CN107699534A - 一种利用d‑阿拉伯糖生产d‑1,2,4‑丁三醇的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用D‑阿拉伯糖生产D‑1,2,4‑丁三醇的基因工程菌，在宿主菌中表达D‑阿拉伯糖脱氢酶、D‑阿拉伯糖酸脱水酶、2‑酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。本发明先将来源于硫磺矿硫化叶菌基因片段AraDH和AraD和来源于恶臭假单胞杆菌mdlc、大肠杆菌的adhp构建到质粒PRSF和质粒PETduet上两种质粒PRSF‑T7‑AraDH‑T7‑AraD和PETduet‑T7‑mdlc‑T7‑adhp，再将已构建好的双质粒导入到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中构建好重组菌株E.coliBL21‑PAD‑PMP，利用D‑阿拉伯糖生产D‑1,2,4丁三醇。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
D-1,2,4-丁三醇(专利中涉及2种(D-1,2,4-Butanetriol，简称BT)是一种重要的四碳多元醇，无色、无味、透明的溶于水是粘稠糖浆类液体。其性质和丙三醇(甘油)类似，具有一定的吸湿性和稳定性。D-1,2,4-丁三醇及其衍生物是许多化合物的重要的底物及合成的前体。在军事上丁三醇可以用来合成丁三醇三硝酸酯(BTTN)，它是一种高效的推进剂和增塑剂。在医药上，能合成降胆固醇的药物Movinolin、抗癌药物、还可以用于治疗艾滋病药物Agenerase(一种HIV蛋白酶抑制剂)。在烟草行业，可以作为卷烟添加剂，可以降低焦油对人体的伤害。另外，D-1,2,4-丁三醇还可以用于高级服装的处理，以及抑菌剂和高分子交联剂等。
目前丁三醇的生产主要采用NaBH4还原苹果酸二酯或铷和碳催化苹果酸加氢等相关方法使用不同的催化剂在19.7～34.0MPa的H2压力下和60～160℃的条件下，可将苹果酸以60％～80％的转化率转化为1,2,4-丁三醇。然后由于化学合成法存在原料成本高、产物转化率低、反应条件严苛、生产危险大、副产物多、环境污染严重等问题，随着近年来生物技术的发展以及1,2,4-丁三醇市场的快速增长，人们开始关注原料成本低廉、反应条件温和、对环境友好且安全高效的生物合成1,2,4-丁三醇的技术途径。
Wei Niu等首次报道了在大肠杆菌(Escherichia coli)中构建了异源代谢途径，随后由E.coli DH5α/p WN6.186A(表达了苯甲酰甲酸脱羧酶基因的工程菌)经三步催化反应生成D-BT，摩尔转化率为25％，利用D-木糖酸和L-阿拉伯糖酸为底物合成1,2,4-丁三醇对映体，产量为2.4g/L。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，以解决现有技术中D-1,2,4-丁三醇生产转化率低、产量少的问题。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是，提供上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌在生产D-1,2,4-丁三醇中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，在宿主菌中表达D-阿拉伯糖脱氢酶、D-阿拉伯糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。D-阿拉伯糖在D-阿拉伯糖脱氢酶作用下生成D-阿拉伯糖酸，之后在D-阿拉伯糖酸脱水酶作用下生成3-脱氧-D甘油戊酮糖酸，在2-酮酸脱羧酶作用下生成3，4二羟基丁醛，最后在醇脱氢酶作用下生成D-1，2，4丁三醇。
作为优选，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
作为优选，所述的D-阿拉伯糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，D-阿拉伯糖酸脱水酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，2-酮酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将D-阿拉伯糖脱氢酶、D-阿拉伯糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶克隆到表达质粒中，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化宿主菌，既得到利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌。
步骤(1)中，所述的表达质粒为PRSF-duet-1或PET-duet-1。
步骤(2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
步骤(1)中，将D-阿拉伯糖脱氢酶、D-阿拉伯糖酸脱水酶同时克隆到PRSF-duet-1质粒中得到重组质粒A，将2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶同时克隆到PET-duet-1质粒中，得到重组质粒B，将重组质粒A和重组质粒B同时导入宿主菌中。
上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法构建得到的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌在本发明的保护范围之内。
上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌在生产D-阿拉伯糖中的应用。
有益效果：
本发明公开了一种可以催化D-阿拉伯糖转化为D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌株，并公开了该基因工程菌的构建方法及其在催化生产D-1,2,4-丁三醇中的应用，本发明构建得到的菌株催化生产D-1,2,4-丁三醇为底物本发明构建一个新的基因工程菌，以阿拉伯糖为底物生产D-1,2,4丁三醇的转化率为40.3％，发酵液中D-1,2,4丁三醇的产量可以达到5.7g/L。
附图说明
图1PRSF-T7-AraDH-T7-AraD质粒图。
图2、PETduet-T7-mdlc-T7-adhp质粒图。
