JP2003521232A

JP2003521232A - Ｌ−ソルボースの製法

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Publication number: JP2003521232A
Application number: JP2000599859A
Authority: JP
Inventors: ヤコブセンアンネ−メッテ; ホーグニールセンキルステン
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2003-07-15
Also published as: NO20013995D0; EP1153120A1; CN1346401A; CA2362926A1; WO2000049133A1; AU2912400A; NO20013995L; DE19907115A1; IL144651A0; KR20010102256A

Abstract

(57)【要約】本発明はグルコノバクター属オキシダン種の高いＤ−ソルボース許容性を有する細菌；その製法；Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースを半連続的に発酵して製造する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、Ｌ−ソルボースを特に工業的に容易に製造できる、Ｌ−ソルボース
の改良された製法に関し、さらに、この方法において特に有利に使用できる特定
の非組み換え細菌に関する。

【０００２】Ｌ−ソルボースは、２−ケト−Ｌ−グルコン酸を製造するための出発物質であ
り、これから工業規模でＬ−アスコルビン酸が合成できる。アスコルビン酸また
はその前駆物質、例えばＬ−ソルボースの、発酵による微生物法を用いた製造は
、所望の製造物を純粋なエナンチオマーの形で製造できるという利点を有する。

【０００３】しかし、Ｌ−ソルボースを製造するために近年利用されている発酵法は、多く
の欠点を有する。これまでに利用されてきた方法の最も深刻な問題点の１つは、
出発物質であるＤ−ソルビトールを約１〜１５質量％の範囲の比較的低い濃度で
しか使用できない点である。そのため、たとえ完全反応であっても、発酵終了後
のＬ−ソルボース濃度は低い。２つ目の深刻な問題点は、反応をバッチワイズで
実施しなければならない点である。これは、各製造バッチにおいて、多工程の最
初に新規接種物を製造しなければならないことを意味する。これは特に、労働の
集約および時間の浪費であり、Ｌ−ソルボースの工業的製造に関する深刻な欠点
である。これらの欠点の主要な理由は、発酵に要する微生物、特にグルコノバク
ター属オキシダン種（Gluconobacter oxydans）の細菌が、工業規模での発酵条
件下、すなわち高濃度Ｄ−ソルビトール、安価な非複合栄養培地、約３〜７の範
囲ｐＨおよびＯ_２０.１〜１.５ｌ／培地１ｌ／ｈの範囲の酸素供給変動という条
件下に、非常に限られた寿命しか有さないことである。さらに、反応条件が理想
的なパラメーターから逸脱すると、特に大きな発酵槽での微生物培養において寿
命が短縮される。広く一般的に使用される微生物は、発酵の最終段階で生存して
いないかまたは増殖ができなくなっている。次段階の反応バッチの理想的な出発
条件を確立するため、すなわち高細胞密度の接種物を製造するために、従って、
従来技術では新しい接種物の培養が必要とされる。

【０００４】ＥＰ−Ａ−０７５８６７９には、２０％濃度のソルビトール培地中で培養でき
るＬ−ソルボース製造Ｇ．オキシダン株Ｇ６２４が記載されている（寄託番号Ｆ
ＥＲＭ−ＢＰ４４１５）。４日間の培養の後、この株は高い収率でＤ−ソルビト
ールをＬ−ソルボースへと変換する。この株はさらに、酵素Ｌ−ソルボースデヒ
ドロゲナーゼおよびＬ−ソルボゾンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを含有
発現構造体により、形質転換される。得られた形質転換体を、Ｄ−ソルビトール
から２−ケト−Ｌ−グルコン酸を製造するために使用する。しかし、発酵に利用
する培地のＤ−ソルビトール濃度は５％濃度でしかない。反応を完了させるため
には、５日間の培養が必要である。総合的に、ＥＰ−Ａ−０７５８６７９に記載
される微生物がＤ−ソルビトール許容（tolerance）ならびにＬ−ソルボース合
成特性のいずれにおいても満足な特性を有さないことを示している。Ｄ−ソルビ
トールの半連続的または連続的変換のために該文献記載の微生物を利用すること
も、奨励できない。

