CN102965401B - 1,2,4-丁三醇的生物合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种1,2,4-丁三醇的生物合成方法。该方法包括用重组生物细胞将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇的步骤;所述重组生物细胞表达具有将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇功能的酶系统。所述酶系统包括如下:(a1)具有将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A功能的酶;(a2)具有将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛功能的酶;(a3)具有将所述苹果酸半醛转化为2,4-二羟基丁酸功能的酶;(a4)具有将所述2,4-二羟基丁酸转化为2,4-二羟基丁酰辅酶A功能的酶;(a5)具有将所述2,4-二羟基丁酰辅酶A转化为1,2,4-丁三醇功能的酶。本发明对建立拥有自主产权的、原料价格低廉的、合成途径全新的、转化效率较高的1,2,4-丁三醇的生物合成方法具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及种1,2,4-丁三醇的生物合成方法,特别涉及一种利用重组大肠杆菌将苹果酸及其盐形式转化为1,2,4-丁三醇的方法。
背景技术
为了满足人类生产和生活方式不断进步的各种需求,越来越多的重要化学品受到了研究者的广泛关注。其中,1,2,4-丁三醇是一种在军工和民用上都具有重要用途的化学品。它是手性多羟基醇,主要用于合成高能材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯,后者可用作飞机、火箭、导弹等军事武器的推进剂,较传统的硝化甘油具有冲击敏感性更低、热稳定性更好、挥发性更小和加工安全性更高四大优点,是硝化甘油理想、安全的替代品。硝化甘油目前在美国双基推进剂中的用量超过130万吨/年,若全部被1,2,4-丁三醇三硝酸酯替代,则1,2,4-丁三醇在美国军用方面的潜在市场需求量至少为170万吨/年,按照目前1,2,4-丁三醇12-19万元/吨的价格估算,其仅在美国军用市场上的市值就至少达2,000-3,000亿元/年。此外,1,2,4-丁三醇还可用于制备生物活性剂、医药用缓释剂、卷烟添加剂、抗菌剂、彩色显影剂等。
目前1,2,4-丁三醇主要以石油化工产品为原料,依靠化学法在高温高压下催化生产。其商业化的生产方式是,将苹果酸二甲酯在NaBH4和C2-C6醇的中进行还原反应,得率为0.48g/g。其存在的主要弊端有:原料成本高、反应能耗大、生产危险性大、副产物多、环境污染严重等。在当今各种全球问题的巨大压力下,人们更倾向于利用廉价的、可再生的生物质资源为原料,通过简单高效、对环境友好的生物发酵过程来生产1,2,4-丁三醇。但是,由于自然界不存在1,2,4-丁三醇的天然生物合成途径,所以生物法生产1,2,4-丁三醇的研究进展比较缓慢。迄今为止,仅一位美国学者在政府的大力支持下,先是利用木糖或阿拉伯糖原料,建立了1,2,4-丁三醇的生物合成途径(Niu,W.,Molefe,M.N.,Frost,J.W. Microbial synthesis ofthe energeticmaterial precursor1,2,4-butanetriol.Joumal ofthe American Chemical Society.2003,125(43):12998-12999.),之后经过不断优化,提高了木糖途径的1,2,4-丁三醇产量,达到35g/L木糖的生产水平(J·W·佛罗斯特,W·牛,D-1,2,4-丁三醇的微生物合成,中国专利申请号:200780032753.9,申请日:2007年7月19日;JohnW.Frost,GreenSyntheisofD-1,2,4ButantetroilfromD-Glucose.2009Annual Report,GrantNo.N000140710323)。继而再改造戊糖磷酸途径,以期利用葡萄糖而非木糖为原料,降低原料成本。截至目前,已通过两步法的生产方式,实现了以葡萄糖为原料的1,2,4-丁三醇的生物合成(John W. Frost,Green Syntheis ofD-1,2,4ButantetroilfromD-Glucose.2009Annual Report,GrantNo.N000140710323):第一步,利用大肠杆菌WY9/pWY1实现了从葡萄糖到木质酸的生物转化,产量为5.5g/L木质酸;第二步,利用大肠杆菌DH5α/pWN6.186A实现了从木质酸到1,2,4-丁三醇的生物转化,转化率和产量均未报道。而将该两步合在起,将葡萄糖直接转化为1,2,4-丁三醇的一步法生产则未取得成功。究其原因,可能是由于葡萄糖本身在大肠杆菌的代谢网络中,进入戊糖磷酸途径的效率并不是很高所致。而葡萄糖经糖酵解进入TCA循环的效率则相对较高。
综上所述,如果能为将来建立一套拥有自主产权的、原料价格低廉的、合成途径全新的、转化效率较高的1,2,4-丁三醇的生物合成方法,将具有重要意义。目前尚未有以苹果酸或其盐类形式为原料生物合成1,2,4-丁三醇的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种1,2,4-丁三醇的生物合成方法。
本发明所提供的制备1,2,4-丁三醇的方法,包括用重组生物细胞将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇的 步骤;所述重组生物细胞表达具有将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇功能的酶系统。
在上述方法中,所述将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇,具体包括如下步骤:
(1)将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A;(2)将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛;(3)将所述苹果酸半醛转化为2,4-二羟基丁酸;(4)将所述2,4-二羟基丁酸转化为2,4-二羟基丁酰辅酶A;(5)将所述2,4-二羟基丁酰辅酶A转化为2,4-二羟基丁醛;(6)将所述2,4-二羟基丁醛转化为1,2,4-丁三醇。
在上述方法中,所述酶系统具体包括如下(a1)-(a5):
(a1)具有将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A功能的酶1;(a2)具有将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛功能的酶2;(a3)具有将所述苹果酸半醛转化为2,4-二羟基丁酸功能的酶3;(a4)具有将所述2,4-二羟基丁酸转化为2,4-二羟基丁酰辅酶A功能的酶4;(a5)具有将所述2,4-二羟基丁酰辅酶A转化为1,2,4-丁三醇功能的酶5。
