CN105567716A - 1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应用 - Google Patents
1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应用。本发明也涉及编码该酶的核苷酸序列，被导入核苷酸序列的重组宿主以及利用重组宿主制备1,2,4-丁三醇的方法。本发明提供的酶可以催化木糖生物合成1,2,4-丁三醇途径中的关键步骤，该酶的应用显著提高了重组宿主1,2,4-丁三醇的生产能力。本发明还构建了利用木糖生产1,2,4-丁三醇能力提高的重组大肠杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应用。
背景技术
从自然资源中发掘新酶或人工设计新酶是合成生物技术的基础，自然界中的生物多样性和丰富的基因资源为发掘具有心功能的酶提供了广阔的来源，通过挖掘新酶已经使人类能够合成很多自然界中不存在的有用化学品。
1,2,4-丁三醇是一种在军工和民用上都具有重要用途的化学品。它是一种手性多羟基醇，作为重要的有机合成中间体，可用于制备生物活性剂、医药用缓释剂、卷烟添加剂、抗菌剂、彩色显影剂等。其硝化产物1,2,4-丁三醇三硝酸酯，可作为飞机、火箭、导弹等军事武器的推进剂，较硝化甘油具有冲击敏感性低、热稳定性好等优点。目前，1,2,4-丁三醇的工业化生产主要依靠化学合成法，缺点是副产物多，产物产率低，对环境有危害等，由此也限制了1,2,4-丁三醇及1,2,4-丁三醇三硝酸酯的商业前景。
自然界不存在1,2,4-丁三醇的天然生物合成途径，所以生物法生产1,2,4-丁三醇的研究进展比较缓慢。2003年，WeiNiu等使用双微生物工艺，以D-木糖和L-阿拉伯糖为碳源，建立了1,2,4-丁三醇的生物合成途径(Niu,W.,Molefe,M.N.,Frost,J.W.Microbialsynthesisoftheenergeticmaterialprecursor1,2,4-butanetriol.JournaloftheAmericanChemicalSociety.2003,125(43):12998-12999.)。随后进一步改良该方法，建立了在大肠杆菌利用D-木糖合成1,2,4-丁三醇的生物合成系统(J·W·佛罗斯特，W·牛，D-1,2,4-丁三醇的微生物合成，中国专利申请号：200780032753.9，申请日：2007年7月19日)。这些研究中，从木糖转化为1,2,4-丁三醇的生物反应途径主要包括脱氢、脱水、脱羧、加氢4步反应，其中，第二步(脱水)和第四步(加氢)反应所需的酶在大肠杆菌中天然存在，而第一步和第三步反应的酶需外源导入。前人研究中催化第一步脱氢反应的酶为木糖脱氢酶(XDH)，来源于新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)；催化第三步反应的酶为2-酮酸脱羧酶，是来自恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高生物法生产1,2,4-丁三醇的产量和得率。
为解决上述技术问题，本发明首先提供1,2,4-丁三醇相关蛋白或其编码基因在制备1,2,4-丁三醇中的应用。
本发明所提供的1,2,4-丁三醇相关蛋白在制备1,2,4-丁三醇中的应用中，所述1,2,4-丁三醇相关蛋白的名称为BSRP，所述BSRP，是如下B1)或B2)的蛋白质：
B1)氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质；
B2)在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质。
其中，SEQIDNo.1由548个氨基酸残基组成。
上述B2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述B2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQIDNo.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
上述应用中，所述BSRP的基因为下述B11)-B13)中的任一种DNA分子：
B11)编码序列是SEQIDNo.2的第71-1717位核苷酸所示的cDNA分子或基因组DNA；
B12)在严格条件下与B11)限定的DNA分子杂交且编码所述BSRP的cDNA分子或基因组DNA；
B13)与B11)或B12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述BSRP的cDNA分子或基因组DNA。
其中，SEQIDNo.2由1726个核苷酸组成，SEQIDNo.2的第71-1717位核苷酸编码SEQIDNo.1所示的氨基酸。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述BSRP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述BSRP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述BSRP，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“75％以上的同一性”包括与本发明的编码BSRP的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高，或97％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种构建用于生产1,2,4-丁三醇的重组细胞的方法。
本发明所提供的构建用于生产1,2,4-丁三醇的重组细胞的方法，包括对受体细胞进行A3)、A5)、A6)和A7)的改造得到重组细胞的步骤：
A3)将所述受体细胞的木糖异构酶基因敲除；
A5)向所述受体细胞中导入木糖脱氢酶基因；
A6)向所述受体细胞中导入醇脱氢酶基因；
A7)向所述受体细胞中导入1,2,4-丁三醇相关蛋白基因；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
上述方法中，所述方法还包括对所述受体细胞进行A1)、A2)和A4)中任一种、任两种或三种的改造得到重组细胞的步骤：
A1)将所述受体细胞的2-酮酸脱氢酶基因敲除；
A2)将所述受体细胞的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因敲除；
A4)将所述受体细胞的木酮糖激酶基因敲除；
上述方法中，所述微生物细胞可来自埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠杆菌，具体可为BL21(DE3)、大肠杆菌BW25113或大肠杆菌BW25113的突变体等。
由于在所述大肠杆菌中存在如图8所示的代谢途径，所以，上述方法中所述重组细胞可为对受体细胞进行所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，所述重组细胞还可为对受体细胞进行所述所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述A1)、所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述A2)、所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述所述A1)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞。
上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因为2-酮酸脱氢酶基因ycdW和yiaE；所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因为3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE和yjhH；所述木糖异构酶基因为木糖异构酶基因xylA；所述木酮糖激酶基因为木酮糖激酶基因xylB；所述醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因adhP；所述木糖脱氢酶基因为木糖脱氢酶基因xdh。
上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE编码下述H1)或H2)的蛋白质：
H1)氨基酸序列为SEQIDNo.3的蛋白质；
H2)在SEQIDNo.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有2-酮酸脱氢酶功能的由H1)衍生的蛋白质；
所述2-酮酸脱氢酶基因ycdW编码下述I1)或I2)的蛋白质：
I1)氨基酸序列为SEQIDNo.5的蛋白质；
I2)在SEQIDNo.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有2-酮酸脱氢酶功能的由I1)衍生的蛋白质；
所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE编码下述J1)或J2)的蛋白质：
