CN117265045A - 一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法 - Google Patents
一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β‑熊果苷方法，涉及生物化工技术领域。该方法由种子培养基和发酵培养基配合完成，且包括以下步骤：在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中引入UbiC、MNX1和AS基因，构建β‑熊果苷合成途径，获得重组谷氨酸棒杆菌13032‑MU‑A；敲除分支酸合成芳香族氨基酸的csm和trpE基因，切断竞争代谢途径。本申请提供的方法以重组谷氨酸棒杆菌为生产菌株，该菌株是一种对人体无毒无害的安全菌株，能够以廉价蔗糖为底物从头合成β‑熊果苷，避免使用对人体健康有危害的对苯二酚为原料，同时异源表达UbiC、MNX1、AS基因，构建了一种能产β‑熊果苷的重组谷氨酸棒杆菌，相比于现有的生物法、化学法以及微生物法来说，在使用的底盘细胞安全性方面具有显著的优势。
Description
技术领域
本申请涉及生物化工技术领域，具体涉及一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法。
背景技术
熊果苷（Arbutin）是广泛存在于植物中的一种对苯二酚糖苷类化合物，它分为α-熊果苷（4-羟基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷）和β-熊果苷（4-羟基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷）两种构型。β-熊果苷存在于天然植物中，也可通过化学法获得，α-熊果苷则主要通过生物转化法获得。二者均能抑制人体内酪氨酸酶的活性，从而干扰黑色素的形成，起到美白的作用。此外，熊果苷还具有抗氧化、消炎和抗癌的作用，因此被广泛应用于医药和化妆品等行业。随着人们生活水平的提高，熊果苷的需求量逐年增加，具有重要的经济价值和广泛的市场前景。
目前，熊果苷可以通过植物提取法、化学合成法、生物转化法和利用工程菌发酵的方法获得，工业生产β-熊果苷主要以化学合成法为主。化学合成法以添加了保护基的葡萄糖和对苯二酚为原料，进行糖苷化反应，然后脱去保护基从而获得熊果苷。此方法步骤繁琐、反应条件要求苛刻且合成的熊果苷立体选择性较差，反应产物一般为β-型和少量α-型的混合物，且无法高效专一的合成美白效果更佳的α-熊果苷。与化学法相比，生物转化法对环境更加友好，反应条件更加温和。目前生物转化法合成熊果苷的研究已取得一定进展，但该方法需要在反应体系中额外添加对苯二酚等底物，且对苯二酚本身对细胞具有一定的毒害作用，浓度过高时会抑制细胞的活性，不利于熊果苷产量的进一步提升。而与化学法和生物转化法相比，微生物发酵法以廉价的葡萄糖作为碳源合成β-熊果苷，具有成本低、环境污染小等优点。目前已有利用大肠杆菌、解脂假丝酵母和假单胞菌从头合成β-熊果苷的报道，但产量均较低，无法满足工业化大规模生产的需要。
为了更好地解决这一些列的难题，从而满足熊果苷在市场上日益增长的需求，因此构建微生物工厂从头生产熊果苷成为了目前的研究热点，而构建高产β-熊果苷底盘微生物细胞工厂便成为了一个亟待解决的问题。在现研究阶段可得知，谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种对人体无毒的生物安全细菌，已被广泛应用于各种氨基酸及其衍生物的生产，在β-熊果苷的生产应用中具有极大的潜力。野生型的谷氨酸棒杆菌不能天然生产β-熊果苷，但经过基因工程和代谢工程等手段改造的重组谷氨酸棒杆菌在作为β-熊果苷的生产菌株时具有以下优点：（1）谷氨酸棒杆菌是一种对人体无毒无害的生物安全细菌；（2）谷氨酸棒杆菌是革兰氏阳性菌，对高浓度的产物具有较强的耐受能力；（3）谷氨酸棒杆菌是模式菌株，其生理生化特征和代谢途径均有深入了解，改造手段也比较成熟。但目前，仍未见利用谷氨酸棒杆菌从头发酵生产β-熊果苷的相关技术报道，因此成了一个急需突破的技术问题。
发明内容
本申请的目的在于：为解决上述背景技术中反应的问题，本申请提供了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法。
本申请为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，由种子培养基和发酵培养基配合完成，且包括以下步骤：
S1、在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中引入UbiC、MNX1和AS基因，构建β-熊果苷合成途径，获得重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A；
