KR20010102256A

KR20010102256A - Ｌ-소르보스의 제조 방법

Info

Publication number: KR20010102256A
Application number: KR1020017010525A
Authority: KR
Inventors: 안네-메테 야콥센; 키르스텐 호그 니엘센
Original assignee: 스타르크, 카르크; 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2001-11-15
Also published as: JP2003521232A; DE19907115A1; NO20013995D0; WO2000049133A1; AU2912400A; CN1346401A; IL144651A0; EP1153120A1; NO20013995L; CA2362926A1

Abstract

본 발명은 D-소르비톨에 대해 내성이 강한 글루코노박터 옥시단스 종의 박테리아, 그의 제조 방법, 및 D-소르비톨로부터 L-소르보스를 반연속 발효시켜 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-소르보스의 제조 방법 {Method for Producing L-Sorbose}

본 발명은 L-소르보스의 개선된 제조 방법, 특히 L-소르보스의 대량 제조를 용이하게 하는 방법, 및 이 제조 방법에서 특히 유익하게 사용할 수 있는 재조합되지 않은 특정 미생물에 관한 것이다.

L-소르보스는 2-케토-L-굴론산을 제조하기 위한 출발 물질이고, 상기 2-케토-L-굴론산으로부터 L-아스코르브산이 대량으로 합성된다. 발효에 의한 미생물학적 방법에서 아스코르브산 또는 그의 전구체, 예컨대, L-소르보스를 제조하는 것은 원하는 생성물을 거울상이성질체적으로 순수한 형태로 제조한다는 장점이 있다.

그러나, 현재까지 L-소르보스를 제조하는 데 사용된 발효 방법은 많은 단점이 있다. 이 방법에 있어서 지금까지 공지되어 있는 가장 심각한 단점 중 하나는 출발 물질인 D-소르비톨이 상대적으로 낮은 농도, 즉 약 1 내지 15 중량%로 사용될 수만 있었다는 점이다. 따라서, 발효를 완결한 후의 L-소르보스 농도는 심지어 완전한 반응 후에도 낮았다. 두 번째로 심각한 단점은 반응을 배치식으로 수행해야 한다는 요구조건이었다. 이것은 각 제조 배치를 위한 새로운 접종물을 다단계에서 먼저 준비해야함을 의미한다. 이것은 특히 노동 집약적이고 시간 소모적이며, L-소르보스의 대량 제조에 있어서 심각한 단점이다. 이들 단점의 주원인은 발효에필요한 미생물, 특히 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter Oxydans) 종의 박테리아가 고농도의 D-소르비톨, 값싼 비복합 영양배지, 약 3 내지 7의 pH 변화, 시간 당 0.1 내지 1.5 L의 O₂/배지 1 L의 산소 공급 변화와 같은, 공업적인 규모의 발효 조건하에서 극도로 한정된 수명만을 가지고 있다는 점이다. 또한, 반응 조건이 이상적인 파라미터로부터 벗어나면 특히 대량 발효에 있어서 박테리아의 수명이 감축된다. 사용된 박테리아의 대다수는 종종 발효 말기에 더 이상 생존 또는 복제할 수 없다. 따라서, 다음 반응 배치를 위한 이상적인 출발 조건을 만들기 위해, 다시 말해 고밀도 세포의 접종물을 준비하기 위해, 선행기술은 새로운 접종물의 배양을 필요로 한다.

EP-A-0 758 679에는 20% 강도의 소르비톨 배지에서 배양할 수 있는 L-소르보스-생산 글루코노박터 옥시단스 균주 G624 (기탁 번호: 제FERM-BP 4415호)가 기재되어 있다. 4일 동안 배양된 후의 상기 균주는 D-소르비톨을 L-소르보스로 고수율로 전환시킨다. 또한, 이 균주는 L-소르보스 데히드로게나제 및 L-소르보손 데히드로게나제 효소를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 구축물로 형질전환시킨다. 얻은 형질전환체는 D-소르비톨로부터 2-케토-L-굴론산을 제조하는 데 사용한다. 그러나, 이 발효에 사용된 배양 배지에는 단지 5% 농도의 D-소르비톨이 함유되어 있다. 반응을 완결하기 위해서는 5일 동안 배양할 필요가 있다. 따라서, 전반적으로, EP-A-0 758 679에 개시되어 있는 박테리아는 L-소르보스 합성 수행능력 면에서 뿐만 아니라 D-소르비톨 내성 면에서도 만족스러운 성질을 가지고 있지 않다고 말할수 있다. 마찬가지로, D-소르비톨의 반연속 또는 연속 전환을 위한 상기 미생물의 사용가능성도 제시되어 있지 않다.

그러므로, 본 발명의 목적은 L-소르보스의 보다 효율적인 발효 제조를 위한 예비조건을 만드는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적이 특히, 글루코노박터 옥시단스 종의 미생물을 사용하여 D-소르비톨로부터 L-소르보스를 제조하기 위한 반연속 발효법을 제공함으로써 달성됨을 발견하였다. 더욱이, 상기 목적은 글루코노박터 옥시단스 종의 최적화된 박테리아를 제공함으로써 달성된다.

따라서, 본 발명은 먼저, D-소르비톨에 대한 내성이 약한 글루코노박터 옥시단스 균주를 단계적으로 증가되는 D-소르비톨 농도에서 배양함으로써 배양 배지 중의 증가된 D-소르비톨 농도에 단계적으로 적응시켜 상기 균주의 성질을 변화시킴으로써 수득할 수 있는, D-소르비톨에 대한 내성이 강한 글루코노박터 옥시단스 종의 박테리아에 관한 것이다.