【０００５】従って、本発明の課題は、Ｌ−ソルボースのより効果的な発酵法のための前提
条件を確率することである。

【０００６】この課題は、特に、グルコノバクター属オキシダン種の微生物を利用してＬ−
ソルビトールからＬ−ソルボースを製造するための半連続的発酵法を実施するこ
とにより解決される。さらに、この課題は、グルコノバクター属オキシダン種の
至適なバクテリアを利用することにより解決される。

【０００７】従って、本発明は、まず、Ｄ−ソルビトールに高い許容性を有するグルコノバ
クター属オキシダン種の細菌に関し、この細菌は、低−許容グルコノバクターオ
キシダン株を、逐次的に上昇する初期Ｄ−ソルビトール濃度で培養し、培地中の
高めたＤ−ソルビトール濃度に段階を追って順応させて調整することにより取得
できる。

【０００８】初期Ｄ−ソルビトール濃度が２０〜４０質量％、例えば約２５〜３８質量％ま
たは２８〜３５質量％である培地中で培養できる場合に、高濃度Ｄ−ソルビトー
ルに順応した本発明の“高−許容性”Ｇ．オキシダン株が出現する。２０質量％
を下回るＤ−ソルビトール濃度での増殖も同様に確かに可能である。有利にこの
種の株は、増殖中に培地中のＤ−ソルビトールを高収率、例えば７０〜１００％
でＬ−ソルボースへ発酵させる。

【０００９】例えば、本発明の高−許容性株は、Ｄ−ソルビトール濃度をステップワイズで
上昇させて約５〜１０質量％の初期濃度から２０〜４０質量％、例えば約２５〜
３８質量％または２８〜３５質量％の最終濃度へ調整することにより取得できる
。調整は、例えば以下のようにして実施される：Ｇ．オキシダンの増殖に好適な本質的に公知の無菌液体培地を製造し、その初
期Ｄ−ソルビトール濃度を設定することにより、接種後に例えば約５〜１５質量
％、例えば１０質量％のＤ−ソルビトール含量となるようにする。培地に好適な
調合は、“Industrielle Mikrobiologie”（Industrial Microbiology）、Hans-
Juergen Rehm, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 2nd Edition
p.500に記載されている。例えば、１０％濃度のソルビトール培地（ｐＨ５）を
使用でき、これに、グルコース０.１質量％を含有するまたは含有しない０.５質
量％のイーストエキストラクトを添加する。この培地に、新たに製造した非調整
のＧ．オキシダン株の接種物を接種した。接種した培地を、好気条件下に、例え
ばゆっくりと振とうまたは撹拌しながら約３０〜３７℃で培養する。発酵をさら
に、Ｌ−ソルボースの著しい形成が認められなくなるまで継続する。発酵液体培
地からの分取物を、その間に製造された、それまでの培養工程の培地に含まれる
よりも多いＤ−ソルビトール含量（再接種後）を有する、第２培養工程用の次の
無菌培地へ接種するために使用する。接種物対接種される培養物との割合は、お
よそ１：５〜１：２０の範囲、例えば１：５〜１：１０である。前記方法を繰り
返し、所望の高い初期Ｄ−ソルビトール濃度を有する培地中で増殖する細菌培養
物が得られるまで、段階的にソルビトール濃度を上昇させる。Ｄ−ソルビトール
濃度の段階的な上昇は、濃度の上昇に対する出発株の応答の関数として選択でき
る。さらに、上昇は同一または異なる幅で実施してよい。例えば、Ｄ−ソルビト
ールは、個々の工程で０.５〜３％、例えば１％または２％づつ段階的に上昇さ
せてよい。

【００１０】さらなる実施態様により、高いＤ−ソルビトール許容性に加えて、実質的に不
変、すなわち安定で、高いＬ−ソルボース合成特性を有するＧ．オキシダンの細
菌が製造される。このような特性のプロファイルを有する細菌は、前記のような
高いソルビトール許容細菌を、高濃度のソルビトール（例えば約２５〜３５％濃
度のＤ−ソルビトール培地）でＬ−ソルボース形成が終了するまで反復して培養
することにより獲得できる。