J1)氨基酸序列为SEQIDNo.7的蛋白质；
J2)在SEQIDNo.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶功能的由J1)衍生的蛋白质；
所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH编码下述K1)或K2)的蛋白质：
K1)氨基酸序列为SEQIDNo.9的蛋白质；
K2)在SEQIDNo.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶功能的由K1)衍生的蛋白质；
所述木糖脱氢酶基因xdh编码下述L1)或L2)的蛋白质：
L1)氨基酸序列为SEQIDNo.11的蛋白质；
L2)在SEQIDNo.11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有木糖脱氢酶功能的由L1)衍生的蛋白质；
所述醇脱氢酶基因adhP编码下述M1)或M2)的蛋白质：
M1)氨基酸序列为SEQIDNo.13的蛋白质；
M2)在SEQIDNo.13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有醇脱氢酶功能的由M1)衍生的蛋白质；
所述木糖异构酶基因xylA编码下述O1)或O2)的蛋白质：
O1)氨基酸序列为SEQIDNo.17的蛋白质；
O2)在SEQIDNo.17所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有木糖异构酶功能的由O1)衍生的蛋白质；
所述木酮糖激酶基因xylB编码下述P1)或P2)的蛋白质：
P1)氨基酸序列为SEQIDNo.19的蛋白质；
P2)在SEQIDNo.19所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有木酮糖激酶功能的由P1)衍生的蛋白质。
上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE为下述H11)-H13)中的任一种DNA分子：
H11)编码序列是SEQIDNo.4的cDNA分子或基因组DNA；
H12)在严格条件下与H11)限定的DNA分子杂交且编码所述2-酮酸脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述2-酮酸脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述2-酮酸脱氢酶基因ycdW为下述I11)-I13)中的任一种DNA分子：
I11)编码序列是SEQIDNo.6的cDNA分子或基因组DNA；
I12)在严格条件下与I11)限定的DNA分子杂交且编码所述2-酮酸脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
I13)与I11)或I12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述2-酮酸脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE为下述J11)-J13)中的任一种DNA分子：
J11)编码序列是SEQIDNo.8的cDNA分子或基因组DNA；
J12)在严格条件下与J11)限定的DNA分子杂交且编码所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的cDNA分子或基因组DNA；
J13)与J11)或J12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH为下述K11)-K13)中的任一种DNA分子：
K11)编码序列是SEQIDNo.10的cDNA分子或基因组DNA；
K12)在严格条件下与K11)限定的DNA分子杂交且编码所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的cDNA分子或基因组DNA；
K13)与K11)或K12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述木糖脱氢酶基因xdh为下述L11)-L13)中的任一种DNA分子：
L11)编码序列是SEQIDNo.12的cDNA分子或基因组DNA；
L12)在严格条件下与L11)限定的DNA分子杂交且编码所述木糖脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
L13)与L11)或L12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述木糖脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述醇脱氢酶基因adhP为下述M11)-M13)中的任一种DNA分子：
M11)编码序列是SEQIDNo.14的cDNA分子或基因组DNA；
M12)在严格条件下与M11)限定的DNA分子杂交且编码所述醇脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
M13)与M11)或M12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述醇脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述苯甲酰甲酸脱羧酶基因mdlC为下述M11)-M13)中的任一种DNA分子：
N11)编码序列是SEQIDNo.16的cDNA分子或基因组DNA；
N12)在严格条件下与N11)限定的DNA分子杂交且编码所述苯甲酰甲酸脱羧酶的cDNA分子或基因组DNA；
N13)与N11)或N12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述苯甲酰甲酸脱羧酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述木糖异构酶基因xylA为下述O11)-O13)中的任一种DNA分子：
O11)编码序列是SEQIDNo.18的cDNA分子或基因组DNA；
O12)在严格条件下与O11)限定的DNA分子杂交且编码所述木糖异构酶的cDNA分子或基因组DNA；
O13)与O11)或O12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述木糖异构酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述木酮糖激酶基因xylB为下述P11)-P13)中的任一种DNA分子：
P11)编码序列是SEQIDNo.20的cDNA分子或基因组DNA；
P12)在严格条件下与P11)限定的DNA分子杂交且编码所述木酮糖激酶的cDNA分子或基因组DNA；
P13)与P11)或P12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述木酮糖激酶的cDNA分子或基因组DNA。
上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE的编码序列如SEQIDNo.4所示，编码由SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质2-酮酸脱氢酶；2-酮酸脱氢酶基因ycdW的编码序列如SEQIDNo.6所示，编码由SEQIDNo.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质2-酮酸脱氢酶；3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE的编码序列如SEQIDNo.8所示，编码由SEQIDNo.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶；3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH的编码序列如SEQIDNo.10所示，编码由SEQIDNo.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶；木糖脱氢酶基因xdh的编码序列如SEQIDNo.12所示，编码由SEQIDNo.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质木糖脱氢酶；醇脱氢酶基因adhP的编码序列如SEQIDNo.14所示，编码由SEQIDNo.13所示的氨基酸序列组成的蛋白质醇脱氢酶；木糖异构酶基因xylA的编码序列如SEQIDNo.18所示，编码由SEQIDNo.17所示的氨基酸序列组成的蛋白质木糖异构酶；木酮糖激酶基因xylB的编码序列如SEQIDNo.20所示，编码由SEQIDNo.19所示的氨基酸序列组成的蛋白质木酮糖激酶。
上述方法中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述方法中，所述A1)具体可为将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE敲除，和/或将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱氢酶基因ycdW替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱氢酶基因ycdW敲除；