글루코노박터 옥시단스 균주를 초기 D-소르비톨 농도가 약 20 내지 40 중량%, 예를 들면, 약 25 내지 38 중량% 또는 약 28 내지 35 중량%인 배지에서 배양하면, 본 발명의 "고내성" 글루코노박터 옥시단스 균주, 즉 높은 D-소르비톨 농도에 적응된 균주가 존재한다. 마찬가지로, 글루코노박터 옥시단스 균주를 20 중량% 이하의 D-소르비톨 농도에서 증식시키는 것도 가능하다는 것은 자명하다. 바람직하게는, 이러한 유형의 균주 역시 증식하는 동안 배지에 존재하는 D-소르비톨을 L-소르보스로 고수율, 예를 들어, 70 내지 100% 발효시킨다.

예를 들면, 본 발명의 고내성 균주는, 저내성 균주를 약 5 내지 10 중량%의 초기 농도부터 약 20 내지 40 중량%, 예컨대, 약 25 내지 38 중량% 또는 28 내지 35 중량%의 최종 농도까지 적응시키는 과정 동안 D-소르비톨 농도를 단계적으로 증가시킴으로써 수득할 수 있다. 상기와 같은 저내성 균주의 성질 변화는 예컨대, 하기와 같이 수행할 수 있다.

글루코노박터 옥시단스의 증식에 적합하며 그 자체가 공지되어 있는 멸균 액체 배지를 제조하고, 접종 후에 상기 배지 중의 초기 D-소르비톨 함량을 예컨대, 약 5 내지 15 중량%, 바람직하게는 약 10 중량%가 되도록 맞춘다. 배양 배지에 적합한 규격은 예컨대, 문헌 ("Industrielle Mikrobiologie" [Industrial Microbiology, Hans-Jurgen Rehm, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 2nd Edition, p. 500)에 기재되어 있다. 예를 들어, 0.1 중량%의 글루코스가 있거나 없는 효모 추출물 0.5 중량%가 첨가된 10% 강도의 소르비톨 배지 (pH 5)를 사용할 수 있다. 이 배지는 새로 준비한, 성질이 변화되지 않은 글루코노박터 옥시단스 균주의 접종물로 접종시킨다. 상기 접종된 배지는 예컨대, 약하게 진탕하거나 교반하면서 호기성 조건하에 약 30 내지 37℃에서 배양한다. 충분한 L-소르보스 생성을 더 이상 관찰할 수 없을 때까지 계속 발효시킨다. 발효 브로쓰 (broth) 로부터 분취액을 얻고, 이를 임시로 제조된, 제2 배양 단계의 추가 멸균 배양 배지를 접종하는 데 사용하였는데, 상기 배양 배지의 D-소르비톨 함량 (재접종 후의 함량)은 전배양 단계의 배지 중의 함량보다 더 높다. 접종할 배양 배지에 대한 접종물의 비율은 대략 1 : 5 내지 1 : 20, 예를 들어, 1 : 5 내지 1 : 10이다. 초기 D-소르비톨의 농도가 원하는 만큼 높은 배지에서 증식하는 박테리아 배양물을 수득할 때까지 소르비톨 농도를 단계적으로 증가시키면서 상기 과정을 반복한다. D-소르비톨 농도의 단계적 증가는 농도 증가에 대한 출발 균주의 반응 작용으로서 선별할 수 있다. 또한, D-소르비톨 농도는 동일하거나 상이한 규모의 단계에서 증가시킬 수 있다. 예를 들어, D-소르비톨 농도는 동일한 단계에서 0.5부터 3%까지, 예컨대, 1 내지 2% 만큼 단계적으로 증가시킬 수 있다.

추가 실시양태에 따라, D-소르비톨에 대한 내성이 증가된 것 이외에도 본질적으로 변하지 않는, 즉 안정한 L-소르보스 합성 수행능력이 높은 글루코노박터 옥시단스 종의 박테리아를 제조한다. 이러한 유형의 성질 프로필을 갖는 박테리아는 전술한 바와 같이, 고농도 소르비톨에 대한 내성이 강한 박테리아를 상승된 소르비톨 농도, 예를 들어, 약 25 내지 35 중량% 강도의 D-소르비톨 배지에서 L-소르보스 생성이 완결될 때까지 반복적으로 배양함으로써 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 만족할 만큼의 "높은" L-소르보스 합성 수행능력은 사용된 소르비톨의 약 90 내지 100 몰%, 예컨대, 약 93 내지 98 몰%의 소르비톨이 약 48시간이내, 특히 약 36시간이내, 예를 들면, 약 15 내지 25시간 또는 18 내지 22시간 후에 반응할 때 얻어진다. 상기 합성 수행능력이 배양 조건에 의해 영향받을 수 있기 때문에, 상기 기준을 특히 하기 표준 조건하에 적용한다: 초기 D-소르비톨 함량: 28-30 중량%; 배지의 pH: 4.5-5.0; 통기: 0.5-1.5 L의 공기/배지 1 L/시간; 바뀐 배양 배지에 대한 접종물의 부피비: 1.5 내지 1.6; 표준 배지 : 배지 1 kg 당 옥수수 담금액 (50% 건조물) 4.354 g, 황산암모늄 0.495 g, 디암모늄 포스페이트0.124 g, 마그네슘 술페이트 헵타히드레이트 0.082 g, 탄산칼슘 0.472 g 및 소포제 0.150 g을 포함함.

