invenção se refere a variantes de aldeido desidrogenase, que são variantes de enzimas que possuem características estruturais e/ou funcionais marcadamente diferentes em comparação com uma enzima de tipo selvagem que ocorre na natureza. Assim, a aldeido desidrogenases da

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8/204 invenção ou enzimas que não ocorrem naturalmente. Tais variantes de aldeído desidrogenase da invenção são úteis em uma célula manipulada, tal como um organismo microbiano, que foi manipulada para produzir um produto desejado. Por exemplo, como divulgado neste documento, uma célula, como um organismo microbiano, com uma via metabólica, pode produzir um produto desejado. Uma aldeído desidrogenase da invenção com características desejáveis pode ser introduzida em uma célula, tal como um organismo microbiano, que possui uma via metabólica que utiliza uma atividade enzimática da aldeído desidrogenase para produzir um produto desejado. Tais variantes de aldeído desidrogenase são adicionalmente úteis como biocatalisadores para transportar nossas reações desejadas ín vitro. Assim, as variantes de aldeído desidrogenase da invenção podem ser utilizadas em células manipuladas, como organismos microbianos, para produzir um produto desejado ou como um biocatalisador ín vitro para produzir um produto desejado.

[0015] Como usado aqui, o termo ocorrência não natural quando usado em referência a uma célula, um organismo microbiano ou micro-organismo da invenção tem a intenção de significar que a célula tem pelo menos uma alteração genética normalmente não encontrada em uma cepa de ocorrência natural das espécies referenciadas, incluindo cepas de tipo selvagem das espécies referenciadas. As alterações genéticas incluem, por exemplo, modificações que introduzem ácidos nucleicos expressáveis que codificam polipeptídeos metabólicos, outras adições de ácidos nucleicos, deleções de ácidos nucleicos e/ou

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9/204 outras perturbações funcionais do material genético da célula. Tais modificações incluem, por exemplo, regiões codificadoras e seus fragmentos funcionais, para polipeptídeos heterólogos, homólogos ou heterólogos e homólogos para as espécies referenciadas. Modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões reguladoras não codificantes nas quais as modificações alteram a expressão de um gene ou operon. Polipeptídeos metabólicos exemplificativos incluem enzimas ou proteínas dentro de uma via biossintética para produzir um produto desejado.

[0016] Uma modificação metabólica se refere a uma reação bioquímica que é alterada de seu estado natural. Portanto, células que não ocorrem naturalmente podem ter modificações genéticas nos ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos metabólicos ou fragmentos funcionais destes. Modificações metabólicas exemplificativas são divulgadas aqui.

[0017] Como usado aqui, o termo isolado quando usado em referência a uma célula ou organismo microbiano tem a intenção de significar que uma célula está substancialmente livre de pelo menos um componente, pois a célula referenciada é encontrada na natureza, se tal célula é encontrado na natureza. O termo inclui uma célula que é removida de alguns ou de todos os componentes, como é encontrado em seu ambiente natural. O termo também inclui uma célula que é removida de alguns ou de todos os componentes, pois a célula é encontrada em ambientes que não ocorrem naturalmente. Portanto, uma célula isolada é parcial ou completamente separada de outras substâncias, como é encontrada na natureza ou quando é

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10/204 cultivada, armazenada ou subsistida em ambientes que não são naturais. Exemplos específicos de células isoladas incluem células parcialmente puras, células substancialmente puras e células cultivadas em um meio de ocorrência não natural.

[0018] Como usado aqui, os termos microbiano, organismo microbiano ou micro-organismo pretendem significar qualquer organismo que exista como uma célula microscópica incluida nos dominios de arquéias, bactérias ou eucariotos. Portanto, o termo pretende abranger células ou organismos procarióticos ou eucarióticos com um tamanho microscópico e inclui bactérias, arquéias e eubactérias de todas as espécies, bem como micro-organismos eucarióticos, como leveduras e fungos. O termo também inclui culturas de células de qualquer espécie que possam ser cultivadas para a produção de um bioquímico.

[0019] Conforme usado na presente invenção, o termo CoA ou coenzima A tem a intenção de significar que um cofator orgânico ou grupo prostético (porção não proteica de uma enzima) cuja presença é requerida para a atividade de muitas enzimas (as apoenzimas) para formar um sistema de enzima ativa. A coenzima A funciona em certas enzimas condensadoras atua nas transferências de grupo acila ou acetila e na sintese e oxidação de ácido graxo, oxidação de piruvato e em outras acetilações.

[0020] Conforme usado na presente invenção, o termo substancialmente anaeróbico quando usado com referência a uma cultura ou condição de proliferação tem a intenção de significar que a quantidade de oxigênio é menor

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11/204 que cerca de 10% de saturação de oxigênio dissolvido em meio líquido. O termo também tem a intenção de incluir câmaras vedadas de meio líquido ou sólido mantido com uma atmosfera de menos que cerca de 1% de oxigênio.

[0021] Exógeno, como aqui utilizado, significa que a molécula referenciada ou a atividade referenciada é introduzida na célula hospedeira. A molécula pode ser introduzida, por exemplo, pela introdução de um ácido nucleico codificador no material genético do hospedeiro, como por integração em um cromossomo hospedeiro ou como material genético não cromossômico, como um plasmídeo. Por conseguinte, o termo tal como é utilizado em referência à expressão de um ácido nucleico codificador se refere à introdução do ácido nucleico codificador em uma forma expressável na célula. Quando usado em referência a uma atividade biossintética, o termo se refere a uma atividade que é introduzida no organismo de referência do hospedeiro. A fonte pode ser, por exemplo, um ácido nucleico codificador homólogo ou heterólogo que expressa a atividade referenciada após a introdução na célula hospedeira. Portanto, o termo endógeno se refere a uma molécula ou atividade referenciada que está presente no hospedeiro. Deste modo, o termo quando utilizado em referência à expressão de um ácido nucleico codificante se refere à expressão de um ácido nucleico codificante contido na célula. O termo heterólogo se refere a uma molécula ou atividade derivada de uma fonte diferente das espécies referenciadas, enquanto homólogo se refere a uma molécula ou atividade derivada da célula hospedeira. Por conseguinte, a expressão

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12/204 exógena de um ácido nucleico codificador da invenção pode utilizar um ou ambos, um ácido nucleico codificador heterólogo ou homólogo.

[0022] Entende-se que quando mais de um ácido nucleico exógeno é incluido em uma célula que mais de um ácido nucleico exógeno se refere ao ácido nucleico codificador referenciado ou atividade biossintética, como discutido acima. É ainda entendido, como divulgado neste documento, que mais de um ácido nucleico exógeno pode ser introduzido na célula hospedeira em moléculas de ácido nucleico separadas, em moléculas de ácido nucleico policistrônico ou uma combinação destes, e ainda ser considerado como mais de um exógeno ácido nucleico. Por exemplo, como divulgado aqui, uma célula pode ser manipulada para expressar dois ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam uma enzima ou proteína desejada, como uma enzima ou proteína da via. No caso em que dois ácidos nucleicos exógenos que codificam uma atividade desejada são introduzidos em uma célula hospedeira, entende-se que os dois ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos como um único ácido nucleico, por exemplo, em um único plasmídeo, em plasmídeos separados. Estar integrado no cromossomo hospedeiro em um único local ou em vários locais e ainda ser considerado como dois ácidos nucleicos exógenos. De modo semelhante, entende-se que mais de dois ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos em um organismo hospedeiro em qualquer combinação desejada, por exemplo, em um único plasmídeo, em plasmídeos separados, que podem ser integrados ao cromossomo hospedeiro em um único local ou em vários locais, e ainda ser

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13/204 considerado como dois ou mais ácidos nucleicos exógenos, por exemplo, três ácidos nucleicos exógenos. Assim, o número de ácidos nucleicos exógenos referenciados ou atividades biossintéticas se refere ao número de ácidos nucleicos codificadores ou ao número de atividades biossintéticas, e não ao número de ácidos nucleicos separados introduzidos no organismo hospedeiro.

[0023] Como aqui utilizado, o termo interrupção genética, ou seus equivalentes gramaticais, tem a intenção de significar que uma alteração genética torna o produto genético codificado inativo ou atenuado. A alteração genética pode ser, por exemplo, exclusão de todo o gene, exclusão de uma sequência reguladora necessária para a transcrição ou tradução, exclusão de uma parte do gene que resulta em um produto gênico truncado ou por qualquer uma das várias estratégias de mutação que inativam ou atenuar o produto genético codificado. Um método particularmente útil de interrupção de genes é a exclusão completa de genes, porque reduz ou elimina a ocorrência de reversões genéticas nas células de ocorrência não natural da invenção. Uma interrupção de gene também inclui uma mutação nula, que se refere a uma mutação dentro de um gene ou região que contém um gene que resulta na não transcrição do gene para o RNA e/ou na tradução de um produto genético funcional. Tal mutação nula pode surgir de muitos tipos de mutações, incluindo, por exemplo, mutações pontuais de inativação, exclusão de uma porção de um gene, deleções de genes inteiros ou exclusão de segmentos cromossômicos.

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[0024] Como usado aqui, o termo acoplado ao crescimento quando usado em referência à produção de um produto bioquímico tem a intenção de significar que a biossíntese do produto bioquímico referenciado é produzida durante a fase de crescimento de um micro-organismo. Em uma modalidade particular, a produção acoplada ao crescimento pode ser obrigatória, o que significa que a biossíntese do bioquímico referenciado é um produto obrigatório produzido durante a fase de crescimento de um micro-organismo.

[0025] Como aqui utilizado, o termo atenuar, ou seus equivalentes gramaticais, pretende enfraquecer, reduzir ou diminuir a atividade ou quantidade de uma enzima ou proteína. A atenuação da atividade ou quantidade de uma enzima ou proteína pode imitar uma ruptura completa se a atenuação fizer com que a atividade ou quantidade caia abaixo de um nível crítico necessário para uma determinada função. No entanto, a atenuação da atividade ou quantidade de uma enzima ou proteína que imita a interrupção completa, por exemplo, interrupção completa de uma via, ainda pode ser suficiente para que uma via separada continue funcionando. Por exemplo, a atenuação de uma enzima ou proteína endógena pode ser suficiente para imitar a ruptura completa da mesma enzima ou proteína para a produção de um produto desejado da invenção, mas a atividade ou quantidade restante de enzima ou proteína ainda pode ser suficiente para manter outras vias, como uma via crítica para a célula hospedeira sobreviver, se reproduzir ou crescer. A atenuação de uma enzima ou proteína também pode estar enfraquecendo, reduzindo ou diminuindo a atividade ou

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15/204 quantidade da enzima ou proteína em uma quantidade que seja suficiente para aumentar o rendimento de um produto desejado da invenção, mas não imite necessariamente a interrupção completa da enzima ou proteína.

[0026] As células de ocorrência não natural da invenção podem conter alterações genéticas estáveis, as quais se referem a células que podem ser cultivadas por mais de cinco gerações sem perda da alteração. Geralmente, alterações genéticas estáveis incluem modificações que persistem por mais de 10 gerações, modificações particularmente estáveis persistirão por mais de 25 gerações e, mais particularmente, modificações genéticas estáveis serão maiores que 50 gerações, incluindo indefinidamente.

[0027] No caso de interrupções de genes, uma alteração genética estável particularmente útil é uma exclusão de genes. O uso de uma deleção genética para introduzir uma alteração genética estável é particularmente útil para reduzir a probabilidade de uma reversão para um fenótipo antes da alteração genética. Por exemplo, a produção estável de um bioquímico acoplado ao crescimento pode ser alcançada, por exemplo, pela exclusão de um gene que codifica uma enzima que catalisa uma ou mais reações dentro de um conjunto de modificações metabólicas. A estabilidade da produção de um bioquímico acoplado ao crescimento pode ser ainda mais aprimorada por meio de múltiplas deleções, reduzindo significativamente a probabilidade de múltiplas reversões compensatórias que ocorrem para cada atividade interrompida.

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[0028] Aqueles versados na técnica irão entender que as alterações genéticas, incluindo modificações metabólicas exemplificadas na presente invenção são descritas com referência a um organismo de fonte adequado tal como E. coli, levedura ou outros organismos revelados na presente invenção e suas reações metabólicas correspondentes ou um organismo de fonte adequado para material genético desejado tal como enzimas que codificam genes para suas reações metabólicas correspondentes. Entretanto, dada a sequência de genoma completa de uma variedade ampla de organismos e o alto nivel de habilidade na área de genômica, aqueles versados na técnica serão prontamente capazes de aplicar os ensinamentos e guia fornecidos na presente invenção para essencialmente todos os outros organismos. Por exemplo, as alterações metabólicas de E. coli exemplificadas na presente invenção podem ser aplicadas prontamente a outras espécies incorporando-se o mesmo ácido nucleico ou ácido nucleico análogo das espécies diferentes das espécies referenciadas. Tais alterações genéticas incluem, por exemplo, alterações genéticas de espécies homólogas, em general e, em particular, deslocamentos de gene ortólogos, parálogos ou não ortólogos.

[0029] Um ortólogo é um gene ou genes que são relacionados por descendência vertical e são responsáveis por substancialmente as mesmas funções ou funções idênticas em diferentes organismos. Por exemplo, epóxido hidrolase de ratos e epóxido hidrolase humana podem ser consideradas ortólogos para a função biológica de hidrólise de epóxidos. Os genes são relacionados pela descendência vertical quando,

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17/204 por exemplo, esses compartilham similaridade de sequências de quantidade suficiente para indicar que os mesmos são homólogos ou relacionados por evolução a partir de um ancestral em comum. Os genes podem também ser considerados ortólogos se esses compartilharem a estrutura tridimensional, mas não necessariamente a similaridade de sequência de uma quantidade suficiente para indicar que estes evoluiram de um ancestral em comum na medida em que a similaridade de sequência primária não é identificável. Os genes que são ortólogos podem codificar proteínas com similaridade de sequência de cerca de 25% a 100% da identidade da sequência de aminoácido. Os genes que codificam as proteínas que compartilham uma similaridade de aminoácido de menos que 25% podem também ser considerados a terem surgido por descendência vertical se sua estrutura tridimensional também mostrar similaridades. Os membros da família de serina protease de enzimas, incluindo elastase e ativador do plasminogênio tecidual, são considerados a terem surgido por descendência vertical a partir de um ancestral em comum.

[0030] Os ortólogos incluem genes ou seus produtos de gene codificado que através de, por exemplo, evolução, divergiram em estrutura ou atividade em geral. Por exemplo, quando uma espécie codifica um produto de gene que exibe duas funções e quando tais funções foram separadas em genes distintos em uma segunda espécie, os três genes e seus produtos correspondentes são considerados a serem ortólogos. Para a produção acoplada por proliferação de um produto bioquímico, aqueles versados na técnica entenderão que o

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18/204 gene ortólogo que abriga atividade metabólica a ser interrompida deve ser escolhido para a construção do microorganismo de ocorrência não natural. Um exemplo de ortólogos que exibem atividades separáveis é quando as atividades distintas foram separadas em produtos de gene distintos entre duas ou mais espécies ou dentro de uma única espécie. Um exemplo específico é a separação de proteólise da elastase e proteólise do plasminogênio, dois tipos de atividade de serina protease, em moléculas distintas como elastase e ativador de plasminogênio. Um segundo exemplo é a separação da atividade de Drosophila DNA polimerase III e microplasma 5'-3' exonuclease. A DNA polimerase da primeira espécie pode ser considerada um ortólogo para uma ou ambas a exonuclease ou a polimerase da segunda espécie e vice versa.

[0031] Em contraste, os parálogos são homólogos relacionados por, por exemplo, duplicação seguida por divergência evolucionaria e têm funções similares ou em comum, mas não idênticas. Os parálogos podem se originar ou derivar, por exemplo, da mesma espécie ou de uma espécie diferente. Por exemplo, a epóxido hidrolase microssomal (epóxido hidrolase I) e a epóxido hidrolase solúvel (epóxido hidrolase II) podem ser consideradas parálogos porque essas representam duas enzimas distintas, coevoluíram de um ancestral em comum, que catalisam reações distintas e têm funções distintas na mesma espécie. Os parálogos são proteínas da mesma espécie com similaridade de sequência significante uma com a outra sugerindo que essas são homólogas ou relacionadas através da coevolução de um ancestral em comum. Os grupos de famílias de proteínas

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19/204 parálogas incluem HipA homólogos, genes luciferase, peptidases e outros.

[0032] Um deslocamento genético não-ortólogo é um gene não-ortólogo de uma espécie que pode substituir uma função genética referenciada em uma espécie diferente. A substituição inclui, por exemplo, ser capaz de desempenhar substancialmente a mesma ou uma função similar nas espécies de origem em comparação com a função referenciada nas diferentes espécies. Embora, geralmente, um deslocamento genético não-ortólogo seja identificável como estruturalmente relacionado a um gene conhecido que codifica a função referenciada, genes menos estruturalmente relacionados, mas funcionalmente similares, e seus correspondentes produtos gênicos, no entanto, ainda se enquadram no significado do termo, como é usado aqui. A similaridade funcional requer, por exemplo, pelo menos alguma similaridade estrutural no local ativo ou na região de ligação de um produto gênico não-ortólogo em comparação com um gene que codifica a função que se procura substituir. Portanto, um gene não-ortólogo inclui, por exemplo, um parálogo ou um gene não relacionado.

[0033] Portanto, ao identificar e construir as células de ocorrência não natural da invenção com capacidade biossintética para um produto desejado, aqueles versados na técnica entenderão com a aplicação do ensinamento e guia fornecidos na presente invenção a uma espécie em particular que a identificação de modificações metabólicas pode incluir identificação e inclusão de ortólogos. Na medida em que

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20/204 paralelos e/ou deslocamentos não-heterólogos de genes estão presentes na célula referenciada que codifica uma enzima que catalisa uma reação metabólica semelhante ou substancialmente semelhante, os especialistas na técnica também podem utilizar esses genes relacionados à evolução. De modo semelhante, para uma interrupção de um gene, os genes relacionados à evolução também podem ser interrompidos ou excluídos em uma célula hospedeira para reduzir ou eliminar a redundância funcional de atividades enzimáticas direcionadas à interrupção.

[0034] Ortólogos, parálogos e deslocamentos de genes não-ortólogo podem ser determinados por métodos bem conhecidos àqueles versados na técnica. Por exemplo, a inspeção de sequências de ácido nucleico ou aminoácido para dois polipeptídeos irão revelar a identidade da sequência e similares entre as sequências comparadas. Com base em tais similaridades, um versado na técnica pode determinar se a similaridade é suficientemente alta para indicar que as proteínas estão relacionadas através da evolução a partir de um ancestral em comum. Os algoritmos bem conhecidos àqueles versados na técnica, tais como Align, BLAST, Clustal W e outros comparam e determinam uma similaridade de sequência ou identidade bruta e também determinam a presença ou significância de vãos na sequência que podem ser designados como peso ou pontuação. Tais algoritmos são também conhecidos na técnica e são similarmente aplicáveis para determinar a similaridade de sequência ou identidade de nucleotídeo. Os parâmetros para similaridade suficiente para determinar a relação são computados com base em métodos bem

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21/204 conhecidos para calcular a similaridade estatística ou a chance de encontrar uma correspondência similar em um polipeptídeo aleatório e a significância da correspondência determinada. Uma comparação de computador de duas ou mais sequências pode, se desejado, ser também otimizada visualmente por aqueles versados na técnica. As proteínas ou produtos de gene relacionados podem ser esperados a ter uma similaridade alta, por exemplo, 25% a 100% da identidade da sequência. As proteínas que não são relacionada podem ter uma identidade que é essencialmente a mesma que seria esperada a ocorrer por acaso, se uma base de dados de tamanho suficiente sofrer varredura (cerca de 5%). As sequências entre 5% e 24% podem ou podem não representar homologia suficiente para concluir que as sequências comparadas estão relacionadas. A análise estatística adicional para determinar a significância de tais correspondências dado o tamanho do conjunto de dados pode ser realizada para determinar a relevância dessas sequências.

[0035] Os parâmetros exemplificativos para determinar a relação de duas ou mais sequências com uso do algoritmo BLAST, por exemplo, pode ser conforme estabelecido abaixo. Brevemente, os alinhamentos de sequência de aminoácido podem ser realizados com uso do BLASTP versão 2.0.8 (05 de Janeiro de 1999) e dos seguintes parâmetros: Matriz: 0 BLOSUM62; abertura de vão: 11; extensão de vão: 1; x_desistências: 50; expectativa: 10,0; tamanho de palavra: 3; filtro: ligado. Os alinhamentos de sequência de ácido nucleico podem ser realizados com uso do BLASTN versão 2.0.6

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22/204 (16 de Setembro de 1998) e dos seguintes parâmetros: Correspondência: 1; incompatibilidade: -2; abertura de vão: 5; extensão de vão: 2; x_desistências: 50; expectativa: 10,0; tamanho de palavra: 11; filtro: desligado. Aqueles versados na técnica saberão quais modificações podem ser feitas aos parâmetros acima para ou aumentar ou diminuir o rigor da comparação, por exemplo, e determinar a relação de duas ou mais sequências.

[0036] Em uma modalidade, a invenção fornece uma aldeido desidrogenase que é uma variante de um tipo selvagem ou aldeído desidrogenase parental. A aldeído desidrogenase da invenção converte um acil-CoA no seu aldeído correspondente. Essa enzima também pode ser chamada de oxidoredutase que converte uma acil-CoA em seu aldeído correspondente. Tal aldeído desidrogenase da invenção pode ser classificada como uma reação 1.2.1.b, oxidoredutase (acil-CoA em aldeído), em que os três primeiros dígitos correspondem aos três primeiros dígitos do número da Comissão de Enzimas que indicam o tipo geral de transformação independente da especificidade do substrato. Conversões enzimáticas exemplificativas de uma aldeído desidrogenase da invenção incluem, mas não estão limitadas à conversão de 3-hidroxibutiril-CoA em 3hidroxibutiraldeido (também referido como 3-HBal) (consulte a Figura 1) e a conversão de 4-hidroxibutiril-CoA para 4hidroxibutiraldeido (ver Figura 2) . Uma aldeído desidrogenase da invenção pode ser usada para produzir produtos desejados, tais como 3-hidroxibutiraldeído (3-HBal), 1,3-butanodiol (1,3BDO), 4-hidroxibutiraldeído (4-HBal), 1,4-butanodiol (1,4-BDO)

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23/204 ou outros produtos desejados, como um produto a jusante, incluindo um éster ou amida deste, em uma célula, como um organismo microbiano, contendo uma via metabólica adequada ou ín vítro. Por exemplo, 1,3-BDO pode reagir com um ácido, ín vivo ou ín vitro, para converter em um éster usando, por exemplo, uma lipase. Esses ésteres podem ter usos nutracêuticos, médicos e alimentares, e são vantajosos quando a forma R do 1,3-butanodiol é usada, pois essa é a forma (em comparação com a forma S ou a mistura racêmica que é feita de petróleo ou etanol por uma rota de sintese quimica do acetaldeido) melhor utilizada por animais e humanos como fonte de energia (por exemplo, um éster de cetona, como o monoéster de (R)-3-hidroxibutil-R-l,3-butanodiol (que tem aprovação nos Estados Unidos, reconhecida como seguro (GRAS)) e (R)-3hidroxibutirato glicerol monoéster ou diéster). Os ésteres de cetona podem ser administrados por via oral, e o éster libera R-l,3-butanodiol que é usado pelo organismo (ver, por exemplo, W02013/150153). Assim, a presente invenção é particularmente útil para fornecer uma via enzimática e um micro-organismo aprimorados para fornecer uma composição aprimorada de 1,3butanodiol, ou seja, R-l,3-butanodiol, altamente enriquecido ou essencialmente enantiomericamente puro e com qualidades de pureza aprimoradas em relação aos subprodutos.

[0037] O 1,3-butanodiol, também conhecido como butileno glicol, tem outros usos relacionados a alimentos, incluindo o uso diretamente como fonte de alimento, ingrediente alimentar, agente aromatizante, solvente ou solubilizador de agentes aromatizantes, estabilizador,

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24/204 emulsificante e um agente antimicrobiano e conservante. O 1,3butanodiol é usado na indústria farmacêutica como solvente de medicamento parenteral. O 1,3-butanodiol encontra uso em cosméticos como um ingrediente emoliente, umectante, que impede a cristalização de ingredientes insolúveis, um solubilizador para ingredientes menos solúveis em água, como fragrâncias, e como agente antimicrobiano e conservante. Por exemplo, ele pode ser usado como umectante, especialmente em sprays de cabelo e loções para fixação; reduz a perda de aromas dos óleos essenciais, preserva contra a deterioração por micro-organismo e é usado como solvente para benzoatos. O 1,3-butanodiol pode ser usado em concentrações de 0,1% ou menos a 50% ou mais. É usado em produtos para cabelos e banho, maquiagem para os olhos e o rosto, fragrâncias, produtos de limpeza pessoal e preparações para barbear e para a pele (consulte, por exemplo, o relatório da diretoria de Revisão de Ingredientes Cosméticos: Final Report on the Safety Assessment of Butylene Glycol, Hexylene Glycol, Ethoxydiglycol, and Dipropylene Glycol, Journal of the American College of Toxicology, Volume 4, Número 5, 1985, que é aqui incorporado por referência). Este relatório fornece usos e concentrações específicos de 1,3-butanodiol (butileno glicol) em cosméticos; veja exemplos na tabela 2 do relatório intitulado Product Formulation Data.

[0038] Em uma modalidade, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada selecionada a partir de: (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos referida como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3

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25/204 ou na Tabela 4, em que a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3; (b) uma molécula de ácido nucleico que hibrida com o ácido nucleico de: (a) sob condições de hibridação altamente rigorosas e compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3; (c) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de consenso da alça A (SEQ ID NO: 5) e/ou alça B (SEQ ID NO: 6), em que a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3; e (d) uma molécula de ácido nucleico que é complementar a (a) ou (b). Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos codificada pela molécula de ácido nucleico, exceto uma ou mais substituições de aminoácidos, possui pelo menos 65%, 70%, 75%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98 % ou 99% da identidade da sequência, ou é idêntico, a uma sequência de aminoácidos referida na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4. A sequência de aminoácidos pode compreender pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, ou mais, das substituições de aminoácidos estabelecidas nas Tabelas 1, 2 e/ou 3, por exemplo, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, ou 43, isto é, até todas as posições de aminoácidos possuindo uma substituição.

[0039] A invenção também fornece um vetor contendo a molécula de ácido nucleico da invenção. Em uma

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26/204 modalidade, o vetor é um vetor de expressão. Em uma modalidade, o vetor compreende DNA de fita dupla.

[0040] A invenção também fornece um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo aldeído desidrogenase da invenção. Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma aldeído desidrogenase da invenção também pode incluir uma molécula de ácido nucleico que hibrida com um ácido nucleico divulgado aqui pela SEQ ID NO, número do GenBank e/ou GI ou uma molécula de ácido nucleico que hibrida com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos aqui divulgada por SEQ ID NO, GenBank e/ou número GI. As condições de hibridação podem incluir condições de hibridação altamente rigorosas, moderadamente rigorosas ou de baixo rigor que são bem conhecidas dos versados na técnica, como as aqui descritas. De modo semelhante, uma molécula de ácido nucleico que pode ser usada na invenção pode ser descrita como tendo uma certa identidade da sequência percentual em relação a um ácido nucleico divulgado aqui pela SEQ ID NO, número do GenBank e/ou GI ou uma molécula de ácido nucleico que hibrida com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos aqui divulgada pela SEQ ID NO, GenBank e/ou número GI. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode ter pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade da sequência, ou seja idêntico, a um ácido nucleico aqui descrito.

[0041] A hibridação rigorosa se refere às condições sob as quais os polinucleotídeos hibridados são

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27/204 estáveis. Como é do conhecimento dos especialistas na técnica, a estabilidade dos polinucleotídeos hibridados é refletida na temperatura de fusão (T_m) dos hibridos. Em geral, a estabilidade dos polinucleotídeos hibridados é uma função da concentração de sal, por exemplo, a concentração de íons de sódio e a temperatura. Uma reação de hibridação pode ser realizada sob condições de menor rigor, seguidas de lavagens de rigor variável, porém mais alto. A referência ao rigor da hibridação se refere a essas condições de lavagem. A hibridação altamente rigorosa inclui condições que permitem a hibridação apenas daquelas sequências de ácidos nucleicos que formam polinucleotídeos hibridizados estáveis em NaCl 0,018M a 65°C, por exemplo, se um híbrido não for estável em NaCl 0,018M a 65 °C, não será estável sob condições de alto rigor, conforme aqui contemplado. Condições de alto rigor podem ser fornecidas, por exemplo, por hibridação em formamida a 50%, solução de 5X Denhart, SSPE 5X, SDS 0,2% a 42°C, seguido de lavagem em SSPE O,1X e SDS 0,1% a 65°C. Condições de hibridação diferentes de condições de hibridação altamente rigorosas também podem ser usadas para descrever as sequências de ácidos nucleicos aqui divulgadas. Por exemplo, a frase hibridação moderadamente rigorosa se refere a condições equivalentes à hibridação em formamida a 50%, solução 5X Denhart, SSPE 5X, SDS 0,2% a 42°C, seguida de lavagem em SSPE 0,2X, SDS 0,2%, a 42°C. A frase hibridação de baixo rigor se refere a condições equivalentes à hibridação em formamida a 10%, solução de 5X Denhart, 6X SSPE, SDS a 0,2% a 22°C, seguida de lavagem em SSPE IX, SDS a 0,2%, a 37 °C. A solução de Denhart contém 1% de Ficoll, 1% de

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28/204 polivinilpirolidona e 1% de albumina de soro bovino (BSA). O SSPE 20X (cloreto de sódio, fosfato de sódio, ácido etileno diamina tetra acético (EDTA)) contém cloreto de sódio 3M, fosfato de sódio 0,2M e 0,025 M (EDTA) . Outros tampões e condições de hibridação de baixo, moderado e alto rigor adequados são bem conhecidos dos especialistas na técnica e são descritos, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999) .

[0042] Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma aldeido desidrogenase da invenção pode ter pelo menos uma certa identidade da sequência com uma sequência de nucleotídeos aqui divulgada. Por conseguinte, em alguns aspectos da invenção, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma aldeido

desidrogenase da invenção	tem uma sequência nucleotídica de pelo
menos 65% da identidade,	pelo menos 70% da identidade, pelo
menos 75% da identidade,	pelo menos 80% da identidade, em pelo
menos 85% da identidade,	pelo menos 90% da identidade, pelo
menos 91% da identidade,	pelo menos 92% da identidade, pelo
menos 93% da identidade,	pelo menos 94% da identidade, pelo
menos 95% da identidade,	pelo menos 96% da identidade, pelo
menos 97% da identidade,	pelo menos 98% da identidade ou pelo
menos 99% da identidade,	ou é idêntico, a um ácido nucleico

divulgado aqui pela SEQ ID NO, número do GenBank e/ou GI ou uma molécula de ácido nucleico que hibrida com uma molécula de ácido

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29/204 nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos aqui divulgada por SEQ ID NO, GenBank e/ou número GI.

[0043] A identidade da sequência (também conhecida como homologia ou similaridade) se refere à similaridade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico ou entre dois polipeptídeos. A identidade pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência, que pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, as moléculas são idênticas nessa posição. Um grau de identidade entre sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas sequências. O alinhamento de duas sequências para determinar sua identidade percentual de sequência pode ser feito usando programas de software conhecidos na técnica, como, por exemplo, os descritos em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999). De preferência, os parâmetros padrão são usados para o alinhamento. Um programa de alinhamento bem conhecido na técnica que pode ser usado é o BLAST definido como parâmetros padrão. Em particular, os programas são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; vertente = ambos; ponto de corte = 60; esperar = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = ALTA PONTUAÇÃO; Bancos de dados = traduções não redundantes de GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detalhes destes programas podem ser encontrados no National Center for Biotechnology Information (ver também Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)).

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30/204

[0044] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico isolada. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico que codifica uma variante de um polipeptídeo de referência, em que (i) o polipeptídeo de referência tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou da Tabela 4 (SEQ ID NOS: 7 a 123), (ii) a variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou aquelas da Tabela 4 e (iii) a uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas das substituições de aminoácidos mostradas nas Tabelas de 1 a 3. As Tabelas de 1 a 3 fornecem listas não limitativas de variantes exemplificativas da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou as da Tabela 4. Em uma modalidade, para cada variante nas Tabelas de 1 a 3, todas as posições, exceto a posição (ções) indicada (s) são idênticas às SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou às da Tabela 4. As substituições de aminoácidos são indicadas por uma letra indicando a identidade do aminoácido original, seguida por um número indicando a posição do aminoácido substituído em SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou os da Tabela 4, seguidos por uma letra indicando a identidade do aminoácido substituído. Por exemplo, D12A indica que o ácido aspártico na posição 12 na SEQ ID NO: 1 ou 2 é substituído por uma alanina. O código de letra única usado para identificar aminoácidos é o código padrão conhecido pelos especialistas na técnica. Algumas variantes nas Tabelas de 1 a 3 compreendem duas ou mais substituições, as quais são indicadas por uma lista de substituições. Uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser selecionadas de qualquer uma das variantes listadas nas Tabelas de 1 a 3 ou de qualquer

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31/204 combinação de duas ou mais variantes listadas nas Tabelas de 1 a 3. Ao selecionar a partir de uma única variante nas Tabelas de 1 a 3, a variante resultante pode compreender uma ou mais das substituições da variante selecionada em qualquer combinação, incluindo todas as substituições indicadas ou menos do que todas as substituições indicadas. Quando as substituições são selecionadas dentre as de duas ou mais variantes nas Tabelas de 1 a 3, a variante resultante pode compreender uma ou mais das substituições das variantes selecionadas, incluindo todas as substituições indicadas ou menos do que todas as substituições indicadas de cada uma das duas ou mais variantes selecionadas, em qualquer combinação. Por exemplo, a variante resultante pode compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições de uma única variante nas Tabelas de 1 a 3. Como outro exemplo, a variante resultante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25 ou mais substituições selecionadas de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais variantes selecionadas das Tabelas de 1 a 3. Em algumas modalidades, a variante resultante compreende todas as substituições indicadas de uma variante selecionada na Tabela de 1 a 3. Em algumas modalidades, a variante resultante difere da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou da Tabela 4 por pelo menos uma substituição de aminoácidos, mas menos de 25, 20, 10, 5, 4 ou 3 substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a variante resultante compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência, como indicado por uma variante selecionada na Tabela de 1 a 3, diferente da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou daquelas na Tabela 4 apenas nas substituições de aminoácidos indicadas.

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32/204

[0045] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma variante de um polipeptídeo de referência (o polipeptídeo de referência tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou aqueles na Tabela 4), em que a variante (i) compreende uma ou mais substituições de aminoácidos de uma variante correspondente selecionada das Tabelas de 1 a 3 e (ii) possui pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98 % 99% ou 100% da identidade da sequência para a variante correspondente. Nos casos em que a segunda variante possui 100% da identidade da sequência com a variante correspondente, a segunda variante compreende uma sequência conforme indicado por uma variante selecionada das Tabelas de 1 a 3 e pode ou não ter um ou mais aminoácidos adicionais em um ou ambos os terminais amino e carboxi. Em algumas modalidades, a variante resultante possui pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% da identidade da sequência com uma variante correspondente selecionada das Tabelas de 1 a 3; em alguns casos, a identidade é de pelo menos 90% ou mais. Nos casos em que a variante resultante é menos de 100% idêntica a uma variante correspondente selecionada nas Tabelas de 1 a 3, a posição de uma ou mais das substituições de aminoácidos indicadas para a variante correspondente pode mudar (por exemplo, no caso de inserção ou exclusão) de um ou mais aminoácidos), mas ainda estar contido na variante resultante. Por exemplo, a substituição de ácido aspártico por alanina correspondente a D12A (na posição 12 em relação à SEQ ID NO: 1 ou 2) pode estar presente, mas em uma

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33/204 posição diferente na variante resultante. Se um aminoácido corresponde a uma substituição indicada, embora em uma posição diferente, pode ser determinado pelo alinhamento da sequência, como é bem conhecido na técnica. Em geral, um alinhamento mostrando identidade ou semelhança de aminoácidos que flanqueiam o aminoácido substituído, de modo que as sequências de flanqueamento sejam consideradas alinhadas com uma sequência homóloga de outro polipeptídeo, permitirá que o aminoácido substituído seja posicionado localmente em relação ao variante correspondente das Tabelas de 1 a 3 para determinar uma posição correspondente para fazer a substituição, embora em uma posição numérica deslocada em uma dada cadeia polipeptídica. Em uma modalidade, uma região compreendendo pelo menos três a quinze aminoácidos, incluindo a posição substituída, alinhará localmente com a sequência variante correspondente com uma identidade percentual relativamente alta, inclusive na posição do aminoácido substituído ao longo da sequência variante correspondente (por exemplo, 90%, 95% ou 100% da identidade) . Em algumas modalidades, as uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, todas ou menos que todas as substituições de aminoácidos) indicadas por uma variante correspondente selecionada nas Tabelas de 1 a 3 são consideradas presentes em uma dada variante, mesmo que ocorram em uma posição física diferente ao longo de uma cadeia polipeptídica, se a sequência do polipeptídeo em comparação for alinhada com a variante correspondente com uma correspondência idêntica ou aminoácido semelhante na

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34/204 posição indicada ao longo da sequência variante correspondente ao usar um algoritmo de alinhamento BLASTP com parâmetros padrão, em que um aminoácido semelhante é aquele considerado como tendo propriedades químicas suficientes para o alinhamento com a posição variante de interesse, usando parâmetros padrão do algoritmo de alinhamento.