所述A2)具体可为将所述大肠杆菌BW25113的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将所述大肠杆菌BW25113的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE敲除，和/或将所述大肠杆菌BW25113的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将所述大肠杆菌BW25113的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH敲除；
所述A3)、所述A4)、所述A5)和所述A6)具体可为将所述大肠杆菌BW25113的所述木糖异构酶基因xylA和所述木酮糖激酶基因xylB替换为含有所述醇脱氢酶基因adhP和所述木糖脱氢酶基因xdh的DNA分子从而将所述大肠杆菌BW25113的所述木糖异构酶基因xylA和所述木酮糖激酶基因xylB敲除并导入所述醇脱氢酶基因adhP和所述木糖脱氢酶基因xdh；
所述A3)、所述A5)和所述A6)具体可为将所述大肠杆菌BW25113的所述木糖异构酶基因xylA替换为含有所述醇脱氢酶基因adhP和所述木糖脱氢酶基因xdh的DNA分子从而将所述大肠杆菌BW25113的所述木糖异构酶基因xylA敲除并将所述醇脱氢酶基因adhP和所述木糖脱氢酶基因xdh导入所述受体细胞中；
所述A7)具体可为将所述1,2,4-丁三醇相关蛋白基因bsrp或所述1,2,4-丁三醇相关蛋白基因bsrp的优化的核苷酸序列导入目的受体细胞(宿主细胞)，得到重组细胞，导入方法可以为重组到所述受体细胞的染色体上，或者以表达载体的形式，使bsrp存在于所述受体细胞中，且能在所述受体细胞中进行功能性表达。
上述方法中，所述含有所述醇脱氢酶基因adhP和所述木糖脱氢酶基因xdh的DNA分子具体可为核苷酸序列为SEQIDNo.21的DNA分子。
其中，SEQIDNo.21的第1-747位核苷酸与序列表中SEQIDNo.12位核苷酸一致，编码SEQIDNo.11所示的氨基酸序列，SEQIDNo.21的第1315-2325位核苷酸与SEQIDNo.14的第1-1011位核苷酸反向互补，SEQIDNo.21的第2349-2377位核苷酸与tac启动子的核苷酸序列反向互补，SEQIDNo.21的第896-924位核苷酸与rrnBT2终止子的核苷酸序列反向互补，SEQIDNo.21的第1055-1009位核苷酸与rrnBT1终止子的核苷酸序列反向互补，SEQIDNo.21的第2334-2337位核苷酸与RBS的核苷酸序列反向互补。
上述方法中，所述受体细胞(宿主细胞)为能产生3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸的目的生物细胞。
上述方法中，bsrp基因可通过bsrp表达盒导入。
上述方法中，可用现有的表达载体构建含有bsrp基因表达盒的重组载体。
上述方法中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述方法中，bsrp基因通过SEQIDNo.2的所示的DNA分子导入所述受体细胞。
在本发明的一个实施例中，bsrp基因是将SEQIDNo.2的SgrAI和NcoI的位点之间的序列替换为质粒pET30a(+)的SgrAI和NcoI的之间的序列，保持pET30a(+)的其他序列不变，得到名称为pET30a-miniPtac-bsrp的重组载体。其中，SEQIDNo.2由1726个核苷酸组成，SEQIDNo.2的第18-46位核苷酸为minPtac启动子，SEQIDNo.2的第58-64位核苷酸为RBS，SEQIDNo.2的第71-1717位核苷酸为bsrp基因的核苷酸序列，编码SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。
用上述方法构建的重组细胞，也属于本发明的保护范围。
用于构建所述重组细胞的生物材料，也属于本发明的保护范围。
上述生物材料为下述C1)或C2)：
C1)用于构建所述重组细胞的成套DNA分子，由所述木糖脱氢酶基因、所述醇脱氢酶基因和所述1,2,4-丁三醇相关蛋白基因组成，这三个基因各自独立包装；
C2)含有C1)所述成套DNA分子中所述三个基因、或其中任两个基因或其中任一个基因的载体。
上述重组细胞在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或上述重组细胞在生物转化D-木糖或L-阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用，也属于本发明的保护范围。
上述重组细胞在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或上述重组细胞在生物转化D-木糖或L-阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用，具体可包括下述步骤a)和b)：
a)用培养基培养上述重组细胞，收集培养物(如发酵液)；
b)从所述培养物中分离和/或纯化1,2,4-丁三醇，得到1,2,4-丁三醇。
上述重组细胞在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或上述重组细胞在生物转化D-木糖或L-阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用中，所述培养基含有D-木糖或L-阿拉伯糖。
BSRP或其编码基因在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或BSRP或其编码基因在生物转化D-木糖或L-阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用，也属于本发明的保护范围。
实验证明，对受体细胞进行上述A1)-A7)的改造，得到的名称为重组菌BW-025的重组细胞的1,2,4-丁三醇的产量为1.35g/L±0.146g/L，1,2,4-丁三醇的得率为0.17g/g±0.021g/g；而将重组菌BW-025的BSRP基因替换为苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)基因，其它基因不变得到的重组菌BW-011的1,2,4-丁三醇产量为0.49g/L±0.011g/L，1,2,4-丁三醇的得率为0.08g/g±0.003g/g；重组菌BW-025的1,2,4-丁三醇的产量和得率是重组菌BW-011的2.8倍和2.1倍。说明BSRP或其编码基因与来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)或其编码基因相比，可大幅提高1,2,4-丁三醇的产量和得率，本发明的1,2,4-丁三醇相关蛋白(BSRP)比已报道的来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)更有利于1,2,4-丁三醇生物合成。本发明的1,2,4-丁三醇的相关蛋白或其编码基因可应用于1,2,4-丁三醇的生物合成。
附图说明
图1为重组质粒pET30a-miniPtac-bsrp的结构图谱。
图2为重组质粒pET30a-miniPtac-mdlC的结构图谱。
图3为BW-011转化液的HPLC检测结果。
图4为BW-025转化液的HPLC检测结果。
图5为1,2,4-丁三醇标准品的HPLC检测结果。
图6为D-木糖标准品的HPLC检测结果。
图7为1,2,4-丁三醇的LC-MS检测结果。
图8为D-木糖的代谢途径。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，大肠杆菌BW25113(TomoyaBaba,TakeshiAra,MikiHasegawa,YukiTakai,YoshikoOkumura,MikiBaba,KirillADatsenko,MasaruTomita,BarryLWanner,andHirotadaMori1.ConstructionofEscherichiacoliK-12in-frame,single-geneknockoutmutants:theKeiocollection.MolecularSystemsBiology(2006):1-11.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pKD46质粒为Clontech公司产品；下述实施例中的pCP20为长沙赢润生物技术有限公司产品，货号为VJC0522。
下述实施例中，ycdW表示2-酮酸脱氢酶的编码基因，yiaE表示2-酮酸脱氢酶的编码基因，yagE表示3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的编码基因，yjhH表示3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的编码基因，xdh表示木糖脱氢酶的编码基因，adhP表示醇脱氢酶的编码基因，xylA表示木糖异构酶的编码基因，xylB表示木酮糖激酶的编码基因，bsrp表示1,2,4-丁三醇相关蛋白的编码基因，BSRP表示1,2,4-丁三醇相关蛋白，mdlC表示苯甲酰甲酸脱羧酶的编码基因，MDLC表示苯甲酰甲酸脱羧酶。