S2、敲除控制分支酸合成芳香族氨基酸的csm和trpE基因，切断竞争代谢途径；
S3、引入P sod 强启动子，强化表达莽草酸途径关键酶的编码基因aroG2，获得重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A, ΔcsmΔtrpE, P sod aroG2(命名为AR09)；
S4、对重组谷氨酸棒杆菌进行好氧发酵验证β-熊果苷产量，所接种发酵成分不低于20 %体积，发酵温度最低为32 ℃，摇床转速为不低于250 rpm，发酵时间不低于 48 h。
进一步地，所述UbiC基因以及MNX1基因由表达质粒pXMJ19进行共表达而获得，所述AS基因由表达质粒pEC-XK99E进行表达而获得。
进一步地，所述csm基因和trpE基因由谷氨酸棒杆菌自6杀性质粒pK18mobsacB进行敲除而获得。
进一步地，所述P sod 强启动子通过构建pK18-P sod aroG2重组质粒以引入aroG2基因。
进一步地，还包括以下步骤：
S5、将所述重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A移至添有12.5 mg/L氯霉素和12.5 mg/L卡那霉素的LB平板上进行活化培养；
S6、将所述LB平板上的菌转接入含有10 ml LBG培养基的100 ml锥形瓶中。
进一步地，还包括以下步骤：
S7、重复所述S5以及S6步骤，以获得LBG培养液；
S8、以20 %的接种量将所述LBG培养液接种至含有20 ml种子培养基的250 ml锥形瓶中。
进一步地，所述S1步骤中，获取重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A时，以及在所述S3步骤中获取AR09时均由电穿孔仪配合完成。
进一步地，所述种子培养基成分至少包括：蔗糖或葡萄糖、酵母粉、玉米浆、MgSO4、（NH4）2SO4、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O。
进一步地，所述S4步骤中，所述发酵培养基成分至少包括：蔗糖或葡萄糖、酵母粉、尿素、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、生物素和焦磷酸硫胺素。
本申请的有益效果如下：
本申请通过表达质粒异源表达UbiC、MNX1、AS基因，构建了一种能产β-熊果苷的重组谷氨酸棒杆菌。
本申请通过优化碳源培养基的种类和添加量，氮源添加量和接种量，提高了β-熊果苷的产量。
本申请敲除分支酸竞争代谢途径和插入强启动子强化表达aroG2基因的方式，进一步提高了β-熊果苷的产量。
附图说明
图1是本申请中关于pXMJ19-MU质粒、pEC-XK99E-A质粒的构建和PCR验证筛菌基因片段示意图；
图2是本申请中关于13032-MU-A重组菌的构建和PCR验证筛菌基因片段示意图；
图3是本申请中关于13032-CK和13032-MU-A摇瓶发酵熊果苷的产量图；
图4是本申请中关于13032-MU-A发酵培养基的碳源优化的数据统计图；
图5是本申请中关于13032-MU-A发酵培养基的氮源和接种量优化的数据统计图；
图6是本申请中pK18-Δcsm质粒、pK18-ΔtrpE质粒的构建和菌落PCR验证筛菌的纯化示意图；
图7是本申请中pK18-Psod aroG2质粒的构建和菌落PCR验证筛菌的纯化示意图；
图8是本申请中AR09重组菌的构建和PCR验证筛菌时的数据变化示意图；
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
如图1-8所示，本申请一个实施例提出的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其需要种子培养基来配合完成，且至少包括这些步骤：重组谷氨酸棒杆菌的获得，即在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中引入UbiC、MNX1和AS基因，构建β-熊果苷合成途径，获得重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A；敲除控制分支酸合成芳香族氨基酸的csm和trpE基因，切断竞争代谢途径；引入P sod 强启动子，强化表达莽草酸途径关键酶的编码基因aroG2，获得重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A, ΔcsmΔtrpE, P sod aroG2(命名为AR09)，对重组谷氨酸棒杆菌进行好氧发酵验证β-熊果苷产量，接种量至少为20 %体积，发酵温度不低于32 ℃，摇床转速也不低于250 rpm，发酵时间则不少于 48 h，关于种子培养基的成分可以包括这些：蔗糖或葡萄糖、酵母粉、玉米浆、MgSO4、（NH4）2SO4、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O；而关于发酵培养基的成分具体可以包括：蔗糖或葡萄糖、酵母粉、尿素、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、生物素和焦磷酸硫胺素；