[0046] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção é complementar a um ácido nucleico descrito em conexão com qualquer uma das várias modalidades deste documento.

[0047] Entende-se que um ácido nucleico da invenção ou um polipeptídeo da invenção pode excluir uma sequência parental do tipo selvagem, por exemplo, uma sequência parental, tal como as SEQ ID NOS: 1, 2 ou 3 ou sequências divulgadas na Tabela 4. Um especialista na técnica compreenderá prontamente o significado de uma sequência do tipo selvagem parental com base no que é bem conhecido na técnica. Entende-se ainda que tal ácido nucleico da invenção pode excluir uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente como encontrada na natureza. De modo semelhante, um polipeptídeo da invenção pode excluir uma sequência de aminoácidos como encontrada na natureza. Assim, em uma modalidade específica, o ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção é como aqui apresentado, com a condição de que a sequência de aminoácidos codificada não seja a sequência parental do tipo selvagem ou uma sequência

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35/204 de aminoácidos que ocorre naturalmente e/ou que a sequência de aminoácido não é uma do tipo selvagem ou sequência de ácido nucleico de ocorrência natural. Uma sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de ocorrência natural é entendida pelos versados na técnica como relacionada a uma sequência que é encontrada em um organismo que ocorre naturalmente como encontrado na natureza. Assim, uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido que não é encontrada no mesmo estado ou que possui a mesma sequência de nucleotídeo ou aminoácido codificada que em um organismo que ocorre naturalmente é incluída no significado de uma sequência de ácido nucleico e/ou aminoácido da invenção. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido que foi alterada em uma ou mais posições de nucleotídeo ou aminoácido de uma sequência parental, incluindo variantes como aqui descritas, estão incluídas no significado de uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido da invenção de ocorrência não natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção exclui um cromossomo que contém a sequência de ácido nucleico e pode excluir ainda outras moléculas encontradas em uma célula que ocorre naturalmente, como proteínas de ligação ao DNA, por exemplo, proteínas como histonas que se ligam aos cromossomos dentro de uma célula eucariótica.

[0048] Assim, uma sequência isolada de ácido nucleico da invenção possui diferenças físicas e químicas em comparação com uma sequência de ácido nucleico que ocorre naturalmente. Um ácido nucleico isolado ou de ocorrência não

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36/204 natural da invenção não contém ou não possui necessariamente algumas ou todas as ligações químicas, ligações covalentes ou não covalentes, de uma sequência de ácido nucleico de ocorrência natural, como encontrado na natureza. Um ácido nucleico isolado da invenção difere assim de um ácido nucleico que ocorre naturalmente, por exemplo, por ter uma estrutura química diferente da sequência de ácido nucleico que ocorre naturalmente como encontrado em um cromossomo. Uma estrutura química diferente pode ocorrer, por exemplo, por clivagem de ligações fosfodiéster que liberam uma sequência isolada de ácido nucleico de um cromossomo que ocorre naturalmente. Um ácido nucleico isolado da invenção também pode diferir de um ácido nucleico de ocorrência natural, isolando ou separando o ácido nucleico de proteínas que se ligam ao DNA cromossômico em células procarióticas ou eucarióticas, diferindo desse modo de um ácido nucleico de ocorrência natural por diferentes ligações não covalentes. No que diz respeito aos ácidos nucleicos de origem procariótica, um ácido nucleico não natural da invenção não possui necessariamente algumas ou todas as ligações químicas naturais de um cromossomo, por exemplo, ligação a proteínas de ligação ao DNA, tais como as polimerases ou proteínas de estruturas cromossômicas ou não está em uma estrutura de ordem superior, como sendo superenrolada. No que diz respeito aos ácidos nucleicos de origem eucariótica, um ácido nucleico não natural da invenção também não contém as mesmas ligações químicas internas de ácido nucleico ou ligações químicas com proteínas estruturais encontradas na

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37/204 cromatina. Por exemplo, um ácido nucleico não natural da invenção não está quimicamente ligado a histonas ou proteínas de suporte e não está contido em um centrômero ou telômero. Assim, os ácidos nucleicos não naturais da invenção são quimicamente distintos de um ácido nucleico natural porque eles não possuem ou contêm diferentes interações de van der Waals, ligações de hidrogênio, ligações iônicas ou eletrostáticas e/ou ligações covalentes de um ácido nucleico como encontrado na natureza. Tais diferenças nas ligações podem ocorrer internamente dentro de regiões separadas do ácido nucleico (isto é cis) ou essa diferença nas ligações pode ocorrer nas trans, por exemplo, interações com proteínas cromossômicas. No caso de um ácido nucleico de origem eucariótica, um cDNA é considerado um ácido nucleico isolado ou de ocorrência não natural, pois as ligações químicas dentro de um cDNA diferem das ligações covalentes, que é a sequência de um gene no DNA cromossômico. Assim, é entendido pelos especialistas na matéria que um ácido nucleico isolado ou de ocorrência não natural é distinto de um ácido nucleico de ocorrência natural.

[0049] Em uma modalidade, a invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos referida como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4, em que a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, a invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo a sequência de

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38/204 aminoácidos de consenso da alça A (SEQ ID NO: 5) e/ou alça B (SEQ ID NO: 6).

[0050] Em outra modalidade, a invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos referenciada como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4, em que a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3, em que a sequência de aminoácidos, exceto uma ou mais substituições de aminoácidos, possui pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% da identidade da sequência, ou é idêntica, a uma sequência de aminoácidos referida como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos compreende ainda uma substituição de aminoácidos conservativa de 1 a 100 posições de aminoácidos, em que as posições são diferentes das uma ou mais substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3. Em outra modalidade, a sequência de aminoácidos não compreende modificação de 2 a 300 posições de aminoácidos comparadas à sequência parental, exceto uma ou mais substituições de aminoácidos estabelecidas nas tabelas 1, 2 e/ou 3, em que as posições são selecionadas dentre aquelas que são idênticas a entre 2, 3, 4 ou 5 das sequências de aminoácidos referidas como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, ou mais, das substituições de aminoácidos estabelecidas nas Tabelas 1, 2 e/ou 3, por exemplo, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

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27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 ou 43, ou seja, até todas as posições de aminoácidos com uma substituição.

[0051] Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção codifica uma aldeído desidrogenase. Em uma modalidade, o polipeptídeo pode converter 3-hidroxibutirilCoA em 3-hidroxibutiraldeído. Em uma modalidade, o polipeptídeo pode converter 4-hidroxibutiril-CoA em 4hidroxibutiraldeído. Em uma modalidade, o polipeptídeo tem atividade mais alta em relação ao polipeptídeo parental. Em uma modalidade, o polipeptídeo tem atividade mais alta para 3-hidroxi-(R)-butiril-CoA sobre 3-hidroxi-(S)-butiril-CoA. Em uma modalidade, o polipeptídeo tem uma especificidade mais alta para 3-hidroxibutiril-CoA sobre acetil-CoA. Em uma modalidade, o polipeptídeo tem uma especificidade mais alta para 4-hidroxibutiril-CoA sobre acetil-CoA. Em uma modalidade, o polipeptídeo produz subprodutos diminuídos em uma célula ou extrato celular. Em uma modalidade particular, o subproduto é etanol ou 4-hidroxi-2-butanona. Em uma modalidade, o polipeptídeo tem um kcat mais alto em relação ao polipeptídeo parental.

[0052] Em algumas modalidades, a invenção fornece um polipeptídeo isolado com uma sequência de aminoácidos aqui divulgada, como SEQ ID NOS: 1, 2 ou 3 ou aquelas referenciadas na Tabela 4, em que a sequência de aminoácidos inclui uma ou mais posições variantes de aminoácidos, conforme definidas nas Tabelas 1, 2 e/ou 3. Em particular, esse polipeptídeo codifica uma aldeído

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40/204 desidrogenase, que pode converter um acil-CoA no aldeído correspondente, por exemplo, 3-hidroxibutiril-CoA em 3hidroxibutiraldeído ou 4-hidroxibutiril-CoA para 4hidroxibutiraldeído. Em alguns aspectos, o polipeptídeo isolado da invenção inclui uma sequência de aminoácidos, além das uma ou mais posições variantes de aminoácidos, conforme estabelecido nas Tabelas 1, 2 e/ou 3, com pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade da sequência, ou é idêntica, a uma sequência de aminoácidos referida como SEQ ID NOS: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4. Entende-se que uma posição variante de aminoácido pode incluir qualquer um dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente, uma substituição conservadora de um tipo selvagem ou sequência parental na posição correspondente da posição de aminoácido variante ou de um aminoácido específico na posição de aminoácido variante, como os aqui divulgados nas Tabelas 1, 2 e/ou 3. Entende-se ainda que qualquer uma das posições variantes de aminoácidos pode ser combinada para gerar outras variantes. Variantes com combinações de duas ou mais posições variantes de aminoácidos exibiram atividades maiores que o tipo selvagem. Assim, como aqui exemplificado, a geração de variantes enzimáticas combinando posições ativas de aminoácidos variantes resultou em variantes enzimáticas com propriedades aprimoradas. Um especialista na técnica pode gerar prontamente polipeptídeos com posições variantes únicas ou combinações de posições variantes usando métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica para gerar

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41/204 polipeptídeos com propriedades desejadas, incluindo atividade aumentada, especificidade aumentada para a forma R da 3-hidroxibutiril- CoA ou 3-hidroxibutiraldeído sobre a forma S, maior especificidade para 3-hidroxibutiril-CoA e/ou 4-hidroxibutiril-CoA sobre acetil-CoA, diminuição da formação de subprodutos, como etanol ou 4-hidroxi-2butanona, aumento de kcat, estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro e similares, como aqui descrito.

[0053] Homologia ou identidade ou similaridade se refere à similaridade de sequência entre dois polipeptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. A homologia pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, as moléculas são idênticas nessa posição. Um grau de homologia entre sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas sequências. Uma região de polipeptídeo ou polipeptídica (ou uma região de polinucleotídeo ou polinucleotídica) possui uma certa porcentagem (por exemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%) da identidade da sequência com outra sequência significa que, quando alinhada, a porcentagem de aminoácidos (ou bases nucleotídicas) é a mesma na comparação das duas sequências.

[0054] Em certas modalidades, a invenção fornece um polipeptídeo isolado com uma sequência de aminoácidos que inclui pelo menos dois, três, quatro, cinco,

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42/204 seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte ou mais variantes em qualquer combinação aqui divulgada. As variantes podem incluir qualquer combinação das variantes estabelecidas nas Tabelas 1, 2 e/ou 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado é uma variante de um polipeptídeo de referência, em que o polipeptídeo de referência tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou aquelas na Tabela 4, e a variante polipeptidica é selecionada nas Tabelas de 1 a 3 e possui uma ou mais substituições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou aquelas na Tabela 4.

[0055] Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado é uma variante de um polipeptídeo de referência, em que o polipeptídeo de referência tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou aquelas na Tabela 4, a variante de polipeptídeo compreende um ou mais substituições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou aquelas da Tabela 4, em que uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas nas Tabelas de 1 a 3 e a variante polipeptidica tem pelo menos 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% da identidade da sequência para uma variante correspondente selecionada nas Tabelas de 1 a 3. Uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser selecionadas de qualquer uma das variantes listadas nas Tabelas de 1 a 3, ou de qualquer combinação de duas ou mais variantes listadas nas Tabelas de 1 a 3. Ao selecionar a partir de uma única variante na Tabela de 1 a 3, a variante

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43/204 resultante pode compreender uma ou mais das substituições da variante selecionada em qualquer combinação, incluindo todas as substituições indicadas ou menos do que todas as substituições indicadas. Quando as substituições são selecionadas dentre as de duas ou mais variantes na Tabela de 1 a 3, a variante resultante pode compreender uma ou mais das substituições das variantes selecionadas, incluindo todas as substituições indicadas ou menos do que todas as substituições indicadas de cada uma das as duas ou mais variantes selecionadas, em qualquer combinação. Por exemplo, a variante resultante pode compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições de uma única variante na Tabela de 1 a 3. Como outro exemplo, a variante resultante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25 ou mais substituições selecionadas de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais variantes selecionadas das Tabelas de 1 a 3, incluindo até todas as posições sendo substituídas, conforme divulgado aqui. Em algumas modalidades, a variante resultante compreende todas as substituições indicadas de uma variante selecionada na Tabela de 1 a 3. Em algumas modalidades, a variante resultante difere da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou da Tabela 4 por pelo menos uma substituição de aminoácidos, mas menos de 25, 20, 10, 5, 4 ou 3 substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a variante resultante compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência, como indicado por uma variante selecionada na Tabela de 1 a 3, diferente da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou daquelas na Tabela 4 apenas nas substituição(ões) de aminoácidos indicada(s).

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[0056] Em algumas modalidades, a variante resultante possui pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% da identidade da sequência com uma variante correspondente selecionada das Tabelas de 1 a 3; em alguns casos, a identidade é de pelo menos 90% ou mais. Nos casos em que a variante resultante é menos de 100% idêntica a uma variante correspondente selecionada nas Tabelas de 1 a 3, a posição de uma ou mais das substituições de aminoácidos indicadas para a variante correspondente pode mudar (por exemplo, no caso de inserção ou exclusão) de um ou mais aminoácidos), mas ainda estar contido na variante resultante. Por exemplo, a substituição de glicina por ácido glutâmico correspondente a D12A (na posição 12 em relação à SEQ ID NO: 1 ou 2) pode estar presente, mas em uma posição diferente na variante resultante. Se um aminoácido corresponde a uma substituição indicada, embora em uma posição diferente, pode ser determinado pelo alinhamento da sequência, como descrito acima e como bem conhecido na técnica. Em algumas modalidades, as uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, todas ou menos que todas as substituições de aminoácidos) indicadas por uma variante correspondente selecionada das Tabelas de 1 a 3 são consideradas presentes em uma dada variante, mesmo que ocorram em uma posição física diferente ao longo de uma cadeia polipeptídica, se a sequência do polipeptídeo em comparação for alinhada com a variante correspondente com uma correspondência idêntica ou aminoácido semelhante na posição indicada ao longo da sequência variante correspondente ao usar um algoritmo de

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45/204 alinhamento BLASTP com parâmetros padrão, em que um aminoácido semelhante é aquele considerado com propriedades químicas suficientes para o alinhamento com a posição variante de interesse, usando parâmetros padrão do algoritmo de alinhamento.

[0057] As variantes sozinhas ou em combinação podem produzir uma enzima que retém ou melhora a atividade em relação a um polipeptídeo de referência, por exemplo, a enzima do tipo selvagem (nativa). Em alguns aspectos, o polipeptídeo da invenção pode ter qualquer combinação de variantes estabelecidas nas Tabelas 1, 2 e/ou 3. Em alguns aspectos, o polipeptídeo da invenção tendo qualquer combinação de variantes estabelecidas nas Tabelas 1, 2, e/ou podem converter um acil-CoA no aldeido correspondente, por exemplo, 3-hidroxibutiril-CoA em 3-hidroxibutiraldeído ou 4 hrdroxrbutinl-CoA em 4-hrdroxrbutiraldeido. Os métodos de geração e análise de tais polipeptídeos são bem conhecidos dos versados na técnica.

[0058] Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado da invenção pode ainda incluir uma substituição de aminoácidos conservativa de 1 a 100 posições de aminoácidos, ou alternativamente de 2a 1( alternativamente de 3 a100 alternativamente de 4 a100 alternativamente de 5 a100 alternativamente de 6 a100 alternativamente de 7 a 100 alternativamente de 8 a100 posições de aminoácidos ou

posições	de	aminoácidos,	ou
posições	de	aminoácidos,	ou
posições	de	aminoácidos,	ou
posições	de	aminoácidos,	ou
posições	de	aminoácidos	ou
posições	de	aminoácidos,	ou

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alternativamente	de	9	a	100	posições	de	aminoácidos	ou
alternativamente	de	10	a	100	posições	de	aminoácidos	ou
alternativamente	de	15	a	100	posições	de	aminoácidos	ou
alternativamente	de	20	a	100	posições	de	aminoácidos	ou
alternativamente	de	30	a	100	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	de	40	a	100	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	de	50	a	100	posições	de	aminoácidos	ou

qualquer número inteiro, em que as posições são diferentes do aminoácido variante posições estabelecidas nas Tabelas 1, 2 e/ou 3. Em alguns aspectos, a sequência de aminoácidos conservativa é uma substituição de aminoácidos quimicamente conservativa ou evolutiva conservativa.

[0059] Os métodos para identificar aminoácidos conservativos são bem conhecidos dos especialistas na técnica, qualquer um destes pode ser utilizado para gerar os polipeptídeos isolados da invenção. Em algumas modalidades,

o polipeptídeo	isolado	da invenção pode	incluir nenhuma
modificação nas	posições de 2 a 300	aminoácidos,	ou
alternativamente	de	3	a 300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	de	4	a 300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	de	5	a 300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	10	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	20	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	30	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	40	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	50	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	60	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	80	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou

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alternativamente	100	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	150	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	200	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou
alternativamente	250	a	300	posições	de	aminoácidos,	ou

qualquer número inteiro, comparado à sequência parental (tipo selvagem), em que as posições são selecionadas dentre aquelas que são idênticas a entre 2, 3, 4 ou 5 da sequência de aminoácidos referenciadas como SEQ ID NOS: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4.

[0060] Entende-se que os polipeptídeos variantes, como variantes polipeptídicas de aldeído desidrogenase, conforme divulgado neste documento, podem realizar uma reação enzimática semelhante à do polipeptídeo parental, por exemplo, converter um acil-CoA em seu aldeído correspondente, tal como converter 3-hidroxibutiril-CoA em 3-hidroxibutiraldeído, ou converter 4-hidroxibutiril-CoA em 4-hidroxibutiraldeído. Entende-se ainda que as variantes polipeptídicas da enzima de aldeído desidrogenase podem incluir variantes que fornecem uma característica benéfica ao polipeptídeo, incluindo mas não se limitando à atividade aumentada, especificidade aumentada para a forma R do 3hidroxibutiril-CoA ou 3-hidroxibutiraldeído sobre a forma S, especificidade aumentada para 3-hidroxibutiril-CoA e/ou 4hidroxibutiril-CoA sobre acetil-CoA, diminuição da formação de subprodutos, como etanol ou 4-hidroxi-2-butanona, aumento do kcat, aumento da estabilidade in vivo e/ou in vitro e similares (ver Exemplo). Em uma modalidade específica, a variante de aldeído desidrogenase pode exibir uma atividade

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48/204 que é pelo menos igual ou superior a um tipo selvagem ou polipeptídeo parental, ou seja, é superior a um polipeptídeo parental sem a(s) posição(ões) de aminoácidos variantes. Por exemplo, as variantes de aldeido desidrogenase da invenção podem ter 1,2; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9.5; 10, ou ainda uma atividade de dobra mais alta do polipeptídeo variante sobre um tipo selvagem ou polipeptídeo parental (ver Exemplo). Entende-se que a atividade se refere à capacidade de uma aldeido desidrogenase da invenção para converter um substrato em um produto em relação a um tipo selvagem ou polipeptídeo parental nas mesmas condições de ensaio.

[0061] Em outra modalidade especifica, a variante de aldeido desidrogenase pode exibir especificidade aumentada para a forma R de 3-hidroxibutiril-CoA ou 3hidroxibutiraldeido sobre a forma S, por exemplo, cerca de 2 a 40 dobras mais altas, por exemplo, 2 a 35, 2 a 30, 2 a 25, 2 a 20, 2 a 15, 2 a 10 ou 2 a 5, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou até mais dobras. Tal especificidade aumentada pode ser medida, por exemplo, pela razão de atividade para o R sobre a forma S de 3-hidroxibutiril-CoA ou 3-hidroxibutiraldeido.

[0062] Em outra modalidade especifica, a variante de aldeido desidrogenase pode exibir especificidade aumentada para 3-hidroxibutiril-CoA e/ou 4-hidroxibutirilCoA sobre acetil-CoA, por exemplo, 1,5 a 100, 1,5 a 95, 1,5 a 90, 1,5 a 85, 1,5 a 80, 1,5 a 75, 1,5 a 70, 1,5 a 65, 1,5 a 60, 1,5 a 55, 1,5 a 50, 1,5 a 45, 1,5 a 40, 1,5 a 35, 1,5

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49/204 a 30, 1,5 a 25, 1,5 a 20, 1,5 a 15, 1,5 a 10 ou 1,5 a 5, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes. Tal especificidade aumentada pode ser medida, por exemplo, pela razão da atividade para 3-hidroxibutirilCoA ou 4-hidroxibutiril-CoA sobre acetil-CoA. A especificidade é indicada pela atividade em 3HB-CoA ou 4HBCoA dividida pela atividade em acetil-CoA.

[0063] Em outra modalidade específica, a variante de aldeído desidrogenase pode exibir formação de subprodutos diminuída, como etanol e/ou 4-hidroxi-2butanona, por exemplo, uma diminuição na formação de subprodutos de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%. Essa variante de aldeído desidrogenase pode exibir uma atividade que diminuiu a formação de subprodutos, como descrito acima, em relação a um tipo selvagem ou um polipeptídeo parental, isto é, um polipeptídeo parental sem a posição de aminoácido variante.

[0064] Em outra modalidade específica, a variante de aldeído desidrogenase pode exibir kcat aumentado, por exemplo, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 vezes ou mais, em relação a um tipo selvagem ou um polipeptídeo parental, isto é, um polipeptídeo parental sem a(s) posição(ões) de aminoácidos. Entende-se que o kcat se refere ao seu significado bem conhecido na enzimologia do número de rotatividade, onde kcat = Vmax/[ET], em que Vmax é a taxa de

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50/204 reação enzimática com substrato saturador e [Et] é a concentração total da enzima (ver Segei, Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Kinetics, Wiley-Interscience, New York (1975)). Essa variante de alderdo desidrogenase pode exibir uma atividade que aumentou o kcat em relação a um tipo selvagem ou um polipeptídeo parental, ou seja, um polipeptídeo parental sem a(s) posição(ões) de aminoácidos variantes.

[0065] Em outra modalidade particular, a variante de alderdo desidrogenase pode exibir estabilidade aumentada, in vitro ou in vivo, ou ambos, em relação a um tipo selvagem ou um polipeptídeo parental, ou seja, um polipeptídeo parental sem a(s) posição(ões) de aminoácidos variantes. Por exemplo, a variante de alderdo desidrogenase pode exibir maior estabilidade in vitro em um lisado celular.

[0066] Entende-se que, em certas modalidades, uma variante de alderdo desidrogenase pode exibir duas ou mais das características descritas acima, por exemplo, duas ou mais das características de (1) aumento da atividade, (2) aumento da especificidade para a forma R de 3hidroxibutiril-CoA ou 3-hidroxibutiraldeído sobre a forma S, (3) aumento da especificidade para 3-hidroxibutiril-CoA e/ou 4-hidroxibutiril-CoA sobre acetil-CoA, (4) diminuição da formação de subprodutos, como etanol e/ou 4-hidroxi-2butanona, (5) aumento de kcat, (6) aumento da estabilidade in vivo e/ou in vitro, e similares, em qualquer combinação. Tais combinações incluem, por exemplo, características 1 e

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2; 1 e 3; 1 e 4; 1 e 5; 1 e 6; 2e3; 2e4; 2e5; 2e6; 3 e 4; 3 e 5; 3 e 6; 4 e 5; 4 e 6; 5 e 6; 1, 2 e 3; 1, 2 e4;

1, 2 e 5; 1, 2 e 6; 1, 3 e 4; 1, 3 e 5; 1, 3 e 6; 1, 4 e5;

1, 4 e 6; 1, 5 e 6; 2, 3 e 4; 2, 3 e 5; 2, 3 e 6; 2, 4 e5;

2, 4 e 6; 2, 5 e 6; 3, 4 e 5; 3, 4 e 6; 3, 5 e 6; 4, 5 e6;

1, 2, 3 e 4; 1, 2, 3 e 5; 1, 2, 3 e 6; 1, 2, 4 e 5; 1, 2, 4 e 6; 1, 2, 5 e 6; 13, 4 e 5; 1, 3, 4 e 6; 1, 3, 5 e 6; 1, 4, e 6; 2, 3, 4 e 5; 2, 3, 4 e 6; 2, 3, 5 e 6; 3, 4, 5 e 6;

1, 2, 3, 4 e 5; 1, 3, 4, 5 e 6; 1, 2, 4, 5 e 6; 1, 2, 3, 5 e 6; 1, 2, 3, 4 e 6; 2, 3, 4, 5 e 6; 1, 2, 3, 4, 5 e 6.

[0067] Os polipeptídeos da invenção podem ser isolados por uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, sistemas de expressão recombinante, precipitação, filtração em gel, troca iônica, cromatografia de fase reversa e afinidade, e similares. Outros métodos bem conhecidos são descritos em Deutscher et al., Guide to Protein Purification: Methods ín Enzymology, Vol. 182, (Academic Press, (1990). Alternativamente, os polipeptídeos isolados da presente invenção podem ser obtidos usando métodos recombinantes bem conhecidos (ver, por exemplo, Sambrook et al., Supra, 1989; Ausubel et al., Supra, 1999). Os métodos e condições para a purificação bioquímica de um polipeptídeo da invenção podem ser escolhidos pelos especialistas na técnica e a purificação monitorada, por exemplo, por um ensaio funcional.

[0068] Um exemplo não limitativo de um método para preparar o polipeptídeo da invenção é expressar ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo em uma célula

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52/204 hospedeira adequada, como uma célula bacteriana, uma célula de levedura ou outra célula adequada, usando métodos bem conhecidos na técnica, e recuperação do polipeptídeo expresso, novamente utilizando métodos de purificação bem conhecidos, como aqui descrito. Os polipeptídeos da invenção podem ser isolados diretamente de células que foram transformadas com vetores de expressão como aqui descrito. Os polipeptídeos recombinantes expressos da invenção também podem ser expressos como proteínas de fusão com marcadores de afinidade apropriados, tais como glutationa S transferase (GST), poli His, estreptavidina e similares, e afinidade purificada, se desejado. Um polipeptídeo da invenção pode reter o marcador de afinidade, se desejado, ou opcionalmente o marcador de afinidade pode ser removido do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos para remover um marcador de afinidade, por exemplo, utilizando clivagem enzimática ou química apropriada. Assim, a invenção fornece polipeptídeos da invenção sem ou opcionalmente com uma etiqueta de afinidade. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma célula hospedeira que expressa um polipeptídeo da invenção aqui divulgada. Um polipeptídeo da invenção também pode ser produzido por síntese química usando um método de síntese de polipeptídeo bem conhecido dos especialistas na técnica (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964); Bodansky, M., Principies of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, 1984); Houghten, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 82:5131 (1985); Grant Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y.

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53/204 (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. Principies of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY (1993)).

[0069] Em algumas modalidades, a invenção fornece o uso de um polipeptídeo aqui divulgado como um biocatalisador. Um biocatalisador, como usado aqui, se refere a uma substância biológica que inicia ou modifica a taxa de uma reação quimica. Um biocatalisador pode ser uma enzima. Um polipeptídeo da invenção pode ser usado para aumentar a taxa de conversão de um substrato em um produto, como divulgado neste documento. No contexto de uma reação industrial, um polipeptídeo da invenção pode ser usado, na ausência de uma célula hospedeira que expresse o polipeptídeo, para melhorar as reações que geram 3-HBal,

1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, por exemplo, usando métodos in vitro. Em uma modalidade, a invenção fornece o uso do polipeptídeo da invenção como um biocatalisador.

[0070] Em algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo que codifica uma aldeido desidrogenase da invenção é fornecida como um lisado celular de uma célula que expressa a aldeido desidrogenase. Nesse caso, o lisado celular serve como fonte de aldeido desidrogenase para realizar a conversão de 3-hidroxibutiril-CoA em 3hidroxibutiraldeido ou 4-hidroxibutiril-CoA em 4hidroxibutiraldeido, ou a reação reversa, reação in vitro. Em outra modalidade, a aldeido desidrogenase pode ser fornecida em uma forma parcialmente purificada, por exemplo,

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54/204 parcialmente purificada a partir de um lisado celular. Em outra modalidade, a aldeído desidrogenase pode ser fornecida na forma substancialmente purificada, na qual a aldeído desidrogenase é substancialmente purificado de outros componentes, tais como os componentes de um extrato celular. Os métodos para purificar parcialmente ou purificar substancialmente um polipeptídeo que codifica uma aldeído desidrogenase são bem conhecidos na técnica, como aqui descrito. Em algumas modalidades, a aldeído desidrogenase é imobilizada em um suporte sólido, por exemplo, um cordão, placa ou membrana. Em uma modalidade particular, a aldeído desidrogenase compreende um marcador de afinidade e o marcador de afinidade é usado para imobilizar a aldeído desidrogenase em um suporte sólido. Tal etiqueta de afinidade pode incluir, mas não está limitada a glutationa S transferase (GST), poli His, estreptavidina e similares, como aqui descrito.

[0071] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição com um polipeptídeo aqui divulgado e pelo menos um substrato para o polipeptídeo. O substrato para cada um dos polipeptídeos aqui divulgados são descritos aqui e são exemplificados nas Figuras. O polipeptídeo dentro da composição da invenção pode reagir com um substrato sob condições in vitro ou in vivo. Neste contexto, uma condição in vitro se refere a uma reação na ausência ou fora de uma célula, incluindo uma célula da invenção.

[0072] Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção e

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55/204 pelo menos um substrato para o polipeptídeo. Em uma modalidade, o polipeptídeo pode reagir com o substrato sob condições in vitro. Em uma modalidade, o substrato é 3hidroxibutiril-CoA. Em uma modalidade, o substrato é 3hidroxi-(R)-butiril-CoA. Em uma modalidade, o substrato é 4hidroxibutiril-CoA.

[0073] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para construir uma cepa hospedeira que pode incluir, entre outras etapas, a introdução de um vetor aqui divulgado em uma célula hospedeira, por exemplo, que é capaz de expressar uma sequência de aminoácidos codificada pelo vetor e/ou é capaz de fermentação. Os vetores da invenção podem ser introduzidos de maneira estável ou transitória em uma célula hospedeira usando técnicas bem conhecidas, incluindo, mas não se limitando a conjugação, eletroporação, transformação química, transdução, transfecção e transformação por ultrassom. Métodos adicionais são divulgados neste documento, qualquer um dos quais pode ser usado no método da invenção.

[0074] Em uma modalidade adicional, a invenção fornece uma célula que compreende um polipeptídeo da invenção, ou seja, uma aldeído desidrogenase da invenção. Assim, a invenção fornece uma célula de ocorrência não natural compreendendo um polipeptídeo que codifica uma aldeído desidrogenase da invenção. Opcionalmente, a célula pode compreender uma via de 3-HBal ou 1,3-BDO ou uma via de 4-HBal ou 1,4-BDO e, também pode, opcionalmente, incluir uma via para produzir um produto a jusante relacionado a ela,

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56/204 como um éster ou amida deste. Em algumas modalidades, a célula de ocorrência não natural compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma aldeído desidrogenase que converte uma acil-CoA no seu aldeído correspondente. Um especialista na técnica entenderá que estes são meramente exemplificativos e que qualquer um dos pares substrato-produto aqui divulgados é adequado para produzir um produto desejado e para o qual uma atividade apropriada está disponível para a conversão do substrato no produto pode ser facilmente determinada por um especialista na técnica com base nos ensinamentos aqui apresentados. Assim, em uma modalidade específica, a invenção fornece uma célula, em particular uma célula de ocorrência não natural, contendo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma aldeído desidrogenase, em que a aldeído desidrogenase funciona em um 3-HBal, 1,3-BDO, Via 4-HBal ou 1,4-BDO, como mostrado nas Figuras 1 e 2.

[0075] Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula compreendendo um vetor da invenção compreendendo um ácido nucleico da invenção. A invenção também fornece uma célula compreendendo um ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é integrada em um cromossomo da célula. Em uma modalidade específica, a integração é específica do site. Em uma modalidade da invenção, a molécula de ácido nucleico é expressa. Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula compreendendo um polipeptídeo da invenção.

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[0076] Em uma modalidade, a célula compreendendo um vetor, ácido nucleico ou polipeptídeo é um organismo microbiano. Em uma modalidade particular, o organismo microbiano é uma bactéria, levedura ou fungo. Em uma modalidade particular, a célula é uma célula eucariótica isolada.

[0077] Em uma modalidade, a célula compreende uma via que produz 3-hidroxibutiraldeido (3-HBal) e/ou 1,3butanodiol (1,3-BDO), ou um éster ou amida deste. Em outra modalidade, a célula compreende uma via que produz 4hidroxibutiraldeido (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4-BDO), ou um éster ou amida deste. Em uma modalidade, a célula é capaz de fermentar. Em uma modalidade, a célula compreende ainda pelo menos um substrato para o polipeptídeo da invenção expresso na célula. Em uma modalidade particular, o substrato é 3-hidroxibutiril-CoA. Em uma modalidade particular, o substrato é 3-hidroxi-(R)-butiril-CoA. Em uma modalidade, a célula tem uma atividade mais alta para 3hidroxi-(R)-butiril-CoA sobre 3-hidroxi-(S)-butiril-CoA. Em outra modalidade particular, o substrato é 4-hidroxibutirilCoA. A invenção também fornece meio de cultura compreendendo uma célula da invenção.

[0078] A aldeido desidrogenase da invenção pode ser utilizada em uma via que converte uma acil-CoA em seu aldeido correspondente. Vias exemplificativas para 3-HBal e/ou 1,3-BDO que compreendem uma aldeido desidrogenase foram descritas, por exemplo, no WO 2010/127319, WO 2013/036764,

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Patente US No. 9.017.983, US 2013/0066035, cada um destes é incorporado aqui por referência.

[0079] Exemplos de vias 3-HBal e/ou 1,3-BDO são mostrados na Figura 1 e descritos nos WO 2010/127319, WO 2013/036764, Patente US No. 9.017.983 e US 2013/0066035. Tal vias 3-HBal e/ou 1,3-BDO que compreende uma aldeido desidrogenase inclui, por exemplo, (G) acetoacetil-CoA redutase (redutora de cetona); (H) 3-hidroxibutiril-CoA redutase (formadora de aldeido), também aqui referida como 3-hidroxibutiraldeido desidrogenase, uma aldeido desidrogenase (ALD); e (C) 3-hidroxibutiraldeído redutase, também aqui referida como uma 1,3-BDO desidrogenase (ver Figura 1). O acetoacetil-CoA pode ser formado pela conversão de duas moléculas de acetil-CoA em uma molécula de acetoacetil-CoA empregando uma tiolase. A acetoacetil-CoA tiolase converte duas moléculas de acetil-CoA em uma molécula cada uma de acetoacetil-CoA e CoA (ver WO 2013/036764 e US 2013/0066035).

[0080] Uma via 1,3-BDO exemplificativa é mostrada na Figura 2 do documento WO 2010/127319. Resumidamente, a acetoacetil-CoA pode ser convertida em 3hidroxibutiril-CoA pela acetoacetil-CoA redutase (redutora de cetona) (EC 1.1.1.a) (etapa G da Figura 1). A 3hidroxibutiril-CoA pode ser convertida em 3hidroxibutiraldeido por 3-hidroxibutiril-CoA redutase (formadora de aldeido) (EC 1.2.1.b), também aqui referida como 3-hidroxibutiraldeído desidrogenase, incluindo uma aldeido desidrogenase da invenção (etapa H da Figura 1) . O

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3-hidroxibutiraldeído pode ser convertido em 1,3-butanodiol pela 3-hidroxibutiraldeído redutase (EC 1.1.1.a), também aqui referida como 1,3-BDO desidrogenase (etapa C da Figura D ·

[0081] Como aqui divulgado, as aldeídos desidrogenases da invenção podem funcionar de maneira a converter 3-hidroxibutiril-CoA em 3-hidroxibutiraldeído. Na via descrita acima, que compreende uma aldeído desidrogenase que converte 3-hidroxibutiril-CoA em 3-hidroxibutiraldeído, a via converte acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA (consulte a Figura 1) . As aldeído desidrogenases da invenção também podem ser utilizadas em outras vias 3-HBal e/ou 1,3-BDO que compreendem 3-hidroxibutiril-CoA como substrato/produto na via. Um especialista na técnica pode utilizar facilmente uma aldeído desidrogenase da invenção para converter 3hidroxibutiril-CoA em 3-hidroxibutiraldeído em qualquer via desejada que compreenda tal reação.

[0082] As vias exemplificativas de 4-HBal e/ou 1,4-BDO são mostradas na Figura 2 e descritas em WO 2008/115840, WO 2010/030711, WO 2010/141920, WO 2011/047101, WO 2013/184602, WO 2014/176514, patente US 8,067,214, patente US 7,858,350, patente US 8,129,169, patente US 8,377,666, US 2013/0029381, US 2014/0030779, US 2015/0148513 e US 2014/0371417. Tal 4-HBal e/ou 1,4-BDO a via que compreende uma aldeído desidrogenase inclui, por exemplo, (1) succinil-CoA sintetase; (2) semialdeído desidrogenase succínica independente de CoA; (3) α-cetoglutarato desidrogenase; (4) glutamato: succinato de semialdeído transaminase; (5)

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60/204 glutamato descarboxilase; (6) semialdeído desidrogenase succinica dependente de CoA; (7) 4-hidroxibutanoato desidrogenase; (8) α-cetoglutarato descarboxilase; (9) 4hidroxibutiril CoA: acetil-CoA transferase; (10) butiratoquinase (também referido como 4-hidroxibutirato-quinase); (11) fosfotransbutirilase (também referida como fosfo-trans-4hidroxibutirilase) ; (12) aldeído desidrogenase (também referida como 4-hidroxibutiril-CoA redutase); (13) álcool desidrogenase, como 1,4-butanodiol desidrogenase (também referida como 4-hidroxibutanal redutase ou 4hidroxibutiraldeido redutase) (consulte Figura 2) .