바뀐 배양 배지에 대한 접종물의 부피비가 바람직하게는 약 1 : 5 내지 1 : 6이 되도록, 보다 정확하게는 사용된 생산 균주의 L-소르보스 합성 수행능력이 별로 감소되지 않도록 배양 브로쓰의 분취액을 새롭게 제조된 배양 배지내에 연속 접종하여 반복적으로 배양하면, 본 발명의 만족할 만큼의 "변화지 않는" 또는 "안정한" L-소르보스 합성 수행능력이 얻어진다. 상기 합성 수행능력은 상기 정의된 전환률 및 반응 기간의 범위내에서 변할 수 있다. 불변의 합성 수행능력은 1 내지 5회 이상 자주, 예컨대, 10 내지 50회 이상 자주 재접종한 후에도 여전히 관찰할 수 있다.

본 발명의 균주 성질 변화 방법은 원칙적으로, 성질이 변화되지 않은 모든 글루코노박터 옥시단스 균주에 적용할 수 있다. 그러나, 글루코노박터 옥시단스 NRRL-B72의 성질을 변화시키는 것이 바람직하다. 이 균주는 기탁 기관 (Northern Regional Research Laboratory, USA)으로부터 자유롭게 입수할 수 있다.

본 발명은 특히 호기성 조건하에서 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시킬 수 있는, 상기 방식으로 성질을 변화시킨 글루코노박터 옥시단스 박테리아에 관한 것으로, 상기 호기성 조건하에서 박테리아는 소르비톨-글루코스-효모 추출물-한천 반고체 배지 및 소르비톨-옥수수 담금액 액체 배지 (pH 약 3.5-6, 온도 약 25-40℃, D-소르비톨 농도 약 40 중량% 이하, 예컨대, 20 내지 40 중량%, 특히 약 25 내지 35 중량%)에서 잘 증식하는, 개별 형태, 쌍 형태 또는 단쇄 형태의 비운동성 그람음성 막대형으로 나타난다.

NRRL-B72로부터 출발하는 상기 균주 성질 변화 방법에 따라 얻은 특히 바람직한 글루코노박터 옥시단스 균주는 명칭이 "2B₃"이고 하기 성질을 갖는다:

1. 2B₃의 형태학적 성질:

-그람 염색: 음성

-세포 형태: 막대형

-세포 크기: 1-2 ㎛

-세포 형태: 개별적인 형태, 쌍 형태 또는 단쇄 형태

-운동성: 음성

-포자 형성: 음성

-콜로니:

a) 수육 추출물-펩톤 한천 (pH 7.0) 상의 콜로니: 2일 동안 인큐베이션한 후, 잘 보이지 않는 불분명한 얇은 콜로니가 종종 나타남;

b) 소르비톨-글루코스-효모 추출물 한천 (pH 5) 상에서 2일 동안 인큐베이션한 후, 모양 및 크기가 핀헤드 (pinhead)와 유사한 반구형의 둥근 콜로니가 나타남. 콜로니는 황백색이고 광택을 띤다.

2. 생리학적 성질:

- 증식 온도: T = 25-40℃, 최적 T = 32℃

- pH 범위: pH 3.5-6에서 증식, pH 4.5-5.0이 최적

-호기성

-카탈라제: 양성

-옥시다제: 음성

-니트레이트 환원: 음성

-젤라틴 액화: 음성

-H₂S 생성: 음성

-인돌 생성: 음성

-아세트산으로의 에탄올 산화: 양성

-전분: 가수분해되지 않음

-글리세롤, D-만니톨, 소르비톨: 사용되지 않음

-락테이트 산화: 음성

-CO₂및 H₂O로의 아세테이트 산화: 음성

따라서, 나타난 균주는 문헌 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (9th Edition), p. 275)의 정보에 기재된 글루코노박터 옥시단스의 필수적인 특징과 일치한다. 이러한 표준 확인 작업은 다른 제한되지 않은 특성에 대해서도 참고로 수행할 수 있다.

또한, 상기에 구체적으로 기재된 글루코노박터 옥시단스 종의 박테리아 이외에도, 본 발명은 상기 박테리아와 본질적으로 동일한 성질을 갖고 있고 본 발명의 L-소르보스의 제조 방법을 수행하는 데 적합한 돌연변이체 및 그의 변이체에 관한것으로, 상기 제조 방법은 이하 단락에 더 자세히 기재되어 있다.

구체적으로 기재된 본 발명의 미생물의 돌연변이체 및 변이체를 제조하는 데 적합한 방법의 예로는 자외선 또는 X-선으로의 조사에 의한 돌연변이유발; 니트로소구아니딘 (N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘), 메틸 메탄술포네이트, 질소 머스타드 등과 같은 화학적 돌연변이유발제로의 처리; 유전자 삽입법; 및 박테리오파지를 사용한 형질도입법이 있지만, 여기에 제한되지 않는다. 이들 방법은 선행 기술로부터 공지되어 있고, 예를 들어, 하기 문헌들에 기재되어 있다: J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1991); M. Singer and P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, California (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); P.B. Kaufman et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, Eds., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993); and P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia Coli, The Guilford Press, New York, NY (1989).