图3重组菌发酵产量图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：基因工程菌构建。
将来源于硫磺矿硫化叶菌D-阿拉伯糖脱氢酶和D-阿拉伯糖酸脱水酶，来源于恶臭假单胞杆菌的2-酮酸脱羧酶，来源于大肠杆菌的醇脱氢酶的构建到质粒中，并将构建好的质粒转入宿主细胞内得到重组的基因工程菌。D-阿拉伯糖脱氢酶(AradH)：SEQ ID NO.1，D-阿拉伯糖酸脱水酶(AraD):SEQ ID NO.2，2-酮酸脱羧酶(mdlc)：SEQ ID NO.3，醇脱氢酶(adHp)SEQ ID NO.4。
在D-阿拉伯糖脱氢酶(AradH)的两端插入酶切位点NcoI和BamHI，在D-阿拉伯糖酸脱水酶(AraD)的两端插入酶切位点NdeI和XhoI，然后将以上两个基因片段构建到PRSF-duet-1质粒上，得到PRSF-T7-AraDH-T7-AraD质粒；在2-酮酸脱羧酶(mdlc)的两端插入酶切位点NcoI和SacI，在醇脱氢酶(adhp)的两端插入酶切位点NdeI和XhoI，然后将上述两个基因片段构建到PET-duet-1质粒上，得到PETduet-T7-mdlc-T7-adhp；最后将PRSF-T7-AraDH-T7-AraD、PETduet-T7-mdlc-T7-adhp将双质粒同时导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，既得到本发明中利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌。
实施例2：基因工程菌的发酵。
在平板上面挑取单菌落接入到5mlLB种子培养基中摇8-10h，将种子液以1％v/v的量接入到含有20g/L D-阿拉伯糖100ml发酵培养基中，待OD600到0.6加入IPTG进行诱导，37℃200rpm下发酵60h，最终D-1,2,4-丁三醇的产量为5.7g/L。
种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、D-阿拉伯糖5g/L。
发酵培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、碳酸钙10g/L，灭菌后加入20g/L D-阿拉伯糖。
实施例3：D-1,2,4-丁三醇的高效液相色谱检测方法
D-1,2,4-丁三醇的检测条件为：Agilent Technologies1290高效液相色谱；Bio-RadHPX-87H IonExclusion Column(300mm×7.8mm)有机酸柱；流动相为5mmol/LH2SO4；流速0.6mL/min，柱温55℃，进样量20μL，示差检测器。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种利用D-阿拉伯糖生产D-1，2，4-丁三醇的基因工程菌及其构建方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> 硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)
<400> 1
atggccgaaa acgttaacat ggttaaatct aaagctgctc tgctgaaaaa attctctgaa 60
ccgctgtcta tcgaagacgt taacatcccg gaaccgcagg gtgaagaagt tctgatccgt 120
atcggtggtg ctggtgtttg ccgtaccgac ctgcgtgttt ggaaaggtgt tgaagctaaa 180
cagggtttcc gtctgccgat catcctgggt cacgaaaacg ctggtactat cgttgaagtt 240
ggtgaactgg ctaaagttaa aaaaggtgac aacgttgttg tttacgctac ctggggtgac 300
ctgacctgcc gttactgccg tgaaggtaaa ttcaacatct gcaaaaacca gatcatcccg 360
ggtcagacca ccaacggtgg tttctctgaa tacatgctgg ttaaatcttc tcgttggctg 420
gttaaactga actctctgtc tccggttgaa gctgctccgc tggctgacgc tggtactacc 480
tctatgggtg ctatccgtca ggctctgccg ttcatctcta aattcgctga accggttgtt 540
atcgttaacg gtatcggtgg tctggctgtt tacaccatcc agatcctgaa agctctgatg 600
aaaaacatca ccatcgttgg tatctctcgt tctaaaaaac accgtgactt cgctctggaa 660
ctgggtgctg actacgtttc tgaaatgaaa gacgctgaat ctctgatcaa caaactgacc 720
gacggtctgg gtgcttctat cgctatcgac ctggttggta ctgaagaaac cacctacaac 780
ctgggtaaac tgctggctca ggaaggtgct atcatcctgg ttggtatgga aggtaaacgt 840
gtttctctgg aagcgttcga caccgctgtt tggaacaaaa aactgctggg ttctaactac 900
ggttctctga acgacctgga agacgttgtt cgtctgtctg aatctggtaa aatcaaaccg 960
tacatcatca aagttccgct ggacgacatc aacaaagcgt tcaccaacct ggacgaaggt 1020
cgtgttgacg gtcgtcaggt tatcaccccg taa 1053
<210> 2
<211> 1125
<212> DNA
<213> 硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)
<400> 2
atggccatca aagacatccg tacctacaaa ctgtgctacg aaggtatcaa cgacgaacgt 60
gacgctctgg ctatcaaagg tctggctgaa cacccgatgg aaatcgttgc taccgaaatc 120