[0083] Semelhante à Figura 2, vias exemplificativas de 1,4-BDO são mostradas na Figura 8A do WO 2010/141920. Resumidamente, a succinil-CoA pode ser convertida em semialdeído succínico por succinil-CoA redutase (ou succinato de semialdeído desidrogenase) (EC 1.2.1.b). O semialdeído succinato pode ser convertido em 4-hidroxibutirato pela 4-hidroxibutirato desidrogenase (EC 1.1.1.a). Alternativamente, a succinil-CoA pode ser convertida em 4hidroxibutirato pela succinil-CoA redutase (formadora de álcool) (EC l.l.l.c). O 4-hidroxibutirato pode ser convertido em 4-hidroxibutiril-CoA pela 4-hidroxibutiril-CoA transferase (EC 2.8.3.a), pela 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase (EC 3.1.2.a) ou pela 4-hidroxibutiril-CoA ligase (ou 4-hidroxibutiril-CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). Alternativamente, o 4-hidroxibutirato pode ser convertido em 4-hidroxibutiril-fosfato por 4hidroxibutirato quinase (EC 2.7.2.a). O 4-hidroxibutirilfosfato pode ser convertido em 4-hidroxibutiril-CoA pela

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61/204 fosfotrans-4-hidroxibutirilase (EC 2.3.1.a). Em alternativa, o 4-hidroxibutiril-fosfato pode ser convertido em 4hidroxibutanal pela 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação) (EC 1.2.1.d). A 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertida em 4-hidroxibutanal pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (ou 4-hidroxibutanal desidrogenase) (EC 1.2.1.b), incluindo por uma variante de aldeido desidrogenase da invenção. Alternativamente, a 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertida em 1,4-butanodiol pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (formadora de álcool) (EC l.l.l.c). O 4-hidroxibutanal pode ser convertido em 1,4-butanodiol pela 1,4-butanodiol desidrogenase (EC 1.1.1.a).

[0084] Exemplos de vias 1,4-BDO também são mostrados na Figura 8B do documento WO 2010/141920. Resumidamente, o alfa-cetoglutarato pode ser convertido em semialdeido succinico pela alfa-cetoglutarato descarboxilase (EC 4.1.1.a). Alternativamente, o alfa-cetoglutarato pode ser convertido em glutamato por glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.a). O 4-aminobutirato pode ser convertido em semialdeido succinico pela 4-aminobutirato oxidoredutase (desaminante) (EC 1.4.1.a) ou 4-aminobutirato transaminase (EC 2.6.1.a). O glutamato pode ser convertido em 4-aminobutirato pela glutamato descarboxilase (EC 4.1.1.a). O semialdeido succinato pode ser convertido em 4-hidroxibutirato pela 4-hidroxibutirato desidrogenase (EC 1.1.1.a). O 4-hidroxibutirato pode ser convertido em 4-hidroxibutiril-CoA pela 4-hidroxibutiril-CoA transferase (EC 2.8.3.a), pela 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase (EC 3.1.2. a) ou pela 4-hidroxibutiril-CoA ligase (ou 4Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 397/565

62/204 hidroxibutiril-CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). O 4-hidroxibutirato pode ser convertido em 4-hidroxibutiril-fosfato pela 4hidroxibutirato quinase (EC 2.7.2. a). O 4-hidroxibutiril-fosfato pode ser convertido em 4-hidroxibutiril-CoA pela fosfotrans-4hidroxibutirilase (EC 2.3.1.a). Em alternativa, o 4hidroxibutiril-fosfato pode ser convertido em 4-hidroxibutanal pela 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação) (EC 1.2.1.d). A 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertida em 4-hidroxibutanal pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (ou 4-hidroxibutanal desidrogenase) (EC 1.2.1.b), incluindo por uma aldeido desidrogenase da invenção. O 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertido em 1,4-butanodiol pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (formadora de álcool) (EC l.l.l.c). O 4-hidroxibutanal pode ser convertido em 1,4-butanodiol pela 1,4-butanodiol desidrogenase (EC 1.1.1.a).

[0085] Como aqui divulgado, as aldeidos desidrogenases da invenção podem funcionar de maneira a converter 4-hidroxibutiril-CoA em 4-hidroxibutiraldeído. Nas vias descritas acima, que compreendem uma aldeido desidrogenase que converte 4-hidroxibutiril-CoA em 4hidroxibutiraldeído, as vias convertem 4-hidroxibutirato em 4hidroxibutiril-CoA ou 4-hidroxibutiril-CoA ou 4hidroxibutiril-CoA ou 4-hidroxibutiril-fosfato em 4hidroxibutiril-figura A (Figura 2) . As aldeidos desidrogenases da invenção também podem ser utilizadas em outras vias 4-HBal e/ou 1,4-BDO que compreendem 4-hidroxibutiril-CoA como substrato/produto na via. Um especialista na técnica pode utilizar facilmente uma aldeido desidrogenase da invenção para

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63/204 converter 4-hidroxibutiril-CoA em 4-hidroxibutiraldeído em qualquer via desejada que compreenda tal reação. Por exemplo, 4-oxobutiril-CoA pode ser convertido em 4-hidroxibutiril-CoA como descrito e mostrado no documento WO 2010/141290, Figura 9A. Além disso, o ácido 5-hidroxi-2-oxopentanóico pode ser convertido em 4-hidroxibutiril-CoA, conforme descrito e mostrado no WO 2010/141290, Figuras 10 e 11. Além disso, acetoacetil-CoA, 3-hidroxibutiril-CoA, crotonil-CoA e/ou vinilacetil-CoA podem ser convertidos em 4-hidroxibutiril-CoA, como descrito e mostrado no documento WO 2010/141290, Figura 12. Além disso, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA pode ser convertido em 4-hidroxibutiril-CoA, como descrito e mostrado no documento WO 2010/141290, Figura 13. Assim, um especialista na técnica entenderá prontamente como usar uma aldeído desidrogenase da invenção em uma via de 4-HBal e/ou 1,4-BDO que compreende a conversão de 4-hidroxibutiril-CoA em 4-hidroxibutiraldeído, conforme desejado.

[0086] Os tipos de enzimas necessários para converter intermediários metabólicos centrais comuns em 1,3BDO ou 1,4-BDO são indicados acima com números representativos da Comissão de Enzimas (EC) (ver também WO 2010/127319, WO 2013/036764, WO 2008/115840, WO 2010/030711, WO 2010/141920, WO 2011/047101, WO 2013/184602, WO 2014/176514, Patente US No. 9.017.983, Patente US No. 8.067.214, Patente US No. 7.858.350, Patente US No. 8.129.169, Patente US No. 8.377.666, US 2013/0066035, US 2013/0029381, US 2014/0030779, US 2015/0148513 e US 2014/0371417) . Os três primeiros dígitos de cada etiqueta correspondem aos três primeiros dígitos do

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64/204 número da Comissão de Enzimas que denotam o tipo geral de transformação independente da especificidade do substrato. As enzimas exemplificativas incluem: 1.1.1.a, Oxidoredutase (cetona para hidroxil ou aldeido para álcool); 1.1.l.c, Oxidoredutase (2 etapas, acil-CoA em álcool); 1.2.1.b, Oxidoredutase (acil-CoA em aldeido); 1.2.l.c, Oxidoredutase (2-oxoácido em acil-CoA, descarboxilação); 1.2.1.d, Oxidoredutase (fosforilação/desfosforilação); 1.3.1.a, Oxidoredutase operando em doadores de CH-CH; 1.4.1.a, Oxidoredutase que opera com aminoácidos (desaminante); 2.3.1.a, Aciltransferase (grupo fosfato transferidor);

2.6.1.a, Aminotransferase; 2.7.2.a, Fosfotransferase, aceitador de grupo carboxila; 2.8.3.a, Coenzima-A transferase;

3.1.2.a, Tioléster hidrolase (especifico de CoA); 4.1.1.a, Carboxi-liase; 4.2.1.a, Hidroilase; 4.3.1.a, Amônia-liase; 5.3.3.a, Isomerase; 5.4.3.a, Aminomutase; e 6.2.1.a, Ácidotiol ligase.

[0087] As aldeidos desidrogenases da invenção podem ser utilizadas em uma célula ou in vitro para converter uma acil-CoA em seu aldeido correspondente. Conforme divulgado neste documento, as aldeido desidrogenases da invenção têm propriedades benéficas e úteis, incluindo, entre outras, a especificidade aumentada para o enantiômero R de 3hidroxibutiril-CoA sobre o enantiômero S, especificidade aumentada para 3-hidroxibutiril-CoA e/ou 4 -hidroxibutiril-CoA sobre acetil-CoA, aumento da atividade, diminuição da produção de subprodutos, aumento do kcat e similares. As aldeidos desidrogenases da invenção podem ser usadas para produzir a

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65/204 forma R do 1,3-butanodiol (também conhecido como (R)-l,3butanodiol), convertendo enzimaticamente o produto de uma alderdo desidrogenase da invenção, 3-hidroxi-(R)-butiraldeido, em (R)-1,3-butanodiol utilizando uma 1,3-butanodiol desidrogenase.

[0088] A forma R bioderivada de 1,3-butanodiol pode ser utilizada para a produção de produtos a jusante para os quais a forma R é preferida. Em algumas modalidades, a forma R pode ser utilizada como um farmacêutico e/ou nutracêutico (ver WO 2014/190251). Por exemplo, o (R)-1,3-butanodiol pode ser usado para produzir (3R)-hidroxibutil (3R)-hidroxibutirato, que pode ter efeitos benéficos, como aumentar o nivel de corpos cetônicos no sangue. O aumento do nivel de corpos cetônicos pode levar a vários benefícios clinicos, incluindo um aprimoramento do desempenho fisico e cognitivo e tratamento de condições cardiovasculares, diabetes e tratamento de distúrbios da disfunção mitocondrial e no tratamento da fadiga e comprometimento muscular (ver WO 2014/190251). A forma R bioderivada de 1,3-butanodiol pode ser utilizada para a produção de produtos a jusante nos quais é desejado um produto não à base de petróleo, por exemplo, substituindo o racemato 1,3-butanodiol derivado do petróleo, sua forma S ou sua forma R, com a forma R bioderivada.

[0089] Em uma modalidade, a invenção fornece 3HBal ou 1,3-BDO, ou produtos a jusante relacionados, como um éster ou amida deste, enriquecido enantiomericamente para a forma R do composto. Em algumas modalidades, 3-HBal ou 1,3-BDO é um racemato enriquecido em enantiômero R, isto é, inclui mais

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66/204 enantiômero R do que enantiômero S. Por exemplo, o racemato 3HBal ou 1,3-BDO pode incluir 55% ou mais de enantiômero R e 45% ou menos de enantiômero S. Por exemplo, o racemato 3-HBal ou 1,3-BDO pode incluir 60% ou mais de enantiômero R e 40% ou menos de enantiômero S. Por exemplo, o racemato 3-HBal ou 1,3BDO pode incluir 65% ou mais de enantiômero R e 35% ou menos de enantiômero S. Por exemplo, o racemato 3-HBal ou 1,3-BDO pode incluir 70% ou mais de enantiômero R e 30% ou menos de enantiômero S. Por exemplo, o racemato 3-HBal ou 1,3-BDO pode incluir 75% ou mais de enantiômero R e 25% ou menos de enantiômero S. Por exemplo, o racemato 3-HBal ou 1,3-BDO pode incluir 80% ou mais de enantiômero R e 20% ou menosde enantiômero S. Por exemplo, o racemato 3-HBal ou 1,3-BDO pode incluir 85% ou mais de enantiômero R e 15% ou menosde enantiômero S. Por exemplo, o racemato 3-HBal ou 1,3-BDO pode incluir 90% ou mais de enantiômero R e 10% ou menosde enantiômero S. Por exemplo, o racemato 3-HBal ou 1,3-BDO pode incluir 95% ou mais de enantiômero R e 5% ou menosde enantiômero S. Em algumas modalidades, 3-HBal ou 1,3-BDO, ou produtos a jusante relacionados a estes, como um éster ou amida destes, é superior a 90% da forma R, por exemplo, superior a 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% da forma R. Em uma modalidade, 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou produtos a jusante relacionados, como um éster ou amida destes, é 155% de enantiômero R, 160% de enantiômero R, 165% de enantiômero R, 170% de enantiômero R, 175% de enantiômero, 180% de enantiômero, 185% de enantiômero R, 185% de enantiômero, ou 190% de enantiômero R ou 195% de enantiômero, e pode ser bastante puro quimicamente, por

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67/204 exemplo, 199%, por exemplo, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 199,1%, 199,2%, 199,3%, 199,4%, 199,5%, 199,6%, 199,7%, 199,8% ou 199,9% de Enantiômero R.

[0090] Em uma modalidade, uma mistura racêmica derivada do petróleo de um precursor de 3-HBal e/ou 1,3-BDO, em particular uma mistura racêmica de 3-hidroxibutiril-CoA, é usada como substrato para uma aldeído desidrogenase da invenção, que exibe especificidade aumentada para a forma R sobre a forma S, para produzir 3-HBal ou 1,3-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, que é enriquecido enantiomericamente para a forma R. Tal reação pode ser realizada alimentando um precursor derivado de petróleo a uma célula que expressa uma aldeído desidrogenase da invenção, em particular uma célula que pode converter o precursor em 3-hidroxibutiril-CoA, ou pode ser realizada in vitro usando uma ou mais enzimas para converter o precursor derivado do petróleo em 3-hidroxibutiril-CoA, ou uma combinação de reações in vivo e in vitro. Uma reação para produzir 4-hidroxibutiril-CoA com uma aldeído desidrogenase da invenção pode similarmente ser realizada alimentando um precursor derivado de petróleo a uma célula que expressa uma aldeído desidrogenase da invenção, em particular uma célula que pode converter o precursor em 4hidroxibutiril-CoA, ou pode ser realizado in vitro usando uma ou mais enzimas para converter o precursor derivado do petróleo em 4-hidroxibutiril-CoA, ou uma combinação de reações in vivo e in vitro.

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68/204

[0091] Embora geralmente descrita aqui como uma célula que contém uma via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO compreendendo uma aldeido desidrogenase da invenção, entende-se que a invenção também fornece uma célula compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma aldeido desidrogenase da invenção. A aldeido desidrogenase pode ser expressa em uma quantidade suficiente para produzir um produto desejado, como um produto da via 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste. Vias exemplificativas de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO são mostradas nas Figuras 1 e 2 e são aqui descritas.

[0092] Entende-se que qualquer uma das vias aqui divulgadas, conforme descrita nos Exemplos e exemplificada nas Figuras, incluindo as vias das Figuras 1 e 2, pode ser utilizada para gerar uma célula que produz qualquer intermediário ou produto da via, como desejado, em particular um via que utiliza uma aldeido desidrogenase da invenção. Como divulgado aqui, uma célula que produz um intermediário pode ser usado em combinação com outra célula que expressa uma ou mais enzimas da via a montante ou a jusante para produzir um produto desejado. No entanto, entende-se que uma célula que produz um intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO pode ser utilizada para produzir o intermediário como um produto desejado.

[0093] A invenção é descrita neste documento com referência geral à reação metabólica, reagente ou produto deste, ou com referência especifica a um ou mais ácidos

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69/204 nucleicos ou genes que codificam uma enzima associada ou catalisadora ou uma proteína associada à reação metabólica referenciada, reagente ou produto. A menos que expressamente indicado de outra forma neste documento, os especialistas na técnica entenderão que a referência a uma reação também constitui referência aos reagentes e produtos da reação. De modo semelhante, salvo indicação expressa em contrário neste documento, a referência a um reagente ou produto também faz referência à reação, e a referência a qualquer um desses constituintes metabólicos também faz referência ao gene ou genes que codificam as enzimas que catalisam ou as proteínas envolvidas na reação, reagente ou produto mencionado. De modo semelhante, dados os campos bem conhecidos da bioquímica metabólica, enzimologia e genômica, a referência aqui a um gene ou ácido nucleico codificador também constitui uma referência à enzima codificada correspondente e à reação que ela catalisa ou a uma proteína associada à reação, bem como aos reagentes e produtos da reação.

[0094] Como divulgado neste documento, um produto ou intermediário de via que é um ácido carboxílico pode ocorrer em várias formas ionizadas, incluindo formas totalmente protonadas, parcialmente protonadas e totalmente desprotonadas. Consequentemente, o sufixo -ato ou a forma ácida pode ser usada alternadamente para descrever tanto a forma ácida livre quanto qualquer forma desprotonada, em particular porque a forma ionizada é conhecida por depender do pH no qual o composto é encontrado. Entende-se que produtos ou intermediários de carboxilato incluem formas ésteres de

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70/204 produtos de carboxilato ou intermediários da via, tais como ésteres de O-carboxilato e S-carboxilato. O- e S-carboxilatos podem incluir alquil inferior, isto é Cl a C6, carboxilatos de cadeia ramificada ou linear. Alguns desses O- ou S-carboxilatos incluem, sem limitação, metil, etil, n-propil, n-butil, ipropil, sec-butil e terc-butil, pentil, hexil O ou Scarboxilatos, qualquer um de que pode ainda possuir uma insaturação, proporcionando, por exemplo, O- ou S-carboxilatos de propenil, butenil, pentil e hexenil. O-carboxilatos podem ser o produto de uma via biossintética. Outros O-carboxilatos biossinteticamente acessíveis podem incluir grupos de cadeia média a longa, ou seja, ésteres C7-C22, O-carboxilatos derivados de álcoois graxos, como heptil, octil, nonil, decil, undecil, lauril, tridecil, miristil, pentadecil, cetil, álcoois palmitolil, heptadecil, estearil, nonadecil, araquidil, henicosil e beenil, qualquer um dos quais pode ser opcionalmente ramificado e/ou conter insaturações. Os ésteres de O-carboxilato também podem ser acessados por meio de um processo bioquímico ou quimico, como a esterificação de um produto de ácido carboxilico livre ou a transesterificação de um O ou S-carboxilato. S-carboxilatos são exemplificados por CoA S-ésteres, cisteinil-ésteres, alquiltioésteres e vários aril e heteroaril tioésteres.

[0095] As células da invenção podem ser produzidas através da introdução de um ácido nucleico expressável que codifica uma aldeido desidrogenase da invenção e de ácidos nucleicos opcionalmente expressáveis que codificam uma ou mais das enzimas ou proteínas que participam de um ou

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71/204 mais vias biossintéticas de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO e, opcionalmente, um ácido nucleico que codifica uma enzima que produz um produto a jusante relacionado a 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO, como um éster ou amida deste. Dependendo da célula hospedeira escolhida, podem ser expressos ácidos nucleicos para parte ou a totalidade de uma via biossintética 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou produto a jusante. Por exemplo, se um hospedeiro escolhido é deficiente em uma ou mais enzimas ou proteínas para uma via biossintética desejada, ácidos nucleicos expressáveis para as enzimas deficiente ou proteínas são introduzidas no hospedeiro para posterior expressão exógena. Alternativamente, se o hospedeiro escolhido exibir expressão endógena de alguns genes da via, mas for deficiente em outros, um ácido nucleico codificador será incluído para as enzimas ou proteínas deficientes para atingir a biossíntese de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou expressão exógena de genes expressos endogenamente pode ser fornecida para aumentar a expressão de enzimas da via, se desejado. Assim, uma célula da invenção pode ser produzida introduzindo uma aldeído desidrogenase da invenção e, opcionalmente, atividades enzimáticas ou proteínas exógenas para obter uma via biossintética desejada, ou introduzindo uma ou mais enzimas ou atividades proteicas exógenas, incluindo uma aldeído desidrogenase da invenção que, juntamente com uma ou mais enzimas ou proteínas endógenas, produz um produto desejado, tal como 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste.

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[0096] As células hospedeiras podem ser selecionadas a partir de células não naturais que expressam uma aldeído desidrogenase da invenção, geradas, por exemplo, em bactérias, leveduras, fungos ou qualquer de uma variedade de micro-organismo aplicáveis ou adequados aos processos de fermentação. Bactérias exemplificativas incluem qualquer espécie selecionada da ordem Enterobactérias, família Enterobacteriaceae, incluindo os gêneros Escherichia e Klebsiella; a ordem Aeromonadales, família Succinivibrionaceae, incluindo o gênero Anaerobiospirillum; a ordem Pasteurellales, família Pasteurellaceae, incluindo os gêneros Actinobacillus e Mannheimia; a ordem Rhizobiales, família Bradyrhizobiaceae, incluindo o gênero Rhizobium; a ordem Bacillales, família Bacillaceae, incluindo o gênero Bacillus; a ordem Actinomycetales, famílias Corynebacteriaceae e Streptomycetaceae, incluindo o gênero Corynebacterium e o gênero Streptomyces, respectivamente; ordem Rhodospirillales, família Acetobacteraceae, incluindo o gênero Gluconobacter; a ordem Sphingomonadales, família Sphingomonadaceae, incluindo o gênero Zymomonas; a ordem Lactobacillales, famílias Lactobacillaceae e Streptococcaceae, incluindo os gêneros Lactobacillus e Lactococcus, respectivamente; a ordem Clostridiales, família Clostridiaceae, gênero Clostridium; e a ordem Pseudomonadales, família Pseudomonadaceae, incluindo o gênero Pseudomonas. As espécies não limitantes de bactérias hospedeiras incluem Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis,

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Corynebacterium glutamicum, Gluconobacteridactilia, Gluconobacterocidácea, Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas putida. E. coli é um organismo hospedeiro particularmente útil, uma vez que é um organismo microbiano bem caracterizado, adequado para engenharia genética.

[0097] De modo semelhante, espécies exemplificativas de leveduras ou espécies de fungos incluem qualquer espécie selecionada da ordem Saccharomycetales, família Saccaromycetaceae, incluindo os gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces e Pichia; a ordem Saccharomycetales, família Dipodascaceae, incluindo o gênero Yarrowia; a ordem Schizosaccharomycetales, família Schizosaccaromycetaceae, incluindo o gênero Schizosaccharomyces; a ordem Eurotiales, família Trichocomaceae, incluindo o gênero Aspergillus; e a ordem Mucorales, família Mucoraceae, incluindo o gênero Rhizopus. Espécies não limitantes de levedura ou fungo hospedeiro incluem Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Rhizopus arrhizus, Rhizobus oryzae, Rhizobus oryolye. Um organismo hospedeiro particularmente útil que é uma levedura inclui Saccharomyces cerevisiae.

[0098] Embora geralmente descrito aqui como utilizando uma célula que é um organismo microbiano como célula hospedeira, particularmente para a produção de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, entende-se que uma célula hospedeira pode ser uma linha celular de um eucarioto superior,

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74/204 tal como uma linha celular de mamifero ou linha celular de inseto. Assim, entende-se que a referência aqui a uma célula hospedeira que é um organismo microbiano pode, alternativamente, utilizar uma linha celular eucariótica mais alta para produzir um produto desejado. Exemplos de linhas celulares eucarióticas superiores incluem, mas não se limitam ao ovário de hamster chinês (CHO), humano (Hela, Rim Embrionário Humano (HEK) 293, Jurkat), camundongo (3T3), primata (Vero), inseto (Sf9), e similar. Tais linhas celulares estão disponíveis comercialmente (ver, por exemplo, a American Type Culture Collection (ATCC;

Manassas VA) ; Life Technologies, Carlsbad CA) . Entende-se que qualquer célula hospedeira adequada pode ser utilizada para introduzir uma aldeido desidrogenase da invenção e, opcionalmente, modificações metabólicas e/ou genéticas para produzir um produto desejado.

[0099] Dependendo dos constituintes da via biossintética de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO de uma célula hospedeira selecionada, as células de ocorrência não natural da invenção incluirão pelo menos um ácido nucleico que codifica a via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO expressada exogenamente e até todos os ácidos nucleicos que codificam uma ou mais vias biossintéticas 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, incluindo uma aldeido desidrogenase da invenção. Por exemplo, a biossintese de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO pode ser estabelecida em um hospedeiro deficiente em uma enzima ou proteina da via através da expressão exógena do ácido nucleico codificador correspondente, incluindo uma aldeido

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75/204 desidrogenase da invenção. Em um hospedeiro deficiente em todas as enzimas ou proteinas de uma via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, a expressão exógena de todas as enzimas ou proteinas na via pode ser incluida, embora se entenda que todas as enzimas ou proteinas de uma a via pode ser expressa mesmo que o hospedeiro contenha pelo menos uma das enzimas ou proteinas da via. Por exemplo, expressão exógena de todas as enzimas ou proteinas em uma via para produção da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, pode ser incluido, incluindo uma aldeido desidrogenase da invenção.

[00100] Dados os ensinamentos e orientações aqui fornecidos, os especialistas na técnica entenderão que o número de ácidos nucléicos codificadores a serem introduzidos de forma expressável será, pelo menos, paralelo as deficiências das vias 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO da célula hospedeira selecionada se uma via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO for incluida na célula. Portanto, uma célula não natural da invenção pode ter um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito e assim por diante, dependendo da via especifica, até todos os ácidos nucléicos que codificam as enzimas ou proteinas que constituem uma via biossintética 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO divulgada aqui. Em algumas modalidades, as células que não ocorrem naturalmente também podem incluir outras modificações genéticas que facilitam ou otimizam a biossintese de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou que conferem outras funções úteis à célula hospedeira. Uma dessas outras funcionalidades pode

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76/204 incluir, por exemplo, aumento da síntese de um ou mais dos precursores da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, como acetil-CoA ou acetoacetil-CoA.

[00101] Geralmente, uma célula hospedeira é selecionada de modo que possa expressar uma aldeido desidrogenase da invenção e, opcionalmente, produz o precursor de uma via de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, em uma célula contendo essa via, como uma molécula produzida naturalmente ou como um produto manipulado que fornece a produção de novo de um precursor desejado ou o aumento da produção de um precursor produzido naturalmente pela célula hospedeira. Um organismo hospedeiro pode ser manipulado para aumentar a produção de um precursor, como divulgado neste documento. Além disso, uma célula que foi projetada para produzir um precursor desejado pode ser usada como organismo hospedeiro e adicionalmente projetada para expressar enzimas ou proteínas de um 3-HBal, 1,3BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO via, ou um produto a jusante relacionado, como um éster ou amida deste, se desejado.

[00102] Em algumas modalidades, uma célula da ocorrência não natural da invenção é gerada a partir de um host que contém a capacidade enzimática de sintetizar 3-HBal, 1,3BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste. Nesta modalidade específica, pode ser útil aumentar a síntese ou acumulação de um produto da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO para, por exemplo, acionar reações da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO em direção à produção de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida

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77/204 deste. A síntese ou acumulação aumentada pode ser conseguida por, por exemplo, pela superexpressão de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais das enzimas ou proteínas da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO descritas acima, incluindo uma aldeido desidrogenase da invenção. A superexpressão da enzima ou enzimas e/ou proteína ou proteínas da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO pode ocorrer, por exemplo, através da expressão exógena do dos genes endógenos ou genes, ou através da expressão exógena do dos genes heterólogos ou genes, incluindo a expressão exógena de uma aldeido desidrogenase da invenção. Portanto, os organismos de ocorrência natural podem ser facilmente convertidos em células da ocorrência não natural da invenção, por exemplo, produzindo 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionado a estes, como um éster ou amida deste, através da superexpressão de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais, dependendo do 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou seja, até todos os ácidos nucleicos que codificam enzimas ou proteínas da via biossintética 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou enzimas que produzem um produto a jusante relacionado a ela, como um éster ou amida deste. Além disso, um organismo não natural pode ser gerado pela mutagênese de um gene endógeno que resulta em um aumento da atividade de uma enzima nas vias biossintéticas 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado, como um éster ou amida deste.

[00103] Em modalidades particularmente úteis, a expressão exógena dos ácidos nucleicos de codificação é empregada. A expressão exógena confere a capacidade de

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78/204 personalizar a expressão e/ou elementos reguladores para o hospedeiro e a aplicação para alcançar um nivel de expressão desejado que é controlado pelo usuário. Entretanto, a expressão endógena também pode ser utilizada em outras modalidades tal como mediante a remoção de um efetor regulador negativo ou indução do promotor de gene quando ligado a um promotor induzivel ou outro elemento regulador. Assim, um gene endógeno que tem um promotor induzivel de ocorrência natural pode ser regulado de forma ascendente mediante o fornecimento do agente de indução apropriado, ou a região reguladora de um gene endógeno pode ser modificado para incorporar um elemento regulador induzivel, desse modo, permite que a regulação de expressão aumentada de um gene endógeno em um momento desejado. De modo semelhante, um promotor induzivel pode ser incluido como um elemento regulador para um gene exógeno introduzido em um organismo microbiano de ocorrência não natural De modo semelhante, um promotor induzivel pode ser incluido como uma célula de ocorrência não natural.

[00104] Entende-se que qualquer um dos um ou mais ácidos nucleicos exógenos pode ser introduzido em uma célula para produzir uma célula de ocorrência não natural da invenção. Os ácidos nucleicos podem ser introduzidos de modo a conferir, por exemplo, um 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, a via biossintética para a célula, incluindo a introdução de um ácido nucleico que codifica uma aldeido desidrogenase da invenção. Alternativamente, ácidos

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79/204 nucleicos codificadores podem ser introduzidos para produzir uma célula com capacidade biossintética para catalisar algumas das reações necessárias para conferir capacidade biossintética 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO para produzir um intermediário. Por exemplo, uma célula de ocorrência não natural com uma via biossintética 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO pode compreender pelo menos dois ácidos nucleicos exógenos que codificam enzimas ou proteínas desejadas, incluindo uma aldeido desidrogenase da invenção. Assim, entende-se que qualquer combinação de duas ou mais enzimas ou proteínas de uma via biossintética pode ser incluída em uma célula não natural da invenção, incluindo uma aldeido desidrogenase da invenção. De modo semelhante, entende-se que qualquer combinação de três ou mais enzimas ou proteínas de uma via biossintética pode ser incluída em uma célula não natural da invenção, conforme desejado, desde que a combinação de enzimas e/ou proteínas da via biossintética desejada resulta na produção do produto desejado correspondente. De modo semelhante, qualquer combinação de quatro ou mais enzimas ou proteínas de uma via biossintética como aqui divulgada pode ser incluída em uma célula não natural da invenção, conforme desejado, desde que a combinação de enzimas e/ou proteínas da via biossintética desejada resulta na produção do produto desejado correspondente.

[00105] Além da biossíntese de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, conforme descrito aqui,

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80/204 as células que não ocorrem naturalmente e os métodos da invenção também podem ser utilizados em várias combinações entre si e/ou com outras células e métodos bem conhecidos na técnica para alcançar a biossintese do produto por outras vias. Por exemplo, uma alternativa para produzir 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, exceto o uso de produtores de 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO é através da adição de outra célula capaz de converter um intermediário da via 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO em 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO. Um desses procedimentos inclui, por exemplo, a fermentação de uma célula que produz um intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO. O intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO pode ser usado como substrato para uma segunda célula que converte o intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO EM 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO. O intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO pode ser adicionado diretamente a outra cultura do segundo organismo ou a cultura original dos produtores intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO podem ser depauperadas dessas células por, por exemplo, separação de células e, em seguida, a adição subsequente do segundo organismo ao caldo de fermentação pode ser utilizada para produzir o produto final sem etapas intermediárias de purificação. Uma célula que produz um produto a jusante relacionado a 3-HBal, 1,3BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, como um éster ou amida deste, pode opcionalmente ser incluída para produzir esse produto a jusante.

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[00106] Alternativamente, essas conversões enzimáticas podem ser realizadas in vitro, com uma combinação de enzimas ou exposição sequencial de substratos a enzimas que resultam na conversão de um substrato em um produto desejado. Como outra alternativa, uma combinação de conversões baseadas em células e conversões enzimáticas in vitro pode ser usada, se desejado.

[00107] Em outras modalidades, as células e métodos não naturais da invenção podem ser montados em uma ampla variedade de subvias para alcançar a biossintese de, por exemplo, 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-bDO ou um produto a jusante relacionado, como um éster ou amida deste. Nestas modalidades, as vias biossintéticas para um produto desejado da invenção podem ser segregadas em células diferentes e as diferentes células podem ser co-cultivadas para produzir o produto final. Nesse esquema biossintético, o produto de uma célula é o substrato para uma segunda célula até que o produto final seja sintetizado. Por exemplo, a biossintese de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, pode ser realizada construindo uma célula que contém vias biossintéticas de conversão de um intermediário da via para outro intermediário da via ou do produto. Como alternativa, 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO também podem ser produzidos biossinteticamente a partir de células através de co-cultura ou co-fermentação usando duas células diferentes no mesmo vaso, onde a primeira célula produz um intermediário 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou

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1,4-BDO e a segunda célula converte o intermediário em 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste.

[00108] Dados os ensinamentos e orientações aqui fornecidos, os especialistas na técnica entenderão que existe uma grande variedade de combinações e permutações para os métodos e células de ocorrência não naturais da invenção, juntamente com outras células, com a co-cultura de outras células de ocorrência não natural com subvias e combinações de outros procedimentos químicos e/ou bioquímicos bem conhecidos na técnica para produzir 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionados, tais como um éster ou amida deste.

[00109] As fontes de ácidos nucleicos codificadores de uma enzima ou proteína da via 3-HBal, 1,3BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida, podem incluir, por exemplo, qualquer espécie em que o produto genético codificado seja capaz de catalisar a reação referenciada. Tais espécies incluem organismos procarióticos e eucarióticos, incluindo, mas não limitados às bactérias, incluindo archaea e eubactérias, e eucariotos, incluindo levedura, planta, inseto, animal e mamífero, incluindo humanos. Espécies exemplificativas para tais fontes incluem, por exemplo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Clostridium kluyveri, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium perfringens,

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Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium tetanomorphum, Clostridium tetani, Clostridium propionicum, Clostridium aminobutyricum, Clostridium subterminale, Clostridium sticklandii, Ralstonia eutropha _f Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Porphyromonas gingivalis, Arabidopsis thaliana, Thermus thermophilus, Pseudomonas species, including Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus, Rhodobacter spaeroides, Thermoanaerobacter brockii, Metallosphaera sedula, Leuconostoc mesenteroides, Chloroflexus aurantiacus, Roseiflexus castenholzii, Erythrobacter, Simmondsia chinensis, Acinetobacter species, including Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter baylyi, Porphyromonas gingivalis, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus acidocaldarius, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus brevis, Bacillus pumilus, Rattus norvegicus, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Euglena gracilis, Treponema denticola, Moorella thermoacetica, Thermotoga marit ima, Halobacterium salinarum, Geobacillus stearothermophilus, Aeropyrum pernix, Sus scrofa, Caenorhabditis elegans, Corynebacterium glutamicum, Acidaminococcus fermentans, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus, Enterobacter aerogenes, Candida, Aspergillus terreus, Pedicoccus pentosaceus, Zymomonas mobilus, Acetobacter pasteurians, Kluyveromyces lactis, Eubacterium barkeri, Bacteroides capillosus, Anaerotruncus colihominis,

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Natranaerobius thermophilusm, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Serratia marcescens, Citrobacter amalonaticus, Myxococcus xanthus, Fusobacterium nuleatum, Penicillium chrysogenum, marine gamma proteobacterium, butyrate-producing bacterium, Nocardia iowensis, Nocardia farcinica, Streptomyces griseus, Schizosaccharomyces pombe, Geobacillus thermoglucosidasius, Salmonella typhimurium, Vibrio cholera, Heliobacter pylori, Nicotiana tabacum, Oryza sativa, Haloferax mediterranei, Agrobacterium tumefaciens, Achromobacter denitrificans, Fusobacterium nucleatum, Streptomyces clavuligenus, Acinetobacter baumanii, Mus musculus, Lachancea kluyveri, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma brucei, Pseudomonas stutzeri, Bradyrhizobium japonicum, Mesorhizobium loti, Bos taurus, Nicotiana glutinosa, Vibrio vulnificus, Selenomonas ruminantium, Vibrio parahaemolyticus, Archaeoglobus fulgidus, Haloarcula marismortui, Pyrobaculum aerophilum, Mycobacterium smegmatis MC2 155, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10, Mycobacterium marinum M, Tsukamurella paurometabola DSM 20162, Cyanobium PCC7001, Dictyostelium discoideum ΆΧ4, Acidaminococcus fermentans, Acinetobacter baylyi, Acinetobacter calcoaceticus, Aquifex aeolicus, Arabidopsis thaliana, Archaeoglobus fulgidus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Bacillus subtilis, Bos Taurus, Candida albicans, Candida tropicalis, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorobium tepidum, Citrobacter koseri, Citrus junos, Clostridium acetobutylicum, Clostridium kluyveri, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Cyanobium PCC7001,

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Desulfatibacillum alkenivorans, Dictyostelium discoideum, Fusobacterium nucleatum, Haloarcula marismortui, Homo sapiens, Hydrogenobacter thermophilus, Klebsiella pnewioniae, Kluyveromyces lactis, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides, Metallosphaera sedula, Methanothermobacter thermautotrophicus, Mus musculus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium smegmatis, Nicotiana tabacum, Nocardia iowensis, Oryctolagus cuniculus, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Porphyromonas gingivalis , Porphyromonas gingivalis , Pseudomonas aeruginos, Pseudomonas putida, Pyrobaculum aerophilum, Ralstonia eutropha, Rattus norvegicus, Rhodobacter sphaeroides, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella enteric, Salmonella typhimurium, Schizosaccharomyces pombe, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Thermoanaerobacter tengcongensis, Thermus thermophilus, Trypanosoma brucei, Tsukamurella paurometabola, Yarrowia lipolytica, Zoogloea ramigera and Zymomonas mobilis, Clostridum, incluindo mas não limitado a Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium botulinum, Clostridium methylpentosum, Clostridium sticklandii, Clostridium phytofermentans, Clostridium saccharolyticum, Clostridium asparagiforme, Clostridium celatum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium clostridioforme, Clostridium bolteae, Caldalkalibacillus thermarum, Clostridium botulinum, Pelosinus fermentans, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, espécie

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Desulfosporosinus, Thermoanaerobacterium species, incluindo mas não limitado a Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobacterium xylanolyticum, Acetonema longum, Geobacillus species, incluindo mas não limitado a Geobacillus thermoglucosidans, Bacillus azotoformans, Thermincola potens, Fusobacterium species, incluindo mas não limitado a Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium ulcerans, Fusobacterium varium, Ruminococcus species, incluindo mas não limitado a Ruminococcus gnavus, Ruminococcus obeum, Lachnospiraceae bacterium, Flavonifractor plautii, Roseburia inulinivorans, Acetobacterium woodii, espécie Eubacterium, incluindo mas não limitado a Eubacterium plexicaudatum, Eubacterium hallii, Eubacterium limosum, Eubacterium yurii, Eubacteriaceae bacterium, Thermosediminibacter oceani, Ilyobacter polytropus, Shuttleworthia satelles, Halanaerobium saccharolyticum, Thermoanaerobacter ethanolicus, Rhodospirillum rubrum, Vibrio, Propionibacterium propionicum, bem como outras espécies exemplificativas aqui divulgadas ou disponíveis como organismos de origem para os genes correspondentes, incluindo os organismos de origem da aldeído desidrogenases descritos na Tabela 4. Entretanto, com a sequência do genoma completa disponível para agora mais do que 550 espécies (com mais do que metade destas disponível em bancos de dados públicos tais como o NCBI), incluindo 395 genomas de micro-organismos e uma variedade de genomas de mamíferos, levedura, fungos, plantas e mamíferos, a identificação de genes de codificação da atividade biossintética 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO para um ou mais genes em espécies relacionadas ou distantes,

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87/204 incluindo, por exemplo, deslocamento de genes homólogos, ortólogos, parálogos e não ortólogos de genes conhecidos, e o intercâmbio de alterações genéticas entre os organismos é rotina e bem conhecido na técnica. Consequentemente, as alterações metabólicas que habilitam a biossintese de 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, incluindo a expressão de uma aldeido desidrogenase da invenção, descrita aqui com referência a um organismo em particular, como E. coli, pode ser facilmente aplicada a outras células, como microorganismo, incluindo organismos procarióticos e eucarióticos. Dados os ensinamentos e orientações aqui fornecidos, os especialistas na técnica saberão que uma alteração metabólica exemplificada em um organismo pode ser aplicada igualmente em outros organismos.