具体的,所述酶1为琥珀酰辅酶A合成酶、苹果酸硫激酶中的至少一种;所述酶2为琥珀酸半醛脱氢酶;所述酶3为4-羟基丁酸脱氢酶;所述酶4为4-羟基丁酸辅酶A转移酶、肉桂酰辅酶A:苯乳酸辅酶A转移酶中的至少一种;所述酶5为双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶。
在本发明的一个实施例中,所述酶系统具体由如下酶1-酶5组成:
所述酶1为百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)MAFF303099的琥珀酰辅酶A合成酶;所述琥珀酰辅酶A合成酶的β亚基的氨基酸序列如序列表中序列1所示,所述琥珀酰辅酶A合成酶的α亚基的氨基酸序列如序列表中序列2所示;
所述酶2为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的琥珀酸半醛脱氢酶;所述琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示;
所述酶3为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的4-羟基丁酸脱氢酶;;所述4-羟基丁酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示;
所述酶4为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的4-羟基丁酸辅酶A转移酶;所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示;
所述酶5为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)DSM1731的双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶;所述双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示。
序列1由394个氨基酸组成;序列2由299个氨基酸组成;序列3由451个氨基酸组成;序列4由371个氨基酸组成;序列5由431个氨基酸组成;序列6由858个氨基酸组成。
在上述方法中,所述重组生物细胞是将如上所述酶系统的编码基因导入目的生物细胞后得到的表达所述酶系统的重组生物细胞:
如序列表中序列7所示的所述琥珀酰辅酶A合成酶的β亚基的编码基因,如序列表中序列8所示的所述琥珀酰辅酶A合成酶的α亚基的编码基因;
如序列表中序列9所示的所述琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因;
如序列表中序列10所示的所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因;
如序列表中序列11所示的所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的编码基因;
如序列表中序列12所示的所述双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶的编码基因。
在本发明的一个实施例中,将所述酶系统的编码基因导入目的生物细胞,具体为通过将携带并表达所述酶系统的编码基因的重组质粒导入所述目的生物细胞中实现的。所述重组质粒具体为下述重组质粒A和下述重组质粒B。
在上述方法中,所述生物细胞可为微生物细胞、动物细胞或植物细胞;
在本发明的一个实施例中,所述生物细胞具体为大肠杆菌,如大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的再一个目的是提供如下DNA片段中的至少一种:
(b1)核苷酸序列为序列表中序列7所示的DNA片段(百脉根根瘤菌(Mesorhizobiumloti)MAFF303099的琥珀酰辅酶A合成酶β亚基的优化后核苷酸序列);
(b2)核苷酸序列为序列表中序列8所示的DNA片段(百脉根根瘤菌(Mesorhizobiuanloti)MAFF303099的琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的优化后核苷酸序列);
(b3)核苷酸序列为序列表中序列9所示的DNA片段(牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)W83的琥珀酸半醛脱氢酶的优化后核苷酸序列);
(b4)核苷酸序列为序列表中序列10所示的DNA片段;(牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)W83的4-羟基丁酸脱氢酶的优化后核苷酸序列)
(b5)核苷酸序列为序列表中序列11所示的DNA片段(牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)W83的4-羟基丁酸辅酶A转移酶的优化后核苷酸序列);
(b6)核苷酸序列为序列12所示的DNA片段(丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)DSM1731的双功能乙醛辅酶A/醇氢酶的优化后核苷酸序列)。
上述6个DNA片段均为经过密码子优化的基因;所述优化为在不改变相应酶的氨基酸序列的前提下,将野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子。
其中,序列7由1185个核苷酸组成,编码序列表中序列1所示的蛋白;序列8由900个核苷酸组成,编码序列表中序列2所示的蛋白;序列9由1356个核苷酸组成,编码序列表中序列3所示的蛋白;序列10由1116个核苷酸组成,编码序列表中序列4所示的蛋白;序列11由1296个核苷酸组成,编码序列表中序列5所示的蛋白;序列12由2577个核苷酸组成,编码序列表中序列6所示的蛋白。
本发明的又一个目的是提供如下(c1)或(c2)的生物材料:
(c1)重组质粒A和/或重组质粒B:所述重组质粒A为携带并表达上述(b1)-(b4)中所述DNA片段的重组表达载体;所述重组质粒B为携带并表达上述(b5)和(b6)中所述DNA片段的重组表达载体;所述重组质粒A和所述重组质粒B中启动(b1)-(b6)中所述DNA片段表达的启动子均为T7启动子。
具体的,所述重组质粒A为在质粒pET-30a的多克隆位点处插入一个序列7所示DNA片段、一个序列8所示DNA片段、一个序列9所示DNA片段、一个序列10所示DNA片段,和三个序列13所示DNA片段后所形成的重组质粒,使所述重组质粒A中形成如下1)-4)四个片段单元:1)自5’端至3’端依次包含序列13和序列7;2)自5’端至3’端依次包含序列13和序列8;3)自5’端至3’端依次包含序列13和序列9;4)自5’端至3’端依次包含序列13和序列10;所述重组质粒B为在质粒pACYC184的酶切位点处插入一个序列11所示的DNA片段、一个序列12所示的DNA片段、两个序列13所示的DNA片段,和一个序列14所示的DNA片段后所形成的重组质粒,使所述重组质粒B中形成如下1)-2)两个片段单元:1)自5’端至3’端依次包含序列13和序列11;2)自5’端至3’端依次包含序列13、序列12和序列14;