gaaacctctg acggttacgt tggttacggt gaatctctgg cttacggttg ctctgacgct 180
gttcaggtta ccatcgaaaa aatcctgaaa ccgctgctgc tgaaagaaga cgaagaactg 240
atcgaatacc tgtgggacaa aatgtacaaa gctaccctgc gtttcggtcg tcgtggtatc 300
gctatcgctg gtatctctgg tgttgacacc gctctgtggg acatcatggg taaaaaagct 360
aaaaaaccga tctacaaact gctgggtggt tctaaacgta aagttcgtgc ttacatcacc 420
ggtggttact actctgaaaa aaaagacctg gaaaaactgc gtgacgaaga agcgtactac 480
gttaaaatgg gtttcaaagg tatcaaagtt aaaatcggtg ctaaatctat ggaagaagac 540
atcgaacgtc tgaaagctat ccgtgaagtt gttggtgaag acgttaaaat cgctgttgac 600
gctaacaacg tttacacctt cgaagaagct ctggaaatgg gtcgtcgtct ggaaaaactg 660
ggtatctggt tcttcgaaga accgatccag accgactacc tggacctgtc tgctcgtctg 720
gctgaagaac tggaagttcc gatcgctggt tacgaaaccg cttacacccg ttgggaattt 780
tacgaaatca tgcgtaaacg tgctgttgac atcgttcaga ccgacgttat gtggaccggt 840
ggtatctctg aaatgatgaa aatcggtaac atggctaaag ttatgggtta cccgctgatc 900
ccgcactact ctgctggtgg tatctctctg atcggtaacc tgcacgttgc tgctgctctg 960
aactctccgt ggatcgaaat gcacctgcgt aaaaacgacc tgcgtgacaa aatcttcaaa 1020
gaatctatcg aaatcgacaa cggtcacctg gttgttccgg accgtccggg tctgggttac 1080
accatccgtg acggtgtttt cgaagaatac aaatgcaaat cttaa 1125
<210> 3
<211> 1598
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)
<400> 3
atgccatggc ttctgttcac ggtaccacct acgaactgct gcgtcgtcag ggtatcgaca 60
ccgttttcgg taacccgggt tctaacgaac tgccgttcct gaaagacttc ccggaagact 120
tccgttacat cctggctctg caggaagctt gcgttgttgg tatcgctgac ggttacgctc 180
aggcttctcg taaaccggct ttcatcaacc tgcactctgc tgctggtacc ggtaacgcta 240
tgggtgctct gtctaacgct tggaactctc actctccgct gatcgttacc gctggtcagc 300
agacccgtgc tatgatcggt gttgaagctc tgctgaccaa cgttgacgct gctaacctgc 360
cgcgtccgct ggttaaatgg tcttacgaac cggcttctgc tgctgaagtt ccgcacgcta 420
tgtctcgtgc tatccacatg gcttctatgg ctccgcaggg tccggtttac ctgtctgttc 480
cgtacgacga ctgggacaaa gacgctgacc cgcagtctca ccacctgttc gaccgtcacg 540
tttcttcttc tgttcgtctg aacgaccagg acctggacat cctggttaaa gctctgaact 600
ctgcttctaa cccggctatc gttctgggtc cggacgttga cgctgctaac gctaacgctg 660
actgcgttat gctggctgaa cgtctgaaag ctccggtttg ggttgctccg tctgctccgc 720
gttgcccgtt cccgacccgt cacccgtgct tccgtggtct gatgccggct ggtatcgctg 780
ctatctctca gctgctggaa ggtcacgacg ttgttctggt tatcggtgct ccggttttcc 840
gttaccacca gtacgacccg ggtcagtacc tgaaaccggg tacccgtctg atctctgtta 900
cctgcgaccc gctggaagct gctcgtgctc cgatgggtga cgctatcgtt gctgacatcg 960
gtgctatggc ttctgctctg gctaacctgg ttgaagaatc ttctcgtcag ctgccgaccg 1020
ctgctccgga accggctaaa gttgaccagg acgctggtcg tctgcacccg gaaaccgttt 1080
tcgacaccct gaacgacatg gctccggaaa acgctatcta cctgaacgaa tctacctcta 1140
ccaccgctca gatgtggcag cgtctgaaca tgcgtaaccc gggttcttac tacttctgcg 1200
ctgctggtgg tctgggtttc gctctgccgg ctgctatcgg tgttcagctg gctgaaccgg 1260
aacgtcaggt tatcgctgtt atcggtgacg gttctgctaa ctactctatc tctgctctgt 1320
ggaccgctgc tcagtacaac atcccgacca tcttcgttat catgaacaac ggtacctacg 1380