基于以上的步骤，重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A和重组谷氨酸棒杆菌AR09在添加了12.5 mg/L氯霉素和12.5 mg/L卡那霉素的LB平板上进行活化培养。将该平板上的菌转接入含有10 ml LBG培养基的100 ml锥形瓶中，在温度32 ℃，摇床转速250 rpm的条件下培养12 h。
以20 %的接种量将LBG培养液接种到含有20 ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，发酵温度为32 ℃，摇床转速为250 rpm，培养时间为12 h。种子培养基成分同上。
以20 %的接种量将种子培养液接种到含有20 ml发酵培养基的250 ml锥形瓶中，发酵温度为32 ℃，摇床转速为250 rpm，接种8 h后额外补加终浓度为1 mM的IPTG诱导剂，发酵时间为72 h，每隔12 h取样。
发酵培养基成分：蔗糖 60 g/L、酵母粉 20 g/L、尿素 6 g/L、蛋白胨 8 g/L、玉米浆 5 g/L、KH2PO40.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O 0.02g/L、生物素 0.5 g/L、焦磷酸硫胺素 1 g/L，氯霉素 12.5 mg/L，卡那霉素 12.5 mg/L。
发酵结束后，测β-熊果苷产量具体如图8所示，β-熊果苷产量明显提高，达到了6.61 g/L。说明在敲除csm和trpE基因的基础上过表达aroG2能够进一步提高β-熊果苷的产量，相比于现有的生物法、化学法以及微生物法来说，在产量上具有显著的优势。
如图1所示，在一些实施例中，所述UbiC基因以及MNX1基因由表达质粒pXMJ19进行共表达而获得，所述AS基因由表达质粒pEC-XK99E进行表达而获得，具体为，经谷氨酸棒杆菌密码子优化的AS-MNX1-UbiC基因为模板，以pEC-A-F和pEC-A-R为引物进行PCR，获得长度约为1400 bp的AS基因片段；以MNX1-F和AMU-R为引物进行PCR，获得长度约为2000 bp的MNX1-UbiC基因片段。利用PCR产物纯化回收试剂盒（全式金）进行纯化如图1所示，将谷氨酸棒杆菌表达质粒pXMJ19、和MNX1-UbiC基因片段分别用BamHI和EcoRI进行双酶切，利用T4DNA连接酶将MNX1-UbiC基因连接到pXMJ19质粒上；将谷氨酸棒杆菌表达质粒pEC-XK99E用EcoRI和BamHI进行双酶切，利用一步法克隆试剂盒（诺唯赞）将AS基因连接到pEC-XK99E上，获得的重组质粒分别通过热激转入大肠杆菌DH5α，分别涂布在含有25 mg/L氯霉素和50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选。分别利用MNX1-F和AMU-R引物对，pEC-XK99E-F和pEC-XK99E-R引物对进行PCR阳性克隆验证（图1，泳道3和4）。测序正确后，该重组表达质粒分别命名为pXMJ19-MU和pEC-XK99E-A。
所用引物序列：
pEC-A-F：cacaggaaacagaccatgGAATTCGAAAGGATTTTTTACCCATGGAAC
pEC-A-R：ctgcaggtcgactctagaGGATCCCGTGCTTGGACAGCCATGTATAT MNX1-F：ctgcaggtcgactctagaGGATCCCAAGGAGATATACATGGCTGTCC
AMU-R：cgccaaaacagccaagctGAATTCTTAGTACAGTGGGGAAGCTG
pEC-XK99E-F：TCATCCGGCTCGTATAATGTGT
pEC-XK99E-R：AACGCAAAAAGGCCATCCGT。