其中,序列13为T7启动子的核苷酸序列;序列14为T7终止子的核苷酸序列。
更加具体的,所述重组质粒A中,1)中所述片段单元和2)中所述片段单元顺次串联位于酶切位点Nde I和BamH I之间;3)中所述片段单元位于酶切位点BamH I和Not I之间;4)中所述片段单元位于酶切位点Not I和Xho I之间。所述重组质粒B中,1)中所述片段单元位于酶切位点Ava I和Ahd I之间;2)中所述片段单元位于酶切位点Ahd I和Bcl I之间。
(c2)重组大肠杆菌1或/和重组大肠杆菌2或/和重组大肠杆菌3:所述重组大肠杆菌1为携带所述重组质粒A和所述重组质粒B,并表达(b1)-(b6)中所述DNA片段的大肠杆菌;所述重组大肠杆菌2为携带所述重组质粒A,并表达(b1)-(b4)中所述DNA片段的大肠杆菌;所述重组大肠杆菌3为携带所述重组质粒B,并表达(b5)和(b6)中所述DNA片段的大肠杆菌。
在本发明的一个实施例中,所述重组大肠杆菌1为采用所述重组质粒A和所述重组质粒B共转化大肠杆菌BL21(DE3)后,得到的表达所述酶1-酶5的大肠杆菌;所述重组大肠杆菌2为采用所述重组质粒A转化大肠杆菌BL21(DE3)后,得到的表达所述酶1-酶3的大肠杆菌;所述重组大肠杆菌3为采用所述重组质粒B转化大肠杆菌BL21(DE3)后,得到的表达所述酶4和酶5的大肠杆菌;
当然,只要是采用本专利所述的苹果酸途径的六步反应,或是其中的若干步反应,来合成1,2,4-丁三醇,则含有(b1)-(b6)所述DNA片段,或是其中的若干DNA片段的表达盒、重组细胞系,以及除上述重组大肠杆菌外的其他重组菌也均属于本发明的保护范围。
本发明建立了全新的以苹果酸及其盐为原料,通过生物合成途径制备1,2,4-丁三醇的方法。本发明对建立拥有自主产权、原料价格低廉、合成途径全新、转化效率较高的1,2,4-丁三醇生物合成方法具有重要意义。
附图说明
图1为1,2,4-丁三醇的生物合成途径(苹果酸途径)。
图2为重组表达载体pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD的质粒图谱。其中,1-2代表mtkAB-2;2-1代表sucD;3-1代表4HbD。
图3为重组表达载体pACYC184/abfT-2/adhE的质粒图谱。其中,4-1代表abfT-2,56-1代表adhE。
图4为重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE及对照菌株BL21(DE3)/pET-30a/pACYC184的PCR鉴定结果。其中,A为重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE;B为对照菌株BL21(DE3)/pET-30a/pACYC184。A和B中,M表示DNA分子量标准;1、2、……表示对应的阳性菌株。
图5为重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD及对照菌株BL21(DE3)/pET-30a的PCR鉴定结果。其中,A为重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD;B为对照菌株BL21(DE3)/pET-30a。A和B中,M表示DNA分子量标准;1、2、……表示对应的阳性菌株。
图6为重组菌株BL21(DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE及对照菌株BL21(DE3)/pACYC184的PCR鉴定结果。其中,A为重组菌株BL21(DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE;B为对照菌株BL21(DE3)/pACYC184。A和B中,M表示DNA分子量标准;1、2、……表示对应的阳性菌株。
图7为从苹果酸或其盐到1,2,4-丁三醇的苹果酸途径六步反应的发酵液的气质联用检测结果。其中,A为1,2,4-丁三醇标准品的气质联用检测结果(选择离子模式检测);B为重组菌BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE的发酵滤液的气质联用检测结果(选择离子模式检测)。
图8为从苹果酸或其盐到1,2,4-丁三醇的苹果酸途径前三步反应的发酵液的气质联用检测结果。其中,A为2,4-二羟基丁酸标准品的气质联用检测结果(选择离子模式检测);B为重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD发酵液的气质联用检测结果(选择离子模式检测);C为重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD发酵液的气质联用检测结果(全扫描模式检测),目标峰即为2,4-二羟基丁酸;D为目标峰2,4-二羟基丁酸的质谱鉴定结果。
图9为从2,4-二羟基丁酸到1,2,4-丁三醇的苹果酸途径后三步反应的发酵液的气质联用检测结果。其 中,A为1,2,4-丁三醇标准品的气质联用检测结果(全扫描模式检测);B为重组菌株BL21(DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE发酵液的气质联用检测结果(选择离子模式检测);C为重组菌株BL21(DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE发酵液的气质联用检测结果(全扫描模测),目标峰即为1,2,4-丁三醇;D为目标峰1,2,4-丁三醇的质谱鉴定结果。
具体实施主式
本发明中制备1,2,4-丁三醇的方法,是在生物细胞中通过酶系统将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇。该方法所涉及的途径称为苹果酸途径,具体包括如下6步骤(图1):
(1)将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A;(2)将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛;(3)将所述苹果酸半醛转化为2,4-二羟基丁酸;(4)将所述2,4-二羟基丁酸转化为2,4-二羟基丁酰辅酶A;(5)将所述2,4-二羟基丁酰辅酶A转化为2,4-二羟基丁醛;(6)将所述2,4-二羟基丁醛转化为1,2,4-丁三醇。
以上6步反应顺次所对应的酶为如下(a1)-(a5):