또한, 본 발명은

a) D-소르비톨을 함유하는 제1 배양 배지를 글루코노박터 옥시단스 종의 박테리아로 접종하고, D-소르비톨의 전환이 본질적으로 완결될 때까지 상기 박테리아를 배양하는 단계;

b) 전환이 완결된 후, 생성된 L-소르보스를 생성된 대부분의 배양 브로쓰로부터 단리하는 단계;

c) D-소르비톨을 함유하는 제2 배양 배지를 1 : 4 내지 1 : 8의 중량비로 나머지 상기 배양 브로쓰로 접종하고, D-소르비톨의 전환이 본질적으로 완결될 때까지 배양하는 단계; 및

d) 전환이 완결된 후, 생성된 L-소르보스를 배양 브로쓰로부터 단리하는 단계

를 포함하는, 각 단계에서 배양 배지 접종 후의 초기 D-소르비톨 농도가 약 40 중량% 이하인 것을 특징으로 하는, L-소르보스의 반연속 발효 제조 방법에 관한 것이다. 접종물의 세포 밀도는 예를 들어, 접종물 1 리터당 1 내지 10 g의 생물체량 (건조물)이다.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에 따라, 단계 a) 내지 c)를 포함하는 발효 주기를 충분한 양의 L-소르보스가 생성될 때까지 원하는 만큼 반복한다. 본 발명의 목적을 위해, 발효 주기의 "원하는" 반복 횟수는 예를 들어, 1 내지 5회 이상 자주, 예컨대, 10 내지 50회 또는 50 내지 200회이다.

본 발명의 방법이 선행 기술과 비교할 때 생산 배양 배지를 접종하는 데 새로운 접종물을 필요로 하지 않는다는 점에서 특히 유리하다는 것을 본원으로부터알 수 있다. 오히려, 필요한 접종물은 바람직하게는, D-소르비톨 전환의 완결 후에 전발효 주기의 배양 브로쓰로부터 직접 얻을 수 있다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 초기 D-소르비톨 농도가 비정상적으로 높을지라도, 예를 들어, 25 내지 35 중량%일지라도, 본 발명에 따라 다수의 발효 주기를 반복할 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 각 발효 주기로부터 실질적으로 많은 양의 수율, 즉 약 15 내지 25시간, 특히 약 20시간의 주기당 반응 시간내에 약 95 내지 98 몰%로 L-소르보스를 얻을 수 있음을 발견하였다. 본 발명에 따라 선택된 배양 배지에 대한 접종물의 비율은 생산 배치가 실질적으로 지체기 (lag phase)를 지나게 하지 않고, 오히려 생존가능성이 높은 박테리아 배양물을 함유하게 한다.

발효 온도는 바람직하게는 약 25 내지 40℃, 특히 약 32 내지 36℃이다. 발효 온도는 박테리아의 증식 최적 온도 (32℃)와, L-소르보스로의 D-소르비톨의 효소 촉매 부분 산화의 최적 온도 (36℃) 사이의 약 35℃인 것이 특히 바람직하다. 25℃ 미만 및 40℃ 이상의 온도에서는 충분한 박테리아 증식을 관찰할 수 없었다. 온도가 25℃ 미만으로 떨어지면, 후속 가열시 증식 및 생산성 증가가 정상값으로 돌아오지만, 40℃를 넘는 온도까지 온도가 증가되면 박테리아 증식 및 생산성이 영구적으로 손상된다.

또한, 본 발명에 따르면 배지 1 리터 및 1분당 약 0.5-1.5 리터의 대기를 공급하면서 발효시키는 것이 바람직하다. 박테리아 증식 및 D-소르비톨의 발효 전환은 공지된 방식으로 공기 중의 산소를 예컨대, 약 20 부피%까지 증가시킴으로써 더 개선시킬 수 있다. 산소 전달도 공지된 방식으로 압력을 변화시킴으로써 조절할수 있다. 교반된 발효기내의 산소 전달은 특히, 사용된 교반기의 교반력에 의해 영향받는다. 배지 1 m³당 약 0.5 내지 4 kW의 교반력이 바람직하다. 통상적으로 사용되는 교반기 유형의 예는 패들 교반기이다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따라 바람직한 박테리아의 증식 최적 pH는 pH 4.5-5.0이다. 6 내지 약 7.5의 pH에서는 증식 및 생산성이 역으로 억제되지만, 발효 과정의 pH는 가동 배치에 있어서의 소르비톨 산화 또는, 다음 발효 주기에 있어서의 증식 및 생산성에 악영향을 주지 않는 3.5 이하의 pH 값, 예컨대, 약 pH 3.0임을 간단히 추정할 수 있다.

추가로, 바람직하게는 소르비톨 기질이 과량의 D-글루코스 불순물을 포함하지 않도록 주의해야 하는데, 이는 기질에 포함된 과량의 D-글루코스 불순물이 발효 과정에서 글루콘산으로 산화됨으로써 pH를 비정상적인 수준으로 감소시키기 때문이다.

발효를 위해 본 발명에 따라 바람직하게 사용된 미생물이 나타나는 시간은 배지내의 소르비톨 농도가 증가됨에 따라 증가한다. 따라서, 미생물이 나타나는 시간은 예를 들어, 배지 강도를 제외한 모든 발효 파라미터가 동일한 조건하에서 10% 강도의 배지보다 27% 강도의 배지에서 3배 더 길다. 약 30-32 중량%의 소르비톨 농도 범위 이상에서는 미생물이 나타나는 시간이 급격하게 증가한다. 약 40 중량%의 농도에서는 증식이 정지된다. 27% 강도의 소르비톨 배지에서는 박테리아를 1 : 5.6의 비율 (배양 배지에 대한 접종물의 비율)로 접종한 후 약 12 내지 18시간내에 최적 박테리아 밀도에 도달한다. L-소르보스로의 D-소르비톨의 산화는 배양이 특정 세포 밀도, 예컨대, 약 30 내지 50%의 최종 밀도에 도달한 후까지 개시되지 않는다.