如图6所示，在一些实施例中，所述csm基因和trpE基因由谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB进行敲除而获得，具体为，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组为模板，分别以csm-up-F和csm-up-R，csm-down-F和csm-down-R，trpE-up-F和trpE-up-R，trpE-down-F和trpE-down-R为引物进行PCR，获得长度约800 bp的csm基因和trpE基因的上下游同源臂csm-up，csm-down，trpE-up，trpE-down。利用PCR产物纯化回收试剂盒（全式金）进行纯化（图6，泳道1、2、3和4）。以csm-up和csm-down片段为模板，以csm-up-F和csm-down-R为引物进行融合PCR扩增，获得csm-up&down基因片段；以trpE-up和trpE-down片段为模板，以trpE-up-F和trpE-down-R为引物进行融合PCR扩增，获得trpE-up&down基因片段。并利用PCR产物纯化回收试剂盒（全式金）对产物进行纯化（图6，泳道5和6）。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB用Hind III和Xba I进行双酶切，利用一步法克隆试剂盒（诺唯赞）分别将csm-up&down基因片段和trpE-up&down基因片段连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒通过热激分别转入大肠杆菌DH5α，涂布在含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上筛选。利用M13通用引物进行PCR阳性克隆验证（图6，泳道7和8），该重组质粒命名为pK18-Δcsm和pK18-ΔtrpE。
所用引物序列：
csm-up-F：aacgacggccagtgccaagctCGGTGTACAAGTTGAGGACTACC
csm-up-R：GTGGCAGAATAGTGTGCATGACTAACTCGGATAAGTTATCCACAGGTAG
csm-down-F：TAGTCATGCACACTATTCTGCCAC
csm-down-R：cggtacccggggatcctctagTTGCCGACGAGCGTAGAAATC
trpE-up-F：aacgacggccagtgccaagctTGTCAGGATCGTGCAGTGAAG
trpE-up-R：ATTAGTTCGCGAGAAGCTGTTCGGGCACCTACCGAGGAAATCAT
trpE-down-F：CGAACAGCTTCTCGCGAACTAAT
trpE-down-R：cggtacccggggatcctctagCTACGAGATCCTCAAGGGTGTAGC。
如图6所示，在一些实施例中，以上的所述Psod强启动子具体通过构建pK18-PsodaroG2重组质粒以引入aroG2基因，具体方式为，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组为模板，分别以aroG2-up-F和aroG2-up-R，aroG2-down-F和aroG2-down-R为引物进行PCR扩增，获得长度约800 bp的aroG2基因上下游同源臂aroG2-up和aroG2-down。利用PCR产物纯化回收试剂盒（全式金）进行纯化。以Sod-F和Sod-R为引物进行PCR扩增，获得长度约200 bp的Psod强启动子，利用PCR产物纯化回收试剂盒（全式金）进行纯化。以aroG2-up和P sod 片段为模板，以aroG2-up-F和Sod-R为引物进行融合PCR扩增，获得aroG2-up&Psod基因片段并利用PCR产物纯化回收试剂盒（全式金）进行纯化。以aroG2-up&Psod和aroG2-down片段为模板，以aroG2-up-F和aroG2-down-R为引物进行融合PCR扩增，获得aroG2-up&Psod&down基因片段并利用PCR产物纯化回收试剂盒（全式金）进行纯化。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB用Hind III和Xba I进行双酶切，利用一步法克隆试剂盒（诺唯赞）将aroG2-up&Psod&down基因片段连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒通过热激转入DH5α，涂布在含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上筛选。利用M13通用引物进行PCR阳性克隆验证，该重组质粒命名为pK18-P sod aroG2。
所用引物序列：
aroG1-up-F：aacgacggccagtgccaagctCTTGTGAGCGCTTCTTTGATC
aroG1-up-R：CAAGCCCGGAATAATTGGCAATGGGATGGGGTGAATTTAGG
aroG1-down-F：AAGATGTATATGCTCGGTGCGGATGCATAGCCCTGAAAGGCAAG