(a1)具有将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A功能的酶,如琥珀酰辅酶A合成酶、苹果酸硫激酶等;(a2)具有将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛功能的酶,如琥珀酸半醛脱氢酶等;(a3)具有将所述苹果酸半醛转化为2,4-二羟基丁酸功能的酶,如4-羟基丁酸脱氢酶等;(a4)具有将所述2,4-二羟基丁酸转化为2,4-二羟基丁酰辅酶A功能的酶,如4羟基丁酸辅酶A转移酶、肉桂酰辅酶A:苯乳酸辅酶A转移酶等;(a5)具有将所述2,4-二羟基丁酰辅酶A转化为1,2,4-丁三醇功能的酶,如双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶等。
下面结合具体实施例进步阐述本发明,应理解,下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
质粒pET-30a:NOVOGEN公司产品;质粒pACYC184:上海科兴生物科技有限公司;大肠杆菌BL21(DE3):北京全式金生物技术有限公司。
实施例1、用于生物合成1,2,4-丁三醇的重组大肠杆菌的构建
一、重组表达载体pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD的构建
1、6步催化反应中步骤(1)-(3)所用酶基因的选择及优化
针对6步反应中步骤(1)的催化反应,选取百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)MAFF303099的琥珀酰辅酶A合成酶基因(mtkAB-2),对所述琥珀酰辅酶A合成酶的β亚基的基因序列和α亚基的基因序列分别进行密码子优化,在不改变相应酶的氨基酸序列的前提下,将野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子。优化后的所述琥珀酰辅酶A合成酶的β亚基的核苷酸序列如序列表中序列7所示,优化后的α亚基的核苷酸序列如序列表中序列8所示。序列7和序列8即分别为百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)MAFF303099的琥珀酰辅酶A合成酶β亚基和α亚基的编码序列,分别编码序列表中的序列1和序列2所示的蛋白质。
针对步骤(2)的催化反应,选取牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的琥珀酸半醛脱氢酶基因(sucD),对其采用同上的方式进行密码子优化。优化后的所述琥珀酸半醛脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示。序列9即为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的琥酸半醛脱氢酶的编码序列,编码序列表中的序列3所示的蛋白质。
针对步骤(3)的催化反应,选取牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的4-羟基丁酸脱氢酶基因(4HbD),对其采用同上的方式进行密码子优化。优化后的所述4-羟基丁酸脱氢酶基因的核苷酸序 列如序列表中序列10所示。序列10即为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)W83的4-羟基丁酸脱氢酶基因的编码序列,编码序列表中的序列4所示的蛋白质。
2、重组表达载体pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD的构建
DNA片段“β亚基+T7启动子+α亚基”:自5’端至3’端,其核苷酸序列依次为GATCAT+序列7+TGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAAT+序列13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATA+序列8+GGATCCGAT,下划线部分依次为限制性内切酶Nde I(CATATG,其中ATG来自序列7中的起始密码子)和BamH I的识别序列,“+”表示直接相连。
DNA片段“T7启动子+sucD”:自5’端至3’端,其核苷酸序列依次为GATGGATCC+TGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAAT+序列13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAT+CCTAGG+序列9+GCGGCCGCGAT,其中下划线部分依次为限制性内切酶BamH I、Avr II和Not I的识别序列,“+”表示直接相连。
DNA片段“T7启动子+4HbD”:自5’端至3’端,其核苷酸序列依次为GATGCGGCCGC+TGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAAT+序列13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAT+ACTAGT+序列10+CTCGAGGAT,其中下划线部分依次为限制性内切酶Not I、Spe I和Xho I的识别序列,“+”表示直接相连。
首先,将DNA片段“β亚基+T7启动子α亚基”用限制性内切酶Nde I和BamH I进行双酶切,与经过同样酶切的pET-30a载体大片段相连,将经测序鉴定正确的重组质粒命名为pET-30a/mtkAB-2。接着,将DNA片段“T7启动子+sucD”用限制性内切酶BamH I和Not I进行双酶切,与经过同样酶切的pET-30a/mtkAB-2载体大片段相连,将经测序鉴定正确的重组质粒命名为pET-30a/mtkAB-2/sucD。最后,将DNA片段“T7启动子+4HbD”用限制性内切酶Not I和Xho I进行双酶切,与经过同样酶切的pET-30a/mtkAB-2/sucD载体大片段相连,将经测序鉴定正确的重组质粒命名为pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD(质粒图谱如图2所示)。
二、重组表达载体pACYC184/abfT-2/adhE的构建
1、6步催化反应中步骤(4)-(6)所用酶基因的选择及优化
针对步骤(4)的催化反应,选取牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因(abfT-2),对其采用同步骤中所述的方式进行密码子优化。优化后的所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因基因的核苷酸序列如序列表中序列11所示。序列11即为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)W83的4-羟基丁酸辅酶A转移酶的编码序列,编码序列表中的序列5所示的蛋白质。