[00110] Em alguns casos, como existe uma via biossintética alternativa 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO em uma espécie não utilizada, 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou uma biossintese de 1,4-BDO pode ser conferida sobre a espécie hospedeira por, por exemplo, expressão exógena de um parálogo ou parálogos da espécie não relacionada que catalisa uma reação metabólica semelhante, contudo não idêntica para substituir a reação referenciada. Pelo fato de que determinadas diferenças dentre redes metabólicas existem entre diferentes organismos, aqueles versados na técnica irão entender que o real uso de genes entre diferentes organismos pode diferenciar-se. Entretanto, dados os ensinamentos e orientação fornecidos no presente documento,

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88/204 aqueles versados na técnica também irão entender que os ensinamentos e métodos da invenção podem ser aplicados a todos os organismos microbianos com a utilização das alterações metabólicas cognatas para aqueles exemplificados no presente documento para construir um organismo microbiano em uma espécie de interesse que irá sintetizar 3-HBal, 1,3BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, se aplicável, incluindo uma introdução de uma aldeído desidrogenase da invenção.

[00111] Métodos para construir e testar os níveis de expressão de um hospedeiro não natural que produz 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou uma amida da mesma, incluindo uma aldeído desidrogenase da invenção, pode ser realizada, por exemplo, por métodos recombinantes e de detecção bem conhecidos na técnica. Tais métodos podem ser encontrados selecionados, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999).

[00112] Um ácido nucleico exógeno que codifica uma aldeído desidrogenase da invenção e sequências de ácidos nucleicos opcionalmente exógenas envolvidas em uma via para a produção de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, podem ser introduzidas de modo estável ou transiente

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89/204 para uma célula hospedeira com a utilização de técnicas bem conhecidas na técnica incluindo, mas não limitadas a, conjugação, eletroporaçâo, transformação química, transdução, transfecção, e transformação de ultrassom. Para a expressão exógena em E. coli ou outras células procarióticas, algumas sequências de ácidos nucleicos nos genes ou cDNAs de ácidos nucleicos eucarióticos podem codificar os sinais de alvo tal como um N-terminal mitocondrial ou outro sinal de alvo, o qual pode ser removido antes da transformação em células hospedeiras procarióticas, se desejado. Por exemplo, a remoção de uma sequência líder mitocondrial levou ao aumento da expressão em E. coli (Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329 a 4338 (2005)). Para a expressão exógena em levedura ou outras células eucarióticas, os genes podem ser expressos no citosol sem a adição de sequência líder, ou podem ser alvejados para mitocôndria ou outras organelas, ou alvejado para secreção, mediante a adição de uma sequência de alvo adequada tal como um alvo mitocondrial ou sinal de secreção adequado para as células hospedeiras. Assim, é entendido que modificações apropriadas a uma sequência de ácidos nucleicos para remover ou incluir uma sequência de alvo podem ser incorporadas a uma sequência de ácidos nucleicos exógenos para transmitir propriedades desejáveis. Além do mais, os genes podem ser submetidos a otimização de códons com técnicas bem conhecidas na técnica para alcançar a expressão otimizada das proteínas.

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[00113] Vetores ou um vetor de expressão podem ser construídos para incluir um ácido nucleico que codifica uma alderdo desidrogenase da invenção e/ou opcionalmente uma ou mais ácidos nucléicos que codificam as vias biossintéticas de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou ácidos nucléicos que codificam uma enzima que produz um produto a jusante relacionado a 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, como um éster ou amida deste, como aqui exemplificado ligado de maneira operável a sequências de controle de expressão funcionais no organismo hospedeiro. Os vetores de expressão aplicáveis para uso nos organismos hospedeiros microbianos da invenção incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores de fagos, vetores virais, episomas e cromossomos artificiais, incluindo sequências de seleção e vetores ou marcadores operáveis para integração estável em um cromossomo hospedeiro. Adicionalmente, os vetores de expressão podem incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e sequências de controle de expressão apropriadas. Os genes marcadores selecionáveis também podem ser inclusos que, por exemplo, fornecem resistência a antibióticos ou toxinas, complementam deficiências auxotróficas, ou suprir nutrientes críticos não no meio de cultura. As sequências de controle de expressão podem incluir promotores induzíveis e constitutivos, intensificadores de transcrição, terminadores de transcrição, e similares que são bem conhecidos na técnica. Quando dois ou mais ácidos nucléicos de codificação exógenos estão para ser expressos ao mesmo tempo, ambos os ácidos

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91/204 nucleicos podem ser inseridos, por exemplo, em um vetor de expressão individual ou em vetores de expressão separados. Para expressão de vetor individual, os ácidos nucleicos de codificação podem ser ligados de modo operacional a uma sequência de controle de expressão comum ou ligados a diferentes sequências de controle de expressão, tais como um promotor induzível e um promotor constitutivo. A transformação de sequências de ácido nucleico exógeno envolvidas em uma trajetória sintética ou metabólica pode ser confirmada com a utilização de métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, análise de ácido nucleico tal como amplificação de mRNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou Northern blots, ou imunoblotting para expressão de produtos de gene, ou outros métodos analíticos adequados para testar a expressão de uma sequência de ácido nucleico introduzida ou seu produto de gene correspondente. É entendido por aqueles versados na técnica que o ácido nucleico exógeno é expresso em uma quantidade suficiente para produzir o produto desejado, e é ainda entendido que níveis de expressão podem ser otimizados para obter suficiente expressão com a utilização de métodos bem conhecidos na técnica e como revelado no presente documento.

[00114] Um vetor ou vetor de expressão também pode ser usado para expressar um ácido nucleico codificado para produzir um polipeptídeo codificado por transcrição e tradução in vitro. Tal vetor ou vetor de expressão compreenderá pelo menos um promotor e inclui os vetores descritos acima. Esse vetor para transcrição e tradução in

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92/204 vitro geralmente é DNA de fita dupla. Os métodos de transcrição e tradução in vitro são bem conhecidos dos especialistas na técnica (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)). Também estão disponíveis comercialmente kits para transcrição e tradução in vitro (ver, por exemplo, Promega, Madison, WI; New England Biolabs, Ipswich, MA; Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA).

[00115] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a produção de 3-hidroxibutiraldeido (3-HBal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-BDO), ou um éster ou amida deste, compreendendo a cultura de uma célula da invenção para produzir 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou um éster ou amida deste. Essa célula expressa um polipeptídeo da invenção. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a produção de 4-hidroxibutiraldeido (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4BDO) , ou um éster ou amida deste, compreendendo a cultura de uma célula da invenção para produzem 4-HBal e/ou 1,4-BDO, ou um éster ou amida deste. Em uma modalidade, a célula está em um meio de cultura substancialmente anaeróbico. Em uma modalidade, o método pode ainda compreender isolar ou purificar 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, ou éster ou amida deste. Em uma modalidade particular, o isolamento ou purificação compreende destilação.

[00116] Em uma modalidade, a invenção fornece um processo para a produção de um produto da invenção,

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93/204 compreendendo reagir quimicamente 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4HBal e/ou 1,4-BDO, com eles mesmos ou outro composto em uma reação que produz o produto.

[00117] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a produção de 3-hidroxibutiraldeído (3-HBal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-BDO), ou um éster ou amida deste, compreendendo fornecer um substrato a um polipeptídeo da invenção e a conversão do substrato em 3-HBal e/ou 1,3-BDO, em que o substrato é uma mistura racêmica de 1,3hidroxibutiril-CoA. Em uma modalidade, 3-HBal e/ou 1,3-BDO é enriquecido enantiomericamente para a forma R. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a produção de 4-hidroxibutiraldefdo (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4BDO) , ou um éster ou amida deste, compreendendo o fornecimento de um substrato a um polipeptídeo da invenção e a conversão do substrato em 4-HBal e/ou 1,4-BDO, em que o substrato é 1,4-hidroxibutiril-CoA. Em uma modalidade, o polipeptídeo está presente em uma célula, em um lisado celular, ou é isolado de uma célula ou lisado celular.

[00118] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a produção de 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, compreendendo a incubação de um lisado de uma célula da invenção para produzir 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4HBal e/ou 1,4-BDO. Em uma modalidade, o lisado celular é misturado com um segundo lisado celular, em que o segundo lisado celular compreende uma atividade enzimática para produzir um substrato de um polipeptídeo da invenção ou um

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94/204 produto a jusante de 3-HBal e/ou 1,3-bDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO.

[00119] A invenção também fornece um método para a produção de um polipeptídeo da invenção, compreendendo a expressão do polipeptídeo em uma célula. A invenção fornece adicionalmente um método para a produção de um polipeptídeo da invenção, compreendendo a transcrição e tradução in vitro de um ácido nucleico da invenção ou um vetor da invenção para produzir o polipeptídeo.

[00120] Como descrito aqui, uma célula pode ser usada para expressar uma aldeído desidrogenase da invenção e, opcionaímente, a célula pode incluir uma via metabólica que utiliza uma aldeído desidrogenase da invenção para produzir um produto desejado, como 3-HBal e/ou 1,3-BDO ou 4HBal e/ou 1,4-BDO. Tais métodos para expressar um produto desejado são descritos aqui. Alternativamente, uma aldeído desidrogenase da invenção pode ser expressa e/ou um produto desejado produzido, em um lisado celular, por exemplo, um lisado celular de uma célula que expressa uma aldeído desidrogenase da invenção ou uma célula que expressa uma aldeído desidrogenase da invenção e uma via metabólica para produzir um produto desejado, como aqui descrito. Em outra modalidade, uma aldeído desidrogenase da invenção pode ser expressa por transcrição e tradução in vitro, na qual a aldeído desidrogenase é produzida em um sistema livre de células. A aldeído desidrogenase expressa por transcrição e tradução in vitro pode ser usada para realizar uma reação in vitro. Opcionaímente, outras enzimas, ou lisado(s)

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95/204 celular(es) contendo tais enzimas, podem ser usadas para converter o produto da reação enzimática da aldeido desidrogenase em um produto a jusante desejado in vitro.

[00121] Purificação e/ou ensaios adequados para testar a expressão de uma aldeido desidrogenase ou a produção de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida da deste, incluindo ensaios para testar a atividade da aldeido desidrogenase, pode ser realizada usando métodos bem conhecidos (ver também a seção Exemplo). Replicações adequadas, tais como, cultivos triplicados, podem ser proliferados para cada cepa modificada a ser testada. Por exemplo, a formação de produto e subproduto no hospedeiro de produção modificada pode ser monitorada. O produto final e intermediário, e outros compostos orgânicos, podem ser analisados por métodos tais como HPLC (Cromatografia Liquida de Alta Eficiência), GC-MS (Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Massas) e LC-MS (Cromatografia Liquida e Espectrometria de Massas) ou outros métodos analíticos adequados que usam procedimentos de rotina bem conhecidos na técnica. A liberação de produto no caldo de fermentação pode também ser testado com o cultivo sobrenadante. Subprodutos e glicose residual podem ser quantificados por uso de HPLC, por exemplo, a detector indice de refração para glicose e álcoois, e um detector UV para ácidos orgânicos (Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)), ou outros ensaios e métodos de deleção adequados bem conhecidos na técnica. A enzima individual ou atividades de proteína das sequências

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96/204 de DNA exógeno podem também ser ensaiadas de forma a usar métodos bem conhecidos na técnica (ver também Exemplo).

[00122] 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou outro produto desejado, como um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, pode ser separado dos outros componentes no cultivo que usa uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos de separação incluem, por exemplo, procedimentos de extração, bem como métodos que inclui extração líquidolíquida contínua, pervaporação, filtração de membrana, separação de membrana, osmose reversa, eletrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de absorção, e ultrafiltração. Todos os métodos acima são bem conhecidos na técnica.

[00123] Qualquer uma das células de ocorrência não natural que expressam uma aldeido desidrogenase da invenção aqui descrita pode ser cultivada para produzir e/ou secretar os produtos biossintéticos da invenção. Por exemplo, as células que produzem 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, podem ser cultivadas para a produção biossintética de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado, como um éster ou amida deste. Por conseguinte, em algumas modalidades, a invenção fornece meio de cultura contendo 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou

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97/204 amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO aqui descrito. Em alguns aspectos, o meio de cultura também pode ser separado das células de ocorrência não natural da invenção que produziram 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este tal como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO. Os métodos para separar uma célula do meio de cultura são bem conhecidos na técnica. Métodos exemplificativos incluem filtração, floculação, precipitação, centrifugação, sedimentação e similares.

[00124] Para a produção de uma aldeído desidrogenase da invenção, ou de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida, em uma célula expressando uma aldeído desidrogenase da invenção, as cepas recombinantes são cultivadas em um meio com fonte de carbono e outros nutrientes essenciais. Às vezes é desejável e pode ser altamente desejável manter condições anaeróbicas no fermentador para reduzir o custo de todo o processo. Tais condições podem ser obtidas, por exemplo, primeiro poupando o meio com nitrogênio e depois selando os frascos com um septo e uma tampa de crimpagem. Para cepas onde o crescimento não é observado anaerobicamente, condições microaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas podem ser aplicadas perfurando o septo com um pequeno orifício para aeração limitada. Condições anaeróbicas exemplificativas foram descritas anteriormente e são bem conhecidas na técnica. Condições aeróbicas e anaeróbicas exemplificativas

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98/204 são descritas, por exemplo, na publicação do pedido de patente Norte-Americano N° 2009/0047719, depositado em 10 de agosto de 2007. As fermentações podem ser realizadas de uma maneira em batelada, alimentação em batelada ou contínua, conforme divulgado aqui. As fermentações também podem ser realizadas em duas fases, se desejado. A primeira fase pode ser aeróbica para permitir alto crescimento e, portanto, alta produtividade, seguida por uma fase anaeróbica de altos rendimentos de um produto desejado, como 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste.

[00125] Se desejado, o pH do meio pode ser mantido em um pH desejado, em particular pH neutro, como um pH em torno de 7 por adição de uma base, como NaOH ou outras bases, ou ácido, como necessário para manter o meio de cultura em um pH desejável. A taxa de proliferação pode ser determinada ao medir densidade óptica ao utilizar um espectrômetro (600 nm) , e a taxa de absorção de glicose ao monitorar depleção de fonte de carbono ao longo do tempo.

[00126] O meio de proliferação pode incluir, por exemplo, qualquer fonte de carboidrato a qual pode fornecer uma fonte de carbono para os micro-organismos de ocorrência não natural. Tais fontes incluem, por exemplo, açúcares como glicose, sacarose, xilose, arabinose, galactose, manose, frutose e amido. Outras fontes de carboidratos incluem, por exemplo, matéria-prima renovável e biomassa. Tipos exemplificativos de biomassas que podem ser usados como matéria-prima nos métodos da invenção incluem biomassa

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99/204 celulósica, biomassa hemicelulósica e matéria prima de lignina ou porções de matéria-prima. Tal matéria-prima de biomassa contém, por exemplo, substratos de carboidrato úteis como fontes de carbono como glicose, sacarose, xilose, arabinose, galactose, manose, frutose e amido. Dado os ensinamentos e diretrizes do presente documento, aqueles versados na técnica entenderão que matérias-primas renováveis e biomassa diferentes daquelas exemplificadas acima também podem ser usadas para cultivar as células da invenção para a expressão de uma aldeido desidrogenase da invenção e, opcionalmente, para produção de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante, como um éster ou amida deste.

[00127] Além de matérias-primas renováveis, como as exemplificadas acima, as células da invenção que produzem 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante, como éster ou amida deste, também pode ser modificado para o crescimento em gás de síntese como sua fonte de carbono. Nesta modalidade específica, uma ou mais proteínas ou enzimas são expressas nos organismos produtores de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO para fornecer uma via metabólica para utilização de gás de síntese ou outra fonte de carbono gasosa.

[00128] O gás de síntese, também conhecido como syngas ou gás produtor, é o produto principal de gaseificação de carvão e de materiais carbonáceos como materiais de biomassa, que inclui colheitas e resíduos de agricultura. O gás de síntese é uma mistura primariamente de

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Η2 e CO e pode ser obtido a partir da gaseificação de quaisquer matérias-primas orgânica, que inclui, mas não limitadas a carvão, óleo de carvão, gás natural, biomassa, e matéria de refugo orgânica. A gaseificação geralmente é realizada sob uma alta razão de combustível para oxigênio. Embora inclua principalmente H2 e CO, o gás de sintese também pode incluir CO2 e outros gases em menores quantidades. Logo, gás de sintese fornece uma fonte de carbono gasoso de custo compensador como CO e, adicionalmente, CO2.

[00129] A via de Wood-Ljungdahl catalisa a conversão de CO e H2 em acetil-CoA e outros produtos como acetato. Os organismos capazes de utilizar CO e gás de sintese geralmente também têm a capacidade de utilizar CO2 e misturas de CO2/H2 através do mesmo conjunto básico de enzimas e transformações abrangidas pela via de WoodLjungdahl. A conversão de CO2 em acetato dependente de H2 por micro-organismos foi reconhecida muito antes de ser revelado que CO também poderia ser utilizado pelos mesmos organismos e que as mesmas trajetórias foram envolvidas. Muitos acetógenos demonstraram proliferar na presença de CO2 e produzir compostos como acetato enquanto hidrogênio está presente para fornecer os equivalentes de redução necessários (consulte, por exemplo, Drake, Acetogenesis, páginas 3 a 60 Chapman e Hall, New York, (1994)) . Isto pode ser resumido pela seguinte equação:

CO₂ + 4 H₂ + n ADP + n Pi CH3COOH + 2 H₂O + η ATP

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Logo, micro-organismo de ocorrência não natural de posse da via de Wood-Ljungdahl também podem utilizar misturas de CO2 e H2 para a produção de acetil-CoA e outros produtos desejados.

[00130] A via de Wood-Ljungdahl é bem conhecida na técnica e consiste em 12 reações que podem ser separadas em dois ramos: (1) ramo metil e (2) ramo carbonil. O ramo metil converte gás de síntese em metil-tetrahidrofolato (metil-THF) dado que o ramo carbonil converte metil-THF em acetil-CoA. As reações no ramo metil são catalisadas em ordem pelas seguintes enzimas ou proteínas: ferredoxina oxidoredutase, formato desidrogenase, formiltetrahidrofolato sintetase, meteniltetrahidrofolato ciclodesidratase, metilenotetrahidrofolato desidrogenase e metilenotetrahidrofolato redutase. As reações no ramo carbonil são catalisadas em ordem pelas seguintes enzimas ou proteínas: metiltetrahidrofolato: proteína metiltransferase corrinoide (por exemplo, AcsE), proteína de ferro-enxofre corrinoide, proteína de acoplagem de níquel-proteína (por exemplo, AcsF), ferredoxina, acetil-CoA sintase, monóxido de carbono desidrogenase e proteína de acoplagem de níquelproteína (por exemplo, C00C) (ver W02009/094485). Segundo os ensinamentos e orientação fornecidos nesta invenção para introduzir um número suficiente de ácido nucleicos codificadores para gerar uma via de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, incluindo um ácido nucleico que codifica uma aldeído desidrogenase da invenção, aqueles

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102/204 versados na técnica entenderão que o mesmo projeto de engenharia também pode ser realizado com relação à introdução de pelo menos os ácidos nucleicos que codificam as enzimas ou proteínas de Wood-Ljungdahl ausentes no organismo hospedeiro. Portanto, a introdução de um ou mais ácidos nucleicos codificadores nas células da invenção, de modo que o organismo modificado contenha a via completa de Wood-Ljungdahl, conferirá capacidade de utilização de gás de síntese.

[00131] Além disso, o ciclo do ácido tricarboxílico redutor (reverso) acoplado às atividades de monóxido de carbono desidrogenase e/ou hidrogenase também pode ser usado para a conversão de CO, CO₂ e/ou H₂ em acetil-CoA e outros produtos, como acetato. Organismos capazes de fixar carbono através da via redutora de TCA podem utilizar uma ou mais das seguintes enzimas: ATP citrato-liase, citrato liase, aconitase, isocitrato desidrogenase, alfa-cetoglutarato: ferredoxina oxidoredutase, succinil-CoA sintetase, succinil-CoA transferase, fumarato redutase, fumarase, malato desidrogenase, NAD(P)H: ferredoxina oxidoredutase, monóxido de carbono desidrogenase e hidrogenase. Especificamente, os equivalentes redutores extraídos de CO e/ou H₂ por monóxido de carbono desidrogenase e hidrogenase são utilizados para fixar CO₂ através do ciclo redutivo de TCA em acetil-CoA ou acetato. O acetato pode ser convertido em acetil-CoA por enzimas como acetil-CoA transferase, acetato cinase/fosfotransacetilase e acetil-CoA sintetase. O acetil

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CoA pode ser convertido em gliceraldeido-3-fosfato, fosfoenolpiruvato e piruvato, por piruvato: ferredoxina oxidoredutase e pelas enzimas da gliconeogênese. O acetilCoA também pode ser convertido em acetoacetil-CoA por, por exemplo, acetoacetil-CoA tiolase para canalizar para uma via 1,3-BDO, como divulgado aqui (ver Figura 1) . Seguindo os ensinamentos e orientações aqui fornecidos para a introdução de um número suficiente de ácidos nucleicos codificadores para gerar uma via de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou via para gerar um produto a jusante relacionados a ele, como um éster ou amida deste, aqueles versados na técnica compreenderão que o mesmo projeto de engenharia também pode ser realizado com relação à introdução de pelo menos os ácidos nucleicos que codificam as enzimas ou proteínas da via redutora de TCA ausentes no organismo hospedeiro. Portanto, a introdução de um ou mais ácidos nucleicos codificadores nas células da invenção pode ser realizada de modo que o organismo modificado contenha uma via redutora de TCA.

[00132] Por conseguinte, dados os ensinamentos e orientações aqui fornecidos, os especialistas na técnica entenderão que uma célula de ocorrência não natural pode ser produzida para produzir e/ou secretar os compostos biossintetizados da invenção quando cultivados em uma fonte de carbono, como um carboidrato. Tais compostos incluem, por exemplo, 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, e qualquer um dos metabólitos intermediários nos 3-HBal, 1,3

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BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO. Tudo o que é necessário é criar uma ou mais atividades enzimáticas ou proteicas necessárias para obter a biossíntese do composto ou intermediário desejado, incluindo, por exemplo, a inclusão de algumas ou de todas as vias biossintéticas do 3-HBal, 1,3-bDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, incluindo uma aldeido desidrogenase da invenção. Por conseguinte, a invenção fornece uma célula de ocorrência não natural que produz e/ou secreta 3-HBal, 1,3BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, quando cultivada em um carboidrato ou outra fonte de carbono e produz e/ou secreta qualquer um dos metabólitos intermediários mostrados na via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO quando cultivada em carboidratos ou outra fonte de carbono. As células que produzem 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a estes, como um éster ou amida deste, da invenção podem iniciar a sintese a partir de um intermediário de uma via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO.

[00133] As células da ocorrência não natural da invenção são construídas usando métodos bem conhecidos na técnica como exemplificado aqui para expressar exogenamente uma aldeido desidrogenase da invenção e, opcionalmente, pelo menos um ácido nucleico que codifica uma enzima ou proteína da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado, como um éster ou amida deste. As enzimas ou proteínas podem ser expressas em quantidades suficientes para produzir 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4

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BDO, ou um produto a jusante relacionado, como um éster ou amida deste. Entende-se que as células da invenção são cultivadas em condições suficientes para expressar uma aldeído desidrogenase da invenção ou produzir 3-HBal, 1,3BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, tal como um éster ou amida deste. Seguindo os ensinamentos e orientações aqui fornecidos, as células não naturais da invenção podem alcançar a biossíntese de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, resultando em concentrações intracelulares entre cerca de 0,1 a 300 mM ou mais, por exemplo, 0,1 a 1,3 M ou superior. Geralmente, a concentração intracelular de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida, está entre cerca de 3 a 150 mM, particularmente entre cerca de 5 a 125 mM e mais particularmente entre 8 a 100 mM, incluindo cerca de 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM ou mais. As concentrações intracelulares entre e acima de cada uma dessas faixas exemplificativas também podem ser alcançadas a partir das células que não ocorrem naturalmente da invenção. Por exemplo, a concentração intracelular de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, pode estar entre cerca de 100 mM e 1,3M, incluindo cerca de 100 mM, 200 mM, 500 mM, 800 mM, 1 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M ou superior.

[00134] Uma célula da invenção é cultivada usando métodos bem conhecidos. As condições de cultura podem

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106/204 incluir, por exemplo, procedimentos de cultura líquida, bem como fermentação e outros procedimentos de cultura em larga escala. Como aqui descrito, rendimentos particularmente úteis dos produtos biossintéticos da invenção podem ser obtidos sob condições de cultura anaeróbica ou substancialmente anaeróbica.

[00135] Em algumas modalidades, condições de cultura incluem proliferação anaeróbica ou substancialmente anaeróbica ou condições de manutenção. Condições anaeróbicas exemplificativas foram descritas previamente e são bem conhecidas na técnica. Condições anaeróbicas exemplificativas para processos de fermentação são descritos neste documento e são descritos, por exemplo, em publicação de n° U.S. 2009/0047719, depositada em 10 de agosto de 2007. Quaisquer dessas condições podem ser empregadas com os organismos microbianos de ocorrência não natural bem como outras condições anaeróbicas bem conhecidas na técnica. Sob tais condições anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas, os produtores de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO podem sintetizar 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, em concentrações intracelulares de 5 a 10 mM ou mais, bem como todas as outras concentrações aqui exemplificadas. Entende-se que, embora a descrição acima se refira a concentrações intracelulares, as células produtoras de 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO podem produzir 3-HBal, 1,3BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, intracelularmente e/ou secretam o produto no meio de cultura.

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[00136] Como descrito aqui, uma condição de crescimento exemplificativa para alcançar a biossíntese de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, inclui cultura anaeróbica ou condições de fermentação. Em certas modalidades, as células de ocorrência não natural da invenção podem ser sustentadas, cultivadas ou fermentadas sob condições anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas. Resumidamente, condições anaeróbicas se referem a um ambiente desprovido de oxigênio. Condições substancialmente anaeróbicas incluem, por exemplo, uma cultura, fermentação em lote ou fermentação continua de forma que a concentração de oxigênio dissolvido no meio permaneça entre 0 e 10% de saturação. Condições substancialmente anaeróbicas também incluem células em proliferação ou em repouso em meio líquido ou em ágar sólido dentro de uma câmara vedada mantida com uma atmosfera de menos do que 1% de oxigênio. A porcentagem de oxigênio pode ser mantida por, por exemplo, espargir a cultura com uma mistura de N2/CO2 ou outro gás sem oxigênio ou gases adequados.

[00137] As condições de cultura descritas aqui podem ser ampliadas e crescidas continuamente para a fabricação de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida, por uma célula da invenção. Procedimentos de crescimento exemplificativos incluem, por exemplo, fermentação em lotes alimentados e separação de lotes; fermentação em lote alimentado e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua. Todos estes

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108/204 processos são bem conhecidos na técnica. Os procedimentos de fermentação são particularmente úteis para a produção biossintética de quantidades comerciais de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado, como um éster ou amida deste. Geralmente, e como nos procedimentos de cultura não contínuos, a produção continua e/ou quase continua de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, incluirá a cultura de uma célula de ocorrência não natural produzindo 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, da invenção em nutrientes e meio suficientes para sustentar e/ou quase sustentar o crescimento em uma fase exponencial. A cultura continua sob tais condições pode incluir, por exemplo, proliferação por 1 dia, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou mais. Adicionalmente, a cultura continua pode incluir periodos de tempo mais longos de 1 semana, 2, 3, 4 ou 5 ou mais semanas e até diversos meses. Alternativamente, organismos da invenção podem ser cultivados por horas, se adequado para uma aplicação particular. Deve ser entendido que as condições de cultura continuas e/ou quase continuas também podem incluir todos os intervalos de tempo entre esses periodos exemplificativos. É ainda entendido que o tempo de cultivar o organismo microbiano da invenção é por um periodo de tempo suficiente para produzir uma quantidade de produto suficiente para um propósito desejado.

[00138] Processos de fermentação exemplificativos incluem, mas não estão limitados a

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109/204 fermentação em lote alimentado e separação de lote; fermentação em lote alimentado e separação continua; e fermentação continua e separação continua. Em um exemplo de protocolo de fermentação em lote, o organismo de produção é cultivado em um biorreator de tamanho adequado, pulverizado com um gás apropriado. Sob condições anaeróbicas, a cultura é pulverizada com um gás inerte ou uma combinação de gases, por exemplo, nitrogênio, mistura N2/CO2, argônio, hélio e similares. À medida que as células crescem e utilizam a fonte de carbono, fontes adicionais de carbono e/ou outros nutrientes são alimentados no biorreator a uma taxa que equilibra aproximadamente o consumo da fonte de carbono e/ou nutrientes. A temperatura do biorreator é mantida a uma temperatura desejada, geralmente na faixa de 22 a 37 °C, mas a temperatura pode ser mantida em uma temperatura mais alta ou mais baixa, dependendo das características de crescimento do organismo de produção e/ou condições desejadas para o processo de fermentação. O crescimento continuo por um periodo de tempo desejado para atingir as características desejadas da cultura no fermentador, por exemplo, densidade celular, concentração do produto e similares. Em um processo de fermentação em lote, o periodo de fermentação geralmente varia de algumas horas a vários dias, por exemplo, 8 a 24 horas ou 1, 2, 3, 4 ou 5 dias ou até uma semana, dependendo das condições de cultura desejadas. O pH pode ser controlado ou não, conforme desejado, caso em que uma cultura na qual o pH não é controlado diminuirá tipicamente para pH 3 a 6 no final da execução. Após a conclusão do periodo de cultivo, o

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110/204 conteúdo do fermentador pode ser passado através de uma unidade de separação de células, por exemplo, uma centrífuga, unidade de filtração e similares, para remover células e resíduos celulares. No caso em que o produto desejado é expresso intracelularmente, as células podem ser lisadas ou rompidas enzimática ou quimicamente antes ou após a separação das células do caldo de fermentação, conforme desejado, a fim de liberar produto adicional. O caldo de fermentação pode ser transferido para uma unidade de separação de produtos. O isolamento do produto ocorre por procedimentos de separação padrões empregados na técnica para separar um produto desejado das soluções aquosas diluídas. Tais métodos incluem, entre outros, extração líquido-líquido usando um solvente orgânico imiscível com água (por exemplo, tolueno ou outros solventes adequados, incluindo, entre outros, éter dietílico, acetato de etila, tetra-hidrofurano (THF), cloreto de metileno, clorofórmio, benzeno, pentano, hexano, heptano, éter de petróleo, éter metil-terciário-butílico (MTBE), dioxano, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) e similares) para fornecer uma solução orgânica do produto, se apropriado, destilação padrão métodos e similares, dependendo das características químicas do produto do processo de fermentação.

[00139] Em um exemplo de protocolo de fermentação totalmente contínuo, o organismo de produção é geralmente primeiro cultivado em modo descontínuo, a fim de atingir a densidade celular desejada. Quando a fonte de carbono e/ou outros nutrientes são esgotados, o meio de

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111/204 alimentação da mesma composição é fornecido continuamente a uma taxa desejada e o liquido de fermentação é retirado na mesma taxa. Sob tais condições, a concentração do produto no biorreator geralmente permanece constante, assim como a densidade celular. A temperatura do fermentador é mantida a uma temperatura desejada, como discutido acima. Durante a fase de fermentação continua, é geralmente desejável manter uma faixa de pH adequada para produção otimizada. O pH pode ser monitorado e mantido usando métodos de rotina, incluindo a adição de ácidos ou bases adequados para manter uma faixa de pH desejada. O biorreator é operado continuamente por longos períodos de tempo, geralmente pelo menos uma semana a várias semanas e até um mês, ou mais, conforme apropriado e desejado. O líquido de fermentação e/ou a cultura são monitorados periodicamente, incluindo amostragem até todos os dias, conforme desejado, para garantir a consistência da concentração do produto e/ou densidade celular. No modo contínuo, o conteúdo do fermentador é removido constantemente à medida que o novo meio de alimentação é fornecido. A corrente de saída, contendo células, meio e produto, geralmente é submetida a um procedimento contínuo de separação de produtos, com ou sem remoção de células e resíduos celulares, conforme desejado. Os métodos de separação contínua empregados na técnica podem ser usados para separar o produto de soluções aquosas diluídas, incluindo, mas não se limitando à extração líquido-líquido contínua usando um solvente orgânico imiscível com água (por exemplo, tolueno ou outros solventes adequados, incluindo

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112/204 mas não limitado a dietil éter, acetato de etila, tetrahidrofurano (THF), cloreto de metileno, clorofórmio, benzeno, pentano, hexano, heptano, éter de petróleo, éter metil terciário-butílico (MTBE), dioxano, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) e semelhantes), métodos padrão de destilação contínua e similares, ou outros métodos bem conhecidos na técnica.

[00140] Os procedimentos de fermentação são bem conhecidos na técnica. Resumidamente, a fermentação para a produção biossintética de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, pode ser utilizada, por exemplo, fermentação de lote alimentado e separação de lote; fermentação em lote alimentado e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua. Exemplos de procedimentos de fermentação contínua e descontínua são bem conhecidos na técnica e aqui descritos.

[00141] Além dos procedimentos de fermentação aqui descritos, utilizando os produtores de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, da invenção para produção contínua de quantidades substanciais de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, 3-HBal,

1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida, os produtores também podem ser, por exemplo, simultaneamente sujeitos a síntese química e/ou procedimentos enzimáticos para converter o produto em outros compostos, ou o produto pode

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113/204 ser separado da cultura de fermentação e submetido sequencialmente a conversão química e/ou enzimática para converter o produto em outros compostos, se desejado.