下述实施例中，1,2,4-丁三醇相关蛋白基因的编码序列如SEQIDNo.2所示，编码由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2-酮酸脱氢酶基因yiaE的编码序列如SEQIDNo.4所示，编码由SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质2-酮酸脱氢酶；2-酮酸脱氢酶基因ycdW的编码序列如SEQIDNo.6所示，编码由SEQIDNo.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质2-酮酸脱氢酶；3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE的编码序列如SEQIDNo.8所示，编码由SEQIDNo.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶；3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH的编码序列如SEQIDNo.10所示，编码由SEQIDNo.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶；木糖脱氢酶基因xdh的编码序列如SEQIDNo.12所示，编码由SEQIDNo.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质木糖脱氢酶；醇脱氢酶基因adhP的编码序列如SEQIDNo.14所示，编码由SEQIDNo.13所示的氨基酸序列组成的蛋白质醇脱氢酶；苯甲酰甲酸脱羧酶基因mdlC的编码序列如SEQIDNo.16所示，编码由SEQIDNo.15所示的氨基酸序列组成的蛋白质苯甲酰甲酸脱羧酶；木糖异构酶基因xylA的编码序列如SEQIDNo.18所示，编码由SEQIDNo.17所示的氨基酸序列组成的蛋白质木糖异构酶；木酮糖激酶基因xylB的编码序列如SEQIDNo.20所示，编码由SEQIDNo.19所示的氨基酸序列组成的蛋白质木酮糖激酶。
实施例1、用于生产1,2,4-丁三醇的重组菌BW-025和BW-011的构建
重组菌BW-025是对大肠杆菌BW25113进行下述A1)、A2)、A3)、A4)、A5)、A6)和A7)的改造得到的重组菌：
A1)将所述受体细胞的2-酮酸脱氢酶基因yiaE和ycdW敲除；
A2)将所述受体细胞的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE和yjhH敲除；
A3)将所述受体细胞的木糖异构酶基因xylA敲除；
A4)将所述受体细胞的木酮糖激酶基因xylB敲除；
A5)向所述受体细胞中导入木糖脱氢酶基因xdh；
A6)向所述受体细胞中导入醇脱氢酶基因adhP；
A7)向所述受体细胞中导入1,2,4-丁三醇相关蛋白基因bsrp。
BW-004的构建方法包括下述1-4，BW-010的构建方法包括下述1-5，BW-025的构建方法包括下述1-6：
1、将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱氢酶基因(yiaE)敲除(缺失)，保持所述大肠杆菌BW25113的其它基因不变，得到所述大肠杆菌BW25113的突变体，将其命名为BW25113ΔyiaE；
2、将所述BW25113ΔyiaE的所述2-酮酸脱氢酶基因(ycdW)敲除(缺失)，保持所述BW25113ΔyiaE的其它基因不变，得到所述BW25113ΔyiaE的突变体，将其命名为BW25113ΔyiaEΔycdW；
3、将所述BW25113ΔyiaEΔycdW的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)敲除(缺失)，保持所述BW25113ΔyiaEΔycdW的其它基因不变，得到所述BW25113ΔyiaEΔycdW的突变体，将其命名为BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE；
4、将所述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)敲除(缺失)，保持所述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的其它基因不变，得到所述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的突变体，将其命名为BW-004；
5、将所述BW-004的木糖异构酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB敲除并向所述BW-004中导入所述木糖脱氢酶基因(xdh)和所述醇脱氢酶基因(adhP)，得到所述BW-004的突变体，将其命名为BW-010；
6、向所述BW-010中导入所述1,2,4-丁三醇相关蛋白基因(bsrp)，得到所述BW-010的突变体，将其命名为BW-025。
重组菌BW-025的具体构建方法如下：
1、BW25113ΔyiaE的构建：
将pKD46(Clontech公司)质粒通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌BW25113中，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌BW25113/pKD46。重组大肠杆菌BW25113/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。
利用5’端含yiaE同源臂的扩增引物对yiaE(kan)P1和yiaE(kan)P2(yiaE(kan)P1和yiaE(kan)P2的序列见表1)，以质粒pKD4(长沙赢润生物技术有限公司，货号：VJC0519)为模板，进行PCR扩增，得到的PCR产物为两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，将该PCR产物用DpnI酶处理，并用cyclepure纯化试剂盒(Omega)回收，将回收得到的两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段电转至上述BW25113/pKD46中，在含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，并进行菌落PCR验证阳性克隆，引物对为yiaEup和kan(yiaEup和kan的序列见表1)，目的片段大小为1097bp，其中，yiaEup和kan引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yiaE基因的上游83-61bp和kan基因的566-582bp附近区域。PCR扩增出大小为1097bp的阳性克隆为BW25113的突变体，测序分析结果表明该突变体的基因组上没有yiaE基因。该突变体是将大肠杆菌BW25113的2-酮酸脱氢酶基因(yiaE)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1439bp)从而将大肠杆菌BW25113的yiaE基因敲除，保持所述大肠杆菌BW25113的其它基因不变得到的突变体，将该突变体命名为BW25113ΔyiaEkan。
利用表达Flp重组酶的质粒pCP20(长沙赢润生物技术有限公司，货号：VJC0522)消除上述BW25113ΔyiaEkan的卡那霉素抗性，具体步骤如下：采用化学转化法将质粒pCP20转入上述BW25113ΔyiaEkan中，在含有终浓度25μg/ml氯霉素的LB平板上于30℃下培养过夜，使菌体基因组上的卡那霉素抗性消除；挑选单克隆菌株，并进行菌落PCR验证，引物对为yiaEup和yiaEdown(yiaEup和yiaEdown的序列见表1)，目的片段大小262bp。其中，yiaEup和yiaEdown引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yiaE基因的上游83-61bp和下游46-70bp附近区域。将扩增出大小为262bp的阳性克隆分别在无抗性LB平板和含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，只在无抗性的LB平板上生长的菌株为卡那霉素抗性基因缺失的菌株，将该菌株于无抗性LB中42℃培养6小时。pCP20为温敏型质粒，在无抗性LB中42℃培养6小时可将质粒消除，得到卡那霉素抗性和pCP20质粒均消除的菌株，将其命名为BW25113ΔyiaE。
2、BW25113ΔyiaEΔycdW的构建：
将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至上述步骤1得到的BW25113ΔyiaE中，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌BW25113ΔyiaE/pKD46。重组大肠杆菌BW25113ΔyiaE/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。