aroG1-down-R：cggtacccggggatcctctagTCGTCGGAGGTTCCGAAGAAG
Sod-F：TGCCAATTATTCCGGGCTTG
Sod-R：TGCCAATTATTCCGGGCTTG。
如图4所示，在一些实施例中，还包括以下步骤：
S5、将所述重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A移至添有12.5 mg/L氯霉素和12.5 mg/L卡那霉素的LB平板上进行活化培养；
S6、将所述LB平板上的菌转接入含有10 ml LBG培养基的100 ml锥形瓶中；
以上的步骤在实施时，先将重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A在添加了12.5 mg/L氯霉素和12.5 mg/L卡那霉素的LB平板上进行活化培养，将该平板上的菌转接入含有10 mlLBG培养基的100 ml锥形瓶中，在温度32 ℃，摇床转速250 rpm的条件下培养12 h。LBG培养基成分同上。
以20 %的接种量将LBG培养液接种到含有20 ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，发酵温度为32 ℃，摇床转速为250 rpm，培养时间为12 h。
种子培养基成分：葡萄糖或蔗糖 50 g/L、酵母粉 10 g/L、玉米浆 30 g/L、MgSO40.25g/L、（NH4）2SO44 g/L、KH2PO41 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、MnSO4·H2O 0.01 g/L，氯霉素 12.5 mg/L，卡那霉素 12.5 mg/L。
以20 %的接种量将种子培养液接种到含有20 ml发酵培养基的250 ml锥形瓶中，发酵温度为32 ℃，摇床转速为250 rpm，接种8 h后额外补加终浓度为1 mM的IPTG诱导剂，发酵时间为48 h，分别在发酵36 h和48 h处取样。
发酵培养基成分：葡萄糖或蔗糖 20-100 g/L、酵母粉 10 g/L、尿素 3 g/L、蛋白胨 4 g/L、KH2PO40.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O 0.02g/L、生物素 0.5 g/L、焦磷酸硫胺素 1 g/L，氯霉素 12.5 mg/L，卡那霉素 12.5 mg/L。
发酵结束后，测β-熊果苷产量。如图4所示：发酵36 h，添加40 g/L蔗糖β-熊果苷产量最高，达到1.81 g/L；发酵48 h，添加60 g/L蔗糖，可以看到β-熊果苷产量最高，为2.27g/L。
如图5所示，在一些实施例中，还包括以下步骤：
S7、重复所述S5以及S6步骤，以获得LBG培养液；
S8、以20 %的接种量将所述LBG培养液接种至含有20 ml种子培养基的250 ml锥形瓶中；
以上步骤在实施时，将获取到的LBG培养液以20 %的接种量将该LBG培养液接种到含有20 ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，发酵温度为32 ℃，摇床转速为250 rpm，培养时间为12 h。
种子培养基成分：蔗糖 50 g/L、酵母粉 10 g/L、玉米浆 30 g/L、MgSO40.25g/L、（NH4）2SO44 g/L、KH2PO41 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、MnSO4·H2O0.01 g/L，氯霉素 12.5 mg/L，卡那霉素 12.5 mg/L。
分别以20%, 30%, 50%的接种量将种子培养液接种到含有20 ml发酵培养基的250ml锥形瓶中（培养基氮源浓度分别为1倍，2倍，3倍和4倍），发酵温度为32 ℃，摇床转速为250 rpm，接种8 h后额外补加终浓度为1 mM的IPTG诱导剂，发酵时间为48 h，在发酵48 h处取样；
关于以上的成分具体是这样的：
1倍氮源发酵培养基成分：蔗糖 60 g/L、酵母粉 10 g/L、尿素 3 g/L、蛋白胨 4g/L、KH2PO40.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O 0.02 g/L、生物素 0.5 g/L、焦磷酸硫胺素 1 g/L，氯霉素 12.5 mg/L，卡那霉素 12.5 mg/L。
2倍氮源发酵培养基成分：酵母粉 20 g/L、尿素 6 g/L、蛋白胨 8 g/L、玉米浆 5g/L，其余成分同1倍氮源发酵培养基。
3倍氮源发酵培养基成分：酵母粉 30 g/L、尿素 9 g/L、蛋白胨 12 g/L、玉米浆 5g/L，其余成分同1倍氮源发酵培养基。