[00142] Além das condições de cultura e fermentação aqui divulgadas, condição de crescimento para alcançar a expressão de uma aldeido desidrogenase da invenção ou biossíntese de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, pode incluir a adição de um osmoprotetor às condições de cultura. Em determinadas modalidades, os organismos microbianos de ocorrência não natural da invenção podem ser sustentados, cultivados ou fermentados como descrito neste documento na presença de um osmoprotetor. Brevemente, um osmoprotetor se refere a um composto que age como um osmólito e ajuda um organismo microbiano como descrito neste documento a sobreviver ao estresse osmótico. Osmoprotetores incluem, mas não estão limitados a, betaínas, aminoácidos e o açúcar trealose. Exemplos não limitantes dos mesmos são glicina betaína, pralina betaína, dimetiltetina, dimetilslfonioproprionato, 3-dimetilsulfônio-2-metilproprionato, ácido pipecólico, dimetilsulfônioacetato, colina, L-carnitina e ectoína. Em um aspecto, o osmoprotetor é glicina betaína. É entendido a elementos versados na técnica que a quantidade e tipo de osmoprotetor adequado para proteger um organismo microbiano descrito neste documento de estresse osmótico dependerão do organismo microbiano usado. A quantidade de osmoprotetor nas condições de cultivo pode ser, por exemplo, não mais do que cerca de 0,1 mM, não mais do que cerca de 0,5 mM, não mais

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114/204 do que cerca de 1,0 mM, não mais do que cerca de 1,5 mM, não mais do que cerca de 2,0 mM, não mais do que cerca de 2,5 mM, não mais do que cerca de 3,0 mM, não mais do que cerca de 5,0 mM, não mais do que cerca de 7,0 mM, não mais do que cerca de 10 mM, não mais do que cerca de 50 mM, não mais do que cerca de 100 mM ou não mais do que cerca de 500 mM.

[00143] Em algumas modalidades, a matéria-prima de carbono e outras fontes de captação celular, como fosfato, amônia, sulfato, cloreto e outros halogênios, podem ser escolhidas para alterar a distribuição isotópica dos átomos presentes em 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou qualquer intermediário da via 3-HBal, 1,3BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO. As várias matérias-primas de carbono e outras fontes de captação enumeradas acima serão referidas aqui coletivamente como fontes de captação. As fontes de captação podem fornecer enriquecimento isotópico para qualquer átomo presente no produto 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou para produtos secundários gerados em reações divergindo das vias 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO. O enriquecimento isotópico pode ser alcançado para qualquer átomo alvo, incluindo, por exemplo, carbono, hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo, cloreto ou outros halogênios.

[00144] Em algumas modalidades, as fontes de captação podem ser selecionadas para alterar as proporções

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115/204 carbono-12, carbono-13 e carbono-14. Em algumas modalidades, as fontes de captação podem ser selecionadas para alterar as proporções oxigênio-16, oxigênio-17 e oxigênio-18. Em algumas modalidades, as fontes de captação podem ser selecionadas para alterar as proporções de hidrogênio, deutério e trítio. Em algumas modalidades, as fontes de captação podem ser selecionadas para alterar as razões nitrogênio-14 e nitrogênio-15. Em algumas modalidades, as fontes de captação podem ser selecionadas para alterar as proporções enxofre-32, enxofre-33, enxofre-34 e enxofre-35. Em algumas modalidades, as fontes de captação podem ser selecionadas para alterar as proporções de fósforo-31, fósforo-32 e fósforo-33. Em algumas modalidades, as fontes de captação podem ser selecionadas para alterar as proporções de cloro-35, cloro-36 e cloro-37.

[00145] Em algumas modalidades, a proporção isotópica de um átomo alvo pode ser variada para uma proporção desejada, selecionando uma ou mais fontes de absorção. Uma fonte de captação pode ser derivada de uma fonte natural, como encontrada na natureza, ou de uma fonte feita pelo homem, e um versado na técnica pode selecionar uma fonte natural, uma fonte feita pelo homem ou uma combinação desta, para obter uma razão isotópica desejada de um átomo alvo. Um exemplo de uma fonte de captação feita pelo homem inclui, por exemplo, uma fonte de captação que é pelo menos parcialmente derivada de uma reação química sintética. Tais fontes de captação isotopicamente enriquecidas podem ser adquiridas comercialmente ou

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116/204 preparadas em laboratório e/ou opcionalmente misturadas com uma fonte natural da fonte de captação para atingir uma proporção isotópica desejada. Em algumas modalidades, uma razão isotópica de átomo alvo de uma fonte de captação pode ser alcançada selecionando uma origem desejada da fonte de captação como encontrada na natureza. Por exemplo, como discutido aqui, uma fonte natural pode ser uma fonte de base biológica derivada ou sintetizada por um organismo biológico ou uma fonte como produtos à base de petróleo ou a atmosfera. Em algumas dessas modalidades, uma fonte de carbono, por exemplo, pode ser selecionada a partir de uma fonte de carbono derivada de combustível fóssil, que pode ser relativamente esgotada de carbono-14 ou de uma fonte de carbono ambiental ou atmosférica, como o CO2, que pode possuir uma quantidade maior de carbono-14 do que seu equivalente derivado do petróleo.

[00146] O isótopo de carbono instável carbono-14 ou radiocarbono compõe aproximadamente 1 em 1012 átomos de carbono na atmosfera da Terra e tem uma meia-vida de cerca de 5700 anos. O estoque de carbono é reabastecido na atmosfera superior por uma reação nuclear envolvendo raios cósmicos e nitrogênio comum (14N). Os combustíveis fósseis não contêm carbono-14, como se deteriorou há muito tempo. A queima de combustíveis fósseis reduz a fração atmosférica de carbono-14, o chamado efeito Suess.

[00147] Os métodos para determinar as razões isotópicas de átomos em um composto são bem conhecidos dos especialistas na técnica. O enriquecimento isotópico é

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117/204 prontamente avaliado por espectrometria de massa usando técnicas conhecidas na técnica, como espectrometria de massa acelerada (AMS), espectrometria de massa com razão de isótopos estáveis (SIRMS) e fracionamento isotópico natural específico do local por ressonância magnética nuclear (SNIFNMR). Tais técnicas espectrais de massa podem ser integradas com técnicas de separação, tais como cromatografia líquida (LC) , cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e/ou cromatografia gasosa, e similares.

[00148] No caso do carbono, o ASTM D6866 foi desenvolvido nos Estados Unidos como um método analítico padronizado para determinar o conteúdo de base biológica de amostras sólidas, líquidas e gasosas usando datação por radiocarbono pela Sociedade Americana de Testes de Materiais (ASTM) Internacional. A norma é baseada no uso de datação por radiocarbono para a determinação do conteúdo de base biológica de um produto. O ASTM D6866 foi publicado pela primeira vez em 2004, e a versão ativa atual do padrão é ASTM D6866-11 (a partir de I^o de abril de 2011) . As técnicas de datação por radiocarbono são bem conhecidas dos especialistas na técnica, incluindo as aqui descritas.

[00149] O teor de base biológica de um composto é estimado pela razão entre o carbono-14 (¹⁴C) e o carbono12 (¹²C). Especificamente, a Fração Moderna (Fm) é calculada a partir da expressão: Fm = (S-B) / (M-B) , onde B, S e M representam as proporções 14^c/12^c do branco, da amostra e da referência moderna, respectivamente. Fraction Modern é uma medida do desvio da proporção 14^c/12^c de uma amostra de

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Modern. Modern é definido como 95% da concentração de radiocarbono (em 1950 dC) do Ácido Oxálico I do Bureau Nacional de Padrões (NBS) (isto é, materiais de referência padrão (SRM) 4990b) normalizados para õ¹³Cvpdb = -19 por mil (Olsson, The use of Oxalic acid as a Standard, in, Radiocarbon

Variations and Absolute Chronology, Nobel Symposium, 12th Proc., John Wiley & Sons, New York (1970) ) . Os resultados da espectrometria de massa, por exemplo, medidos por ASM, são calculados usando a definição acordada internacionalmente de 0,95 vezes a atividade especifica do Ácido Oxálico I (NBS) (SRM 4990b) normalizado para õ¹³Cvpdb = -19 por mil. Isto é equivalente a uma razão 14^c/12^c absoluta (AD 1950) de 1,176 ± 0,010 x 10-12 (Karlen et al., Arkiv Geofysik, 4:465-471 (1968) ) . Os cálculos padrão levam em consideração a captação diferencial de um isótopo em relação a outro, por exemplo, a captação preferencial em sistemas biológicos de C¹² sobre C¹³sobre C¹⁴, e essas correções são refletidas como uma Fm corrigida para δ¹³.

[00150] Um padrão de ácido oxálico (SRM 4990b ou HOx 1) foi feito a partir de uma colheita de beterraba sacarina de 1955. Embora houvesse 1000 libras, este padrão de ácido oxálico não está mais disponível comercialmente. O padrão Ácido Oxálico II (H0x2; designação N.I.S.T SRM 4990 C) foi feito a partir de uma colheita de melaço de beterraba francesa de 1977. No inicio dos anos 80, um grupo de 12 laboratórios mediu as proporções dos dois padrões. A razão da atividade do Ácido Oxálico II para 1 é 1,2933 ± 0,001 (a média ponderada). A proporção isotópica de HOx II é de -17,8

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119/204 por mil. A norma ASTM D6866-11 sugere o uso do Ácido Oxálico II padrão disponivel SRM 4990 C (Hox2) para o padrão moderno (consulte a discussão sobre os padrões originais versus os disponíveis no momento, em Mann, Radiocarbon, 25(2):519-527 (1983) ) . Um Fm = 0% representa toda a falta de átomos de carbono-14 em um material, indicando assim uma fonte de carbono fóssil (por exemplo, à base de petróleo) . Um Fm = 100%, após a correção da injeção de carbono 14 após a década de 1950 na atmosfera a partir de testes de bombas nucleares, indica uma fonte de carbono totalmente moderna. Conforme descrito aqui, essa fonte moderna inclui fontes de base biológica.

[00151] Conforme descrito na ASTM D6866, a porcentagem de carbono moderno (pMC) pode ser superior a 100% devido aos efeitos contínuos, mas decrescentes, dos programas de testes nucleares da década de 1950, que resultaram em um enriquecimento considerável de carbono-14 na atmosfera, conforme descrito na ASTM D6866-11. Como todas as atividades de amostra de carbono-14 são referenciadas a um padrão pré-bomba e porque quase todos os novos produtos de base biológica são produzidos em um ambiente pós-bomba, todos os valores de pMC (após correção da fração isotópica) devem ser multiplicados por 0,95 (a partir de 2010) para refletir melhor o verdadeiro conteúdo de base biológica da amostra. Um conteúdo de base biológica superior a 103% sugere que ocorreu um erro analítico ou que a fonte de carbono de base biológica tem mais de vários anos.

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[00152] A norma ASTM D6866 quantifica o conteúdo de base biológica em relação ao conteúdo orgânico total do material e não considera o carbono inorgânico e outras substâncias que não contêm carbonos presentes. Por exemplo, um produto que é 50% de material à base de amido e 50% de água seria considerado com um conteúdo de base biológica = 100% (50% de conteúdo orgânico 100% de base biológica) com base na ASTM D68 66. Em outro exemplo, um produto que é 50% de material à base de amido, 25% à base de petróleo e 25% de água teria um conteúdo de base biológica = 66,7% (75% de conteúdo orgânico, mas apenas 50% do produto é de base biológica). Em outro exemplo, um produto com 50% de carbono orgânico e um produto à base de petróleo seria considerado com um conteúdo de base biológica = 0% (50% de carbono orgânico, mas proveniente de fontes fósseis). Assim, com base nos métodos e padrões conhecidos para determinar o conteúdo de base biológica de um composto ou material, um especialista na técnica pode determinar rapidamente o conteúdo de base biológica de um composto ou material e/ou produtos a jusante preparados que utilizam um composto ou material da invenção tendo um conteúdo de base biológica desejado.

[00153] As aplicações das técnicas de datação por carbono-14 para quantificar o conteúdo de materiais de base biológica são conhecidas na técnica (Currie et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 172: 281-287 (2000)) . Por exemplo, a datação por carbono 14 foi usada para quantificar o conteúdo de base biológica em

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121/204 materiais contendo tereftalato (Colonna et al., Green Chemistry, 13: 2543-2548 (2011)) . Notavelmente, os polímeros de polipropileno tereftalato (PPT) derivados de 1,3propanodiol renovável e ácido tereftálico derivado de petróleo resultaram em valores de Fm próximos a 30% (ou seja, já que 3/11 do carbono polimérico deriva de 1,3propanodiol renovável e 8/11 do ácido tereftálico do elemento final fóssil) (Currie et al., Supra, 2000) . Por outro lado, o polímero de tereftalato de polibutileno derivado de 1,4-butanodiol renovável e ácido tereftálico renovável resultou em conteúdo de base biológica superior a 90% (Colonna et al., Supra, 2011) .

[00154] Por conseguinte, em algumas modalidades, a presente invenção fornece 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário da via de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, produzido por uma célula da invenção, que possui uma proporção de carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que reflete um carbono atmosférico, também referido como carbono ambiental, fonte de absorção. Por exemplo, em alguns aspectos, 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um 3-HBal, 1,3-BDO, intermediário da via 4-HBal ou 1,4-BDO pode ter um valor de Fm de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos

45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%,

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122/204 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou até 100%. Em algumas dessas modalidades, a fonte de captação é CO2. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário da via de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4BDO que possui uma proporção de carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que reflete a fonte de captação de carbono baseada em petróleo. Nesse aspecto, 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO pode ter um valor de Fm menor que 95%, menor que 90%, menor que 85%, menor que 80%, menor que 75%, menor que 70%, menor que 65%, menor que 60%, menor que 55%, menor que 50%, menor que 45%, menor que 40%, menor que 35%, menor que 30%, menor que 25%, menor que 20%, menor que 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 2% ou menos de 1%. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário da via de 3-HBal, 1, 3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO que possui uma proporção de carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que é obtida por uma combinação de uma fonte de captação atmosférica de carbono com uma fonte de captação baseada em petróleo. Usar essa combinação de fontes de captação é uma maneira pela qual a proporção de carbono-12, carbono-13 e carbono-14 pode ser variada, e as respectivas proporções refletiriam as proporções das fontes de captação.

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[00155] Além disso, a presente invenção se refere ao 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO produzido biologicamente ou a um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário da via 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, conforme divulgado neste documento, e aos produtos derivados destes, em que 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO possui uma relação isotópica carbono-12, carbono-13 e carbono-14 de aproximadamente o mesmo valor que o CO2 que ocorre no ambiente. Por exemplo, em alguns aspectos, a invenção fornece 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário da via 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado com uma proporção de isótopos carbono-12 versus carbono-13 versus carbono-14 com aproximadamente o mesmo valor que o CO2 que ocorre no ambiente ou qualquer uma das proporções aqui divulgadas. Entende-se, como divulgado neste documento, que um produto pode ter uma proporção de isótopos carbono-12 versus carbono-13 versus carbono-14 com aproximadamente o mesmo valor que o CO2 que ocorre no ambiente ou qualquer uma das razões aqui divulgadas, em que o produto é gerado a partir de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO bioderivado, conforme divulgado aqui, em que

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124/204 o produto bioderivado é quimicamente modificado para gerar um produto final. Métodos de modificação química de um produto bioderivado de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário de um 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO, para gerar um produto desejado são bem conhecidos dos especialistas na técnica, como aqui descrito. A invenção também fornece plásticos, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, náilon, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, produtos à base de butadieno e/ou butadieno, que podem ser baseados em 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, e plásticos, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4-hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano-poliureia, chamados fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons e similares, que podem ser baseados em 4-HBal e/ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, com uma proporção de isótopo carbono-12 versus carbono-13 versus carbono-14 com aproximadamente o mesmo valor que o CO2 que ocorre no ambiente equipamento, em que os plásticos, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4hidroxibutirato (P4HB) ou seus copolímeros, poli (éter

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125/204 tetrametileno) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, óxido de politetrametileno) , tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, butadieno e/ou produtos à base de butadieno são gerados diretamente a partir de ou em combinação com 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um intermediário da via 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, como aqui divulgado. Os métodos para a produção de butadieno e/ou produtos à base de butadieno foram descritos anteriormente (ver, por exemplo, WO 2010/127319, WO 2013/036764, Patente US No. 9.017.983, US 2013/00 66035, WO/2012/018624, US 2012/0021478, cada um dos quais é incorporado aqui por referência). 1,3-BDO pode reagir com um ácido, in vivo ou in vitro, para converter em um éster usando, por exemplo, uma lipase. Esses ésteres podem ter usos nutracêuticos, farmacêuticos e alimentares, e são vantajosos quando a forma R do 1,3-BDO é usada, uma vez que é a forma (comparada à forma S ou à mistura racêmica) mais utilizada por animais e humanos como uma fonte de energia (por exemplo, um éster de cetona, como monoéster de (R)-3-hidroxibutil-R-1, 3butanodiol (que possui a aprovação nos Estados Unidos pela (GRAS) e glicerol monoéster ou diéster de (R)-3hidroxibutirato). Os ésteres de cetona podem ser administrados por via oral, e o éster libera R-1,3Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 461/565

126/204 butanodiol que é usado pelo organismo (ver, por exemplo, W02013150153). Os métodos de produção de amidas são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Goswami e Van Lanen, Mol. Biosyst. 11 (2) : 338-353 (2015)) .

[00156] Assim, a presente invenção é particularmente útil para fornecer uma rota enzimática e um micro-organismo aprimorados para fornecer uma composição aprimorada de 1,3-BDO, ou seja, R-l,3-butanodiol, altamente enriquecido ou essencialmente enantiomericamente puro e com qualidades de pureza aprimoradas em relação aos subprodutos. O 1,3-BDO tem outros usos relacionados a alimentos, incluindo o uso diretamente como fonte de alimento, ingrediente alimentar, agente aromatizante, solvente ou solubilizador de agentes aromatizantes, estabilizador, emulsificante e agente e conservante antimicrobiano. O 1,3BDO é utilizado na indústria farmacêutica como solvente de medicamento parenteral. O 1,3-BDO encontra uso em cosméticos como um ingrediente emoliente, umectante, que impede a cristalização de ingredientes insolúveis, um solubilizador para ingredientes menos solúveis em água, como fragrâncias, e como agente e conservante antimicrobiano. Por exemplo, este pode ser usado como umectante, especialmente em sprays de cabelo e loções para fixação; reduz a perda de aromas dos óleos essenciais, preserva contra a deterioração por microorganismo e é usado como solvente para benzoatos. O 1,3-BDO pode ser usado em concentrações de 0,1% a 50% e até menos de 0,1% e até mais de 50%. É usado em produtos para cabelos e banho, maquiagem para os olhos e o rosto, fragrâncias,

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127/204 produtos de limpeza pessoal e preparações para barbear e para a pele (consulte, por exemplo, o relatório da diretoria de Revisão de Ingredientes Cosméticos: Final Report on the Safety Assessment of Butylene Glycol, Hexylene Glycol, Ethoxydiglycol, and Dipropylene Glycol, Journal of the American College of Toxicology, Volume 4, Número 5, 1985, que é aqui incorporado por referência). Este relatório fornece usos e concentrações especificas de 1,3-BDO em cosméticos; veja, por exemplo, a tabela 2 do relatório com o titulo Dados de formulação do produto.

[00157] Em uma modalidade, a invenção fornece um meio de cultura compreendendo 3-HBal e/ou 1,3-BDO bioderivado ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, em que 3-HBal e/ou 1,3BDO bioderivado, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, tem uma proporção de isótopos carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que reflete uma fonte de absorção de dióxido de carbono na atmosfera e em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO bioderivado ou 4-HBal e/ou 1,4BDO são produzidos por uma célula, ou em um Usado celular, da invenção ou um método da invenção. Em uma modalidade, o meio de cultura é separado da célula.

[00158] Em uma modalidade, a invenção fornece 3hidroxibutiraldeido (3-HBal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-BDO) ou 4-hidroxibutiraldeido (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4BDO), tendo uma razão de isótopos carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que reflete uma fonte de absorção de dióxido de carbono na atmosfera, em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO ou o 4-HBal e/ou 1,4-BDO, é produzido por uma célula, ou em um Usado celular, da invenção ou um método da invenção. Em uma

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128/204 modalidade, o 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou o 4-HBal e/ou 1,4-BDO, tem um valor de Fm de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

[00159] Em uma modalidade, a invenção fornece 3hidroxibutiraldeído (3-HBal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-BDO) ou 4-hidroxibutiraldeído (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4BDO) , produzido por uma célula, ou em um lisado celular da invenção ou em um método da invenção. Em uma modalidade, a invenção fornece 3-hidroxibutiraldeído (3-HBal) e/ou 1,3butanodiol (1,3-BDO) com uma proporção de isótopos carbono12, carbono-13 e carbono-14 que reflete um carbono atmosférico fonte de captação de dióxido, em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO é produzido por uma célula, ou em um lisado celular, da invenção ou um método da invenção, em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO é enriquecido enantiomericamente para a forma R. Em uma modalidade, o 3-HBal e/ou 1,3-BDO tem um valor de Fm de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

[00160] Em uma modalidade, a invenção fornece 3hidroxibutiraldeído (3-HBal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-BDO) produzido por uma célula ou em um lisado celular da invenção ou um método da invenção, em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO é enantiomericamente enriquecido para a forma R. Em uma modalidade, a forma R é maior que 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% do 3-HBal e/ou 1,3-BDO. Em uma modalidade, o 3-HBal e/ou 1,3-BDO é 155% de enantiômero R, 160% de enantiômero R, 165% de enantiômero R, 170%, enantiômero R, 1 75% de

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129/204 enantiômero, 1 80% de enantiômero, 185% de enantiômero, 1 90% de enantiômero, ou 195% de enantiômero, ou 195% de enantiômero, e pode ser bastante puro quimicamente, por exemplo, 1 99%, por exemplo, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 199,1%, 199,2%, 199,3%, 199,4%, 199,5%, 199,6%, 199,7%, 199,8% ou 199,9% enantiômero R.

[00161] Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição compreendendo 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou o 4HBal e/ou 1,4-BDO, produzido por uma célula, ou em um lisado celular, da invenção ou um método da invenção e um composto diferente de 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal ou 1,4-BDO, respectivamente. Em uma modalidade, o composto que não seja o 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou o 4-HBal e/ou 1,4-BDO, é uma porção de uma célula que produz o 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou o 4-HBal e/ou 1,4-BDO, respectivamente, ou que expressa um polipeptídeo da invenção.

[00162] Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição compreendendo 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou o 4HBal e/ou 1,4-BDO, produzido por uma célula, ou em um lisado celular, da invenção ou um método da invenção, ou um lisado celular ou sobrenadante da cultura de uma célula que produz o 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou o 4-HBal e/ou 1,4-BDO.

[00163] Em uma modalidade, a invenção fornece um produto que compreende 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou o 4-HBal e/ou 1,4-BDO, produzido por uma célula ou em um lisado celular da invenção ou um método da invenção, em que o produto é um plástico, fibra elástica, poliuretano, poliéster, polihidroxialcanoato, poli-4-hidroxibutirato (P4HB) ou um

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130/204 copolímero deste, poli (éter tetrametileno) glicol (PTMEG) , tereftalato de polibutileno (PBT), copolímero de poliuretano-poliureia, náilon, solvente orgânico, resina de poliuretano, resina de poliéster, agente hipoglicêmico, produto à base de butadieno ou butadieno. Em uma modalidade, o produto é um produto cosmético ou um aditivo alimentar. Em uma modalidade, o produto compreende pelo menos 0,1%, pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% de 3-HBal e/ou 1,3-BDO bioderivado ou 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado. Em uma modalidade, o produto compreende uma porção do 3-HBal e/ou 1,3-BDO produzido, ou o 4-HBal e/ou 1,4-BDO produzido, como uma unidade de repetição. Em uma modalidade, a invenção fornece um produto moldado obtido pela moldagem de um produto fabricado com ou derivado de 3HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO produzido por uma célula, ou em um lisado celular da invenção ou em um método da invenção.

[00164] A invenção fornece ainda uma composição compreendendo 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, e um composto diferente do 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado, como um éster ou amida deste. O composto diferente do produto bioderivado pode ser uma porção celular, por exemplo, uma quantidade vestigial de uma porção celular de, ou pode ser um caldo de fermentação ou meio de cultura ou uma fração purificada ou parcialmente

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131/204 purificada produzida na presença de uma célula não natural da invenção que possui uma via que produz 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste. A composição pode compreender, por exemplo, um nível reduzido de um subproduto quando produzido por um organismo com formação reduzida de subproduto, como divulgado neste documento. A composição pode compreender, por exemplo, 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou um lisado celular ou sobrenadante da cultura de uma célula da invenção.

[00165] 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida, é um produto químico usado em aplicações comerciais e industriais. Exemplos não limitativos de tais aplicações incluem a produção de plásticos, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4-hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também referido como como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, produtos à base de butadieno e/ou butadieno. Além disso, 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO também é usado como matéria-prima na produção de uma ampla gama de produtos, incluindo plásticos, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli

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132/204 hidroxialcanoatos, tais como poli-4-hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano e poliureia, como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilon, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, butadieno e/ou produtos à base de butadieno. Por conseguinte, em algumas modalidades, a invenção fornece plásticos de base biológica, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros dos mesmos, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também referido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, produtos à base de butadieno e/ou butadieno compreendendo um ou mais 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-Hbal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, produzido por uma célula de ocorrência não natural da invenção, por exemplo, expressando uma alderdo desidrogenase da invenção ou produzido usando um método aqui divulgado.

[00166] Como aqui utilizado, o termo bioderivado significa derivado ou sintetizado por um organismo biológico e pode ser considerado um recurso

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133/204 renovável, uma vez que pode ser gerado por um organismo biológico. Esse organismo biológico, em particular as células da invenção aqui divulgada, pode utilizar matériaprima ou biomassa, como açúcares ou carboidratos obtidos de uma fonte agrícola, vegetal, bacteriana ou animal. Alternativamente, o organismo biológico pode utilizar carbono atmosférico. Como aqui utilizado, o termo base biológica significa um produto como descrito acima que é composto, no todo ou em parte, de um composto bioderivado da invenção. Um produto de base biológica ou bioderivada está em contraste com um produto derivado de petróleo, em que esse produto é derivado ou sintetizado a partir de petróleo ou de uma matéria-prima petroquímica.

[00167] Em algumas modalidades, a invenção fornece plásticos, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros dos mesmos, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, butadieno e/ou produtos à base de butadieno compreendendo 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, tal como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, em que 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um

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134/204 produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado inclui todo ou parte do 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO usado na produção de plásticos, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e poliuretano-poliuretano copolímeros, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilon, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, butadieno e/ou produtos à base de butadieno. Por exemplo, os plásticos finais, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo polihidroxialcanoatos, como poli-4-hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros, poli (tetrametileno éter) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, produtos à base de butadieno e/ou butadieno 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou

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135/204 uma porção deste que é o resultado da fabricação de plásticos, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4hidroxibutirato (P4HB) ou copolimeros, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, politetram óxido de etileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolimeros de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, produtos à base de butadieno e/ou butadieno. Tal fabricação pode incluir reagir quimicamente o 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado (por exemplo, conversão quimica, funcionalização quimica, acoplamento quimico, oxidação, redução, polimerização, copolimerização e similares) nos plásticos finais, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4hidroxibutirato (P4HB) ou copolimeros, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolimeros de poliuretano-poliureia como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, produtos à base de butadieno e/ou butadieno. Assim, em alguns aspectos, a invenção fornece um plástico de base biológica, fibra elástica, poliuretano, poliéster,

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136/204 incluindo poli-hidroxialcanoato, como poli-4-hidroxibutirato (P4HB) ou seus copolímeros, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também referido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímero de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilon, resina de poliuretano, resina de poliéster, agente hipoglicêmico, butadieno e/ou produto à base de butadieno compreendendo pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos

30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de 3-HBal, 1,3-BDO,

4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, como aqui divulgado.

[00168] Além disso, em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição com um 3-HBal, 1,3-BDO, 4HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO divulgado aqui e um composto diferente do 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO. Por exemplo, em alguns aspectos, a invenção fornece plásticos de base biológica, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres,

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137/204 incluindo poli-hidroxialcanoatos como poli-4-hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros dos mesmos, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG) (também referido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, à base de butadieno e/ou butadieno produtos em que 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO usado em sua produção é uma combinação de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, derivado de petróleo e bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO. Por exemplo, plásticos de base biológica, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros, poli (tetrametileno éter) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, butadieno e/ou produtos à base de butadieno podem ser produzidos usando 50% de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, tal como um éster ou amida deste, e 50% de 3-HBal,

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1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO derivado de petróleo ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou outras proporções desejadas, como 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 90%/10%, 95%/5%, 100%/0%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90% de precursores bioderivados/ derivados de petróleo, desde que pelo menos uma porção do produto compreenda um produto bioderivado produzido pelas células aqui divulgadas. Entende-se que métodos para a produção de plásticos, fibras elásticas, poliuretanos, poliésteres, incluindo poli-hidroxialcanoatos, como poli-4hidroxibutirato (P4HB) ou copolímeros, poli (tetrametileno éter) glicol (PTMEG) (também conhecido como PTMO, óxido de politetrametileno), tereftalato de polibutileno (PBT) e copolímeros de poliuretano-poliureia, referidos como fibra elástica, elastano ou Lycra™, náilons, solventes orgânicos, resinas de poliuretano, resinas de poliéster, resinas de poliéster, agentes hipoglicêmicos, butadieno e/ou produtos à base de butadieno 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, ou intermediário da via 3HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO bioderivado da invenção é bem conhecido na técnica.

[00169] Para gerar melhores produtores, a modelagem metabólica pode ser utilizada para aperfeiçoar condições de crescimento. A modelagem pode também ser usada para modificar genes knockouts que adicionalmente aperfeiçoam a utilização da via (vide, por exemplo, Publicações de Pedidos de Patente Norte-Americanos U.S.

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2002/0012939, U.S. 2003/0224363, U.S. 2004/0029149, U.S. 2004/0072723, U.S. 2003/0059792, U.S. 2002/0168654 e U.S. 2004/0009466 e a Patente U.S. 7,127,379) . A análise de modelagem permite previsões confiáveis dos efeitos sobre o crescimento celular de deslocamento do metabolismo em direção à produção mais eficiente de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, tal como um éster ou amida deste.

[00170] Um método computacional para identificar e planejar alterações metabólicas que favorecem biossintese de um produto desejado é o esquema computacional OptKnock (Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)). OptKnock é uma modelagem metabólica e programa de simulação que sugere deleção de gene ou estratégias de ruptura que resulta em micro-organismos geneticamente estáveis que produzem demais o produto de destino. Especificamente, o esquema examina a rede de metabólica e/ou de bioquímicos completa de um micro-organismo para sugerir manipulações genéticas que forçam os bioquímicos desejados a se tornarem um subproduto obrigatório de crescimento de célula. Por acoplar produção bioquímica com crescimento de célula através de deleções de gene instaladas estrategicamente ou outra ruptura funcional de gene, as pressões de seleção de proliferação impostas na cepa modificada após longos períodos de tempo em um bioreator induzem a aprimoramentos em desempenho como resultado da produção bioquímica acoplada à proliferação compulsória. Finalmente, quando as deleções de gene são construídas, existe uma possibilidade

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140/204 desprezível das cepas modificadas reverterem a seus estados de tipo selvagem porque os genes selecionados pelo OptKnock devem ser completamente removidos do genoma. Dessa forma, essa metodologia computacional pode ser usada ou para identificar trajetórias alternativas que conduzem à biossíntese de um produto desejado ou usada em conexão com os organismos microbianos de ocorrência não natural para adicionalmente aprimorar a biossíntese de um produto desejado.

[00171] Resumidamente, o OptKnock é um termo usado neste documento se referir a um sistema e método computacional para modelar metabolismo celular. O programa OptKnock se refere a um esquema de modelos e métodos que incorporam restrições particulares nos modelos de análise de equilíbrio de fluxo (FBA). Essas restrições incluem, por exemplo, informações cinéticas qualitativas, informações regulatórias qualitativas, e/ou dados experimentais de micro arranjos de DNA. O OptKnock também computa soluções para vários problemas metabólicos por, por exemplo, fortalecer os limites de fluxo derivado através de modelos de equilíbrio de fluxo e subsequentemente, experimentar os limites de desempenho de redes metabólicas na presença de deleções e adições de gene. O esquema computacional OptKnock permite a construção de formulações de modelo que permitem uma consulta efetiva dos limites de desempenho de redes metabólicas e proporcionam métodos para resolver os problemas resultantes de programação linear de inteiro misturado. Os métodos de simulação e modelagem metabólica

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141/204 referidos neste documento como OptKnock são descritos em, por exemplo, Publicação N° U.S. 2002/0168654, depositado em 10 de janeiro de 2002, na Patente Internacional de N° PCT/US02/00660, depositada em 10 de janeiro de 2002 e Pedido de Patente de N° de série 11/891.602, depositado em 10 de agosto de 2007.

[00172] Outro método computacional para identificar e planejar alterações metabólicas que favorecem produção biossintética de um produto é um sistema de simulação e modelagem metabólica chamado de SimPheny®. Esse sistema e método computacional é descrito, por exemplo, na Publicação U.S. 2003/0233218, depositada em 14 de junho de 2002, e no Pedido de Patente Internacional N° PCT/US03/18838, depositado em 13 de junho de 2003. SimPheny® é um sistema computacional que pode ser usado para produzir um modelo de rede in silico e para simular o fluxo de massa, energia ou carga através das reações químicas de um sistema biológico para definir um espaço de solução que contém qualquer ou todas as funcionalidades possíveis das reações químicas no sistema, e assim, determinar um intervalo de atividades permitidas para o sistema biológico. Essa abordagem é referida a como modelar com base em restrições visto que o espaço de solução é definido por restrições como uma estequiometria conhecida das reações incluídas, bem como a reação termodinâmica e as restrições de capacidade associadas com fluxos máximos através de reações. O espaço definido por essas restrições pode ser interrogado para

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142/204 determinar capacidades fenotípicas e comportamento do sistema biológico ou de seus componentes bioquímicos.

[00173] Essas abordagens computacionais são consistentes com realidades biológicas, visto que os sistemas biológicos são flexíveis e podem alcançar o mesmo resultado em muitas diferentes formas. Os sistemas biológicos são planejados através de mecanismos evolucionários que foram restringidos por restrições fundamentais que todos os sistemas existentes devem estar direcionados. Dessa forma, a estratégia de modelagem com base nas restrições adota essas realidades gerais. Além disso, a habilidade de impor continuamente restrições adicionais em um modelo de rede por meio do fortalecimento de restrições resulta em uma redução no tamanho do espaço de solução, e assim, aumenta a precisão com que o desempenho fisiológico ou fenótipo pode ser previsto.

[00174] Dadas as instruções e guia proporcionados neste documento, os elementos versados na técnica serão capazes de aplicar vários esquemas computacionais para simulação e modelagem metabólica para modificar e implementar a biossintese de um composto desejado em organismos hospedeiros microbianos. Tais métodos de simulação e modelagem metabólica incluem, por exemplo, os sistemas computacionais exemplificados acima como o SimPheny® e o OptKnock. Para a ilustração da invenção, alguns métodos são descritos neste documento com referência ao esquema de computação OptKnock para modelagem e simulação. Os elementos versados na técnica saberão como

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143/204 aplicar a identificação, planejamento e implementação das alterações metabólicas que usam OptKnock em quaisquer dos outros esquemas computacionais de simulação e modelagem metabólica e métodos bem conhecidos na técnica.

[00175] Os métodos descritos acima fornecerão um conjunto de reações metabólicas para romper. A eliminação de cada reação dentro do conjunto ou modificação metabólica pode resultar em um produto desejado como um produto obrigatório durante a fase de proliferação do organismo. Como as reações são conhecidas, uma solução para o problema de nível duplo OptKnock também fornecerá o gene ou genes associados que codificam uma ou mais enzimas que catalisam cada reação dentro do conjunto de reações. A identificação de um conjunto de reações e seus genes correspondentes que codificam as enzimas que participam em cada reação é geralmente um processo automatizado, executado através de correlação das reações com um banco de dados de reação que tem uma relação entre enzimas e genes codificadores.

[00176] Uma vez identificado, o conjunto de reações que devem ser rompidas para alcançar produção de um produto desejado é implantado na célula ou organismo alvo por ruptura funcional de pelo menos um gene que codifica cada reação metabólica dentro do conjunto. Um meio particularmente útil para alcançar ruptura funcional do conjunto de reação é deletar cada gene codificador. Entretanto, em algumas ocorrências, pode ser benéfico romper a reação por outras aberrações genética que inclui, por exemplo, mutação, deleção de regiões regulatórias como

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144/204 promotores ou sítios de aglutinação cis para fatores regulatórios, ou por truncagem da sequência de codificação em qualquer de um número de locais. Estas aberrações posteriores, resultando em deleção menor do quer total do conjunto de gene pode ser útil, por exemplo, quando avaliações rápidas da acoplagem de um produto são desejadas ou quando reversão genética for menos propensa a ocorrer.

[00177] Para identificar soluções eficazes adicionais para o acima descrito problema de nivel duplo OptKnock que leva a conjuntos de reações para romper ou modificações metabólicas que podem resultar na biossintese, que inclui biossintese acoplada à proliferação de um produto desejado, um método de otimização, cortes de números inteiros proporcionais, pode ser implantada. O método avança ao resolver iterativamente problema OptKnock exemplificado acima com a incorporação de uma restrição adicional referida como um corte de número inteiro em cada iteração. O corte de número inteiro restrições efetivamente impede o procedimento de solução de escolher o mesmo conjunto de reações identificado em qualquer iteração anterior que acopla obrigatoriamente biossintese de produto à proliferação. Por exemplo, se uma modificação metabólica acoplada à proliferação anteriormente identificada especifica reações 1, 2, e 3 para ruptura, então a seguinte restrição impede as mesmas reações de serem simultaneamente considerado em soluções subsequentes. O método de corte de número inteiro é bem conhecido na técnica e pode ser encontrado descrito em, por exemplo, Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17:7 91 a 7 97

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145/204 (2001) . Assim como com todos os métodos descritos nesta invenção com referência aos seus usos em combinação com o esquema computacional OptKnock para modelagem e simulação metabólica, o método de corte de número inteiro de reduzir redundância em análise computacional iterativa também pode ser aplicado com outros esquemas computacionais bem conhecidos na técnica que inclui, por exemplo, SimPheny®.