利用5’端含ycdW同源臂的扩增引物对ycdW(Kan)P1和ycdW(Kan)P2(ycdW(Kan)P1和ycdW(Kan)P2的序列见表1)，以质粒pKD4为模板，进行PCR扩增，得到的PCR产物为两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，将该PCR产物用DpnI酶处理，并用cyclepure纯化试剂盒(Omega)回收，将回收得到的两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段电转至上述BW25113ΔyiaE/pKD46中，在含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，并进行菌落PCR验证阳性克隆，引物对为ycdWup和步骤1中所述kan(ycdWup和kan的序列见表1)，目的片段大小为1095bp，其中，ycdWup和kan引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的ycdW基因的上游81-61bp和kan基因的566-582bp附近区域。PCR扩增出大小为1095bp的阳性克隆为BW25113ΔyiaE的突变体，测序分析结果表明该突变体的基因组上没有ycdW基因。该突变体是将大肠杆菌BW25113的2-酮酸脱氢酶基因(ycdW)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1439bp)从而将BW25113ΔyiaE的ycdW基因敲除，保持所述BW25113ΔyiaE的其它基因不变得到的突变体，将该突变体命名为BW25113ΔyiaEΔycdWkan。
利用表达Flp重组酶的质粒pCP20消除上述BW25113ΔyiaEΔycdWkan的卡那霉素抗性，具体步骤如下：采用化学转化法将质粒pCP20转入上述BW25113ΔyiaEΔycdWkan中，在含有终浓度25μg/ml氯霉素的LB平板上于30℃下培养过夜，使菌体基因组上的卡那霉素抗性消除；挑选单克隆菌株，并进行菌落PCR验证，引物对为ycdWup和ycdWdown(ycdWup和ycdWdown的序列见表1)，目的片段大小257bp。其中，ycdWup和ycdWdown引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的ycdW基因的上游81-61bp和下游43-67bp附近区域。将扩增出大小为257bp的阳性克隆分别在无抗性LB平板和含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，只在无抗性的LB平板上生长的菌株为卡那霉素抗性基因缺失的菌株，将该菌株于无抗性LB中42℃培养6小时。pCP20为温敏型质粒，在无抗性LB中42℃培养6小时可将质粒消除，得到卡那霉素抗性和pCP20质粒均消除的菌株，将其命名为BW25113ΔyiaEΔycdW。
3、BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的构建：
将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至上述步骤2得到的BW25113ΔyiaEΔycdW中，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌BW25113ΔyiaEΔycdW/pKD46。重组大肠杆菌BW25113ΔyiaEΔycdW/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。
利用5’端含yagE同源臂的扩增引物对yagE(Kan)P1和yagE(Kan)P2(yagE(Kan)P1和yagE(Kan)P2的序列见表1，以质粒pKD4为模板，进行PCR扩增，得到的PCR产物为两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，将该PCR产物用DpnI酶处理，并用cyclepure纯化试剂盒(Omega)回收，将回收得到的两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段电转至上述BW25113ΔyiaEΔycdW/pKD46中，在含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，并进行菌落PCR验证阳性克隆，引物对为yagEup和步骤1中所述kan(yagEup和kan的序列见表1)，目的片段大小为1591bp，其中，yagEup和kan引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yagE基因的上游598-579bp和kan基因的566-582bp附近区域。PCR扩增出大小为1591bp的阳性克隆为BW25113ΔyiaEΔycdW的突变体，测序分析结果表明该突变体的基因组上没有yagE基因。该突变体是将BW25113ΔyiaEΔycdW的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1439bp)从而将BW25113ΔyiaEΔycdW的yagE基因敲除，保持所述BW25113ΔyiaEΔycdW的其它基因不变得到的突变体，将该突变体命名为BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan。
利用表达Flp重组酶的质粒pCP20消除上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan的卡那霉素抗性，具体步骤如下：采用化学转化法将质粒pCP20转入上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan中，在含有终浓度25μg/ml氯霉素的LB平板上于30℃下培养过夜，使菌体基因组上的卡那霉素抗性消除；挑选单克隆菌株，并进行菌落PCR验证，引物对为yagEup和yagEdown(yagEup和yagEdown的序列见表1)，目的片段大小1200bp。其中，yagEup和yagEdown引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yagE基因的上游598-579bp和下游493-512bp附近区域。将扩增出大小为1200bp的阳性克隆分别在无抗性LB平板和含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，只在无抗性的LB平板上生长的菌株为卡那霉素抗性基因缺失的菌株，将该菌株于无抗性LB中42℃培养6小时。pCP20为温敏型质粒，在无抗性LB中42℃培养6小时可将质粒消除，得到卡那霉素抗性和pCP20质粒均消除的菌株，将其命名为BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE。4、BW-004的构建：
将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至上述步骤3得到的BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE中，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE/pKD46。重组大肠杆菌BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。
利用5’端含yjhH同源臂的扩增引物对yjhH(kan)P1和yjhH(kan)P2(yjhH(kan)P1和yjhH(kan)P2的序列见表1)，以质粒pKD4为模板，进行PCR扩增，得到的PCR产物为两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，将该PCR产物用DpnI酶处理，并用cyclepure纯化试剂盒(Omega)回收，将回收得到的两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段电转至上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE/pKD46中，在含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，并进行菌落PCR验证阳性克隆，引物对为yjhHup和步骤1中所述kan(yjhHup和kan的序列见表1)，目的片段大小为1593bp，其中，yjhHup和kan引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yjhH基因的上游579-559bp和kan基因的566-582bp附近区域。PCR扩增出大小为1593bp的阳性克隆为BW25113的突变体，测序分析结果表明该突变体的基因组上没有yjhH基因。该突变体是将大肠杆菌BW25113的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1439bp)从而将BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的yjhH基因敲除，保持所述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的其它基因不变得到的突变体，将该突变体命名为BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan。