针对步骤(5)和(6)的催化反应,选取丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DSM1731的双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶,对其采用同上的方式进行密码子优化。优化后的所述双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表中序列12所示。序列12即为丙酮丁醇梭菌(Clostridhmacetobutylicum)DSM1731的双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶基因的编码序列,编码序列表中的序列6所示的蛋白质。
2、重组表达载体pACYC184/abfT-2/adhE的构建
DNA片段“T7启动子+abfT-2”:自5’端至3’端,其核苷酸序列依次为 GATCTCGGG+TGCTYAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATGTACACGGCCGCATAATCGAAAT+序列13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATA+CAT+序列11+GACTGAGAGTCGAT。其中下划线部分依次为限制性内切酶Ava I、Nde I(CATATG,其中ATG来自序列11中的起始密码子)和AhdI的识别序列,“+”表示直接相连。
DNA片段“T7启动子+adhE+T7终止子”:自5’端至3’端,其核苷酸序列依次为GATGACTGAGAGC+TGCTYAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTAGACGGCCGCATAATCGAAA+序列13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAT+GACGTC+序列12+CTGCAG+TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAAC+序列14+CTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT+TGATCAGAT。其中下划线部分依次为限制性内切酶AhdI、AatII、PstI和BclI的识别序列,“+”表示直接相连。
首先,将DNA片段“T7启动子+abfT-2”用限制性内切酶AvaI和AhdI进行双酶切,与经过同样酶切的pACYC184载体大片段相连,将经测序鉴定正确的重组质粒命名为pACYC/abfT-2。接着,将DNA片段“T7启动子+adhE+T7终止子”用限制性内切酶AhdI和BclI进行双酶切,与经过同样酶切的pACYC/abfT-2载体大片段相连,将经测序鉴定正确的重组质粒命名为pACYC/abfT-2/adhE(质粒图谱如图3所示)。
三、用于从苹果酸或其盐生物合成1,2,4-丁三醇的重组大肠杆菌的构建
将步骤和步骤二中的重组表达载体pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD和pACYC184/abfT-2/adhE,共转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中,转化后涂布到含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB固体培养基平板上进行压力筛选,挑取若干个单菌落,接种到含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,37℃剧烈振荡培养过夜。以菌液为模板,分别用pETup和1-2内.P2引物对与56-1内.5P和末2.R引物对,进行PCR扩增,分别能扩增得到大小约为825bp和2210bp的目的条带(图4中A)的单克隆菌株为阳性重组菌株,命名为BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE。
以pETup和1-2内.P2引物对,进行PCR反应的程序为:94℃3min;94℃30S,60℃30S,72℃30S,28个循环;72℃7min。
pETup:5’-ATGCGTCCGGCGTAGA-3’(pET-30a载体上的序列);
1-2内.P2:5’-GAGATTTCCGGACGACGG-3’(序列7的第672-689位的反向互补序列)。
以56-1内.5P和末2.R引物对,进行PCR反应的程序为:94℃3min;94℃30S,60℃30S,72℃90S,28个循环;72℃7min。
56-1内.5P:5’-AAACGGTGCTATCAACGC-3’(序列12的第858-875位);
末2.R:5’-CCGTCTGTGATGGCTTCC-3’(pACYC184载体上的序列)。
同时设置共转化pET-30a和pACYC184空质粒的BL21(DE3)重组菌株,转化后同样在含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的抗性平板上压力筛选后,挑取若干个单菌落进行液体培养。以菌液为模板,分别用pET up和T7.R引物对与184末.F和末2.R引物对,进行PCR扩增,分别能扩增得到大小约为400bp和1100bp(图4中B)目的条带的单克隆菌株为阳性对照重组菌株,命名为BL21(DE3)/pET-30a/pACYC184。
以pETup和T7.R引物对,进行PCR反应的程序为:94℃3min;94℃30S,60℃30S,72℃15S,28个循环;72℃7min。
pETup:5’-ATGCGTCCGGCGTAGA-3’(pET-30a载体上的序列);
T7.R:5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(pET-30a载体上的序列)。
以184末.F和末2.R引物对,进行PCR反应的程序为:94℃3min;94℃30S,60℃30S,72℃35S,28个循环;72℃7min。
184末.F:5’-TCGCTAACGGATTCACCAC-3’(pACYC184载体上的序列);
末2.R:5’-CCGTCTGTGATGGCTTCC-3’(pACYC184载体上的序列)。
四、用于从苹果酸或其盐生物合成2,4-二羟基丁酸的重组大肠杆菌的构建
将步骤一中的重组表达载体pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中,转化后涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上进行压力筛选,挑取若干个单菌落,接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃剧烈振荡培养过夜。以菌液为模板,用3-1P1和3-2P2引物对,进行PCR扩增,能扩增得到大小约为1280bp的目的条带(图5中A)的单克隆菌株为阳性重组菌株,命名为BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD。
以3-1P1和3-2P2引物对,进行PCR反应的程序为:94℃3min;94℃30S,60℃30S,72℃45S,28个循环;72℃7min。