4倍氮源发酵培养基成分：酵母粉 40 g/L、尿素 12 g/L、蛋白胨 16 g/L、玉米浆5 g/L，其余成分同1倍氮源发酵培养基。
发酵结束后，测β-熊果苷产量。综合考虑，认为2倍氮源发酵培养基和20%的接种量为最优条件，由图5可知β-熊果苷产量为3.9 g/L。
如图6-8所示，在一些实施例中，所述S1步骤中，获取重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A时，以及在所述S3步骤中获取AR09时均由电穿孔仪配合完成；
关于重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A的获取是这样的，利用电穿孔仪（伯乐）将表达质粒pXMJ19-MU电转入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，电转杯宽度为2 mm，电击电压为3000V，电击时间为4 ms。重组菌在含12.5 mg/L氯霉素的LBHIS平板上筛选。挑选单菌落以UbiC-F和AMU-R为引物进行菌落PCR，能扩增出500 bp左右大小的条带则认为重组质粒pXMJ19-MU已成功转入谷氨酸棒杆菌，该重组菌命名为13032-MU（图2，泳道2）。利用电穿孔仪（伯乐）将表达质粒pEC-XK99E-A电转入重组谷氨酸棒杆菌13032-MU中，电转条件同上。重组菌在含12.5 mg/L氯霉素和12.5 mg/L卡那霉素的LBHIS平板上筛选。挑选单菌落以pEC-XK99E-F和pEC-XK99E-R为引物进行菌落PCR（图2，泳道1），能扩增出1400 bp左右大小的条带则认为重组质粒pEC-XK99E-A已成功转入谷氨酸棒杆菌，该重组菌命名为13032-MU-A。
所用引物序列：
UbiC-F：ctgcaggtcgactctagaGGATCCCCAAGGAGCTTTAAAACAGCAT；
关于AR09的获取是这样的，利用电穿孔仪（伯乐）将pK18-Δcsm电转入13032-MU中，电转杯宽度为2 mm，电击电压为3000 V，电击时间为4 ms。重组菌在含12.5 mg/L氯霉素和12.5 mg/L卡那霉素的LBHIS平板上筛选。挑选单菌落在50 μL含有12.5 mg/L氯霉素的液体LB中培养5 h后，将其涂布在含有12.5 mg/L氯霉素和100 g/L蔗糖的LB平板上进行二次筛选。挑选单菌落以csm-check-F和csm-down-R为引物进行菌落PCR（图7，泳道3），不能扩增出800 bp左右大小的条带则认为csm基因敲除成功，该重组菌命名为13032-MUΔcsm。
利用电穿孔仪（伯乐）将pK18-ΔtrpE电转入13032-MUΔcsm中，电转条件和筛选条件同上。二次筛选后，挑选单菌落以trpE-check-F和trpE-down-R为引物进行菌落PCR（图7，泳道4），不能扩增出800 bp左右大小的条带则认为trpE基因敲除成功，该重组菌命名为13032-MUΔcsmΔtrpE。
利用电穿孔仪（伯乐）将pK18-P sod aroG2电转入13032-MUΔcsmΔtrpE，电转条件和筛选条件同上。二次筛选后，挑选单菌落以Sod-F和aroG2-down-R为引物进行菌落PCR（图7，泳道5），能扩增出1000 bp左右大小的条带则认为P sod 启动子成功插入aroG2上游，该重组菌命名为13032-MUΔcsmΔtrpEP sod aroG2。
利用电穿孔仪（伯乐）将表达质粒pEC-XK99E-A电转入13032-MUΔcsmΔtrpEP sod aroG2中，电转条件同上。重组菌在含12.5 mg/L氯霉素和12.5 mg/L卡那霉素的LBHIS平板上筛选。挑选单菌落以pEC-XK99E-F和pEC-XK99E-R为引物进行菌落PCR（图7，泳道2），能扩增出1500 bp左右大小的条带则认为重组质粒pEC-XK99E-A已成功转入谷氨酸棒杆菌，该重组菌命名为AR09。
所用引物序列：
csm-check-F：TTTTGGATCTCCGCATCGGAC
trpE-check-F：TTTCACCCTGAGTCAGTGCTAAG。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (9)
1.一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其特征在于，由种子培养基和发酵培养基配合完成，且包括以下步骤：
S1、在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中引入UbiC、MNX1和AS基因，构建β-熊果苷合成途径，获得重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A；