[00178] Os métodos exemplificados nesta invenção permitem a construção de células e organismos que produzem biossinteticamente um produto desejado, que inclui a acoplagem obrigatória de produção de um produto bioquímico alvo para proliferar da célula ou organismo modificado para abrigar as alterações genéticas identificadas. Portanto, os métodos computacionais descritos nesta invenção permitem a identificação e implantação de modificações metabólicas que são identificadas por um método in silico selecionado a partir de OptKnock ou SimPheny®. O conjunto de modificações metabólicas pode incluir, por exemplo, adição de um ou mais enzimas de trajetória biossintética e/ou ruptura funcional de um ou mais reações metabólicas que incluem, por exemplo, ruptura por deleção de gene.

[00179] Como discutido acima, a metodologia OptKnock foi desenvolvida com a premissa de que redes microbianas de mutante podem ser evoluídas para seus fenótipos de proliferação máxima computacionalmente previstos quando expostas a longos períodos de seleção de proliferação. Em outras palavras, a abordagem alavanca uma habilidade de organismo de se autoaprimorar sob pressões

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146/204 seletivas. O esquema OptKnock permite a enumeração exaustiva de deleção de combinações de gene que força uma acoplagem entre produção bioquímica e proliferação de célula com base em estequiometria de rede. A identificação de gene ideal/knockouts de reação exige a solução de um problema de otimização de nivel duplo que escolhe o conjunto de reações ativas tal que uma solução de proliferação ideal para a rede resultante superproduz o produto bioquímico de interesse (Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647 a 657 (2003)).

[00180] Um modelo estequiométrico in silico de metabolismo de E. coli pode ser empregado para identificar genes essenciais para trajetórias metabólicas como exemplificado anteriormente e descrito em, por exemplo, publicações de patentes U.S. US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 e US 2004/0009466, e em Patente U.S. n° 7.127.379. Como revelado nesta invenção, o esquema matemático OptKnock pode ser aplicado para isolar deleções de gene que leva à produção acoplada à proliferação de um produto desejado. Além disso, a solução do problema de nivel duplo OptKnock fornece apenas um conjunto de deleções. Para enumerar todas as soluções importantes, isto é, todos os conjuntos de knockouts que levam à formação de produção acoplada à proliferação, uma técnica de otimização, cortes de números inteiros proporcionais, pode ser implantada. Isto acarreta na resolução iterativa do problema OptKnock com a incorporação de uma restrição adicional referida como um

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147/204 corte de número inteiro em cada iteração, como discutido acima.

[00181] Como aqui divulgado, a invenção se refere a variantes de aldeído desidrogenase (ver Exemplo). A geração de tais variantes é descrita no exemplo. Qualquer um de uma variedade de métodos pode ser usado para gerar uma variante de aldeído desidrogenase, como as variantes de aldeído desidrogenase aqui divulgadas. Tais métodos incluem, entre outros, mutagênese dirigida ao local, mutagênese aleatória, bibliotecas combinatórias e outros métodos de mutagênese descritos abaixo (Sambrook et al., Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999).; Gillman et al., Criação de Biblioteca de Evolução Dirigida: Métodos e Protocolos (Métodos em Biologia Molecular) Springer, 2nd ed (2014) .

[00182] Como aqui divulgado, um ácido nucleico que codifica uma atividade desejada de uma via para 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, pode ser introduzido em um organismo hospedeiro. Em alguns casos, pode ser desejável modificar uma atividade de um 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO ou um produto a jusante relacionado a este, como um éster ou amida deste, enzima da via ou proteína para aumentar a produção de 3-HBal, 1,3-BDO, 4-HBal ou 1,4-BDO, ou um produto a jusante relacionado, como um éster ou amida deste. Por exemplo, mutações conhecidas

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148/204 que aumentam a atividade de uma proteína ou enzima podem ser introduzidas em uma molécula de ácido nucleico codificante. Adicionalmente, os métodos de aperfeiçoamento podem ser aplicados para aumentar a atividade de uma enzima ou proteína e/ou diminuir uma atividade inibitória, por exemplo, diminuir a atividade de um regulador negativo.

[00183] Um método de aprimoramento é a evolução direcionada. A evolução direcionada é uma abordagem poderosa que envolve a introdução de mutações alvejadas a um gene específico a fim de aprimorar e/ou alterar as propriedades de uma enzima. As enzimas aprimoradas e/ou alteradas podem ser identificadas através do desenvolvimento e implantação de ensaios de triagem de alto rendimento sensíveis que permitem a triagem automatizada de muitas variantes de enzima (por exemplo, >10⁴) . Os ciclos iterativos de mutagênese e a triagem tipicamente são desempenhados para produzir uma enzima com propriedades aperfeiçoadas. Algoritmos computacionais que podem ajudar a identificar áreas do gene para aerar e triar. Numerosas tecnologias de evolução direcionada têm sido desenvolvidas (para resenhas, consulte Hibbert et al., Biomol.Eng 22: 11 a 19 (2005);

Huisman e Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical e biotechnology industries páginas de 717 a 742 (2007), Patel (ed.), CRC Press; Otten e Quax. Biomol.Eng 22: 1 a 9 (2005) .; e Sen et al., ApplBiochem. Biotechnol 143:212 a 223 (2007)) para serem eficazes na criação de diversas bibliotecas variantes, e esses métodos têm sido aplicados com sucesso para o aprimoramento de uma ampla faixa de

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149/204 propriedades ao longo de muitas classes de enzima. Características de enzima que têm sido aprimoradas e/ou alteradas por tecnologias de evolução direcionada incluem, por exemplo: seletividade/especificidade, para a conversão de substratos não naturais; estabilidade de temperatura, para processamento robusto em alta temperatura; estabilidade de pH, para bioprocessamento em condições de pH mais altas ou baixas; tolerância ao substrato ou produto, de modo que titulações de produto altas possam ser alcançadas; ligação (K_m) , incluindo a ampliação de ligação de substrato para incluir substratos não naturais; inibição (Ki) , para remover a inibição por produtos, substratos, ou intermediários chave; atividade (kcat), para aumentar as taxas de reação enzimática para alcançar o fluxo desejado; níveis de expressão, para aumentar os rendimentos de proteína e o fluxo da trajetória em geral; a estabilidade de oxigênio, para a operação de enzimas sensíveis ao ar em condições aeróbicas; e a atividade anaeróbica, para a operação de uma enzima aeróbica na ausência de oxigênio.

[00184] Inúmeros métodos exemplificadores têm sido desenvolvidos para a mutagênese e a diversificação de genes para propriedades desejadas alvejadas de enzimas específicas. Tais métodos são bem conhecidos para os versados na técnica. Qualquer desses pode ser usado para alterar e/ou aperfeiçoar a atividade de uma enzima de trajetória de anilina ou proteína. Tais métodos incluem, mas não se limitam a EpPCR, que introduz mutações pontuais aleatórias ao reduzir a fidelidade de DNA polimerase em

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150/204 reações de PCR (Pritchard et al., J Theor.Biol. 234:497 a 509 (2005)); Amplificação por Circulo Rolante propensa ao

Erro (epRCA) , que é similar a epPCR exceto que todo um plasmídeo circular é usado como o gabarito e 6 meros aleatórios com ligações de tiofosfato resistentes à exonuclease nos últimos 2 nucleotídeos são usados para amplificar o plasmídeo seguido por transformação em células nas quais o plasmídeo é recircularizado em repetições consecutivas (Fujii et al., Nucleic Acids Res. 32:el45 (2004); e Fujii et al., Nat. Protoc. 1:2493 a 2497 (2006)); Embaralhamento de Família ou DNA, que tipicamente envolve a digestão de dois ou mais genes variantes com nucleases como Dnase I ou EndoV para gerar um grupo de fragmentos aleatórios que são reagrupados por ciclos de recozimento e extensão na presença de DNA polimerase para criar uma biblioteca de genes quiméricos (Stemmer, Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747 a 10751 (1994); e Stemmer, Nature 370:389 a 391 (1994)); Extensão Alternada (StEP), que implica na iniciação do gabarito seguida por ciclos repetidos de PCR de 2 etapas com desnaturação e duração muito curta de recozimento/extensão (tão curta quanto 5 seg.) (Zhao et al., Nat. Biotechnol. 16:258 a 261 (1998)); Recombinação

Iniciadora Aleatória (RPR), na qual iniciadores de sequência aleatórios são usados para gerar muitos fragmentos de DNA curtos complementares a diferentes segmentos do gabarito (Shao et al., Nucleic Ácido Res 26:681 a 683 (1998)).

[00185] Métodos adicionais incluem Recombinação

Heteroduplex, em que o DNA de plasmídeo llinearizado é usado

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151/204 para formar heteroduplexos que são reparados por reparo do emparelhamento errôneo (Volkov et al., Nucleic Acids Res. 27:el8 (1999); e Volkov et al., Methods Enzymol. 328:456 a 463 (2000)); Quimeragênese Aleatória Em Modelos Transientes (RACHITT), que emprega a fragmentação de Dnase I e fracionamento de tamanho de DNA de filamento único (ssDNA) (Coco et al., Nat. Biotechnol. 19:354 a 359 (2001));

Extensão Recombinada em Modelos Truncados (RETT), que implica mudança de modelo de filamentos de proliferação unidirecional a partir de iniciadores na presença de fragmentos de ssDNA unidirecional usados como uma piscina de modelos (Lee et al., J. Molec. Catalysis 26: 119 a 129 (2003)); Embaralhamento De Gene De Oligonucleotideo Degenerado (DOGS), em que os iniciadores degenerados são usados para controlar a recombinação entre moléculas; (Bergquist e Gibbs, Methods Mol.Biol 352: 191 a 204 (2007); Bergquist et al., Biomol.Eng 22:63 a 72 (2005); Gibbs et al., Gene 271 : 13 a 20 (2001)); Truncamento de Incremento Para a Criação De Enzimas Híbridas (ITCHY) , que cria uma biblioteca de combinação com 1 par base de deleções de um gene ou fragmento de gene de interesse (Ostermeier et al., Proc. Natl. Acad. Soí. USA 96:3562 a 3567 (1999); e

Ostermeier et al., Nat. Biotechnol. 17: 1205 a 1209 (1999)); Tio-truncamento de incrementação para a criação de enzimas híbridas (THIO-ITCHY), que é similar a ITCHY exceto que dNTPs de fosfotioato são usados para gerar truncamentos (Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16 (2001)); SCRATCHY, que combina dois métodos para recombinar genes, ITCHY e

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152/204 embaralhamento de DNA (Lutz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 11248 a 11253 (2001)); Mutagênese Aleatória por Transposões (RNDM), em que as mutações feitas através de epPCR são seguidas por triagem/seleção para as que mantém atividade utilizável (Bergquist et al., Biomol. Eng. 22:6372 (2005)); Mutagênese por Saturação de Sequência (SeSaM), um Método De Mutagênese Aleatória que gera uma piscina de fragmentos de extensão variada que usa incorporação aleatória de um nucleotídeo de fosfotioato e divagem, que é usada como um modelo para se estender na presença de bases universais tal como a inosina, e a replicação de um complemento que contém inosina gera a incorporação de base aleatória e, consequentemente, a mutagênese (Wong et al., Biotechnol. J. 3:74 a 82 (2008); Wong et al., Nucleic Acids Res. 32:e26 (2004); e Wong et al., Anal. Biochem. 341: 187 a 189 (2005)); Embaralhamento Sintético, que usa oligonucleotideos sobrepostos projetados para codificar toda a diversidade genética nos alvos e permite uma diversidade muito alta para a progênie embaralhada (Ness et al., Nat. Biotechnol. 20: 1251 a 1255 (2002)); Tecnologia NexT de troca e excisão de nucleotídeo, explora uma combinação de incorporação de dUTP seguida pelo tratamento com uracila DNA glicosilase e então piperidina para executar fragmentação de DNA de ponto final (Muller et al., Nucleic Acids Res. 33:el 17 (2005)).

[00186] Métodos adicionais incluem Recombinação De Proteína Independente De Hologia De Sequência (SHIPREC), em que uma ligação é usado para facilitar a fusão entre dois

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153/204 genes distantemente relacionados ou não relacionados, e uma faixa de quimeras é gerada entre os dois genes, o que resulta em bibliotecas de híbridos de cruzamento único (Sieber et al., Nat. Biotechnol. 19:456 a 460 (2001)); Gene Sítio Maturation Mutagenesis™ (GSSM™) , em que os materiais de partida incluem um DNA de filamento duplo superenrolado (dsDNA) que contém plasmídeo e um inserto e dois iniciadores que são degenerados no sítio de mutações desejado (Kretz et al., Methods Enzymol. 388:3 a 11 (2004)); Mutagênese por Cassete de Combinação (CCM), que envolve o uso de cassetes de oligonucleotideo curto para substituir regiões limitadas com um grande número de alterações possíveis de sequência de aminoácido (Reidhaar-Olson et al. Methods Enzymol. 208:564 a 586 (1991); e Reidhaar-Olson et al. Science 241 :53 a 57 (1988)); Mutagênese por Cassete Múltiplo de Combinação (CMCM) , que é essencialmente similar a CCM e usa epPCR uma alta taxa de mutação para identificar pontos preferenciais e regiões preferenciais e então a extensão por CMCM para cobrir uma região definida de espaço de sequência de proteína (Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589 a 3591 (2001)); A Técnica de Cepas de Mutação, em que plasmídeos de mutação de ts condicional, utilizando o gene mutD5, que codifica uma subunidade mutante de DNA polimerase III, para permitir aumentos de 20 a 4000-X frequência de mutação aleatória e natural durante a seleção e acúmulo em bloco de mutações deletérias quando a seleção não é requerida (Selifonova et al., Appl. Environ. Mlcrobiol.

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67:3645 a 3649 (2001)); Low et al.,<7. Mol. Biol. 260:359 a 3680 (1996)).

[00187] Métodos exemplificadores adicionais incluem Mutagênese por Transparência (LTM), que é um método de mutagênese multidimensional que avalia e aprimora mutações de combinação de aminoácidos selecionados (Rajpal et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102:8466 a 8471 (2005)); Remontagem de Gene, que é um método de embaralhamento de DNA que pode ser aplicado a múltiplos genes de uma única vez ou para criar uma biblioteca grande de quimeras (mutações múltiplas) de um único gene (tecnologia Tunable GeneReassembly™ (TGR™) suprida pela Verenium Corporation), automação de projeto de proteína in Silico (PDA), que é um algoritmo aprimorado que ancora a cadeia principal de proteína definida estruturalmente que possui uma dobra em particular, e busca espaço de sequência para substituições de aminoácido que podem estabilizar a dobra e energética de proteína no geral, e geralmente funciona de maneira mais eficiente em proteínas com estruturas tridimensionais conhecidas (HaSim et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 15926 a 15931 (2002)); e Mutagênese por Saturação Iterativa (ISM), que envolve o uso do conhecimento sobre estrutura/função para escolher um sítio provável para a melhoria de enzima, e executa a mutagênese por saturação em um sítio escolhido pelo uso de um método de mutagênese tal como Stratagene QuikChange (Stratagene; San Diego CA), triagem/seleção para s propriedades desejadas, e, pelo uso clone(s) melhorado(s), e começa novamente em outro sítio e

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155/204 continua a se repetir até que uma atividade desejada seja alcançada (Reetz et al., Nat. Protoc. 2:891 a 903 (2007); e Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745 a 7751 (2006) ) .

[00188] Qualquer um dos métodos mencionados acima para mutagênese pode ser usado por si só ou em qualquer combinação. Adicionalmente, qualquer uma ou a combinação dos métodos de evolução direcionada pode ser usada juntamente com as técnicas de evolução adaptativa, conforme descrito neste.

[00189] Entende-se que modificações que não afetam substancialmente a atividade das várias modalidades desta invenção também são fornecidas dentro da definição da invenção fornecida nesta invenção. Desta forma, os seguintes exemplos pretendem ilustrar, mas não limitar, a presente invenção.

EXEMPLO

Variantes de aldeido desidrogenase

[00190] Este exemplo descreve a geração de variantes de aldeido desidrogenase com propriedades desejáveis.

[00191] Técnicas de mutagênese foram usadas para gerar variantes de aldeido desidrogenases com base no modelo ALD-1. As variantes foram geradas usando PCR propenso a erros, mutagênese direcionada ao local e por mutações espontâneas durante a seleção genética. O modelo ALD-1 corresponde à aldeido desidrogenase fornecida abaixo:

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MIKDTLVSITKDLKLKTNVENANLKNYKDDSSCFGVFENVENAISNAVHAQKILSLHYTK EQREKIITEIRKAALENKEILATMILEETHMGRYEDKILKHELVAKYTP GTEDLTTTAWS GDNGLTWEMSP YGVIGAITP STNP TETVICNSIGMIAAGNTWFNGHP GAKKCVAFAVE MINKAIISCGGPENLVTTIKNPTMDSLDAIIKHPSIKLLCGTGGPGMVKTLLNSGKKAIG AGAGNPPVIVDDTADIEKAGKSIIEGCSFDNNLPCIAEKEVFVFENVADDLISNMLKNNA VIINEDQVSKLIDLVLQKNNETQEYSINKKWVGKDAKLFLDEIDVESPSSVKCIICEVSA SHPFVMTELMMPILPIVRVKDIDEAIEYAKIAEQNRKHSAYIYSKNIDNLNRFEREIDTT IFVKNAKSFAGVGYEAEGFTTFTIAGSTGEGITSARNFTRQRRCVLAG (SEQ ID NO:1).

[00192] Sequências ALD adicionais para ALD-2 e

ALD-3 são fornecidas abaixo:

ALD-2

MNTENIEQAIRKILSEELSNPQSSTATNTTVPGKNGIFKTVNEAIAATKAAQENYADQPISVRNK

VIDAIREGFRPYIEDMAKRIHDETGMGTVSAKIAKLNNALYNTPGPEILQPEAETGDGGLVMYEY APFGVIGAVGPSTNPSETVIANAIMMLAGGNTLFFGAHPGAKNITRWTIEKLNELVADATGLHNL VVSLETPSIESVQEVMQHPDVAMLSITGGPAVVHQALISGKKAVGAGAGNPPAMVDATANIALAA HNIVDSAAFDNNILCTAEKEWVEAAVKDELIMRMQQEGAFLVTDSADIEKLAQMTIGPKGAPDR KFVGKDATYILDQAGISYTGTPTLIILEAAKDHPLVTTEMLMPILPWCCPDFDSVLATATEVEG GLHHTASIHSENLPHINKAAHRLNTSIFWNGPTYCGTGVATNGAHSGASALTIATPTGEGTATS KTYTRRRRLNSPEGFSLRTWEA (SEQ ID NO:2)

ALD-3

MTVNEQLVQDIIKNWASMQLTQTNKTELGVFDDMNQAIEAAKEAQLVVKKMSMDQREKIISAIR KKTIEHAETLARMAVEETGMGNVGHKILKHQLVAEKTPGTEDITTTAWSGDRGLTLVEMGPFGVI GAITPCTNPSETIICNTIGMLAGGNTWFNPHPAAIKTSNFAVQLINEASLSAGGPVNIACSVRK PTLDSSKIMMSHQDIPLIAATGGPGVVTAVLQSGKRGIGAGAGNPPVLVDETADIRKAAEDIING CTFDNNLPCIAEKEWAIDAIANELMNYMVKEQGCYAITKEQQEKLTNLVITPKGLNRNCVGKDA RTLLGMIGIDVPSNIRCIIFEGEKEHPLISEELMMPILGIVRAKSFDDAVEKAVWLEHGNRHSAH IHSKNVDRITTYAKAIDTAILVKNAPSYAAIGFGGEGFCTFTIASRTGEGLTSASTFTKRRRCVM

SDSLCIR (SEQ ID NO:3)

[00193] ALD-1 é ligeiramente mais especifico para o enantiômero R do 3-hidroxibutiril-CoA em comparação

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157/204 com o enantiômero S. Um alinhamento de sequência de ALD-1 para ALD-2 e ALD-3 é mostrado na Figura 3. As sequências correspondem à SEQ ID NOS: 1, 2 e 3, respectivamente. Também existe uma estrutura cristalina para ALD-3 (PDBID 4C3S), e ALD-2 está mais intimamente relacionado à ALD-3 do que ao ALD-1. Portanto, ALD-3 foi usado como modelo. 2 regiões de alça são sublinhadas na Figura 3, a primeira designada A, a segunda B, ambas envolvidas na especificidade do substrato e na especificidade do enantiômero, conforme aqui determinado. A Alça A em ALD-1 é a sequência LQKNNETQEYSINKKWVGKD (SEQ ID NO:124), em ALD-2 é a sequência IGPKGAPDRKFVGKD (SEQ ID NO:125) e em ALD-3 é a sequência ITPKGLNRNCVGKD (SEQ ID NO: 126). Alça B em ALD-1 é a sequência SFAGVGYEAEGFTTFTIA (SEQ ID NO:127), em ALD-2 é a sequência TYCGTGVATNGAHSGASALTIA (SEQ ID NO:128), e em ALD-3 é a sequência SYAAIGFGGEGFCTFTIA (SEQ ID NO:129). A sequência e o comprimento da especificidade do substrato da alça A e B de ALD-2 diferem dos de ALD-1 e ALD-3; no entanto, o alinhamento mostra conservação suficiente para facilitar a identificação das posições correspondentes para substituição, como descrito aqui, e especialmente se combinado com a modelagem 3D, como mostrado na Figura 6, que mostra as duas regiões de alça interagindo para afetar a especificidade do substrato e a especificidade do enantiômero, especialmente quando modificadas com substituições exemplificativas, como aqui descrito. ALD-1 e ALD-3 são 51,9% idênticos. ALD-1 e ALD-2 são 35,9% idênticos. ALD-3 e ALD-2 são 40% idênticos. Foi gerada uma sequência de ALD de consenso com base no alinhamento da Figura 3. Um consenso para a alça A baseado no alinhamento

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158/204 de ALD-1, ALD-2 e ALD-3 é IXPKG XXNRKXVGKD (SEQ ID NO: 5) . Um consenso para a alça B baseado no alinhamento de ALD-1, ALD-2 e ALD-3 é SYAGXGXXXE---GFXTFTIA (SEQ IDNO:6).

[00194] Alinhamentos adicionais foram realizados (Figura 4) . A Figura 4A mostra um alinhamento com um ponto de corte de 40 a 55% em comparação com ALD-1. A Figura 4B mostra um alinhamento com um ponto de corte de 75 a 90% em comparação com ALD-1. A Figura 4C mostra um alinhamento com um ponto de corte de 90% em comparação com ALD-1. Os alinhamentos de exemplos de aldeído desidrogenases (ALD) mostrados nas Figuras 4A^a a 4C demonstram a identificação de posições em ALDs que correspondem a posições na sequência ALD do modelo representativo, onde podem ser feitas substituições da invenção. As duas regiões principais da alça estão sublinhadas, a primeira designada A, a segunda B, ambas envolvidas na especificidade do substrato e na especificidade do enantiômero, conforme aqui determinado. As Figuras 4A a 4C demonstram que as posições correspondentes para substituições aqui ensinadas podem ser identificadas em ALDs que são pelo menos 40% idênticas a ALD-1, especialmente as regiões de alça A e B, e especialmente a região de alça B muito conservada.

[00195] A mutagênese para aumentar a especificidade da variante 45 para 3HB-CoA em relação ao acetil-CoA levou a várias variantes com aumento da produção de 1,3 BDO e diminuição do etanol. Mutações que aumentam a especificidade do 3hidroxibutiril-CoA sobre o acetil-CoA fornecem uma diminuição no etanol, uma vez que o acetaldeído gerado a partir do acetil-CoA pode ser convertido em etanol por enzimas nativas na célula

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159/204 hospedeira ou por uma enzima de via que converte o 3hidroxibutiraldeído para 1,3-butanodiol. Variantes que aumentam a atividade enzimática da aldeido desidrogenase ou aumentam sua especificidade para 3-hidroxibutiril-CoA diminuem a 4-hidroxi-2butanona, aumentando o fluxo através de uma via enzimática para o 1,3-butanodiol, que puxa a acetoacetil-CoA para a formação do 1,3-butanodiol, diminuindo sua disponibilidade para conversão em duas etapas em 4-hidroxi-2-butanona por enzimas nativas ou enzimas de via menos especificas. A sequência da variante 45 é fornecida abaixo:

MIKDTLVSITKDLKLKTNVENANLKNYKDDSSCFGVFENVENAISNAVHAQKILSLHYTKEQREK IITEIRKAALENKEILATMILEETHMGRYEDKILKHELVAKYTPGTEDLTTTAWSGDNGLTVVEM SPYGVIGAITPSTNPTETVICNSIGMIAAGNTWFNGHPGAKKSVAFAVEMINKAIISCGGPENL VTTIKNPTRDSLDAIIKHPSIKLLVGTGGPGMVKTLLNSGKKAIGAGAGNPPVIVDDTADIEKAG KSIIEGASFDNNLPCIAEKEVFVFENVADDLISNMLKNNAVIINEDQVSKLIDLVLQKNNETQEY SINKKWVGKDAKLFLDEIDVESPSSVKCIITEVSASHPFVMTELMMPILPIVRVKDIDEAIEYAK IAEQNHKHSAYIYSKNIDNLNRFEREIDTTIFVKNAKSFAGVGYEAPGFTTFTIAGSTGEGITSA RNFTRQRRIVLVG (SEQ ID NO:4)

[00196] O ensaio realizado é um ensaio in vitro para examinar a atividade em 3HB-CoA, monitorando uma diminuição na absorvância à medida que o NADH é convertido em NAD. Os ensaios também foram realizados com acetil-CoA (AcCoA) como substrato e enzimas melhoradas foram identificadas como uma melhoria na razão de atividade de 3HB-CoA vs. AcCoA. Mutações que aumentam a especificidade do 3-hidroxibutiril-CoA sobre o acetil-CoA fornecem uma diminuição no etanol, uma vez que o acetaldeido gerado a partir do acetil-CoA pode ser convertido em etanol por

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160/204 enzimas nativas na célula hospedeira ou por uma enzima de via que converte o 3-hidroxibutiraldeido para 1,3butanodiol.

[00197] Uma investigação mais aprofundada de um subconjunto dessas variantes com (R) e (S) 3-hidroxibutiraldeido mostrou que cinco das variantes testadas (952, 955, 957, 959, 961) apresentaram melhor seletividade para o enantiômero R em comparação com a enzima mãe (variante 45) e ALD-1 do tipo selvagem (Figura 5) . A Figura 5A mostra a atividade especifica das variantes ALD-2, ALD-1 e ALD-1 em 3 hidróxi-(R)-butiraldeido (barras esquerdas no conjuntos de barras) e 3 hidróxi-(S)butiraldeido (barras direita no conjuntos de barras). As proteínas marcadas com estreptavidina purificadas foram analisadas a 35°C em tampão IVI pH 7,5, NAD+ 0,5 mM, CoA 2 mM na presença de 10 mM R ou S 3-hidroxibutiraldeido S, e a atividade foi monitorada por alteração na absorvência de NADH a 340 nm. O buffer IVI contém 5 mM de potássio fosfato monobásico, fosfato de potássio 20 mM dibásico, glutamato de sódio 10 mM, monohidrato e cloreto de potássio 150 mM, pH 7,5. Assim, a reação enzimática no ensaio foi realizada na direção inversa à mostrada na Figura 1, ou seja, a reação mediu a conversão de 3hidroxibutiraldeido em 3-hidroxibutiril-CoA. Como mostrado na Figura 5B, certas variantes de aldeido desidrogenase exibiram seletividade para R-3-hidroxibutiraldeido (R-3HB-aldeido) sobre S-3-hidroxibutiraldeido (S-3HB-aldeido).

[00198] A modelagem computacional do mutante 959 usando uma estrutura de cristal ALD-1 sugere que a substituição de aminoácidos F442N permite que uma rede de ligação de

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161/204 hidrogênio seja formada com o hidroxil no carbono 3 do isômero R, mas não o isômero (S) (Figura 6) As Figuras 6A a 6C mostram diagramas de fita da estrutura da aldeido desidrogenase 959. Os diagramas mostram acoplamento de 3-hidroxi-(R)-butiraldeído (Figura 6A) ou 3-hidroxi-(S)-butiraldeído (Figura 6B) no 959. A Figura 6C mostra que quando o 3-hidroxi-(S)-butiraldeído é encaixado na mesma orientação mais favorecida energeticamente para encaixe de 3-hidroxi-(R)-butiraldeído, como mostrado na Figura 6A, uma interação desfavorável (circulada) é criada com uma isoleucina localizada no site ativo. O modelo indica que a mutação F442N cria uma ligação de hidrogênio entre a proteína e um hidroxil de 3-hidroxi-(R)-butiraldeído que não é possível com o enantiômero S.

[00199] Exemplos de variantes de aldeído desidrogenase são mostrados nas Tabelas 1A-1D.

Tabela IA. Variantes ALD exemplificativas

Variante	Posição
	12	19	33	44	65	72	73	107	122	129	139	143
12	D12A										I139S
16	D12A		C33R								I139S
17	D12A										I139V	T143N
30										E129I
34	D12A										I139S
56	D12A										I139S
71								Y107K
80								Y107K
93	D12A										I139S
156	D12A							Y107K
166	D12A							Y107K
180	D12A										I139S
182
184	D12A										I139S
194											I139S
199

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162/204

Variante	Posição
	12	19	33	44	65	72	73	107	122	129	139	143
203
205	D12A										I139S
208
213												T143S
235	D12A										I139S
240	D12A										I139V
321	D12V										I139S
598	D12A										I139S
45
951
952
953
954
955
957
958
959
960		V19I							D122N
961
975	D12A										I139V
991	D12A										I139L	T143N
992							A73S
993
994
995
996
997				I44L
998
999					K65A
1000
1001
1002
1003
1004
1005
1006
1015
1016
1017
1018

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163/204

Variante	Posição
	12	19	33	44	65	72	73	107	122	129	139	143
1019
1020
1021
1022
1023
1024
1025
1026
1027
1028
1029
1030
1031
1032
1033
1034
1035
1036
1037						K72N
1038
1039
1040
1041
1042
1043
1044
1045
1046
1047
1048
1049
1050
1051
1052
1053
1054
1055
1056
1057
1058

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164/204

Variante	Posição
	12	19	33	44	65	72	73	107	122	129	139	143
1059
1060
1061
1062
1063
1064
1065
1066
1067
1068
1069
1070
1071
1072
1073
1074
1075
1076
1077
1078
1079							A73D
1080							A73G
1081							A73L
1082							A73Q.
1083							A73F
1084							A73G
1085							A73E
1086							A73W
1087
1088
1089
1090
1091
1092
1093							A73L
1094							A73R
1095							A73C
1096
1097							A73W
1098							A73M

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165/204

Variante	Posição
	12	19	33	44	65	72	73	107	122	129	139	143
1099
1100							A73F
1101

Tabela 1B. Variantes ALD exemplificativas

Variante	Posição
	145	155	163	167	174	189	204	220	227	229
12							M204R
16					C174S	C189A	M204R	C220V
17				G167S	C174S		M204R	C220V
30					C174S			C220V
34					C174S		M204R	C220V
56					C174S		M204R	C220V
71					C174S		M204R	C220V
80					C174S			C220V
93					C174S		M204R	C220V
156					C174S		M204R	C220V
166					C174S			C220V
180					C174S		M204R	C220V
182					C174S		M204R	C220V
184					C174S		M204R	C220V
194					C174S		M204R	C220V
199					C174S		M204R	C220V
203					C174S		M204R	C220V
205					C174S		M204R	C220V
208					C174S		M204R	C220V
213					C174S		M204R	C220V
235					C174S		M204R	C220V
240					C174S		M204R	C220V	M227K
321							M204R
598					C174S		M204R	C220V	M227Q.
45					C174S		M204R	C220V
951					C174S		M204R	C220V
952					C174S		M204R	C220V
953					C174S		M204R	C220V
954					C174S		M204R	C220V
955					C174S		M204R	C220V
957					C174S		M204R	C220V
958					C174S		M204R	C220V

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166/204

Variante	Posição
	145	155	163	167	174	189	204	220	227	229
959					C174S		M204R	C220V
960					C174S		M204R	C220V
961					C174S		M204R	C220V
975					C174S		M204R	C220V	M227Q.
991					C174S		M204R	C220V
992					C174S		M204R	C220V
993					C174S		M204R	C220V
994			V163C		C174S		M204R	C220V
995					C174S		M204R	C220V		K229S
996					C174S		M204R	C220V
997					C174S		M204R	C220V
998					C174S		M204R	C220V
999					C174S		M204R	C220V
1000			V163C		C174S		M204R	C220V
1001					C174S		M204R	C220V
1002					C174S		M204R	C220V
1003		G155G			C174S		M204R	C220V
1004	P145P				C174S		M204R	C220V
1005					C174S		M204R	C220V
1006					C174S		M204R	C220V
1015					C174S		M204R	C220V	M227I
1016					C174S		M204R	C220V
1017					C174S		M204R	C220V
1018					C174S		M204R	C220V
1019					C174S		M204R	C220V
1020					C174S		M204R	C220V
1021					C174S		M204R	C220V	M227V
1022					C174S		M204R	C220V	M227V
1023					C174S		M204R	C220V	M227I
1024					C174S		M204R	C220V	M227I
1025					C174S		M204R	C220V
1026					C174S		M204R	C220V
1027					C174S		M204R	C220V	M227I
1028					C174S		M204R	C220V
1029					C174S		M204R	C220V
1030					C174S		M204R	C220V
1031					C174S		M204R	C220V
1032					C174S		M204R	C220V
1033					C174S		M204R	C220V
1034					C174S		M204R	C220V	M227I

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167/204

Variante	Posição
	145	155	163	167	174	189	204	220	227	229
1035					C174S		M204R	C220V
1036					C174S		M204R	C220V
1037					C174S		M204R	C220V
1038					C174S		M204R	C220V
1039					C174S		M204R	C220V
1040					C174S		M204R	C220V
1041					C174S		M204R	C220V
1042					C174S		M204R	C220V
1043					C174S		M204R	C220V	M227V
1044					C174S		M204R	C220V
1045					C174S		M204R	C220V
1046					C174S		M204R	C220V
1047					C174S		M204R	C220V	M227C
1048					C174S		M204R	C220V	M227L
1049					C174S		M204R	C220V
1050					C174S		M204R	C220V	M227C
1051					C174S		M204R	C220V
1052					C174S		M204R	C220V
1053					C174S		M204R	C220V	M227C
1054					C174S		M204R	C220V	M227C
1055					C174S		M204R	C220V
1056					C174S		M204R	C220V
1057					C174S		M204R	C220V
1058					C174S		M204R	C220V
1059					C174S		M204R	C220V
1060					C174S		M204R	C220V	M227L
1061					C174S		M204R	C220V	M227A
1062					C174S		M204R	C220V
1063					C174S		M204R	C220V
1064					C174S		M204R	C220V
1065					C174S		M204R	C220V
1066					C174S		M204R	C220V	M227I
1067					C174S		M204R	C220V	M227I
1068					C174S		M204R	C220V	M227I
1069					C174S		M204R	C220V
1070					C174S		M204R	C220V	M227V
1071					C174S		M204R	C220V	M227C
1072					C174S		M204R	C220V
1073					C174S		M204R	C220V
1074					C174S		M204R	C220V

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 503/565

168/204

Variante	Posição
	145	155	163	167	174	189	204	220	227	229
1075					C174S		M204R	C220V
1076					C174S		M204R	C220V	M227L
1077					C174S		M204R	C220V
1078					C174S		M204R	C220V	M227V
1079					C174S		M204R	C220V	M227I
1080					C174S		M204R	C220V	M227I
1081					C174S		M204R	C220V	M227I
1082					C174S		M204R	C220V	M227I
1083					C174S		M204R	C220V	M227I
1084					C174S		M204R	C220V	M227I
1085					C174S		M204R	C220V	M227I
1086					C174S		M204R	C220V	M227I
1087			V163G		C174S		M204R	C220V	M227I
1088			V163T		C174S		M204R	C220V	M227I
1089					C174S		M204R	C220V	M227L
1090					C174S		M204R	C220V
1091					C174S		M204R	C220V
1092					C174S		M204R	C220V
1093					C174S		M204R	C220V	M227I
1094					C174S		M204R	C220V	M227I
1095			V163C		C174S		M204R	C220V	M227I
1096			V163C		C174S		M204R	C220V	M227I
1097			V163C		C174S		M204R	C220V	M227I
1098			V163C		C174S		M204R	C220V	M227I
1099			V163C		C174S		M204R	C220V	M227I
1100			V163C		C174S		M204R	C220V	M227I
1101			V163C		C174S		M204R	C220V	M227I

Tabela 1C. Variantes ALD exemplificativas

Variante	Posição
	230	243	244	254	267	315	353	356	396	429
12									R396H
16					C267A		C353A	C356T	R396H
17	T230R				C267A			C356T	R396H	F429Y
30					C267A			C356T	R396H
34					C267A			C356T	R396H
56					C267A			C356T	R396H	F429Y
71					C267A			C356T
80					C267A			C356T