3-1P1:5’-GCGGCCGCTGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCG-3’(4HbD的5’端序列);
3-2P2:5’-CTCGAGTTAGTAGAGTCTTCTGTAGA-3’(4HbD的3’端反向互补序列)。
同时设置转化pET-30a空质粒的BL21(DE3)重组菌株,转化后同样在含50μg/mL卡那霉素的抗性平板上压力筛选后,挑取若干个单菌落进行液体培养。以菌液为模板,用T7.F和T7.R引物对,进行PCR扩增,能扩增得到大小约为370bp(图5中B)目的条带的单克隆菌株为阳性对照重组菌株,命名为BL21(DE3)/pET-30a。
以T7.F和T7.R引物对,进行PCR反应的程序为:94℃3min;94℃30S,60℃30S,72℃15S,28个循环;72℃7min。
T7.F:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(pET-30a载体上的序列);
T7.R:5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(pET-30a载体上的序列)。
五、用于从2,4-二羟基丁酸或其盐生物合成1,2,4-丁三醇的重组大肠杆菌的构建
将步骤二中的重组表达载体pACYC184/abfT-2/adhE,转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中,转化后涂布到含有25μg/mL氯霉素的LB固体培养基平板上进行压力筛选,挑取若干个单菌落,接种到含25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,37℃剧烈振荡培养过认。以菌液为模板,用56-1P1和56-1P2引物对,进行PCR扩增,能扩增得到大小约为2900bp的目的条带(图6中A)的单克隆菌株为阳性重组菌株,命名为BL21(DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE。
以56-1P1和56-1P2引物对,进行PCR反应的程序为:94℃3min;94℃30S,60℃30S,72℃90S,28个循环;72℃7min。
56-1P1:5’-GACTGAGAGTCTGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCG-3’(adhE的5’端序列);
56-1P2:5’-TGATCAATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’(adhE的3’端反向互补序列)。
同时设置转化pACYC184空质粒的BL21(DE3)重组菌株,转化后同样在含25μg/mL氯霉素的抗性平板上压力筛选后,挑取若干个单菌落进行液体培养。以菌液为模板,用步骤三中所述184末.F和末2.R引物对,进行PCR扩增,能扩增得到大小约为1100bp(图6中B)目的条带的单克隆菌株为阳性对照重组菌株,命名为BL21(DE3)/pACYC184。
以184末.F和末2.R引物对,进行PCR反应的程序为:94℃3min;94℃30S,60℃30S,72℃35S, 28个循环;72℃7min。
实施例2、以苹果酸或其盐为底物的1,2,4-丁三醇的生物合成及检测
一、通过生物发酵将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇
M9发酵培养基(各组分的浓度为在培养基中的终浓度):6.78g/L Na2HPO4,3.0g/L KH2PO4,0.5g/LNaCl,1.0g/LNH4Cl,1mM MgSO4,0.1mM CaCl2,10mMNaHCO3,20g/LD-葡萄糖,100mM MOPS,10μg/ml维生素B1,50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素。其中,D-葡萄糖,维生素B1,卡那霉素和氯霉素均经0.22μm过膜后,加入到经高温灭菌的含有其他成份的培养基中。
取5ml M9发酵培养基,接种100μl能同时表达苹果酸途径六步反应的酶蛋白的BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE重组菌,37℃,200rpm,好氧培养(摇瓶培养,透气不密封)过夜。取2ml过夜培养的菌液,加入到20mlM9发酵培养基中,37℃,200rpm,微耗氧培养至OD600=0.6,加入IPTG至终浓度为0.25mM,加入苹果酸或其二钠盐至终浓度为100mM。控制pH为6.5-7.0,诱导24h后取发酵液进行产物检测。其中,微耗养培养即在厌氧瓶瓶盖上插入一根1ml注射器的针头。对照菌株BL21(DE3)/pET-30a/pACYC184以相同方法进行发酵测试。实验重复三次。
二、目标产物1,2,4-丁三醇的检测
将步骤一所获得的发酵液用0.22μm滤膜过滤,取100μl发酵滤液,真空离心干燥,加入20μl浓度为10mM的环己醇内标溶液(所用溶剂是二甲基甲酰胺(DMF))悬浮,加入100μl“N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(体积百分含量为99%)+三甲基氯硅烷(体积百分含量为1%)”硅烷化试剂,混匀后70℃放置30min。离心5min,取上清,过0.22μm滤膜,滤液用于气质联用检测。以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂,配制浓度为10mM的1,2,4-丁三醇标准品。取20μl10mM的1,2,4-丁三醇标准品,加入硅烷化试剂后按同样方法进行硅烷化处理。
气质联用条件:HP-5柱子(柱长为30米),不设分流比,进样量2μl,质荷比范围30-500。进样口温度设置为280℃。以氦气为载体,流速设置为1.0mL/min。气质升温程序设置为:80℃保持1.5min;以3℃/min的速率升温至140℃,保持0min;以50℃/min的速率升温至280℃,保持10min。目标产物仅用选择离子模式检测,选择离子设定为:103m/z,129m/z,219m/z,232m/z。
经气质联用分析,并与1,2,4-丁三醇标准品(图7中A)作比较,结果表明,重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE的发酵滤液中含有与标准品保留时间高度一致的、含有标准品特征离子谱的目标峰(图7中B)。而对照菌株BL21(DE3)/pET-30a/pACYC184的发酵滤液中则没有该目标峰。表明重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE的发酵滤液中的目标峰可能即为1,2,4-丁三醇,初步判断苹果酸途径可能已经打通。进一步完全鉴定的方法和结果,见实施例3和实施例4。
实施例3、以苹果酸或其盐为底物的2,4-二羟基丁酸的生物合成及检测
一、通过生物发酵将苹果酸或其盐转化为2,4-二羟基丁酸
M9发酵培养基:除不加氯霉素外,其他组成成份、终浓度及配制方法同实施例2步骤一。