바람직하게는, 사용된 D-소르비톨 기질은 L-소르보스를 결정 형태로 단리해야 할 경우 D-만니톨 불순물을 함유하지 않아야 한다. 이는 D-만니톨이 D-프럭토스로 효소에 의해 전환되기 때문이다. 소량의 D-프럭토스는 결정화 과정을 억제한다.

본 발명의 추가 장점은 상대적으로 저렴한 단순 영양 배지 또는 배양 배지를 사용하여 본 제조 방법을 수행할 수 있다는 점이다. 바람직하게는, 이것은 액체 배지 1 kg당 a) 약 100 내지 300 g의 D-소르비톨, b) 약 4 내지 5 g의 옥수수 담금액 (50% 건조물), c) 약 0.4 내지 0.6 g의 (NH₄)₂SO₄, d) 약 0.1 내지 0.15 g의 (NH₄)₂HPO₄, e) 약 0.06 내지 0.1 g의 MgSO₄ㆍ7H₂O, f) 약 0.5 내지 0.9 g의 CaCO₃및 g) 임의로 활성량의 소포제를 포함한다.

접종 전, 배양 배지를 공지된 방식으로 멸균한다. 이를 위해, 멸균 전에 배지의 pH는 예를 들어, 약 70 내지 80% 강도의 아세트산을 사용하여 5.5에 맞춘다. 발효 동안에는 탄산칼슘만을 첨가하여 pH를 조절한다. 예를 들어, 수산화나트륨 용액을 가동 발효 과정 동안 첨가하여 추가 조절할 필요는 없다. 초기 증식기 동안에는 배양물의 pH가 약 5.5 내지 6이고, 대수증식기 (박테리아의 대수적 증식) 동안에는 pH가 약 4.0 내지 4.5까지 감소한다.

그 자체가 발효에 완전히 충분한 상기 필수 성분 이외에, 필요하다면 다른성분을 본 발명에 따라 사용된 영양 배지에 첨가할 수 있다.

따라서, 예를 들어, 전분 가수분해물, 셀룰로스 가수분해물 또는 당밀과 같은 하나 이상의 다른 탄화수소원, 및 글리세롤과 같은 알콜이 존재할 수 있다.

게다가, 하나 이상의 질소원, 예컨대, 암모니아; 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 예를 들어, 염화암모늄, 질산암모늄, 인산암모늄, 황산암모늄 및 아세트산암모늄; 우레아; 질산염 및 아질산염; 및 기타 질소 함유 물질, 예컨대, 아미노산, 수육 추출물, 펩톤, 어류분; 어류 가수분해물, 카세인 가수분해물, 대두 가수분해물, 효모 추출물, 건조된 효모, 에탄올 효모 증류물, 대두분, 목화씨분 등이 추가로 존재할 수 있다.

또한, 무기염, 예를 들어, 칼륨, 칼슘, 나트륨, 마그네슘, 망간, 철, 코발트, 아연, 구리 및 기타 미량 원소; 및 인산도 존재할 수 있다.

마찬가지로, 적합한 미량 원소 및 증식 인자도 개별적으로, 또는 예를 들어, 조효소 A, 판토텐산, 바이오틴, 티아민, 리보플라빈, 플라빈 모노뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 및 기타 비타민, 시스테인과 같은 아미노산, 소듐 티오술페이트, p-아미노벤조산, 니아신아미드 등과의 배합물로 첨가할 수 있다. 이들은 순수한 형태, 또는 이들 물질을 함유하는 천연 물질의 형태로 사용할 수 있다.

각 경우에서 사용된 바람직한 발효 기술은 주로 배치의 크기에 달려 있다. 일반적으로 보다 작은 배치에는 호기성 진탕 배양이 적합하지만, 본 발명의 방법을 공업 규모로 수행하기 위해서는 액침 호기성 조건하의 발효가 바람직하다.

D-소르비톨의 전환 후에 통상적인 방식, 예를 들어, 회수된 샘플의 HPLC 분석을 수행한다. L-소르보스 함량을 측정하기에 적합한 방법은 예를 들어, HPLC 분석이다 (컬럼 타입 OA KC 7.8 x 300 mm (Merck사로부터 시판됨), 이동상 0.05 N 황산, 0.4 ml/분 유속).

생성된 L-소르보스는 통상적인 방법을 사용하여 연속적으로, 또는 배치식으로 단리한다. 경우에 따라, 예컨대, 여과 또는 원심분리로 세포 덩어리를 제거한 후 생성된 배양 브로쓰를 통상적인 방식으로 먼저 농축한다. 예를 들어, 고온, 예컨대, 50 내지 80℃에서 감압하에, 예컨대, 0.01 내지 0.1 bar의 압력하에 증발시켜 농축한다. 침전된 결정은 여과하고, 필요하다면 재결정화한다. 필요하다면 다른 정제 단계, 예를 들어, 용매 추출, 크로마토그래피, 침전 또는 염석 (salting out)을 개별적으로, 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 방법의 구체적으로 바람직한 실시양태는 하기 실시예에 기재되어 있다.