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 504/565

169/204

Variante	Posição
	230	243	244	254	267	315	353	356	396	429
93	T230R				C267A			C356T	R396H	F429Y
156					C267A			C356T
166					C267A			C356T
180					C267A			C356T	R396H
182		A243P			C267A			C356T	R396H
184					C267A			C356T	R396H
194					C267A			C356T	R396H
199					C267A			C356T	R396H	F429Q.
203					C267A			C356T	R396H	F429Y
205		A243P			C267A			C356T	R396H	F429Y
208					C267A			C356T	R396H
213					C267A			C356T	R396H
235		A243P			C267A			C356T	R396H
240					C267A			C356T	R396H	F429Y
321									R396H
598	T230R	A243P			C267A			C356T	R396H	F429Y
45					C267A			C356T	R396H
951					C267A			C356T	R396H	F429H
952					C267A			C356T	R396H	F429M
953					C267A			C356T	R396H	F429M
954					C267A			C356T	R396H	F429Q.
955					C267A			C356T	R396H
957					C267A			C356T	R396H
958					C267A			C356T	R396H
959					C267A			C356T	R396H
960					C267A			C356T	R396H	F429D
961					C267A	V315A		C356T	R396H
975	T230R	A243P			C267A			C356T	R396H	F429Y
991	T230R	A243P			C267A			C356T	R396H	F429Y
992					C267A			C356T	R396H
993				A254T	C267A			C356T	R396H
994					C267A			C356T	R396H
995					C267A			C356T	R396H
996					C267A			C356L	R396H
997					C267A			C356T	R396H
998					C267A			C356T	R396H
999					C267A			C356T	R396H
1000					C267A			C356T	R396H
1001					C267A			C356T	R396H
1002					C267A			C356T	R396H

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 505/565

170/204

Variante	Posição
	230	243	244	254	267	315	353	356	396	429
1003					C267A			C356T	R396H
1004					C267A			C356T	R396H
1005			G244G		C267A			C356T	R396H
1006					C267A			C356T	R396H
1015	T230K				C267A			C356T	R396H
1016	T230R	A243Q.			C267A			C356T	R396H
1017	T230H	A243Q.			C267A			C356T	R396H
1018	T230A	A243E			C267A			C356T	R396H
1019	T230M	A243S			C267A			C356T	R396H
1020	T230H	A243N			C267A			C356T	R396H
1021	T230C				C267A			C356T	R396H
1022	T230H				C267A			C356T	R396H
1023	T230L				C267A			C356T	R396H
1024	T230C				C267A			C356T	R396H
1025	T230M	A243E			C267A			C356T	R396H
1026	T230S	A243Q.			C267A			C356T	R396H
1027	T230A				C267A			C356T	R396H
1028	T230K				C267A			C356T	R396H
1029	T230Y	A243Q.			C267A			C356T	R396H
1030	T230G	A243Q.			C267A			C356T	R396H
1031	T230M	A243K			C267A			C356T	R396H
1032	T230T	A243L			C267A			C356T	R396H
1033	T230I				C267A			C356T	R396H
1034	T230K				C267A			C356T	R396H	F429L
1035	T230H				C267A			C356T	R396H
1036	T230Y	A243E			C267A			C356T	R396H
1037		A243S			C267A			C356T	R396H
1038	T230C	A243K			C267A			C356T	R396H
1039	T230H	A243K			C267A			C356T	R396H
1040	T230H	A243C			C267A			C356T	R396H
1041	T230A	A243Q.			C267A			C356T	R396H
1042	T230S	A243C			C267A			C356T	R396H
1043	T230S				C267A			C356T	R396H
1044	T230H	A243M			C267A			C356T	R396H
1045	T230A	A243K			C267A			C356T	R396H
1046	T230W				C267A			C356T	R396H
1047	T230R				C267A			C356T	R396H
1048	T230N				C267A			C356T	R396H
1049	T230N				C267A			C356T	R396H
1050	T230L				C267A			C356T	R396H

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 506/565

171/204

Variante	Posição
	230	243	244	254	267	315	353	356	396	429
1051	T230V				C267A			C356T	R396H
1052	T230L				C267A			C356T	R396H
1053	T230K				C267A			C356T	R396H
1054	T230V				C267A			C356T	R396H
1055	T230T	A243N			C267A			C356T	R396H
1056	T230T	A243I			C267A			C356T	R396H
1057	T230T	A243C			C267A			C356T	R396H
1058	T230G	A243K			C267A			C356T	R396H
1059	T230R	A243K			C267A			C356T	R396H
1060		A243P			C267A			C356T	R396H
1061		A243P			C267A			C356T	R396H
1062		A243Q.			C267A			C356T	R396H
1063	T230Q.				C267A			C356T	R396H
1064	T230N	A243I			C267A			C356T	R396H
1065	T230C	A243C			C267A			C356T	R396H
1066	T230R				C267A			C356T	R396H
1067		A243L			C267A			C356T	R396H
1068		A243M			C267A			C356T	R396H
1069		A243M			C267A			C356T	R396H
1070					C267A			C356T	R396H
1071		A243Q.			C267A			C356T	R396H
1072	T230R	A243C			C267A			C356T	R396H
1073	T230L	A243M			C267A			C356T	R396H
1074	T230I	A243M			C267A			C356T	R396H
1075	T230M	A243Q.			C267A			C356T	R396H
1076	T230W				C267A			C356T	R396H
1077	T230V	A243M			C267A			C356T	R396H
1078	T230I				C267A			C356T	R396H
1079	T230K				C267A			C356T	R396H
1080	T230K				C267A			C356T	R396H
1081	T230K				C267A			C356T	R396H
1082	T230K				C267A			C356T	R396H
1083	T230K				C267A			C356T	R396H
1084	T230K				C267A			C356T	R396H
1085	T230K				C267A			C356T	R396H
1086	T230K				C267A			C356T	R396H
1087	T230K				C267A			C356T	R396H
1088	T230K				C267A			C356T	R396H
1089	T230S				C267A			C356T	R396H
1090		A243E			C267A			C356T	R396H

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 507/565

172/204

Variante	Posição
	230	243	244	254	267	315	353	356	396	429
1091	T230T	A243E			C267A			C356T	R396H
1092		A243K			C267A			C356T	R396H
1093	T230K				C267A			C356T	R396H
1094	T230K				C267A			C356T	R396H
1095	T230K				C267A			C356T	R396H
1096	T230K				C267A			C356T	R396H
1097	T230K				C267A			C356T	R396H
1098	T230K				C267A			C356T	R396H
1099	T230K				C267A			C356T	R396H
1100	T230K				C267A			C356T	R396H
1101	T230K				C267A			C356T	R396H

Tabela ID. Variantes ALD exemplificativas

Variante	Posição
	432	437	440	441	442	444	447	450	460	464	467
12
16										C464V
17		E437P			F442T					C464I	A467V
30										C464I	A467V
34										C464I
56		E437P			F442T					C464I	A467V
71										C464I	A467V
80										C464I
93		E437P			F442T					C464I	A467V
156										C464I	A467V
166										C464I
180										C464I	A467V
182		E437P								C464I	A467V
184		E437P								C464I	A467V
194		E437P								C464I	A467V
199		E437P								C464I	A467V
203		E437P			F442T					C464I	A467V
205		E437P			F442T					C464I	A467V
208		E437P			F442Y					C464I	A467V
213		E437P								C464I	A467V
235		E437P								C464I	A467V
240		E437P			F442T					C464I	A467V
321
598		E437P			F442T					C464I	A467V

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 508/565

173/204

Variante	Posição
	432	437	440	441	442	444	447	450	460	464	467
45		E437P								C464I	A467V
951		E437P			F442H					C464I	A467V
952		E437P			F442H					C464I	A467V
953		E437P			F442N					C464I	A467V
954		E437P								C464I	A467V
955		E437P			F442N					C464I	A467V
957		E437P			F442Q					C464I	A467V
958		E437P				I444V				C464I	A467V
959		E437P	T440H		F442N					C464I	A467V
960		E437P			F442Q			E450E		C464I	A467V
961		E437P	T440H		F442N					C464I	A467V
975		E437P			F442T					C464I	A467V
991		E437P			F442T					C464I	A467V
992		E437P			F442M		S447M			C464I	A467V
993		E437P			F442M					C464I	A467V
994		E437P			F442M					C464I	A467V
995		E437P			F442N					C464I	A467V
996		E437P			F442N					C464I	A467V
997		E437P		T441G						C464I	A467V
998		E437P			F442M					C464I	A467V
999		E437P			F442N					C464I	A467V
1000		E437P			F442N					C464I	A467V
1001		E437P			F442M				R460K	C464I	A467V
1002		E437P			F442M		S447M			C464I	A467V
1003		E437P			F442F					C464I	A467V
1004		E437P								C464I	A467V
1005		E437P								C464I	A467V
1006	V432V	E437P								C464I	A467V
1015		E437P			F442N					C464I	A467V
1016		E437P			F442N					C464I	A467V
1017		E437P			F442N					C464I	A467V
1018		E437P			F442N					C464I	A467V
1019		E437P			F442N					C464I	A467V
1020		E437P			F442N					C464I	A467V
1021		E437P			F442N					C464I	A467V
1022		E437P			F442N					C464I	A467V
1023		E437P			F442N					C464I	A467V
1024		E437P			F442N					C464I	A467V
1025		E437P			F442N					C464I	A467V
1026		E437P			F442N					C464I	A467V

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 509/565

174/204

Variante	Posição
	432	437	440	441	442	444	447	450	460	464	467
1027		E437P			F442N					C464I	A467V
1028		E437P			F442N					C464I	A467V
1029		E437P			F442N					C464I	A467V
1030		E437P			F442N					C464I	A467V
1031		E437P			F442N					C464I	A467V
1032		E437P			F442N					C464I	A467V
1033		E437P			F442N					C464I	A467V
1034	V432N	E437P			F442N					C464I	A467V
1035		E437P			F442N					C464I	A467V
1036		E437P			F442N					C464I	A467V
1037		E437P			F442N					C464I	A467V
1038		E437P			F442N					C464I	A467V
1039		E437P			F442N					C464I	A467V
1040		E437P			F442N					C464I	A467V
1041		E437P			F442N					C464I	A467V
1042		E437P			F442N					C464I	A467V
1043		E437P			F442N					C464I	A467V
1044		E437P			F442N					C464I	A467V
1045		E437P			F442N					C464I	A467V
1046		E437P			F442N					C464I	A467V
1047		E437P			F442N					C464I	A467V
1048		E437P			F442N					C464I	A467V
1049		E437P			F442N					C464I	A467V
1050		E437P			F442N					C464I	A467V
1051		E437P			F442N					C464I	A467V
1052		E437P			F442N					C464I	A467V
1053		E437P			F442N					C464I	A467V
1054		E437P			F442N					C464I	A467V
1055		E437P			F442N					C464I	A467V
1056		E437P			F442N					C464I	A467V
1057		E437P			F442N					C464I	A467V
1058		E437P			F442N					C464I	A467V
1059		E437P			F442N					C464I	A467V
1060		E437P			F442N					C464I	A467V
1061		E437P			F442N					C464I	A467V
1062		E437P			F442N					C464I	A467V
1063		E437P			F442N					C464I	A467V
1064		E437P			F442N					C464I	A467V
1065		E437P			F442N					C464I	A467V
1066		E437P			F442N					C464I	A467V

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175/204

(/ariante	Posição
	432	437	440	441	442	444	447	450	460	464	467
1067		E437P			F442N					C464I	A467V
1068		E437P			F442N					C464I	A467V
1069		E437P			F442N					C464I	A467V
1070		E437P			F442N					C464I	A467V
1071		E437P			F442N					C464I	A467V
1072		E437P			F442N					C464I	A467V
1073		E437P			F442N					C464I	A467V
1074		E437P			F442N					C464I	A467V
1075		E437P			F442N					C464I	A467V
1076		E437P			F442N					C464I	A467V
1077		E437P			F442N					C464I	A467V
1078		E437P			F442N					C464I	A467V
1079		E437P			F442N		S447P			C464I	A467V
1080		E437P			F442N		S447H			C464I	A467V
1081		E437P			F442N		S447K			C464I	A467V
1082		E437P			F442N		S447R			C464I	A467V
1083		E437P			F442N		S447K			C464I	A467V
1084		E437P			F442N		S447K			C464I	A467V
1085		E437P			F442N		S447K			C464I	A467V
1086		E437P			F442N		S447R			C464I	A467V
1087		E437P			F442N		S447P			C464I	A467V
1088		E437P			F442N		S447P			C464I	A467V
1089		E437P			F442N					C464I	A467V
1090		E437P			F442N					C464I	A467V
1091		E437P			F442N					C464I	A467V
1092		E437P			F442N					C464I	A467V
1093		E437P			F442N		S447P			C464I	A467V
1094		E437P			F442N		S447T			C464I	A467V
1095		E437P			F442N					C464I	A467V
1096		E437P			F442N		S447E			C464I	A467V
1097		E437P			F442N		S447K			C464I	A467V
1098		E437P			F442N		S447R			C464I	A467V
1099		E437P			F442N		S447P			C464I	A467V
1100		E437P			F442N		S447P			C464I	A467V
1101		E437P			F442N		S447S			C464I	A467V

[00200] Várias atividades das variantes ALD foram determinadas e são mostradas na Tabela 2.

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Tabela 2: Atividades de variantes ALD exemplificativas.

Variante	Mutações relativas ao tipo selvagem Aid	Pequena Escala In vivo Produção¹1,3 BDO	3HBCoA /A Especi fi cidade cCoA²	Aldeído R-3HB /Aldeído S-3HB	Atividade especi fica³
12	D12A, I139S, M204R, R396H	sim
16	D12A, C33R, I139S, C174S, C189A, M204R, C220V, C267A, C353A, C356T, R396H, C464V
17	D12A, I139V, T143N, G167S, C174S, M204R, C220V, T230R, C267A, C356T, R396H, F429Y, F442T, E437P, C464I, A467V
30	E129I, C174S, C220V, C267A, C356T, R396H, C464I, A467V	*
34	D12A, I139S, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, C464I	Sim
56	D12A, I139S, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429Y,, E437P, F442T, C464I, A467V	sim
71	Y107K, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, C464I, A467V
80	Y107K, C174S, C220V, C267A, C356T, C464I	*
93	D12A, I139S, C174S, M204R, T230R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429Y, F442T, E437P, C464I, A467V	*
156	D12A, Y107K, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, C464I, A467V	*
166	D12A, Y107K, C174S, C220V, C267A, C356T, C464I	*
180	D12A, I139S, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, C464I, A467V	*
182	C174S, M204R, C220V, A243P, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V	*
184	D12A, I139S, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V	*
194	I139S, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V	*
199	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429Q., E437P, C464I, A467V	*
203	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429Y, E437P, F442T, C464I, A467V	*
205	D12A, I139S, C174S, M204R, C220V, A243P, C267A, C356T, R396H, F429Y, F442T, E437P, C464I, A467V	*
208	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442Y, C464I, A467V	*

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177/204

213	T143S, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V	*
235	D12A, I139S, C174S, M204R, C220V, A243P, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V	*
240	D12A, I139V, C174S, M204R, M227K, C220V, C267A, C356T, R396H, F429Y, F442T, E437P, C464I, A467V	*
321	D12V, I139S, M204R, R396H	*
598	D12A, I139S, C174S, M204R, M227Q., T230R, A243P, C220V, C267A, C356T, R396H, F429Y, F442T, E437P, C464I, A467V	Sim	+
45	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V	Sim	+++	+
951	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429H, E437P, F442H, C464I, A467V		+	+
952	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429M, E437P, F442H, C464I, A467V		+
953	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429M, E437P, F442N, C464I, A467V		+
954	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429Q., E437P, C464I, A467V		+
955	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	Sim	+++	+
957	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442Q., C464I, A467V		+	+
958	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, I444V, C464I, A467V		+	+
959	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, T440H, F442N, C464I, A467V		+	+
960	V19I, D122N, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429D, E437P, F442Q., E450E, C464I, A467V		+
961	C174S, M204R, C220V, C267A, V315A, C356T, R396H, E437P, T440H, F442N, C464I, A467V		+	+
975	D12A, I139V, C174S, M204R, C220V, M227Q., T230R, A243P, C267A, C356T, R396H, F429Y, F442T, E437P, C464I, A467V	Sim
991	D12A, I139L, T143N, C174S, M204R, C220V, T230R, A243P, C267A, C356T, R396H, F429Y, F442T, E437P, C464I, A467V
992	A73S, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M,S447M, C464I, A467V		+	'+
993	C174S, M204R, C220V, A254T, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, C464I, A467V		+
994	V163C, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, C464I, A467V		+
995	C174S, M204R, C220V,K 229S, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V		+
996	C174S, M204R, C220V, C267A, C356L,		+

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178/204

R396H, E437P, F442N, C464I, A467V

R396H, Ε437Ρ, F442N, C464I, A467V

997	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, T441G, I44L, C464I, A467V		+
998	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, C464I, A467V		+	'+
999	K65A, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V		+
1000	V163C, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V		+	'+
1001	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, R460K,C464l, A467V		+
1002	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, S447M, C464I, A467V	Sim	+	'+
1003	G155G, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442F, C464I, A467V
1004	P145P, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V
1005	G244G, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V
1006	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, V432V, E437P, C464I, A467V
1015	C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++		-
1016	C174S, M204R, C220V, T230R, A243Q., C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++		-
1017	C174S, M204R, C220V, T230H, A243Q., C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++		-
1018	C174S, M204R, C220V, T230A, A243E, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++		-
1019	C174S, M204R, C220V, T230M, A243S, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++		-
1020	C174S, M204R, C220V, T230H, A243N, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++		-
1021	C174S, M204R, C220V, M227V,T230C, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++		-
1022	C174S, M204R, C220V, M227V,T230H, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++		-
1023	C174S, M204R, C220V, M227l,T230L, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++		-
1024	C174S, M204R, C220V, M227IJ230C, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++		-

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 514/565

179/204

1025	C174S, M204R, C220V, T230M, A243E, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1026	C174S, M204R, C220V, T230S, A243Q., C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1027	C174S, M204R, C220V, M227I, T230A, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1028	C174S, M204R, C220V,T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	-	-
1029	C174S, M204R, C220V, T230Y, A243Q., C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1030	C174S, M204R, C220V, T230G, A243Q., C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1031	C174S, M204R, C220V, T230M, A243K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1032	C174S, M204R, C220V, T230T, A243L,C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1033	C174S, M204R, C220V, T230l,C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1034	C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H,F429L,V432N, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1035	C174S, M204R, C220V, T230H, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1036	C174S, M204R, C220V, T230Y,A243E, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1037	K72N,C174S, M204R, C220V,A243S, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1038	C174S, M204R, C220V, T230C,A243K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1039	C174S, M204R, C220V, T230H,A243K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1040	C174S, M204R, C220V, T230H,A243C, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1041	C174S, M204R, C220V, T230A,A243Q, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1042	C174S, M204R, C220V, T230S,A243C, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1043	C174S, M204R, C220V, M227V,T230S, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 515/565

180/204

1044	C174S, M204R, C220V, T230H, A243M, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1045	C174S, M204R, C220V, T230A, A243K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1046	C174S, M204R, C220V, T230W, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1047	C174S, M204R, C220V, M227C,T230R, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1048	C174S, M204R, C220V, M227L,T230N, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1049	C174S, M204R, C220V, T230N, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1050	C174S, M204R, C220V, M227C, T230L, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1051	C174S, M204R, C220V, T230V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1052	C174S, M204R, C220V, T230L, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1053	C174S, M204R, C220V, M227C, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+	-
1054	C174S, M204R, C220V, M227C, T230V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1055	C174S, M204R, C220V, T230T, A243N, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1056	C174S, M204R, C220V, T230T, A243I, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1057	C174S, M204R, C220V, T230T,A243C, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+	-
1058	C174S, M204R, C220V, T230G, A243K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1059	C174S, M204R, C220V, T230R, A243K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1060	C174S, M204R, C220V, M227L, A243P, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+	-
1061	C174S, M204R, C220V, M227A, A243P, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1062	C174S, M204R, C220V, A243Q., C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+	-

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 516/565

181/204

1063	C174S, M204R, C220V, T230Q., C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1064	C174S, M204R, C220V, T230N, A243I, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1065	C174S, M204R, C220V, T230C, A243C, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1066	C174S, M204R, C220V, M227I, T230R, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1067	C174S, M204R, C220V, M227I, A243L, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1068	C174S, M204R, C220V, M227I, A243M, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1069	C174S, M204R, C220V, A243M, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1070	C174S, M204R, C220V, M227V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1071	C174S, M204R, C220V, M227C, A243Q., C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1072	C174S, M204R, C220V, T230R, A243C, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1073	C174S, M204R, C220V, T230L, A243M, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1074	C174S, M204R, C220V, T230I, A243M, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+++	-
1075	C174S, M204R, C220V, T230M, A243Q., C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1076	C174S, M204R, C220V, M227L, T230W, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1077	C174S, M204R, C220V, T230V, A243M, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1078	C174S, M204R, C220V, M227V, T230I, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'++	-
1079	A73D, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447P, C464I, A467V	sim	'++	'+

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 517/565

182/204

1080	A73G, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447H, C464I, A467V	sim	'+	-
1081	A73L, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447K, C464I, A467V	sim	'+	-
1082	A73Q., C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447R, C464I, A467V	sim	'++	-
1083	A73F, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447K, C464I, A467V	sim	'+	-
1084	A73G, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447K, C464I, A467V	sim	'+	-
1085	A73E, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447K, C464I, A467V	sim	'+	-
1086	A73W, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447R, C464I, A467V	sim	'++	-
1087	V163G, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447P, C464I, A467V	sim	'+	-
1088	V163T, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447P, C464I, A467V	sim	'+	-
1089	C174S, M204R, C220V, M227L, T230S, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+	-
1090	C174S, M204R, C220V, A243E, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+	'+
1091	C174S, M204R, C220V, T230T, A243E, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+	-
1092	C174S, M204R, C220V, A243K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+	'+
1093	A73L, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447P, C464I, A467V	sim	'+	'+
1094	C464I, A467V	sim	'+	'+
1095	A73C, V163C, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	sim	'+	'+
1096	V163C, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447E, C464I, A467V	sim	'+	-

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 518/565

183/204

1097	A73W, V163C, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447K, C464I, A467V	sim	'+	'+
1098	A73M, V163C, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447R, C464I, A467V	sim	'+	'+
1099	V163C, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447P, C464I, A467V	sim	'+	'+
1100	A73F, V163C, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447P, C464I, A467V	sim	'+	-
1101	V163C, C174S, M204R, C220V, M227I, T230K, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, S447S, C464I, A467V	sim	'+++	-

i* ativo em outros dióis 2'- = especificidade < Γ ' += especificidade entre 1,0-2,0' '++ = especificidade entre 2.0-3,0' '+++ = especificidade >3,0

3'- = atividade relativa < Γ '+ = atividade relativa >1'

[00201] Atividades adicionais de variantes ALD exemplificativas são mostradas na Tabela 3. Níveis de produção de 1,3-BDO em 48 horas foram obtidos com variantes ALD superiores a 50 g/litro, superiores a 60 g/litro, superiores a 70 g/litro, superior a 80 g/litro e superior a 90 g/litro.

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 519/565

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Tabela 3. Atividades de variantes de ALD exemplificativas.

Variante	Mutações Relativas ao Aid do Tipo Selvagem	Atividade Enzimática estável em Lisados Brutos	Preferência de cofator	Especificidade 3HBCoA/ AcCoA	Aldeído R-3HB/ Aldeído S-3HB	1,3-BDO aumentado produzido in vivo	Atividade de enzima aumentada in vitro
45	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V	+	NADH	+	+		+
951	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429H, E437P, F442H, C464I, A467V	+	NADH	+	+		+
952	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429M, E437P, F442H, C464I, A467V	+	NADH	+			+
953	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429M, E437P, F442N, C464I, A467V	+	NADH	+			+
954	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429Q, E437P, C464I, A467V	+	NADH	+			+
955	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+	NADH	+	+		+
957	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442Q, C464I, A467V	+	NADH	+	+		+
958	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, I444V, C464I, A467V	+	NADH	+	+		+
959	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, T440H, F442N, C464I, A467V	+	NADH	+	+		+
960	V19I, D122N, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, F429D, E437P, F442Q, E450E, C464I, A467V	+	NADH	+			+
961	C174S, M204R, C220V, C267A, V315A, C356T, R396H, E437P, T440H, F442N, C464I, A467V	+	NADH	+	+		+
962	A73S, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M,S447M, C464I, A467V	+		+		+
963	C174S, M204R, C220V, A254T, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, C464I, A467V	+		+		+
964	V163C, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, C464I, A467V	+		+		+
965	C174S, M204R, C220V,K229S, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+		+		+
966	C174S, M204R, C220V, C267A, C356L, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+		+		+
967	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, T441G, I44L, C464I, A467V	+		+		+
968	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, C464I, A467V	+		+		+

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 520/565

185/204

Variante	Mutações Relativas ao Aid do Tipo Selvagem	Atividade Enzimática estável em Lisados Brutos	Preferência de cofator	Especificidade 3HBCoA/ AcCoA	Aldeido R-3HB/ Aldeido S-3HB	13-BDO aumentado produzido in vivo	Atividade de enzima aumentada in vitro
969	K65A, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+		+		+
970	V163C, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+		+		+
971	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, R460K,C464l, A467V	+		+		+
972	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442M, S447M, C464I, A467V	+		+		+
598	D12A, 11395, C174S, M204R, M227Q, T230R, A243P, C220V, C267A, C356T, R396H, F429Y, F442T, E437P, C464I, A467V	+	NADH/NADPH	+			+
973	C174S, M204R, C220V, C267A, A243K, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+	NADH	+			+
974	Y107N, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+	NADPH	+			+
975	D122G, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+	NADPH	+			+
976	C174S, M204R, C220V, C267A, S349T, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+		+			+
977	C174S, N201D, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V	+		+			+
978	C174S, M204R, C220V, C267A, D313R, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V		NADH	+			+
979	C174S, M204R, C220V, C267A, P348G, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V		NADH	+			+
980	C174S, M204R, C220V, C267A, C356L, R396H, E437P, C464I, A467V		NADH	+			+
981	C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, A360K, R396H, E437P, C464I, A467V		NADH	+			+
982	C174S, M204R, C220V, A243K, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V		NADH	+			+
983	C174S, M204R, C220V, K258W, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V		NADH	+			+
984	Y107N, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V		NADH	+			+
985	C174S, M204R, C220V, N223Q, C267A, C356T, R396H, E437P, C464I, A467V		NADH	+			+
986	S131A, C174S, M204R, C220V, C267A, C356T, R396H, E437P, F442N, C464I, A467V		NADH	+			+

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[00202] Tais variantes de aldeido desidrogenase, como descritas acima, podem ser usadas para produzir um estereoisômero de R-3-hidroxibutiraldeido ou uma mistura de formas R e S com uma proporção maior da forma R. Tal estereoisômero pode ser utilizado para produzir estereoisômeros de produtos a jusante, como o R-1,3butanodiol. Tais estereoisômeros têm utilidade como produtos farmacêuticos ou nutracêuticos.

[00203] Estes resultados demonstram a produção de variantes de aldeido desidrogenase com propriedades desejáveis, úteis para a produção comercial de 3hidroxibutiraldeido, 1,3-butanodiol, 4-hidroxibutiraldeido ou 1,4-butanodiol ou outros produtos desejados que são produzidos por vias metabólicas compreendendo uma aldeido desidrogenase.

[00204] As variantes descritas acima são baseadas na sequência parental ALD-1. Entende-se que as posições variantes dos aminoácidos, como mostrado nas Tabelas 1, 2 ou 3, podem ser aplicadas a sequências homólogas de aldeido desidrogenase. A Tabela 4 fornece sequências ALD exemplificativas com base na homologia. Um especialista na técnica compreenderá prontamente que tais sequências podem ser analisadas com métodos de rotina e bem conhecidos para alinhar sequências (por exemplo, BLAST, blast.ncbi.nlm.nih.gov; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403410 (1990) ) . Além disso, sequências ALD homólogas adicionais podem ser identificadas pesquisando bancos de dados de sequências disponíveis ao público, como os encontrados no

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187/204 banco de dados GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI), European Molecular Biology Laboratory (EMBL), ExPasy Prosite ou outros bancos de dados de sequência disponíveis publicamente usando BLAST. Tais alinhamentos podem fornecer informações sobre residuos conservados que podem ser utilizados para identificar uma sequência de consenso para preservar a atividade enzimática, bem como posições para gerar outras variantes enzimáticas.

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Tabela 4. Sequências exemplificativas de aldeido desidrogenase (ALD).

butiraldeído desidrogenase [Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4(HMT)]	AAP42563.1 GI:31075383 (SEQ ID NO: 7)
proteína hipotética ROSEINA2194_01708 [Roseburia inulinivorans DSM 16841]	EEG94445.1 (SEQIDNO: 8)
aldeido desidrogenase [Bacillus sp. FJAT-21945]	KOP84001.1 (SEQIDNO: 9)
aldeido desidrogenase [Bacillus solani]	KQL21940.1 (SEQ ID NO: 10
aldeido desidrogenase [Terrisporobacter othiniensis]	WP_039679531.1 (SEQIDNO: 11)
aldeido desidrogenase [Roseburia inulinivorans DSM 16841]	ABC25528.1 GI:83596371 (SEQIDNO: 12)
propionaldeído desidrogenase [Clostridium sp. ASF502]	WP_004073235.1 (SEQIDNO: 13)
aldeido desidrogenase [[Bacillus] selenitireducens]	WP_013174003.1 (SEQIDNO: 14)
aldeido desidrogenase [Blautia obeum]	WP_005427729.1 (SEQIDNO: 15)
proteína hipotética CFOBOF_07248 [[Clostridium] bolteae ATCC BAA-613]	EDP 12494.1 (SEQ ID NO: 16)
aldeido desidrogenase [Jeotgalibacillus alimentarius]	WP_041123321.1 (SEQIDNO: 17)
aldeido desidrogenase (NAD) proteína familiar [[Clostridium] hiranonis DSM 13275]	EEA85935.1 (SEQIDNO: 18)
MULTIESPÉCIES: Aldeido desidrogenase [Thermoanaerobacter]	WP_003870148.1 (SEQIDNO: 19)
MULTIESPÉCIES: Aldeido desidrogenase [Clostridiales]	WP_008705584.1 (SEQ ID NO. 20)

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aldeído Dehydrogenase [Sebaldella termitidis ATCC 33386]	ACZ07905.1 (SEQID NO: 21)
propionaldeído desidrogenase [Eubacterium plexicaudatum]	WP_004061597.1 (SEQID NO: 22)
MULTIESPÉCIES: Aldeído desidrogenase [Escherichia]	WP_000997839.1 (SEQID NO: 23)
aldeído desidrogenase [Rhodospirillum rubrum]	WP_011388669.1 (SEQID NO: 24)
aldeído desidrogenase [Clostridium beijerinckii]	WP 012060202.1 (SEQID NO: 25)
aldeído desidrogenase [[Eubacterium] hallii]	WP_005344386.1 (SEQID NO: 26)
aldeído desidrogenase [Vibrio sp. EJY3]	WP 014232054.1 (SEQID NO: 27)
aldeído desidrogenase [Rhodopseudomonas palustris BisB18]	ABD86737.1 (SEQID NO: 28)
aldeído desidrogenase EutE [Desulfatibacillum alkenivorans]	WP 015949695.1 (SEQID NO: 29)
aldeído desidrogenase Aid [Clostridium saccharobutylicum]	WP 022747467.1 (SEQID NO: 30)
aldeído desidrogenase [Clostridium sp. DL-VIII]	WP 009171375.1 (SEQID NO: 31)
aldeído desidrogenase EutE [Clostridium taeniosporum]	WP 069679818.1 (SEQID NO: 32)
aldeído desidrogenase [Clostridium botulinum]	WP 012425099.1 (SEQID NO: 33)
aldeído desidrogenase [Clostridium botulinum]	WP 035786720.1 (SEQID NO: 34)
aldeído desidrogenase [Clostridium botulinum]	WP 039308447.1 (SEQID NO: 35)

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aldeído desidrogenase [Clostridium botulinum]	WP 035792132.1 (SEQIDNO: 36)
aldeído desidrogenase [Clostridium pasteurianum]	WP 023973059.1 (SEQIDNO: 37)
Aldeído desidrogenase NAD-dependente [Clostridium saccharoperbutylacetonicum]	WP_015395720.1 (SEQIDNO: 38)
MULTIESPÉCIES: Aldeído desidrogenase [Clostridium]	WP 023975647.1 (SEQIDNO: 39)
aldeído desidrogenase [Clostridium beijerinckii]	WP 026888070.1 (SEQIDNO: 40)
Clostridium beijerinckii, cepa NRRL B593, proteína hipotética, aldeído desidrogenase acilante da coenzima A (ald), acetoacetato: butirato/acetato coenzima A transferase (ctfA), acetoacetato: genes do butirato/acetato coenzima A transferase (ctfBar) (decbox305) AF132754)	AF157306.2 (SEQIDNO:41)
aldeído desidrogenase [Clostridium beijerinckii]	WP 012059995.1 (SEQIDNO: 42)
aldeído desidrogenase [Clostridium beijerinckii]	WP_041898834.1 (SEQIDNO: 43)
aldeído desidrogenase [Clostridium beijerinckii]	WP 017211959.1 (SEQIDNO: 44)
aldeído desidrogenase EutE [Clostridium beijerinckii]	WP 065419149.1 (SEQIDNO: 45)
aldeído desidrogenase NAD-dependente [Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1 -4(HMT)] >gb\|AGF59413.11NADdependent Aldeído desidrogenase [Clostridium saccharoperbutylacetonicum NI-4(HMT)]	YP 007458667.1 GI:451822466 (WP-015395720.1) (SEQIDNO: 46)
aldeído desidrogenase [Clostridium beijerinckii NCIMB 8052] > gb \| AAQ12068.11 coenzima a aldeído desidrogenase acilante [Clostridiumbeijerinckii NCIMB 8052]> gb \| AAQ12072.11 coenzima a aldeído desidrogenase acilante [Clostridium beijerinckii] > gb \| AAT48939.11 aldeído desidrogenase [Clostridium beijerinckii] > gb \| AAT66436.11 coenzima A- acilante aldeído desidrogenase [Clostridium beijerinckii] > gb \| ABR35947.11 aldeído desidrogenase [Clostridium beijerinckii NCIMB 8052]	YP_001310903.1 GI: 150018649 (WP_012059995.1) (SEQIDNO: 47)
coenzima a aldeído desidrogenase acilante [Clostridium beijerinckii]	AAD31841.1 GL4884855 (SEQ ID NO: 48)

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Acetaldeído desidrogenase (acetilação) [Clostridium sp. DL-VHI]> gb \| EHJ00721.11 Acetaldeído desidrogenase (acetilação) [Clostridium sp. DL-VHI]	ZP_09206127.1 GI:359413662 (SEQ ID NO: 49)
coenzima a aldeido desidrogenase acilante [Clostridium saccharobutylicum]	CAQ57983.1 GI: 189310620 (SEQIDNO: 50)
proteína de utilização de etanolamina EutE [Clostridium botulinum B str. Eklund 17B] > gb \| ACD24339.11 proteína de utilização de etanolamina EutE [Clostridium botulinum B str. Eklund 17B]	YP_001886323.1 GI: 187934965 (WP_012425099.1) (SEQIDNO: 51)
aldeido desidrogenase [Caldalkalibacillus thermarumTA2.Al]> gb \| EGL82399.11 aldeido desidrogenase [Caldalkalibacillus thermarum TA2. A1 ]	ZP_08533507.1 GI:335040377 (SEQIDNO: 52)
Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans DSM 17108] > ref \| ZP_15517111.11 Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans B4]> ref \| ZP_15521980.11 Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans B3]> ref \| ZP_15526533.11 Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans A12]> ref \| ZP_15534416.11 Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans Al 1] > gb \| EIW18982.1 \| Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans B4]> gb \| EIW21808.1 \| Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans Al 1] > gb \| EIW29163.11 Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans DSM 17108] > gb \| EIW35484.11 Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans B3]> gb \| EIW36902.11 Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans A12]	ZP_10327808.1 GI:392962372 (SEQIDNO: 53)
Aldeido desidrogenase dependente de NAD [Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M0795]> gb \| AGB19701.11 Aldeido desidrogenase dependente de NAD [Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M0795]	YP_007299398.1 GI:433655690 (WP_015312185.1) (SEQIDNO: 54)
Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans JBW45]> gb \| EIW48189.11 Aldeido desidrogenase [Pelosinus fermentans JBW45]	ZP_15537951.1 GI:421076976 (SEQIDNO: 55)
proteína da família aldeido desidrogenase [Desulfosporosinus sp. OT]> gb \| EGW35902.11 proteína da família aldeido desidrogenase [Desulfosporosinus sp. OT]	ZP_08814704.1 GI:345862484 (SEQIDNO: 56)
proteína hipotética CLOSTMETH_00016 [Clostridium methylpentosum DSM 5476] >gb\|EEG32278.1\| proteína hipotética CLGSTMETH_00016 [Clostridium methylpentosum DSM 5476]	ZP_03705305.1 GL225016072 (SEQ ID NO: 57)