取5ml M9发酵培养基,接种100μl能同时表达苹果酸途径前三步反应的酶蛋白的BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD重组菌,37℃,200rpm,好氧培养(摇瓶培养,透气不密封)过夜。取2ml过夜培养的菌液,加入到20ml M9发酵培养基中,37℃,200rpm,微耗氧培养至OD600=0.6,加入IPTG至终浓度为0.2mM,加入苹果酸或其钠盐至终浓度为180mM。不控制pH,诱导24h后取发酵液进行产物检测。微耗养培养方式同实施例2步骤中所述。对照菌株BL21(DE3)/pET-30a以相同方法进 行发酵测试。实验重复三次。
二、目标产物2,4-二羟基丁酸的检测
发酵液的取样及气质联用的前处理(三甲基硅烷化处理),同实施例2中的二。以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂,配制浓度为0.5mM的2,4-二羟基丁酸标准品。取20μl0.5mM的2,4-二羟基丁酸标准品,按同样方法进行硅烷化处理。
气质联用条件:HP-5柱子(柱长为30米),分流比设为5:1(全扫描模式)或15:1(选择离子模式),进样量1μl,质荷比范围30-500。进样口温度设置为280℃。以氦气为载体,流速设置为1.0mL/min。气质升温程序设置为:80℃保持1.5mn;以10℃/min的速率升温至140℃,保持3min;以30℃/min的速率升温至280℃,保持12min。目标产物分别用全扫描模式和选择离子模式检测。选择离子设定为:103.0m/z,219.1m/z,321.1m/z。选择离子模式的检测时间设定为11.20~12.50min。全扫描的检测时间设定为6~13.50min。
经气质联用分析,并与2,4-二羟基丁酸标准品(图8中A)作比较,结果表明,重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD的发酵滤液中含有与标准品保留时间高度一致的、含有标准品特征离子谱的目标峰(图8中B)。且在全扫描模式下通过对目标峰进行质谱分析(图8中C、D),结果表明,目标峰的质谱裂解规律与标准品高度一致。可以确定,该目标峰即为2,4-二羟基丁酸。而对照菌株BL21(DE3)/pET-30a的发酵滤液中则没有该目标峰。
实施例4、以2,4-二羟基丁酸钠为底物的1,2,4-丁三醇的生物合成及检测
一、通过生物发酵将2,4-二羟基丁酸钠转化为1,2,4-丁三醇
M9发酵培养基:除不加卡那霉素外,其他组成成份、终浓度及配制方法同实施例2步骤一。
取5ml M9发酵培养基,接种100μl能同时表达苹果酸途径后三步反应的酶蛋白的BL21(DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE重组菌,37℃,200rpm,好氧培养(摇瓶培养,透气不密封)过夜。取2ml过夜培养的菌液,加入到20mlM9发酵培养基中,37℃,200rpm,微耗氧培养至OD600=0.6,加入IPTG至终浓度为0.2mM,加入2,4-二羟基丁酸钠至终浓度为180mM。不控制pH,诱导24h后取发酵液进行产物检测。微耗养培养方式同上。对照菌株BL21(DE3)/pACYC184以相同方法进行发酵测试。实验重复三次。
二、目标产物1,2,4-丁三醇的检测
取样及气质联用的前处理(三甲基硅烷化处理),同实施例2中的步骤二。
气质联用条件:HP-5柱子(柱长为30米),不设分流比,进样量2μl,质荷比范围30-500。进样口温度设置为280℃。以氦气为载体,流速设置为1.0mL/min。气质升温程序设置为:80℃保持1.5min;以3℃/min的速率升温至140℃,保持0min;以50℃/min的速率升温至280℃,保持10min。目标产物用全扫描模式和选择离子模式检测。选择离子的设定,同实施例2中的步骤二。
经气质联用分析,并与1,2,4-丁三醇标准品(图9中A)作比较,结果表明,重组菌株BL21(DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE的发酵滤液中含有与标准品保留时间高度一致的、含有标准品特征离子谱的目标峰(图9中B)。且在全扫描模式下通过对目标峰进行质谱分析(图9中C、D),结果表明,目标峰的质谱裂解规律与标准品高度一致。可以确定,该目标峰即为1,2,4-丁三醇。而对照菌株BL21(DE3)/pACYC184的发酵滤液中则没有该目标峰。
另外,本发明的发明人对利用重组菌株BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE通过生物发酵将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇的产量进行了初步检测,其产量达到μg/L发酵液的级别。
Claims (4)
1.一种制备1,2,4-丁三醇的方法,包括用重组生物细胞将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇的步骤;所述重组生物细胞表达具有将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇功能的酶系统;
所述酶系统包括如下(a1)-(a5):
(a1)具有将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A功能的酶1;
(a2)具有将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛功能的酶2;
(a3)具有将所述苹果酸半醛转化为2,4-二羟基丁酸功能的酶3;
(a4)具有将所述2,4-二羟基丁酸转化为2,4-二羟基丁酰辅酶A功能的酶4;
(a5)具有将所述2,4-二羟基丁酰辅酶A转化为1,2,4-丁三醇功能的酶5;
所述酶1为琥珀酰辅酶A合成酶,所述琥珀酰辅酶A合成酶的β亚基的氨基酸序列如序列表中序列1所示,所述琥珀酰辅酶A合成酶的α亚基的氨基酸序列如序列表中序列2所示;
所述酶2为琥珀酸半醛脱氢酶;所述琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示;
所述酶3为4-羟基丁酸脱氢酶;所述4-羟基丁酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示;
所述酶4为4-羟基丁酸辅酶A转移酶;所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示;
所述酶5为双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶;所述双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示;
所述生物细胞为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述重组生物细胞是将如下编码基因导入目的生物细胞后得到的表达所述酶系统的重组生物细胞:
如序列表中序列7所示的所述琥珀酰辅酶A合成酶的β亚基的编码基因,如序列表中序列8所示的所述琥珀酰辅酶A合成酶的α亚基的编码基因;
如序列表中序列9所示的所述琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因;
如序列表中序列10所示的所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因;
如序列表中序列11所示的所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的编码基因;
如序列表中序列12所示的所述双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶的编码基因。
3.重组质粒A和/或重组质粒B,其特征在于:所述重组质粒A为携带并表达如下(b1)-(b4)所述DNA片段的重组表达载体;所述重组质粒B为携带并表达如下(b5)和(b6)所述DNA片段的重组表达载体;
(b1)核苷酸序列为序列表中序列7所示的DNA片段;
(b2)核苷酸序列为序列表中序列8所示的DNA片段;
(b3)核苷酸序列为序列表中序列9所示的DNA片段;
(b4)核苷酸序列为序列表中序列10所示的DNA片段;
(b5)核苷酸序列为序列表中序列11所示的DNA片段;
(b6)核苷酸序列为序列表中序列12所示的DNA片段。
4.重组大肠杆菌1或/和重组大肠杆菌2或/和重组大肠杆菌3,其特征在于:所述重组大肠杆菌1为携带权利要求3中所述重组质粒A和所述重组质粒B,并表达如下(b1)-(b6)所述DNA片段的大肠杆菌;所述重组大肠杆菌2为携带权利要求3中所述重组质粒A,并表达如下(b1)-(b4)所述DNA片段的大肠杆菌;所述重组大肠杆菌3为携带权利要求3中所述重组质粒B,并表达如下(b5)和(b6)所述DNA片段的大肠杆菌;
(b1)核苷酸序列为序列表中序列7所示的DNA片段;
(b2)核苷酸序列为序列表中序列8所示的DNA片段;
(b3)核苷酸序列为序列表中序列9所示的DNA片段;
(b4)核苷酸序列为序列表中序列10所示的DNA片段;
(b5)核苷酸序列为序列表中序列11所示的DNA片段;
(b6)核苷酸序列为序列表中序列12所示的DNA片段。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105567716A (zh) * | 2014-10-08 | 2016-05-11 | 中国科学院微生物研究所 | 1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应用 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014176514A2 (en) * | 2013-04-26 | 2014-10-30 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds |
EP3280794B1 (en) * | 2015-04-07 | 2020-05-27 | Metabolic Explorer | A modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxyburyrate with enhanced 2,4-dihydroxybutyrate efflux |
CN105506058B (zh) * | 2015-12-08 | 2018-06-01 | 深圳市倍诺博生物科技有限公司 | 铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系和方法 |
EP3601546A1 (en) | 2017-03-31 | 2020-02-05 | Genomatica, Inc. | Aldehyde dehydrogenase variants and methods of use |
CN107699534A (zh) * | 2017-10-17 | 2018-02-16 | 南京工业大学 | 一种利用d‑阿拉伯糖生产d‑1,2,4‑丁三醇的基因工程菌及其构建方法与应用 |
CN108148796B (zh) * | 2017-12-29 | 2021-01-01 | 北京理工大学 | 一种重组大肠杆菌、制备方法及其合成d-1,2,4-丁三醇的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101512004A (zh) * | 2006-07-19 | 2009-08-19 | 密歇根州州立大学托管委员会 | D-1,2,4-丁三醇的微生物合成 |
CN102498215A (zh) * | 2009-06-04 | 2012-06-13 | 基因组股份公司 | 生产1,4-丁二醇的微生物和相关方法 |
-
2012
- 2012-11-14 CN CN201210457975.8A patent/CN102965401B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101512004A (zh) * | 2006-07-19 | 2009-08-19 | 密歇根州州立大学托管委员会 | D-1,2,4-丁三醇的微生物合成 |
CN102498215A (zh) * | 2009-06-04 | 2012-06-13 | 基因组股份公司 | 生产1,4-丁二醇的微生物和相关方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Green synthesis of D-1,2,4-Butantetriol from D-glucose;John W. Frost et al.;《2009 Annual Report, Grant No.N000140710323》;20091231;1-6 * |
Microbial Synthesis of the Energetic Material Precursor 1,2,4-Butanetriol;Wei Niu , Mapitso N. Molefe , and J. W. Frost;《Journal of the American Chemical Society》;20031007;第125卷(第43期);12998–12999 * |
丙酮丁酸发酵菌的分子遗传改造;杨明等;《中国生物工程杂质》;20091031;第29卷(第10期);109-114 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105567716A (zh) * | 2014-10-08 | 2016-05-11 | 中国科学院微生物研究所 | 1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应用 |
Also Published As
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