<실시예 1> 다양한 영양 배지의 제조

a) 옥수수 담금액-염 혼합물

옥수수 담금액 (50% 건조물) 240 g (약 200 ml)

황산암모늄 22.2 g

디암모늄 포스페이트 6.6 g

마그네슘 술페이트 헵타히드레이트 3.6 g

탄산칼슘 48.6 g

탄산칼슘을 제외한 모든 성분을 혼합하고, 25% 강도의 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 약 6에 맞추어 배지를 제조하였다. 그 다음으로, 탄산칼슘을 첨가하였다. pH를 다시 측정하고, 필요하다면 6.5에 맞추었다.

b) 소르비톨-옥수수 담금액-염 한천

글루코노박터 옥시단스를 한천 사면 튜브내의 상기 고체 배지 상에서 실험 배양하였다. 발효기의 제1 접종을 위한 접종 배양물을 루 (Roux) 플라스크내의 상기 고체 배지 상에서 배양한 후, 즉시 접종하였다.

소르비톨 시럽 (70 중량%의 건조물) 75.0 g (약 5% 소르비톨)

옥수수 담금액-염 혼합물 7.5 g

한천 분말 25.0 g

광물이 제거된 물 1000 ml

소르비톨 시럽, 옥수수 담금액-염 혼합물 및 물을 혼합하고, 60℃까지 가열하고 여과하였다. 이어서, 한천 분말을 끊는 여액에 천천히 첨가하였다. 그 다음으로, 뜨거운 배지를 배양 용기 (30 ml 한천 사면 튜브당 9 ml, 및 650 ml 루 플라스크당 100 ml)에 배분하였다. 그 후, 상기 용기를 봉합하고 121℃에서 20분 동안 고압멸균하였다.

c) 소르비톨-글루코스-효모 추출물 한천 (pH 5)

이 배지는 발효 동안의 배양물 순도를 연구하는 데 사용하였다. 상기 배지는 글루코노박터 옥시단스의 증식에 적합하고, 통상적으로 증식할 수 있는 대부분의 오염 미생물에는 부적합하다. 글루코노박터 옥시단스는 32℃에서 1 내지 2일동안 인큐베이션한 후 상기 배지 상에서 특징적인 반구형의 둥근 황백색 광택성 배양물을 생성하였다.

소르비톨 시럽 (70 중량%의 건조물) 75.0 g (약 5% 소르비톨)

글루코스 1.0 g

효모 추출물 5.0 g

한천 분말 15.0 g

광물이 제거된 물 1000 ml

소르비톨 시럽, 효모 추출물 및 글루코스를 혼합한 후 물을 첨가하였다. pH를 12 중량% 강도의 아세트산으로 5.3 내지 5.4에 맞추었다. 한천 분말을 상기 끊는 혼합물에 서서히 첨가하였다. 여전히 뜨거운 상기 배지를 마개가 나사 모양인 유리 병에 분배하고, 121℃에서 20분 동안 고압멸균하였다. 상기 배지를 약 50℃까지 냉각시킨 후, 멸균된 플라스틱 페트리 디쉬 상에 부었다.

d) 수육 추출물-펩톤 한천 (pH 7)

이 배지는 발효 동안의 배양물 순도를 연구하는 데 사용하였다. 이 배지는 통상적으로 증식하는 대부분의 오염 미생물을 위한 영양 배지이다. 상기 배지는 글루코노박터 옥시단스의 증식에는 적합하지 않다. 글루코노박터 옥시단스를 32℃에서 2일 동안 인큐베이션한 후, 대부분의 글루코노박터 옥시단스는 이 배지 상에서 잘 보이지 않는 불분명한 콜로니를 형성하였다. 보통, 증식을 관찰하지 못하였다.

수육 추출물 3.0 g

펩톤 5.0 g

한천 분말 15.0 g

광물이 제거된 물 1000 ml

이 배지는 pH를 7에 맞춘다는 점을 제외하고는 상기 배지 c)와 유사하게 제조하였다.

e) 생산 배지

28% 강도의 소르비톨 배지 1000 kg을 위한 규격 (밀도 1097 kg/m³)

옥수수 담금액 (50% 건조물) 4.354 kg

황산암모늄 0.495 kg

디암모늄 포스페이트 0.124 kg

마그네슘 술페이트 헵타히드레이트 0.082 kg

탄산칼슘 0.472 kg

소포제 0.150 kg

소르비톨 시럽 (70% 건조물; 400 g의 소르비톨과 동량)을 수돗물로 희석하고 옥수수 담금액을 첨가하였다. 그 다음으로, 수돗물에 미리 용해시키거나 현탁시킨 광물염을 첨가하였다. 이어서, 70-80% 강도의 아세트산을 사용하여 pH를 5.5에 맞추었다. 최종적으로, 소포제를 첨가하였다. 배지를 공지된 방식으로 141℃에서 2분 동안 멸균하였다.

<실시예 2> 글루코노박터 옥시단스의 접종 배양물 생성

글루코노박터 옥시단스를 한천 배양물 (배지 b) 형태로 5℃에서 미리 배양하였다. 멸균된 접종 루프를 사용하여 한 한천 배양물로부터 얻은 접종물을 32℃에서 2일 동안 인큐베이션함으로써 5개의 새로운 한천 배양물을 생성하였다. 이러한 한천 배양물 8개의 박테리아는 루 (Roux) 플라스크내의 상기 배지를 접종시키는 데 사용하였다. 이를 위해, 한천 배양물의 박테리아를 0.9% 강도의 멸균된 염화나트륨 용액 2 x 5 ml에 현탁시켰다. 이 현탁액을 루 플라스크로 옮겼다. 총 8개의 접종된 플라스크를 32℃에서 2일 동안 인큐베이션하고, 필요한 경우 5℃에 보관하였다. 두 개의 루 플라스크내에서 증식된 박테리아를 0.9% 강도의 멸균된 염화나트륨 용액 2 x 50 ml에 현탁시키고, 멸균된 유리 용기로 옮겼다. 이 배양물을 접종물로 사용하여 50 m³발효기에서 소르비톨을 발효시켰다. 상기 접종물의 세포 밀도는 약 10⁹박테리아/ml이다.