gtgctctgcg ttggttcgct ggtgttctgg aagctgaaaa cgttccgggt ctggacgttc 1440
cgggtatcga cttccgtgct ctggctaaag gttacggtgt tcaggctctg aaagctgaca 1500
acctggaaca gctgaaaggt tctctgcagg aagctctgtc tgctaaaggt ccggttctga 1560
tcgaagtttc taccgtttct ccggttaaat aagagctc 1598
<210> 4
<211> 1011
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 4
atgaaggctg cagttgttac gaaggatcat catgttgacg ttacgtataa aacactgcgc 60
tcactgaaac atggcgaagc cctgctgaaa atggagtgtt gtggtgtatg tcataccgat 120
cttcatgtta agaatggcga ttttggtgac aaaaccggcg taattctggg ccatgaaggc 180
atcggtgtgg tggcagaagt gggtccaggt gtcacctcat taaaaccagg cgatcgtgcc 240
agcgtggcgt ggttctacga aggatgcggt cattgcgaat actgtaacag tggtaacgaa 300
acgctctgcc gttcagttaa aaatgccgga tacagcgttg atggcgggat ggcggaagag 360
tgcatcgtgg tcgccgatta cgcggtaaaa gtgccagatg gtctggactc ggcggcggcc 420
agcagcatta cctgtgcggg agtcaccacc tacaaagccg ttaagctgtc aaaaattcgt 480
ccagggcagt ggattgctat ctacggtctt ggcggtctgg gtaacctcgc cctgcaatac 540
gcgaagaatg tctttaacgc caaagtgatc gccattgatg tcaatgatga gcagttaaaa 600
ctggcaaccg aaatgggcgc agatttagcg attaactcac acaccgaaga cgccgccaaa 660
attgtgcagg agaaaactgg tggcgctcac gctgcggtgg taacagcggt agctaaagct 720
gcgtttaact cggcagttga tgctgtccgt gcaggcggtc gtgttgtggc tgtcggtcta 780
ccgccggagt ctatgagcct ggatatccca cgtcttgtgc tggatggtat tgaagtggtc 840
ggttcgctgg tcggcacgcg ccaggattta actgaagcct tccagtttgc cgccgaaggt 900
aaagtggtgc cgaaagtcgc cctgcgtccg ttagcggaca tcaacaccat ctttactgag 960
atggaagaag gcaaaatccg tggccgcatg gtgattgatt tccgtcacta a 1011
Claims (10)
1.一种利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，其特征在于，在宿主菌中表达D-阿拉伯糖脱氢酶、D-阿拉伯糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
3.根据权利要求1所述的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，其特征在于，所述的D-阿拉伯糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，D-阿拉伯糖酸脱水酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，2-酮酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.权利要求1所述的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将D-阿拉伯糖脱氢酶、D-阿拉伯糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶克隆到表达质粒中，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化宿主菌，既得到利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的表达质粒为PRSF-duet-1或PET-duet-1。
6.根据权利要求4所述的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.根据权利要求4所述的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将D-阿拉伯糖脱氢酶、D-阿拉伯糖酸脱水酶同时克隆到PRSF-duet-1质粒中得到重组质粒A，将2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶同时克隆到PET-duet-1质粒中，得到重组质粒B。
8.根据权利要求7所述的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，将重组质粒A和重组质粒B同时导入宿主菌中。
9.权利要求4～8所述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法构建得到的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌。
10.权利要求9所述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌在生产D-阿拉伯糖中的应用。
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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