【００１１】本発明の十分“高い”Ｌ−ソルボース合成特性は、約４８時間を超えない時間
、特に約３６時間を超えない時間、例えば約１５〜２５時間または１８〜２２時
間後に、使用するソルビトールの約９０〜１００モル％、例えば９３〜９８モル
％が反応する場合に達成される。合成特性は培養条件の影響を受けるので、前記
基準は、特に以下の標準条件に対応するものである：初期Ｄ−ソルビトール含量
：２８〜３０質量％；培地のｐＨ：４.５〜５.０；好気条件：大気０.５〜１.５
ｌ／培地１ｌ／ｈ；接種物対培地の体積比約１：５〜１：６；培地１ｋｇに対し
て以下のものを含有する標準培地：コーンスチープリカー、５０％乾燥物４.３５４ｇ硫酸アンモニウム０.４９５ｇリン酸ジアンモニウム０.１２４ｇ硫酸マグネシウム７水和物０.０８２ｇ炭酸カルシウム０.４７２ｇ脱泡剤０.１５０ｇ本発明の十分“不変”または“安定”なＬ−ソルボース合成特性は、分取した
液体培地を新しく製造した培地へ連続的に接種することにより培養が反復できる
場合に達成され、この際有利には、接種物対培地の体積比は、約１：５〜１：６
であり、より正確には使用する生産株のＬ−ソルボース合成特性が著しく減少し
ないような体積比である。合成特性は、変換率および反応時間に関して、前記定
義した範囲内で変動する。１〜５回またはより多くの、例えば１０〜５０回また
はより多くの再接種の後であっても、不変の合成特性を有するべきである。

【００１２】本発明の調整方法は、原則的に、全て非−調整Ｇ．オキシダン株を用いて実施
される。しかし、有利には、グルコノバクターオキシダンＮＲＲＬ−Ｂ７２を用
いて調整を行う。この株は、寄託所（Northern Regional Research laboratory,
USA）から自由に入手できる。

【００１３】本発明は、特に、好気条件下でＤ−ソルビトールをＬ−ソルボースに変換でき
る前記方法により調整されたＧ．オキシダン細菌に関し、ここで、細菌はさらに
、非−運動性の単位体、ペアまたは短鎖、グラム陰性桿菌の形で存在し、半固形
ソルビトール−グルコース−イーストエキストラクト−アガー培地中および液体
ソルビトール−コーンスチープリカー培地中で、ｐＨ約３.５〜６で、約２５〜
４０℃の温度で、および約４０質量％までのＤ−ソルビトール濃度で、例えば２
０〜４０質量％、特に約２５〜３５質量％のＤ−ソルビトール濃度で、良好な増
殖を示す。

【００１４】前記調整法で得られる特に有利なＧ．オキシダン株は、ＮＲＲＬ−Ｂ７２を出
発株としたものであり、内部名“２Ｂ_３”として記録され、以下の特性を有する
：１. ２Ｂ_３の形態学的特徴： −グラム染色：陰性 −細胞形状：桿状体 −細胞の大きさ：１〜２μｍ −細胞発生：単位体、ペアまたは短鎖 −運動性：なし −芽胞形成：なし −コロニー：ａ）ミートエキストラクト−ペプトンアガー（ｐＨ７.０）上：接種２日後、時
折、薄く肉眼で認めにくい不明瞭なコロニーが出現する；ｂ）ソルビトール−グルコース−イーストエキストラクトアガー（ｐＨ５）上に
接種した２日後、盛り上がった丸い針先程度の大きさのコロニーが出現する。コ
ロニーは白っぽい黄色で、光沢がある。

【００１５】２.生理学的特徴： −増殖温度：Ｔ＝２５〜４０℃、至適温度３２℃ −ｐＨ範囲：ｐＨ３.５〜６で増殖、至適ｐＨ４.５〜５.０ −好気性 −カタラーゼ：あり −オキシダーゼ：なし −硝酸還元：なし −ゼラチン液化：なし −Ｈ_２Ｓ形成：なし −インドール生成：なし −エタノールの酢酸への酸化：あり −デンプン：加水分解なし −グリセロール、Ｄ−マンニトール、ソルビトール：利用 −乳酸の酸化：なし −酢酸のＣＯ_２およびＨ_２Ｏへの酸化：なし Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(9th edition), p.275ffに記載
されるＧ．オキシダンの根本的特性に合致するように株を製造した。参照文献を
、他の様々な特性の識別証明の標準的方法とする。