S2、敲除控制分支酸合成芳香族氨基酸的csm和trpE基因，切断竞争代谢途径；
S3、引入P sod 强启动子，强化表达莽草酸途径关键酶的编码基因aroG2，获得重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A, ΔcsmΔtrpE, P sod aroG2 (命名为AR09)；
S4、对重组谷氨酸棒杆菌进行好氧发酵验证β-熊果苷产量，所接种发酵成分不低于20%体积，发酵温度最低为32 ℃，摇床转速为不低于250 rpm，发酵时间不低于 48 h。
2.根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其特征在于，所述UbiC基因以及MNX1基因由表达质粒pXMJ19进行共表达而获得，所述AS基因由表达质粒pEC-XK99E进行表达而获得。
3.根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其特征在于，所述csm基因和trpE基因由谷氨酸棒杆菌自杀质粒pK18mobsacB进行敲除而获得。
4.根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其特征在于，所述P sod 强启动子通过构建pK18-P sod aroG2重组质粒以引入aroG2基因。
5.根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其特征在于，还包括以下步骤：
S5、将所述重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A移至添有12.5 mg/L氯霉素和12.5 mg/L卡那霉素的LB平板上进行活化培养；
S6、将所述LB平板上的菌转接入含有10 ml LBG培养基的100 ml锥形瓶中。
6.根据权利要求5所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其特征在于，还包括以下步骤：
S7、重复所述S5以及S6步骤，以获得LBG培养液；
S8、以20 %的接种量将所述LBG培养液接种至含有20 ml种子培养基的250 ml锥形瓶中。
7.根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其特征在于，所述S1步骤中，获取重组谷氨酸棒杆菌13032-MU-A时，以及在所述S3步骤中获取AR09时均由电穿孔仪配合完成。
8.根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其特征在于，所述种子培养基成分至少包括：蔗糖或葡萄糖、酵母粉、玉米浆、MgSO4、（NH4）2SO4、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O。
9.根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法，其特征在于，所述S4步骤中，所述发酵培养基成分至少包括：蔗糖或葡萄糖、酵母粉、尿素、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、生物素和焦磷酸硫胺素。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310374309.6A CN117265045A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产β-熊果苷方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN117265045A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118389310A (zh) * | 2024-06-20 | 2024-07-26 | 华南理工大学 | 一种高产β-熊果苷的毕赤酵母工程菌及其构建方法和应用 |
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2023
- 2023-04-10 CN CN202310374309.6A patent/CN117265045A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118389310A (zh) * | 2024-06-20 | 2024-07-26 | 华南理工大学 | 一种高产β-熊果苷的毕赤酵母工程菌及其构建方法和应用 |
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