利用表达Flp重组酶的质粒pCP20消除上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan的卡那霉素抗性，具体步骤如下：采用化学转化法将质粒pCP20转入上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan中，在含有终浓度25μg/ml氯霉素的LB平板上于30℃下培养过夜，使菌体基因组上的卡那霉素抗性消除；挑选单克隆菌株，并进行菌落PCR验证，引物对为yjhHup和yjhHdown(yjhHup和yjhHdown的序列见表1)，目的片段大小1179bp。其中，yjhHup和yjhHdown引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yjhH基因的上游579-559bp和下游468-489bp附近区域。将扩增出大小为1179bp的阳性克隆分别在无抗性LB平板和含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，只在无抗性的LB平板上生长的菌株为卡那霉素抗性基因缺失的菌株，将该菌株于无抗性LB中42℃培养6小时。pCP20为温敏型质粒，在无抗性LB中42℃培养6小时可将质粒消除，得到卡那霉素抗性和pCP20质粒均消除的菌株，将其命名为BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEΔyjhH。
对上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEΔyjhH进行菌落PCR，引物对为以下四种：yjhHup和yjhHdown、ycdWup和ycdWdown、yagEup和yagEdown、yiaEup和yiaEdown，其中，能同时扩增出大小分别为1179bp、257bp、1591bp和262bp四种条带的菌株为成功将yjhH、ycdW、yagE和yiaE四个基因敲除的菌株，将其命名为BW-004。
5、BW-010的构建：
1)合成SEQIDNo.21所示的DNA片段“xdh-T1T2-adhP-miniPtac”，SEQIDNo.21的第1-747位核苷酸与序列表中SEQIDNo.12位核苷酸一致，编码SEQIDNo.11所示的氨基酸序列，SEQIDNo.21的第1315-2325位核苷酸与SEQIDNo.14的第1-1011位核苷酸反向互补，SEQIDNo.21的第2349-2377位核苷酸与tac启动子的核苷酸序列反向互补，SEQIDNo.21的第896-924位核苷酸与rrnBT2终止子的核苷酸序列反向互补，SEQIDNo.21的第1055-1009位核苷酸与rrnBT1终止子的核苷酸序列反向互补，SEQIDNo.21的第2334-2337位核苷酸与RBS的核苷酸序列反向互补。将“xdh-T1T2-adhP-miniPtac”DNA片段替换质粒pET30a(+)的NdeI和XhoI之间的序列，保持pET30a(+)的其他序列不变，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pET30a-xdh-T1T2-adhP-miniPtac。
2)以步骤1)的重组质粒pET30a-xdh-T1T2-adhP-miniPtac为模板，用引物对xdhminiPtacF和xdhminiPtacR(xdhminiPtacF和xdhminiPtacR的序列见表1)进行PCR扩增，得到大小为2450bp的DNA片段，将该DNA片段命名为“xdh-T1T2-adhP-miniPtac-1”；以菌株BL21(DE3)为模板，用引物对xylAupF和xylAupR(xylAupF和xylAupR的序列见表1)进行PCR扩增，得到长度为1000bp的xylA的上游同源臂序列，将其命名为xylAup，其中，xylAupF和xylAupR引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的xylA基因的上游1000-976bp和上游26-1bp附近区域；以菌株BL21(DE3)为模板，用引物对xylBdownF和xylBdownR(xylBdownF和xylBdownR的序列见表1)进行PCR扩增，得到长度为1000bp的xylB的下游同源臂序列，将其命名为xylBdown，其中，xylBdownF和xylBdownR引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的xylB基因的下游1-14bp和下游975-1000bp附近区域；以上述PCR扩增得到的三种PCR产物：xdh-T1T2-adhP-miniPtac-1、xylAup、xylBdown为模板，用引物对xylAupF和xylBdownR进行PCR扩增，得到的PCR产物含有xdh-T1T2-adhP-miniPtac的DNA片段、xylA的上游同源臂序列和xylB的下游同源臂序列，将该PCR产物命名为“xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown”。
2)用限制性酶XhoI和SalI对xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown和自杀型质粒pKmTsSacB分别进行双酶切，分别得到xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown的双酶切产物和自杀型质粒pKmTsSacB的骨架，将xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown的双酶切产物和自杀型质粒pKmTsSacB的骨架连接，保持质粒pKmTsSacB的其他序列不变，得到重组质粒，该重组质粒为从5’端到3’端依次为xylA的上游同源臂序列、xdh-T1T2-adhP-miniPtac和xylB的下游同源臂序列的DNA片段替换质粒pKmTsSacB的XhoI和SalI间的序列得到，将测序验证正确的重组质粒命名为pKmTsSacB-xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown。
3)将步骤2)得到的重组质粒pKmTsSacB-xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown电转至上述步骤4得到的BW-004中，得到重组菌，将该重组菌于37℃下复壮培养2h后涂布在含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板上，42℃下过夜培养。挑取过夜培养后的单克隆菌株，用引物对xylABup-1和miniPtac-1(xylABup-1和miniPtac-1的序列见表1)进行菌落PCR，验证xylA和xylB是否通过单交换被xdh-T1T2-adhP-miniPtac替换并整合至大肠杆菌的基因组中，目的片段大小为3679bp，其中，xylABup-1和miniPtac-1引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的xylA基因的上游1295-1275bp和xdh-T1T2-adhP-miniPtac片段2361-2384bp附近区域。将扩增出大小为3679bp的的菌株命名为BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylB。
4)将步骤3)得到的BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylB挑取单菌落过夜活化后，梯度稀释菌液，每个梯度浓度的菌液分别涂布在含有终浓度为100g/l蔗糖的LB平板和不含蔗糖的LB平板上，37℃下培养。在合适梯度浓度下，含蔗糖的LB平板上有少量菌落生长、而对应的涂有相同菌液的不含蔗糖的LB平板上有大量菌落生长，其中蔗糖平板上的菌落则为发生双交换而丢失了sacB基因的菌株，将该菌株命名为BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylBΔsacB-1。
5)将步骤4)得到的BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylBΔsacB-1挑取单菌落，每个单菌落对应划线于含终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板和无抗性的LB平板上，37℃下培养。在无抗性的LB平板上生长、且在含卡那霉素的LB平板上不生长的单菌落可能为xylA和xylB被xdh-T1T2-adhP-miniPtac替换的重组菌，以该重组菌为模板，用引物对xylABup-1和xylABdown-1(xylABup-1和xylABdown-1的序列见表1)进行菌落PCR，验证片段xdh-T1T2-adhP-miniPtac是否完整插入至BW-004的基因组中，目的片段大小4828bp，其中，xylABup-1和xylABdown-1引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的xylA基因的上游1295-1275bp和xylB基因的下游1127-1149bp附近区域。将扩增出大小为4828bp的阳性克隆命名为BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylBΔsacB-2。