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Aldeído desidrogenase [ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumJW/SL-YS485] >gb\|AFK85255.1\| aldeído desidrogenase [Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485]	YP_006390854.1 GI:390933349 (WP 014757178.1) (SEQIDNO: 58)
acetaldeído desidrogenase [Thermoanaerobacterium xylanolyticum LX-11 ] >gb\|AEFl 8105.11 acetaldeído desidrogenase (acetilação) [Thermoanaerobacterium xylanolyticum LX-11]	YP_004471777.1 GI:333897903 (WP 013788835.1) (SEQIDNO: 59)
Aldeído desidrogenase EutE [Acetonema longum DSM 6540] >gb\|EGO64744.1\| Aldeído desidrogenase EutE [Acetonema longumDSM 6540]	ZP_08623980.1 GI:338811775 (SEQ ID NO: 60)
proteína de utilização de etanolamina eutE [Geobacillus thermoglucosidans TNO-09.020]> gb \| EID44455.11 proteína de utilização de etanolamina eutE [Geobacillus thermoglucosidans TNO-09.020]	ZP_17694107.1 GI:423719925 (SEQIDNO: 61)
Aldeído desidrogenase [Geobacillus sp. Y4.1MC1] >gb\|ADP74637.1\| aldeído desidrogenase [Geobacillus sp. Y4.1MC1]	YP_003989248.1 GI:312110932 (WP_013400810.1) (SEQIDNO: 62)
acetaldeído desidrogenase [Geobacillus thermoglucosidasius C56-YS93] >gb\|AEH47899.1\| acetaldeído desidrogenase (acetilação) [Geobacillus thermoglucosidasius C56-YS93]	YP_004587980.1 GI:336235364 (WP_013876899.1) (SEQ ID NO: 63)
Aldeído desidrogenase EutE [Bacillus azotoformans LMG 9581] >gb\|EKN64472.1\| Aldeído desidrogenase EutE [Bacillus azotoformans LMG 9581]	ZP_11313951.1 GI:410460269 (SEQIDNO: 64)
putativo aldeído desidrogenase, proteína de utilização de etanolamina [[Clostridium] sticklandii] >emb\|CBH20800.1\| putativo aldeído desidrogenase, proteína de utilização de etanolamina [[Clostridium] sticklandii]	YP_003935705.1 GI:310657984 (WP_013360893.1) (SEQIDNO: 65)
aldeído desidrogenase [Thermincola potens JR] >gb\|ADG81503.1\| aldeído desidrogenase [Thermincola potens JR]	YP_003639404.1 GL296132157 (WP_013119524.1) (SEQ ID NO: 66)

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propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Clostridium sp. D5] >gb\|EGB92558.1\| propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Clostridium sp. D5]	ZP_08130302.1 GI:325263568 (SEQ ID NO: 67)
acetaldeído desidrogenase (acetilação) [Fusobacterium sp. 3_1_33] >gb\|EEW94895.1\| acetaldeído desidrogenase (acetilação) [Fusobacterium sp. 3_1_33]	ZP_05815063.1 GI:260494934 (SEQIDNO: 68)
proteína de utilização de etanolamina eutE [Fusobacterium sp. 7_ 1 ] >gb\|EEO43449.11 proteína de utilização de etanolamina eutE [Fusobacterium sp. 7_1]	ZP_04573939.1 GI:237743458 (SEQIDNO: 69)
propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Ruminococcus sp. SR1/5] >emb\|CBL20089.1\| propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Ruminococcus sp. SR1/5]	YP_007783752.1 GI:479153977 (WP_015525955.1) (SEQIDNO: 70)
proteína hipotética HMPREF9942_01197 [Fusobacterium nucleatum subsp. animalis F0419] >gb\|EH078009.1\| proteína hipotética HMPREF9942_01197 [Fusobacterium nucleatum subsp. animalis F0419]	ZP_17125059.1 GI:423137416 (SEQIDNO: 71)
possível aldeido desidrogenase [Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953] >gb\|EDK87521.1\| possível aldeido desidrogenase [Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953]	ZP_04969437.1 GI:254302079 (SEQ ID NO: 72)
proteína de utilização de etanolamina eutE [Fusobacterium sp. D11 ] >gb\|EFD80567.11 proteína de utilização de etanolamina eutE [Fusobacterium sp. Dl 1]	ZP_06524378.1 GI:289765000 (SEQIDNO: 73)
Aldeido desidrogenase EutE [Fusobacterium nucleatum ChDC F128] >gb\|EJU08233.1\| Aldeido desidrogenase EutE [Fusobacterium nucleatum ChDC F128]	ZP_15972610.1 GI:421526001 (SEQ ID NO: 74)
propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum F0401] >gb\|EHG19190.1\| propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum F0401]	ZP_16419680.1 GI:422338720 (SEQIDNO: 75)
propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Fusobacterium sp. 11_3_2] >gb\|EGN65750.1\| CoA-dependent propionaldeído desidrogenase [Fusobacterium sp. 11_3_2]	ZP_08600044.1 GL336419790 (SEQ ID NO: 76)

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 529/565

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proteína hipotética CLOSTASPAR_02210 [Clostridium asparagifomie DSM 15981] >gb\|EEG55710.1\| proteína hipotética CLOSTASPAR_02210 [Clostridium asparagifornie DSM 15981]	ZP_03758198.1 GI:225388474 (SEQ ID NO: 77)
aldeído desidrogenase [Clostridium phytofermentans ISDg] >gb\|ABX41556.1\| aldeído desidrogenase_ [Clostridium phytofermentans ISDg]	YP 001558295.1 GI: 160879327 (WP 012199204.1) (SEQIDNO: 78)
propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Fusobacterium sp. 1_1_41FAA] >gb\|EFG28139.1\| propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Fusobacterium sp. 1_1_41FAA]	ZP_06748808.1 GI:294783484 (SEQIDNO: 79)
proteína hipotética HMPREF0991_01940 [Eachnospiraceae bacterium 2_1_58FAA] >gb\|EGN47419.1\| proteína hipotética HMPREF0991_01940 [Eachnospiraceae bacterium 2_1_58FAA]	ZP_08612821.1 GI:336432991 (SEQIDNO: 80)
proteína hipotética RUMGNA_01022 [Ruminococcus gnavus ATCC 29149] >gb\|EDN78612.1\| Aldeído desidrogenase (NAD) proteína familiar [Ruminococcus gnavus ATCC 29149]	ZP_02040258.1 GI: 154503198 (SEQIDNO: 81)
propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Ruminococcus obeum A2-162] >emb\|CBE23217.1\| propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Ruminococcus obeum A2-162]	YP_007805199.1 GI:479177598 (WP 015542038.1) (SEQIDNO: 82)
aldeído desidrogenase [Clostridium saccharolyticumWMl] >gb\|ADE04402.1\| aldeído desidrogenase [Clostridium saccharolyticum WM1]	YP_003822025.1 GI:302386203 (WP_013272491.1) (SEQIDNO: 83)
aldeído desidrogenase proteína familiar [Flavoniffactor plautii ATCC 29863] >gb\|EHM40040.11 Aldeído desidrogenase proteína familiar [Havonifractor plautii ATCC 29863]	ZP_09385796.1 GI:365844997 (SEQ ID NO: 84)
proteína hipotética RUMGBE_00094 [Ruminococcus obeum ATCC 29174] >gb\|EDM88971.11 Aldeído desidrogenase (NAD) proteína familiar [Ruminococcus obeum ATCC 29174]	ZP 01962381.1 GI: 153809713 (SEQIDNO: 85)

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aldeído desidrogenase [Clostridium carboxidivorans P7] >ref\|ZP_06856832.11 Aldeído desidrogenase (NAD) proteína familiar [Clostridium carboxidivoransP7] >gb\|EET88516.1\| aldeído desidrogenase [Clostridium carboxidivorans P7] >gb\|EFG86154.1\| Aldeído desidrogenase (NAD) proteína familiar [Clostridium carboxidivorans P7] >gb\|ADO12117.1\| CoAacylating Aldeído desidrogenase [Clostridium carboxidivorans P7]	ZP 05391061.1 GI:255524100 (SEQID NO: 86)
proteína hipotética FUAG_00592 [Fusobacterium ulcerans ATCC 49185] >gb\|EFS25077.11 proteína hipotética FUAG_00592 [Fusobacteriumulcerans ATCC 49185]	ZP_10974295.1 GI:404368948 (SEQ ID NO: 87)
proteína hipotética HMPREF0402_00608 [Fusobacterium sp. 12_1B] >gb\|EHO83590.1\| proteína hipotética HMPREF0402_00608 [Fusobacterium sp. 12_1B]	ZP_09586735.1 GI:373496187 (SEQID NO: 88)
aldeído desidrogenase [Clostridium carboxidivorans P7] >ref\|ZP_06855343.1\| Aldeído desidrogenase (NAD) proteína familiar [Clostridium carboxidivorans P7] >gb\|EET85788.1\| aldeído desidrogenase [Clostridium carboxidivorans P7] >gb\|EFG87815.1\| Aldeído desidrogenase (NAD) proteína familiar [Clostridium carboxidivorans P7]	ZP_05393779.1 GI:255526882 (SEQID NO: 89)
propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Clostridium cf. saccharolyticum K10] >emb\|CBK77787.1\| propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Clostridium cf. saccharolyticum K10]	YP_007849785.1 GI:479338567 (WP_015574070.1) (SEQID NO: 90)
proteína de utilização de etanolamina eutE [Fusobacterium varium ATCC 27725] >gb\|EES62817.11 proteína de utilização de etanolamina eutE [Fusobacterium varium ATCC 27725]	ZP_08693593.1 GI:340756989 (SEQID NO: 91)
aldeído desidrogenase proteína familiar [Clostridium celatum DSM 1785] >gb\|EKY29259.1\| Aldeído desidrogenase proteína familiar [Clostridium celatum DSM 1785]	ZP_19296595.1 GI:429764274 (SEQID NO: 92)
propionaldeído desidrogenase [Clostridium sp. ASF502]	EMZ20682.1 GI:476613570 (SEQID NO: 93)
proteína hipotética HMPREF0988_02063 [Lachnospiraceae bacterium 1_4_56FAA] >gb\|EGN36620.1\| proteína hipotética HMPREF0988_02063 [Lachnospiraceae bacterium 1_4_56FAA]	ZP_08616478.1 GI:336436768 (SEQ ID NO: 94)
proteína hipotética HMPREF0994_03038 [Lachnospiraceae bacterium 3_1_57FAA_CT1] >gb\|EGN40215.1\| proteína hipotética HMPREF0994_03038 [Lachnospiraceae bacterium 3_1_57FAA_CT1]	ZP_08607032.1 GI:336427027 (SEQID NO: 95)

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 531/565

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Aldeido desidrogenase [Ruminococcus sp. 5_1_39B_FAA] >gb\|EES77009.1\| Aldeido desidrogenase [Ruminococcus sp. 5_1_39BFAA]	ZP_04856816.1 GI:253579547 (SEQIDNO: 96)
proprionaldeído desidrogenase dependente de CoA PduP [Acetobacterium woodii DSM 1030] >gb\|AFA49334.1\| proprionaldeído desidrogenase dependente de CoA PduP [Acetobacterium woodii DSM 1030]	YP_005270223.1 GI:379012411 (WP_014356934.1) (SEQIDNO: 97)
proteína de utilização de etanolamina EutE [Clostridium botulinum E1 str. 'BoNT E Belugá] >gb\|EES5022E 11 proteína de utilização de etanolamina EutE [Clostridium botulinum E1 str. 'BoNT E Belugá]	ZP_04822936.1 GI:251780016 (SEQIDNO: 98)
proteína de utilização de etanolamina EutE [Clostridium botulinum B str. Eklund 17B] >gb\|ACD22415.1\| proteína de utilização de etanolamina EutE [Clostridium botulinum B str. Eklund 17B]	YP_001885942.1 GI: 187933041 (WP_012423269.1) (SEQIDNO: 99)
proteína de utilização de etanolamina EutE [Clostridium botulinum E3 str. Alaska E43] >gb\|ACD53952.11 proteína de utilização de etanolamina EutE [Clostridium botulinum E3 str. Alaska E43]	YP_001921227.1 GI: 188590535 (WP_012451752.1) (SEQIDNO: 100)
propionaldeído desidrogenase [Eubacterium plexicaudatum ASF492]	EMZ27833.1 GI:476621007 (SEQIDNO: 101)
aldeido desidrogenase [Thermosediminibacter oceani DSM 16646] >gb\|ADL07333.1\| aldeido desidrogenase [Thermosediminibacter oceani DSM 16646]	YP_003824956.1 GI:302389135 (WP_013275382.1) (SEQ ID NO: 102)
proteína hipotética HMPREF1090_01637 [Clostridium clostridioforme 90A8]	ENZ17687.1 GI:480674262 (SEQIDNO: 103)
proteína hipotética HMPREF9467_03550 [Clostridium clostridioforme 2_1_49FAA] >gb\|EHG29726.11 proteína hipotética HMPREF9467_03550 [Clostridium clostridioforme 2_1_49FAA]	ZP_09116578.1 GI:357055510 (SEQIDNO: 104)
aldeido desidrogenase [Ilyobacter polytropus DSM 2926] >gb\|ADO84118.1\| aldeido desidrogenase [Hyobacter polytropus DSM 2926]	YP_003968466.1 GI:310780134 (WP_013388777.1) (SEQ ID NO: 105)

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 532/565

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proteína hipotética GCWU000342_00651 [Shuttleworthia sateües DSM 14600] >gb\|EEP29295.1\| proteína hipotética GCWU000342_00651 [Shuttleworthia satelles DSM 14600]	ZP_04454656.1 GI:229828587 (SEQIDNO: 106)
Aldeido desidrogenase [Clostridium beijerinckii NCIMB 8052] >gb\|ABR36155.1\| Aldeido desidrogenase [Clostridium beijerinckii NCIMB 8052]	YP_001311111.1 GI: 150018857 (WP_012060202.1) (SEQIDNO: 107)
propionaldeído desidrogenase [Clostridium clostridioforme CM201 ] >gb\|ENZ04399.11 propionaldeído desidrogenase [Clostridium clostridioforme 90B1] >gb\|ENZ17257.1\| propionaldeído desidrogenase [Clostridium clostridioforme 90A8] >gb\|ENZ22132.1\| propionaldeído desidrogenase [Clostridium clostridioforme 90A3] >gb\|ENZ29200.1\| propionaldeído desidrogenase [Clostridium clostridioforme 90A1] >gb\|ENZ64224.1\| propionaldeído desidrogenase [Clostridium clostridioforme 90A4] >gb\|ENZ70105.1\| propionaldeído desidrogenase [Clostridium clostridioforme 90A6]	ENY83847.1 GI:480639338 (SEQIDNO: 108)
Proteína do domínio aldeido desidrogenase (NAD) [Clostridium sp. MSTE9] >gb\|EJF40077.1\| Proteína do domínio aldeido desidrogenase (NAD) [Clostridium sp. MSTE9]	ZP_14663848.1 GI:420157008 (SEQ ID NO: 109)
propionaldeído desidrogenase [Clostridium bolteae 90B8] >gb\|ENZ57487.1\| propionaldeído desidrogenase [Clostridium bolteae 90A5] >gb\|ENZ67775.1\| propionaldeído desidrogenase [Clostridium bolteae 90B7]	ENZ31577.1 GI:480688660 (SEQIDNO: 110)
proteína hipotética EUBHAL_00514 [EubacteriumhaUii DSM 3353] >gb\|EEG37590.11 Aldeido desidrogenase (NAD) proteína familiar [EubacteriumhaUii DSM 3353]	ZP_03715465.1 GI:225026273 (SEQIDNO: 111)
propionaldeído desidrogenase acüado com CoA [Halanaerobium saccharolyticum subsp. saccharolyticum DSM 6643] >emb\|CCU77919.11 propionaldeído desidrogenase acüado com CoA [Halanaerobium saccharolyticum subsp. saccharolyticum DSM 6643]	ZP_23773859.1 GI:470960332 (SEQIDNO: 112)
proteína hipotética [EubacteriumlimosumKIST612] >gb\|ADO39014.1\| proteína hipotética ELI_4072 [Eubacterium limosum KIST612]	YP_003961977.1 GI:310829620 (WP_013382321.1) (SEQIDNO: 113)

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sp. X561] >ref\|YP_003903905.1\| Aldeido desidrogenase [Thermoanaerobacter sp. X513] >ref\|ZP_08212082.1\| aldeido desidrogenase [Thermoanaerobacter ethanolicus JW 200] >gb\|ABY93220.1\| Aldeido desidrogenase [Thermoanaerobacter sp. X514] >gb\|EFK84693.1\| aldeido desidrogenase [Thermoanaerobacter sp. X561] >gb\|ADN54614.1\| Aldeido Dehydrogenase [Thermoanaerobacter sp. X513] >gb\|EGD51928.1\| aldeido desidrogenase (Thermoanaerobacter ethanolicus JW 200]	GI: 167040571 (WP_003870148.1) (SEQIDNO: 114)
Aldeido desidrogenase [RhodospirillumrubrumATCC 11170] >ref\|YP_006047210.1\| Aldeido desidrogenase EutE [RhodospiriUumrubrum F11] >gb\|ABC21715.1\| Aldeido desidrogenase [RhodospiriUumrubrum ATCC 11170] >gb\|AEO47413.1\| Aldeido desidrogenase EutE [Rhodospirillum rubrum F11]	YP_426002.1 GI:83592250 (SEQIDNO: 115)
propionaldeído desidrogenase dependente de CoA [Eubacterium yurii subsp. margaretiae ATCC 43715] >gb\|EFM39950.1\| CoA- dependent propionaldeído desidrogenase [Eubacterium yurii subsp. margaretiae ATCC 43715]	ZP_07453625.1 GI:306819974 (SEQIDNO: 116)
Proteína do domínio aldeido desidrogenase (NAD) [Eubacterium sp. AS15] >gb\|EJP26117.11 Proteína do domínio aldeido desidrogenase (NAD) [Eubacterium sp. AS 15]	ZP_10828060.1 GI:402309064 (SEQIDNO: 117)
Aldeido desidrogenase EutE [Vibrio sp. EJY3] >gb\|AEX22176.1\| Aldeido desidrogenase EutE [Vibrio sp. EJY3]	YP_005023154.1 GI:375265711 (WP_014232054.1) (SEQIDNO: 118)
proteína hipotética HMPREF9629_00032 [Eubacteriaceae bacterium ACC19a] >gb\|EHL16790.1\| proteína hipotética HMPREF9629_00032 [Eubacteriaceae bacterium ACC19a]	ZP_09320518.1 GI:363893420 (SEQIDNO: 119)
proteína do domínio desidrogenase aldeído-álcool [Propionibacterium propionicum F0230a] >gb\| AFN47240.11 Proteína do domínio desidrogenase aldeído-álcool [Propionibacterium propionicum F0230a]	YP_006513121.1 GI:397671586 (WP_014847902.1) (SEQ ID NO: 120)
proteína hipotética HMPREF9628_01348 [Eubacteriaceae bacterium CM5] >gb\|EHL19659.1\| proteína hipotética HMPREF9628_01348 [Eubacteriaceae bacterium CM5]	ZP_09316712.1 GI:363889349 (SEQIDNO: 121)
Aldeido desidrogenase (NAD) proteína familiar [Eubacteriaceae bacterium OBRC8] >gb\|EJU23517.1\| Aldeido desidrogenase (NAD) proteína familiar [Eubacteriaceae bacterium OBRC8]	ZP_10886417.1 GI:402837902 (SEQIDNO: 122)
Aldeido desidrogenase [Clostridium beijerinckii]	(SEQ ID NO: 123)

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199/204

[00205] Entende-se que as variantes de ALD individuais, como as descritas acima, podem ser usadas sozinhas ou podem ser combinadas com qualquer outra posição de aminoácido variante, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, isto é, até todas as posições variantes de aminoácidos como aqui divulgadas (ver Tabelas de 1 a 3), para gerar variantes adicionais com atividades desejáveis. Exemplos de variantes de ALD incluem, entre outros, substituições únicas ou uma combinação de uma ou mais substituições, nas posições de aminoácidos divulgadas em qualquer uma das Tabelas de 1 a 3, por exemplo, nas posições dos aminoácidos 12, 19, 33, 44, 65, 72, 73, 107, 122, 129, 139, 143, 145, 155, 163, 167, 174, 189, 204, 220, 227, 229, 230, 243, 244, 254, 267, 315, 353, 356, 396, 429, 432, 437, 440, 441, 442, 444, 447, 450, 460, 464 ou 467 correspondendo à sequência de aminoácidos de ALD-1 (SEQ ID NO: 1) (consulte as Tabelas de 1 a 3) . Por exemplo, as variantes ALD incluem, entre outras, substituição de aminoácidos, substituições simples ou uma combinação de uma ou mais substituições, nas posições de aminoácidos D12, V19, C33, 144, K65, K72, A73, Y107, D122, E129, 1139, T143, P145,

G155, V163, G167, C174, C189, M204, C220, M227, K229, T230,

A243, G244, A254, C267, V315, C353, C356, R396, F429, E437,

T440, T441, F442, 1444, S447, E450, R460, C464 ou A467 correspondente à sequência de aminoácidos de ALD-1 (SEQ ID NO: 1) (consulte as Tabelas de 1 a 3) . Entende-se que qualquer substituição dos outros 19 aminoácidos pode ser feita em uma ou mais posições de aminoácidos desejadas.

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200/204

[00206] Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 12 que é D12A. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 19 que é VI91. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 33 que é C33R. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 44 que é I44L. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 65 que é K65A. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 72 que é K72N. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 73 selecionada de A73S, A73D, A73G, A73L, A73Q, A73F, A73E, A73W, A73R, A73C e A73M. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 107 que é Y107K. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 122 que é D122N. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 129 que é E129I. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 139 selecionada de 1139S, 1139V e 1139L. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 143 que é T143N ou T143S. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 163 selecionada de V163C, V163G e V163T. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 167 que é G167S. Em uma modalidade, a variante de ALD

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 536/565

201/204 compreende uma substituição de aminoácidos na posição 174 que é C174S. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 189 que é C189A. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 204 que é M204R. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 220 que é C220V. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 227 selecionada entre M227K, M227Q, M227I, M227V, M227C, M227L e M227A. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 22 9 que é K 229S. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 230 selecionada de T230R, T230K, T230H, T230A, T230M, T230C, T230L, T230S, T230Y, T230G, T230T, T230I, T230W, T230N, T230V e T230Q. Em um modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 243 selecionada de A243P, A243Q, A243E, A243S, A243N, A243K, A243L, A243C, A243M e A243I. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 254 que é A254T. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 267 que é C2 67A. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 315 que é V315A. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 353 que é C353A. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 35 6 que é C35 6T ou C35 6L. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na

Petição 870190097463, de 30/09/2019, pág. 537/565

202/204 posição 396 que é R396H. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 429 selecionada de F429Y, F429Q, F429H, F429M, F429D e F429L. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 432 que é V432V ou V432N. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 437 que é E437P. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 440 que é T440H. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 441 que é T441G. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 442 selecionada de F442T, F442Y, F442H, F442N, F442Q, F442M e F442F. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 444 que é I444V. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 447 selecionada de S447M, S447P, S447H, S447K, S447R, S447T, S447E e S447S. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 460 que é R4 60K. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 464 que é C464V ou C464I. Em uma modalidade, a variante de ALD compreende uma substituição de aminoácidos na posição 467 que é A467V. Qualquer uma das posições de aminoácidos acima descritas pode ser usada para substituições de aminoácidos simples ou uma combinação de uma ou mais das substituições, para gerar uma variante de ALD da invenção.

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203/204

[00207] Com base nos ensinamentos deste documento, um especialista na técnica pode identificar rapidamente as posições de aminoácidos correspondentes a qualquer uma das posições de aminoácidos 12, 19, 33, 44, 65, 72, 73, 107, 122, 129, 139, 143, 145 155, 163, 167, 174, 189, 204, 220, 227, 229, 230, 243, 244, 254, 267, 315, 353, 356, 396, 429, 432, 437, 440, 441, 442, 444, 447, 450, 460, 464 ou 467 correspondendo à sequência de aminoácidos de ALD-1 (SEQ ID NO: 1) em sequências homólogas de ALD. Por exemplo, como mostrado no alinhamento na Figura 4A, o aminoácido 1139 do ALD-1 corresponde ao aminoácido 1133 da SEQ ID NO: 13 e 20. Para a SEQ ID NO: 24, a posição correspondente é VI99. Usando métodos bem conhecidos para alinhar sequências de aminoácidos, geralmente usando parâmetros padrão como aqui divulgados, um especialista na técnica pode determinar rapidamente uma posição de aminoácido em outra sequência ALD que corresponde a qualquer uma das posições de aminoácidos 12, 19, 33, 44 , 65, 72, 73, 107, 122, 129, 139, 143,145, 155, 163, 167, 174, 189, 204, 220, 227, 229, 230, 243, 244, 254, 267, 315, 353, 356, 396, 429, 432, 437, 440, 441, 442, 444, 447, 450, 460, 464 ou 467 correspondendo à sequência de aminoácidos de ALD-1 (SEQ ID NO: 1).

[00208] Entende-se ainda que uma variante de ALD pode conter 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, ou seja, até todas posições de aminoácidos variantes como aqui divulgado, por exemplo, nas Tabelas de 1 a 3. Um especialista na técnica pode gerar facilmente uma variante de ALD com base em qualquer substituição única ou combinação de aminoácidos, como divulgado aqui, como as posições de variantes

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204/204 de aminoácidos descritas acima e nas Tabelas de 1 a 3. Em uma modalidade específica, as variantes ALD são as divulgadas nas Tabelas de 1 a 3.

[00209] Ao longo de todo este pedido, várias publicações foram mencionadas. As revelações dessas publicações em suas totalidades, incluindo as publicações de GenBank e de número GI, são neste documento incorporadas como referência neste pedido com a finalidade de descrever mais completamente o estado da técnica para o qual essa invenção pertence. Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos fornecidos acima, deve ser entendido que várias modificações poderão ser feitas sem se afastar do espírito da invenção.

Claims

1. Molécula isolada de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de ser selecionada de:

(a) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos referida como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4, em que a referida sequência de aminoácidos compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3;

(b) uma molécula de ácido nucleico que hibrida com o ácido nucleico de (a) sob condições de hibridação altamente rigorosas e compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3;

(c) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de consenso da alça A (SEQ ID NO: 5) e/ou alça B (SEQ ID NO: 6), em que a referida sequência de aminoácidos compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3; e (d) uma molécula de ácido nucleico que é complementar a (a) ou (b).

2. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de aminoácidos, exceto uma ou mais substituições de aminoácidos, tem pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98 % ou 99% da identidade da sequência, ou é idêntico, a uma sequência de aminoácidos referida na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4.

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3. Ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 das substituições de aminoácido estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3.

4. Vetor caracterizado pelo fato de que conter a molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.

5. Vetor, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido vetor é um vetor de expressão.

6. Vetor, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende DNA de fita dupla.

7. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos referida como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4, em que a referida sequência de aminoácidos compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3.

8. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos de consenso da alça A (SEQ ID NO: 5) e/ou alça B (SEQ ID NO: 6).

9. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos referida como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4, em que a referida sequência de aminoácidos compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos estabelecidas nas Tabelas 1, 2 e/ou 3, em que a referida sequência de aminoácidos, exceto

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3/14 uma ou mais substituições de aminoácidos, tem pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% da identidade da sequência ou é idêntica, a uma sequência de aminoácidos referida como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4.

10. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de aminoácidos compreende ainda uma substituição de aminoácidos conservativa de 1 a 100 posições de aminoácidos, em que as referidas posições são diferentes das uma ou mais substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3.

11. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de aminoácidos não compreende modificação de 2 a 300 posições de aminoácidos em comparação com a sequência parental, exceto uma ou mais substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3, em que as referidas posições são selecionadas dentre aquelas que são idênticas a entre 2, 3, 4 ou 5 das sequências de aminoácidos referidas como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou na Tabela 4 .

12. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 das substituições de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, 2 e/ou 3.

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13. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 12, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codifica uma aldeído desidrogenase.

14. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo o pode converter 3hidroxibutírí1-CoA em 3-hidroxibutiraldeído.

15. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo pode converter 4-hidroxibutirilCoA em 4-hidroxibutiraldeído.

16. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo tem atividade mais alta em relação ao polipeptídeo parental.

17. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo tem atividade mais alta para 3hidroxi-(R)-butiril-CoA sobre 3-hidroxi-(S)-butiril-CoA.

18. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo tem uma especificidade mais alta para 3-hidroxibutiril-CoA sobre acetil-CoA.

19. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 13 ou 15, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo tem uma especificidade mais alta para 4-hidroxibutiril-CoA sobre acetil-CoA.

20. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 15, caracterizado pelo fato de

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5/14 que o referido polipeptídeo produz subprodutos diminuídos em uma célula ou extrato celular.

21. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o subproduto é etanol ou 4-hidroxi-2-butanona.

22. Polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 15, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem um kcat mais alto em relação ao polipeptídeo parental.

23. Célula, caracterizada pelo fato de compreender o vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 4 a 6.

24. Célula, caracterizada pelo fato de compreender o ácido nucleico definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.

25. Célula, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico é integrada em um cromossomo da célula.

26. Célula, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a referida integração é especifica do local.

27. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 26, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico é expressa.

28. Célula, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 22.

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29. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 28, caracterizada pelo fato de que a célula é um organismo microbiano.

30. Célula, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o organismo microbiano é uma bactéria, levedura ou fungo.

31. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 28, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica isolada.

32. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 31, caracterizada pelo fato de que a referida célula compreende uma via que produz 3hidroxibutiraldeido (3-HBal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-BDO), ou um éster ou amida deste.

33. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 31, caracterizada pelo fato de que a referida célula compreende uma via que produz 4hidroxibutiraldeido (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4-BDO), ou um éster ou amida deste.

34. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 33, caracterizada pelo fato de que a referida célula é capaz de produzir fermentação.

35. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 34, caracterizada pelo fato de compreender ainda pelo menos um substrato para o referido polipeptídeo.

36. Célula, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o substrato é 3hidroxibutiril-CoA.

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37. Célula, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o substrato é 3-hidroxi-(R)butiril-CoA.

38. Célula, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizada pelo fato de que a célula tem atividade mais alta para 3-hidroxi-(R)-butiril-CoA sobre 3-hidroxi(S)-butiril-CoA.

39. Célula, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o substrato é 4hidroxibutiril-CoA.

40. Uso do polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 22, caracterizado pelo fato de ser útil como um biocatalisador.

41. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 22 e pelo menos um substrato para o referido polipeptídeo.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo pode reagir com o referido substrato sob condições in vitro.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que o substrato é 3hidroxibutiril-CoA.

44. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o substrato é 3-hidroxi-(R)butiril-CoA.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que o substrato é 4hidroxibutiril-CoA.

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46. Meio de cultura, caracterizado pelo fato de que compreende a célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 23 a 39.

47. Método para construir uma cepa hospedeira, caracterizado pelo fato de compreender a introdução do vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 4 a 6 em uma célula que é capaz de fermentar.

48. Método para produzir 3-hidroxibutiraldeído (3HBal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-BDO), ou um éster ou amida deste, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a referida célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 23 a 39 para produzir 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou um éster ou amida deste.

49. Método para produzir 4-hidroxibutiraldeído (4HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4-BDO), ou um éster ou amida deste, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a referida célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 23 a 39 para produzir 4-HBal e/ou 1,4-BDO, ou um éster ou amida deste.

50. Método, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que a referida célula está em um meio de cultura substancialmente anaeróbico.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 48 a 50, caracterizado pelo fato de compreender ainda o isolamento ou a purificação do 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, ou éster ou amida deste.

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52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o isolamento ou purificação compreende destilação.

53. Meio de cultura, caracterizado pelo fato de compreender 3-HBal e/ou 1,3-BDO bioderivado, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, em que o referido 3-HBal e/ou 1,3-BDO bioderivado ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, possui uma proporção de isótopos carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que reflete uma fonte de absorção de dióxido de carbono na atmosfera e em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO é produzido pela célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 23 a 3 9 ou pelo método definido em qualquer uma das reivindicações de 48 a 52.

54. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o referido meio de cultura é separado da célula.

55. 3-hidroxibutiraldeído (3-HBal) e/ou 1,3butanodiol (1,3-BDO) ou 4-hidroxibutiraldeído (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4-BDO), caracterizado pelo fato de ter uma proporção de isótopos carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que reflete uma fonte de absorção de dióxido de carbono na atmosfera, em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO ou 4-HBal e/ou 1,4BDO, é produzido pela célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 23 a 39 ou pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 48 a 52.

56. 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o referido 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou o referido 4-HBal

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10/14 e/ou 1,4-BDO, tem um valor de Fm de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

57. 3-hidroxibutiraldeído (3-HBal) e/ou 1,3butanodiol (1,3-BDO) ou 4-hidroxibutiraldeido (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4-BDO), caracterizado pelo fato de ser produzido pela célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 23 a 39 ou pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 48 a 52.

58. 3-Hidroxibutiraldeido (3-HBal) e/ou 1,3butanodiol (1,3-BDO), caracterizado pelo fato de ter uma proporção de isótopos carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que reflete uma fonte de absorção de dióxido de carbono na atmosfera, em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO é produzido pela célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 23 a 39 ou pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 48 a 52, em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO é enantiomericamente enriquecido para a forma R.

59. 3-HBal e/ou 1,3-BDO, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o referido 3-HBal e/ou 1,3-BDO tem um valor de Fm de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%.

60. 3-Hidroxibutiraldeido (3-HBal) e/ou 1,3butanodiol (1,3-BDO), caracterizado pelo fato de ser produzido pela célula conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 23 a 39 ou pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 48 a 52, em que 3-HBal e/ou 1,3-BDO é enantiomericamente enriquecido para a forma R.

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61. 3-HBal e/ou 1,3-BDO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a forma R é superior a 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% do 3-HBal e/ou 1,3-BDO.

62. Composição, caracterizada pelo fato de compreender 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 58 a 61, e um composto diferente do 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4HBal ou 1,4-BDO, respectivamente.

63. Composição, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que o composto diferente de 3HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, é uma porção de uma célula que produz 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, respectivamente, ou que expressem o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 22 .

64. Composição, caracterizada pelo fato de compreender 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 55 a 61, ou um lisado celular ou sobrenadante da cultura de uma célula que produz o 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou o 4-HBal e/ou 1,4-BDO.

65. Produto, caracterizado pelo fato de compreender 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, conforme definido qualquer uma das reivindicações 55 a 61, em que o referido produto é um plástico, fibra elástica, poliuretano, poliéster, poli-hidroxialcanoato, poli-4hidroxibutirato (P4HB) ou um copolímero deste, poli (éter de tetrametileno) glicol (PTMEG), tereftalato de polibutileno

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12/14 (PBT), copolímero de poliuretano-poliureia, náilon, solvente orgânico, resina de poliuretano, poliéster resina, agente hipoglicêmico, butadieno ou produto à base de butadieno.

66. Produto, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de ser um produto cosmético ou um aditivo alimentar.

67. Produto, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% de 3-HBal e/ou 1,3-BDO bioderivado, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO bioderivado.

68. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 65 a 67, caracterizado pelo fato de que o referido produto compreende uma porção do 3-HBal e/ou 1,3BDO produzido, ou do 4-HBal e/ou 1,4-BDO produzido, como uma unidade de repetição.

69. Produto moldado, caracterizado pelo fato de ser obtido por moldagem do produto definido em qualquer uma das reivindicações 65, 67 ou 68.

70. Processo para a produção do produto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 65 a 68, caracterizado pelo fato de que compreende reagir quimicamente 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, com eles mesmos ou outro composto em uma reação que produz o referido produto.

71. Processo para a produção do produto, conforme definido na reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que compreende reagir quimicamente 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4

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HBal e/ou 1,4-BDO, com eles mesmos ou outro composto em uma reação que produz o referido produto.

72. Método para produzir 3-hidroxibutiraldeido (3-HBal) e/ou 1,3-butanodiol (1,3-BDO), ou um éster ou amida deste, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um substrato ao polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 22 e converter o substrato em 3HBal e/ou 1,3-BDO, em que o substrato é uma mistura racêmica de 1,3-hidroxibutiril-CoA.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que 3-HBal e/ou 1,3-BDO é enriquecido enantiomericamente para a forma R.

74. Método para produzir 4-hidroxibutiraldeido (4-HBal) e/ou 1,4-butanodiol (1,4-BDO), ou um éster ou amida deste, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um substrato ao polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 22 e converter o substrato em 4HBal e/ou 1,4-BDO, em que o substrato é 1,4-hidroxibutirilCoA.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 72 a 74, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo está presente em uma célula, em um lisado celular, ou é isolado de uma célula ou lisado celular.

76. Método para produzir 3-HBal e/ou 1,3-BDO, ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO, caracterizado pelo fato de compreender incubar um lisado da célula conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 23 a 39 para produzir 3-HBal e/ou 1,3-BDO ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO.

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77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o lisado celular é misturado com um segundo lisado celular, em que o segundo lisado celular compreende uma atividade enzimática para produzir um substrato do polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 22, ou um produto a jusante de 3HBal e/ou 1,3-BDO ou 4-HBal e/ou 1,4-BDO.

78. Método para produzir o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 22, caracterizado pelo fato de compreender expressar o polipeptídeo em uma célula.

79. Método para produzir o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende a transcrição e tradução in vitro do ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 ou o vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 4 a 6 para produzir o polipeptídeo.