<실시예 3> D-소르비톨의 발효

a) 제1 발효 단계

소르비톨 함량이 단지 15 중량%이고 옥수수 담금액 및 광물염의 함량이 각각 30 중량%인 생산 배지 (실시예 1의 배지 e)를 참조) 15,000 kg으로 50 m³의 발효기를 채웠다. 상기 배지의 온도를 35℃에 맞추었다. 실시예 2에 따라 제조된 200 ml의 접종 배양물을 멸균 조건하에 상기 발효기로 옮겼다. 발효기를 시간당 1600-1800 m³의 멸균된 공기로 통기시켰다. 발효기내의 압력은 약 1.3 atm이었다. 초기pH는 약 5.5 내지 6.0이었다. 이 제1 단계에 있어서 발효 기간은 약 30 내지 40 시간이었다. pH는 발효 말기에 약 4.0 내지 4.5까지 떨어졌다. 생성된 L-소르보스를 단리하거나, 제2 발효 단계를 위한 접종물로서 사용하기 위해, 생성된 배양 브로쓰를 마무리 처리하였다.

b) 제2 발효 단계

50 m³의 제2 발효기를 멸균된 생산 배지 (28 중량%의 소르비톨을 함유함) 33,000 kg으로 채우고, 6400 리터의 접종물 (제1 발효 단계로부터 얻은 7000 kg의 배양물에 상응하는 양)로 접종하였다. 생산 배지에 대한 접종물의 비율은 1 : 4.7이었다. 그 다음으로, 소르비톨 농도가 0.1 중량% 미만으로 감소할 때까지 약 18 내지 22시간에 걸쳐 발효시켰다. L-소르로스 수율은 시간당 약 8.3 kg/발효기 1 m³이었다. 다음 발효 주기를 위해 생성된 발효 브로쓰로부터 6400 리터의 접종물을 더 얻었다. L-소르보스를 단리하기 위해, 남아 있는 양의 발효 브로쓰를 마무리 처리하였다.

<실시예 4> L-소르보스의 단리

실시예 3에 따른 방법 후에 존재하는 발효 브로쓰는 약 25 내지 26 중량%의 L-소르보스, 약 0.1 중량% 미만의 D-소르비톨, 배양 배지의 잔류물 (용해되지 않았거나 현탁된 것) 및 리터당 1 내지 2 g의 박테리아 덩어리를 포함하였다. 상기 발효 브로쓰는 추가적인 박테리아 증식 및 소르보스의 손실을 방지하기 위해 약 50℃에서 보관하였다.

먼저, 제1 농축 단계에 있어서 상기 발효 브로쓰를 0.02 bar 압력하에 60 내지 80℃의 통상적인 강하-막 증발기에서 약 42 중량%의 소르보스 함량까지 농축하였다. 제2 단계에 있어서, 상기 발효 브로쓰를 0.02 bar 압력하에 57℃의 통상적인 장튜브 증발기에서 더 농축하였다. 농축된 L-소르보스 용액은 상기 제2 증발 단계를 통해 과포화시켰다. 결정 함량은 약 30 내지 50 부피%이었다. 그 다음으로, 이 방식으로 얻은 조 결정 현탁액을 통상적인 침전 용기로 옮겼다. 얼마간의 시간 후에 본질적으로 박테리아 덩어리로부터 떨어져 있는 매우 조밀한 결정 현탁액이 상기 침전 용기의 바닥 부위에 생성되었다. 이 결정 현탁액을 상등액으로부터 분리하고, 원심분리하고, 물로 세척하고, 잔류 수분 함량이 약 90℃에서 0.1 중량% 미만이 될 때까지 건조하였다.

그 다음으로, 경우에 따라 또다른 배치의 발효 브로쓰와 합한 후, 상기 침전 용기로부터 얻은 모액, 세척액 및 상등액을 상기와 같이 더 마무리 처리할 수 있다.

사용된 D-소르비톨을 기준으로 한 총 수율은 완전한 마무리처리 후 통상적으로 약 89 내지 92 몰%이었다. 이 방식으로 제조된 생성물은 L-아스코르브산을 제조하기 위한 출발 물질로서 작용한다.

<실시예 5> 글루코노박터 옥시단스의 성질 변화

a) D-소르비톨 함량이 약 10 중량%인, 한천을 함유하지 않는 멸균된 액체 배지 (2 L의 배양 용기내의 총 850 ml의 부피의 배지)를 상기 배지 c) (실시예 1 참조)와 유사한 방식으로 제조하였다. 이 배지를 성질이 변화되지 않은 글루코노박터 옥시단스 균주의, 새로 제조된 접종 배양물 150 ml로 접종하였다.