6)将步骤5)得到的BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylBΔsacB-2挑取单菌落，在无抗性的LB液体培养基中活化过夜，涂布无抗性的LB平板，37℃培养，再从平板上挑取单菌落，每个单菌落对应划线于含终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板和无抗性的LB平板上，37℃下培养。在无抗性的LB平板上生长、且在含卡那霉素的LB平板上不生长的单菌落可能为xylA和xylB被xdh-T1T2-adhP-miniPtac替换的重组菌，以该重组菌为模板，用上述引物对xylABup-1和xylABdown-1进行菌落PCR，目的片段大小4828bp，回收PCR产物并测序，验证片段xdh-T1T2-adhP-miniPtac是否完整插入至BW-004的基因组中，测序正确的阳性克隆为xdh-T1T2-adhP-miniPtac成功插入至BW-004的基因组中的BW-004的突变体，将该BW-004的突变体命名为BW-010。
6、BW-025和BW-011的构建：
根据大肠杆菌密码子的偏好性，在不改变序列表中SEQIDNo.1的氨基酸序列的前提下，对BSRP的编码序列进行密码子优化，得到BSRP编码基因的优化核苷酸序列，如序列表中SEQIDNo.2所示，将该优化核苷酸序列命名为bsrp。本申请中，将bsrp利用miniPtac启动子进行组成型表达。
制备miniPtac启动bsrp表达的DNA片段，名称为“miniPtac-bsrp”，该DNA片段(序列表中SEQIDNo.2)自5’端至3’端依次为：TGGCGCCGGTG+GAGCTG+miniPtac+TGTGGTCACAC+AAGGAG+ATATCAT+bsrp+CCATGGCTG，其中CGCCGGTG为限制性内切酶SgrAI的识别序列,CCATGG为限制性内切酶NcoI的识别序列，AAGGAG为RBS，miniPtac为启动子，代表SEQIDNo.2的17-45位的核苷酸，bsrp为1,2,4-丁三醇相关蛋白基因，代表SEQIDNo.2的70-1716位的核苷酸，“+”表示直接相连。将质粒pET30a(+)的SgrAI和NcoI的之间的序列替换为商业合成的“miniPtac-bsrp”的SgrAI和NcoI的位点之间的序列，保持pET30a(+)的其他序列不变，将序列正确的重组质粒命名为pET30a-miniPtac-bsrp，pET30a-miniPtac-bsrp的结构图谱如图1所示。
按照上述方法，将pET30a-miniPtac-bsrp中的bsrp替换为SEQIDNo.16的mdlC(mdlC为根据大肠杆菌密码子的偏好性，在不改变MDLC氨基酸序列的前提下，对MDLC的编码序列进行密码子优化得到的核苷酸序列)，其他序列不变，得到重组质粒pET30a-miniPtac-mdlC，pET30a-miniPtac-mdlC的结构图谱如图2所示。SEQIDNo.16的mdlC编码SEQIDNo.15的苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)。
将上述重组质粒pET30a-miniPtac-bsrp和pET30a-miniPtac-mdlC分别电转至步骤5得到的BW-010中，在含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，将含有重组质粒pET30a-miniPtac-bsrp的重组菌命名为BW-025，将含有重组质粒pET30a-miniPtac-mdlC的重组菌命名为BW-011。
表1、引物序列表
实施例2、重组菌BW-011和BW-025的D-木糖生物转化
1、重组菌BW-011和BW-025的D-木糖生物转化
本实施例中M9盐溶液为无菌溶液，M9盐溶液各组分及其在M9盐溶液中的终浓度分别为：6.78g/LNa2HPO4，3.0g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/LNH4Cl，1mMMgSO4，0.1mMCaCl2，10mMNaHCO3，100mMMOPS，50μg/ml卡那霉素，其余为水。其中，卡那霉素溶液经0.22μm膜过滤除菌后，加入到经高温灭菌的含有除卡那霉素外其他所有组分的M9盐溶液中，使卡那霉素在M9盐溶液中的终浓度为50μg/ml。
实验重复三次，每次重复实验的方法如下：
将实施例1步骤6得到的BW-011和BW-025的分别在含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB无菌平板上划线，于37℃下培养过夜，分别得到BW-011单克隆和BW-025的单克隆。分别挑BW-011单克隆和BW-025的单克隆，将分别加至10ml含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB无菌液体无菌培养基中，于37℃、200rpm下过夜培养，分别得到BW-011菌液和BW-025菌液。分别吸取1mlBW-011菌液和1mlBW-025菌液接种至100ml含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB液体无菌培养基中，于37℃、200rpm下摇瓶培养10h，收集含有等量的BW-011和BW-025的菌体的培养液，于4℃、8000rpm下离心5min，弃上清，得到BW-011菌体和BW-025菌体。分别向等量的BW-011菌体和BW-025菌体加入8mlM9盐溶液，分别重悬BW-011和BW-025的菌体，分别得到BW-011和BW-025的重悬液，分别将BW-011和BW-025的重悬液转移至厌氧瓶中，并分别加入2ml100g/L的D-木糖溶液，将厌氧瓶瓶盖上均分别插入一根1ml无菌注射器的针头通气，针头在厌氧瓶瓶外的通气孔用0.22um无菌滤膜封闭。将含有上述BW-011重悬液与上述D-木糖溶液的厌氧瓶、含有上述BW-025重悬液与上述D-木糖溶液的厌氧瓶置于37℃、200rpm的培养条件下培养72h，进行D-木糖的生物转化，分别得到BW-011和BW-025的转化液。每种处理3瓶。
分别取上述BW-011的转化液和BW-025的转化液各1ml，于16000rpm下离心5min，得到含有1,2,4-丁三醇的BW-011上清液和BW-025上清液，分别将BW-011上清液和BW-025上清液用0.22μm滤膜过滤，并分别转移至液相色谱瓶中。
用液谱仪器(Agilent1260infinity)按照HPLC法以D-木糖(国药集团化学试剂北京有限公司，货号：63012037)为标准品检测转化产物，采用标准曲线法(外标法)进行定量分析待测样品中D-木糖的含量；用液谱仪器(Agilent1260infinity)按照HPLC法以1,2,4-丁三醇(Aldrich，货号：296678)为标准品检测转化产物，采用标准曲线法(外标法)进行定量分析待测样品中1,2,4-丁三醇的含量。BW-011转化液的HPLC检测结果如图3所示，BW-025转化液的HPLC检测结果如图4所示，1,2,4-丁三醇标准品的HPLC检测结果如图5所示，D-木糖标准品的HPLC检测结果如图6所示。
HPLC法检测条件：AminexHPX-87H有机酸分析柱(300mmx7.8mm；BioRad)，流动相为0.015mol/LH2SO4水溶液，流速为0.5ml/min，进样量为10μL，柱温为15℃，检测器为示差折光检测器，检测器温度为30℃。
计算BW-011和BW-025转化D-木糖的1,2,4-丁三醇产量(g/L)和D-木糖的消耗量(g/L)，并计算1,2,4-丁三醇的得率(1,2,4-丁三醇的得率等于1,2,4-丁三醇的产量除以D-木糖的消耗量)。BW-011转化D-木糖的1,2,4-丁三醇产量(g/L)和D-木糖的消耗量(g/L)见图3，BW-025转化D-木糖的1,2,4-丁三醇产量(g/L)和D-木糖的消耗量(g/L)见图4。
结果显示，重组菌BW-025的1,2,4-丁三醇的产量为1.35g/L±0.146g/L，1,2,4-丁三醇的得率为0.17g/g±0.021g/g；而重组菌BW-011的1,2,4-丁三醇产量为0.49g/L±0.011g/L，1,2,4-丁三醇的得率为0.08g/g±0.003g/g；重组菌BW-025的1,2,4-丁三醇的产量和得率是重组菌BW-011的2.8倍和2.1倍。说明BSRP或其编码基因与来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)或其编码基因相比，可大幅提高1,2,4-丁三醇的产量和得率，本发明的1,2,4-丁三醇相关蛋白(BSRP)比已报道的来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)更有利于1,2,4-丁三醇生物合成。
2、转化产物中1,2,4-丁三醇的鉴定
步骤1的BW-025的转化液利用Agilent液质联用仪(Agilent1200HPLC/6520QTOFMS)检测目的产物1,2,4-丁三醇。色谱检测条件：AminexHPX-87H有机酸分析柱(300mm×7.8mm；BioRad)，流动相为1‰的甲酸，流速为0.5ml/min，进样量为10μL，柱温为15℃，检测器为示差折光检测器，检测器温度为30℃。质谱条件为：电喷雾电离正离子模式(ESI+)，干燥气温度300℃，干燥气流速12L/min，雾化器压力25psi，毛细管电压3500V，碎裂电压130V，扫描范围80-1000m/z。经液质联用分析，HPLC分离得到的保留时间为16.285min的目标峰，为1,2,4-丁三醇，且目标峰成分单一，未检测到其他杂质物质(图7)。
Claims (10)
1.重组细胞的构建方法，包括对受体细胞进行A3)、A5)、A6)和A7)的改造得到重组细胞的步骤：
A3)将所述受体细胞的木糖异构酶基因敲除；
A5)向所述受体细胞中导入木糖脱氢酶基因；
A6)向所述受体细胞中导入醇脱氢酶基因；
A7)向所述受体细胞中导入1,2,4-丁三醇相关蛋白基因；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对所述受体细胞进行A1)、A2)和A4)中任一种、任两种或三种的改造得到重组细胞的步骤：
A1)将所述受体细胞的2-酮酸脱氢酶基因敲除；
A2)将所述受体细胞的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因敲除；
A4)将所述受体细胞的木酮糖激酶基因敲除。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述受体细胞为大肠杆菌。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述2-酮酸脱氢酶基因为2-酮酸脱氢酶基因ycdW和2-酮酸脱氢酶基因yiaE；所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因为3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE和3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH；所述木糖异构酶基因为木糖异构酶基因xylA；所述木酮糖激酶基因为木酮糖激酶基因xylB；所述醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因adhP；所述木糖脱氢酶基因为木糖脱氢酶基因xdh。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1,2,4-丁三醇相关蛋白是如下B1)或B2)的蛋白质：
B1)氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质；
B2)在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质；
所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE编码下述H1)或H2)的蛋白质：
H1)氨基酸序列为SEQIDNo.3的蛋白质；
H2)在SEQIDNo.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有2-酮酸脱氢酶功能的由H1)衍生的蛋白质；
所述2-酮酸脱氢酶基因ycdW编码下述I1)或I2)的蛋白质：
I1)氨基酸序列为SEQIDNo.5的蛋白质；
I2)在SEQIDNo.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有2-酮酸脱氢酶功能的由I1)衍生的蛋白质；
所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE编码下述J1)或J2)的蛋白质：
J1)氨基酸序列为SEQIDNo.7的蛋白质；
J2)在SEQIDNo.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶功能的由J1)衍生的蛋白质；
所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH编码下述K1)或K2)的蛋白质：
K1)氨基酸序列为SEQIDNo.9的蛋白质；
K2)在SEQIDNo.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶功能的由K1)衍生的蛋白质；
所述木糖脱氢酶基因xdh编码下述L1)或L2)的蛋白质：
L1)氨基酸序列为SEQIDNo.11的蛋白质；
L2)在SEQIDNo.11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有木糖脱氢酶功能的由L1)衍生的蛋白质；
所述醇脱氢酶基因adhP编码下述M1)或M2)的蛋白质：
M1)氨基酸序列为SEQIDNo.13的蛋白质；
M2)在SEQIDNo.13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有醇脱氢酶功能的由M1)衍生的蛋白质；
所述木糖异构酶基因xylA编码下述O1)或O2)的蛋白质：
O1)氨基酸序列为SEQIDNo.17的蛋白质；
O2)在SEQIDNo.17所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有木糖异构酶功能的由O1)衍生的蛋白质；
所述木酮糖激酶基因xylB编码下述P1)或P2)的蛋白质：
P1)氨基酸序列为SEQIDNo.19的蛋白质；
P2)在SEQIDNo.19所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有木酮糖激酶功能的由P1)衍生的蛋白质。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述1,2,4-丁三醇相关蛋白基因为下述B11)-B13)中的任一种DNA分子：
B11)编码序列是SEQIDNo.2的第71-1717位核苷酸所示的cDNA分子或基因组DNA；
B12)在严格条件下与B11)限定的DNA分子杂交且编码所述1,2,4-丁三醇相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA；
B13)与B11)或B12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述1,2,4-丁三醇相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA；
所述木糖脱氢酶基因xdh为下述L11)-L13)中的任一种DNA分子：
L11)编码序列是SEQIDNo.12的cDNA分子或基因组DNA；
L12)在严格条件下与L11)限定的DNA分子杂交且编码所述木糖脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
L13)与L11)或L12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述木糖脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述醇脱氢酶基因adhP为下述M11)-M13)中的任一种DNA分子：
M11)编码序列是SEQIDNo.14的cDNA分子或基因组DNA；
M12)在严格条件下与M11)限定的DNA分子杂交且编码所述醇脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
M13)与M11)或M12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述醇脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA。
7.由权利要求1-6中任一所述方法构建的重组细胞。
8.用于构建权利要求7所述的重组细胞的生物材料，为C1)或C2)：
C1)用于构建权利要求7所述的重组细胞的成套DNA分子，由权利要求1-6中任一所述方法中的所述木糖脱氢酶基因、所述醇脱氢酶基因和所述1,2,4-丁三醇相关蛋白基因组成，这三个基因各自独立包装；
C2)含有C1)所述成套DNA分子中所述三个基因、或其中任两个基因或其中任一个基因的载体。
9.权利要求7所述重组细胞在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或权利要求7所述重组细胞在生物转化D-木糖或L-阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用。
10.权利要求1或5或6中所述1,2,4-丁三醇相关蛋白或其编码基因在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或权利要求1或5或6中所述1,2,4-丁三醇相关蛋白或其编码基因在生物转化D-木糖或L-阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20190212 Termination date: 20201008 |