접종된 배지 (pH 5)를 철저히 진탕하면서 (80 rpm) 호기성 조건하에 (대기하에) 32℃에서 인큐베이션하였다. 충분한 L-소르보스 생성을 더 이상 관찰할 수 없을 때까지 계속 발효시켰다. 발효 브로쓰로부터 150 ml의 분취액을 얻고, 이를 사용하여 임시로 제조된, D-소르비톨 함량이 11 중량%인 다른 멸균 배양 배지를 접종하였다. 30 중량% 강도의 D-소르비톨 배지에서 증식하는 박테리아 배양물을 수득할 때까지 소르비톨 농도를 단계적으로 증기시키면서 (단계마다 1%씩 증가시킴) 상기 과정을 반복하였다.

따라서, 높은 소르비톨 농도에 적응된 글루코노박터 옥시단스를 수득한 후, L-소르보스 합성 수행능력을 더 최적화하기 위해, 상기 글루코노박터 옥시단스를 30 중량% 강도의 D-소르비톨 배지내에 연속적으로 접종하였다 (850 ml의 배지당 접종물 150 ml). 약 24시간 동안 배양한 후, 사용된 소르비톨의 90 내지 98 몰%의 소르비톨이 전환되었을 때 최적 합성 수행능력이 얻어졌다.

Claims

D-소르비톨에 대한 내성이 약한 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter Oxydans) 균주를, 단계적으로 증가되는 D-소르비톨 농도에서 배양함으로써 배양 배지 중의 증가된 D-소르비톨 농도에 단계적으로 적응시켜 상기 균주의 성질을 변화시킴으로써 수득할 수 있는, D-소르비톨에 대한 내성이 강한 글루코노박터 옥시단스 종의 박테리아.
제1항에 있어서, 상기 D-소르비톨 농도를 약 5 내지 10 중량%의 초기 농도부터 약 25 내지 38 중량%의 최종 농도까지 단계적으로 증가시킴으로써 수득할 수 있는 박테리아.
제1항 또는 제2항에 있어서, 본질적으로 안정한 L-소르보스 합성 수행능력을 특징으로 하는 박테리아.
제3항에 있어서, 소르비톨에 대한 내성이 있는 박테리아를 L-소르보스의 생성이 완결될 때까지 상승된 소르비톨 농도에서 반복적으로 배양함으로써 수득할 수 있는 박테리아.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코노박터 옥시단스 NRRL-B72의 성질을 변화시킴으로써 수득할 수 있는 박테리아.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

a) 호기성 조건하에서 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키고;

b) 개별적인 형태, 쌍 형태, 또는 단쇄 형태의, 포자를 형성하지 않는 비운동성 그람 음성 막대형으로 나타나고;

c) pH가 3.5 내지 6이고 온도가 25 내지 40℃이며, D-소르비톨 농도가 약 38 중량%인 소르비톨-글루코스-효모 추출물-한천 배지 및 소르비톨-옥수수 담금액 배지 상에서 잘 증식하는 것

을 특징으로 하는 박테리아.
a) D-소르비톨을 함유하는 제1 배양 배지를 글루코노박터 옥시단스 종의 박테리아로 접종하고, D-소르비톨의 전환이 본질적으로 완결될 때까지 상기 박테리아를 배양하는 단계;

b) 전환이 완결된 후, 생성된 L-소르보스를 생성된 대부분의 배양 브로쓰로부터 단리하는 단계;

c) D-소르비톨을 함유하는 제2 배양 배지를 1 : 4 내지 1 : 8의 중량비로 나머지 상기 배양 브로쓰로 접종하고, D-소르비톨의 전환이 본질적으로 완결될 때까지 배양하는 단계; 및

d) 전환이 완결된 후, 생성된 L-소르보스를 상기 배양 브로쓰로부터 단리하는 단계

를 포함하며, 각 단계에서 배양 배지 접종 후의 초기 D-소르비톨 농도가 약 38 중량% 이하인 것을 특징으로 하는, L-소르보스의 반연속 발효 제조 방법.
제7항에 있어서, 단계 a) 내지 c)를 포함하는 발효 주기를 원하는 만큼 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 발효 온도가 약 25 내지 40℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 새로 접종된 배양 배지의 pH를 약 5 내지 6에 맞추고, 이 pH가 발효 과정 동안 약 pH 3.5 미만까지 떨어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 분당 배지 1 L당 약 0.5 내지 1.5 리터의 대기를 공급하면서 발효시키는 것을 특징을 하는 방법.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 접종 후 배지를 약 15 내지 30시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 1 kg당 a) 약 100 내지 300 g의 D-소르비톨, b) 약 4 내지 5 g의 옥수수 담금액 (50% 건조물), c) 약 0.4 내지 0.6 g의 (NH₄)₂SO₄, d) 약 0.1 내지 0.15 g의 (NH₄)₂HPO₄, e) 약 0.06 내지 0.1 g의 MgSO₄ㆍ7H₂O, f) 약 0.5 내지 0.9 g의 CaCO₃및 임의로 g) 활성량의 소포제를 포함하는 배양 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 박테리아를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
a) 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 청구된 방법을 이용한 발효를 통해 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 단계; 및

b) 이러한 방식에 의해 제조된 L-소르보스를 통상적인 방식으로 동일 발효계에서, 또는 중간 단리 후 2-케토-L-굴론산으로 전환시키는 단계

를 포함하는, 2-케토-L-굴론산의 제조 방법.
D-소르비톨로부터 L-아스코르브산을 제조하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 청구된 박테리아의 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 글루코노박터 옥시단스종의 박테리아의 성질을 변화시키는 것을 포함하는, D-소르비톨에 대한 내성이 강한 박테리아의 제조 방법.