【００１６】Ｇ．オキシダン種の細菌に関して記載した前記特性に加えて、本発明はまた、
実質的に同一の特性を有しかつ進歩性を有するＬ−ソルボースの製法（該方法に
ついては別の部分でより詳細に説明する）を実施するのに好適な、該細菌の突然
変異体および変性体に関する。

【００１７】特別に記載した、発明性を有する微生物の変異体および変性体を製造するため
に好適な方法の例は以下の方法であるが、これに限定するものではない：紫外線
またはＸ線照射による突然変異；ニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、メチルメタンスルホネート、ナイトロジェンマ
スタードおよびその類似物のような化学的突然変異原による処理；遺伝子挿入法
、およびバクテリオファージを用いた形質導入。これらの方法は当業者に公知で
あり、例えば以下の文献に記載されている：J. H. Miller, Experiments in Mol
ecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor
, New York (1972)；J. H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, C
old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1991)
；M. Singer and P. Berg, Genes & Genomes, University science Books, Mill
Valley, California (1991)；J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis,
Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)；P. B. kaufman et a
l., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine,
CRC Press, Boca Raton, Florida (1995)；Methods in Plant Molecular Biolog
y and Biotechnology, B. R. Glick and J. E. Thompson, Eds., CRC Press, Bo
ca Raton, Florida (1993)；and P. F. Smith-Keary, Molecular Genetics of E
scherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989）。

【００１８】本発明はまた、Ｌ−ソルボースの半連続的発酵法に関し、該方法は、ａ）グルコノバクター属オキシダン種の細菌を、Ｄ−ソルビトールを含有する第
１培地に接種し、Ｄ−ソルビトール変換が実質的に終了するまで培養し；ｂ）変換終了後、得られた液体培地の大部分から、形成されたＬ−ソルボースを
単離し；ｃ）残りの液体培地と質量比１：４〜１：８で、第２Ｄ−ソルビトール−含有培
地を接種し、Ｄ−ソルビトール変換が実質的に終了するまで培養し；ｄ）変換終了後、形成されたＬ−ソルボースを液体培地から単離することから成り、培地接種後の初期Ｄ−ソルビトール濃度は、いずれの場合も約４
０質量％までである。接種物は例えば、接種物１リットルに対して１〜１０ｇの
バイオマス（乾燥物）に相当する細胞密度を有する。

【００１９】本発明の有利な実施態様において、工程ａ）〜ｃ）を含む発酵サイクルを、十
分量のＬ−ソルボースが形成されるまで、所望の限り反復する。本発明の目的に
関わる発酵サイクルの“所望”の反復回数は、例えば１〜５回またはそれ以上、
例えば１０〜５０回または５０〜２００回である。

【００２０】従来技術と比較して本発明の方法は、生産培地の接種の際に新たな接種物を必
要としない点で特に有利である。むしろ必要な接種物を、より以前の発酵サイク
ルの液体培地から、有利にはＤ−ソルビトール変換終了後に、そのまま分離でき
る。意外なことには、Ｄ−ソルビトール初期濃度が一般的に高くて例えば２５〜
３５質量％であっても、本発明の方法においては複数回数の発酵サイクルを実施
できる。さらに驚くべきことに、各サイクルの反応時間１５〜２５時間、特に２
０時間で、各発酵サイクルにおいて実質的に定量的な収量、すなわち９５〜９８
モル％のＬ−ソルボースが得られる。本発明における接種物対培地の割合であれ
ば、生成バッチは実質的に対数増殖期を有さず、むしろ高い生存率で細菌培養で
きる。

【００２１】発酵温度は、有利に約２５〜４０℃、特に約３２〜３６℃である。特に有利な
発酵温度は、細菌の至適増殖温度（３２℃）と酵素触媒によるＤ−ソルビトール
からＬ−ソルボースへの部分酸化に至適な温度（３６℃）との間の３５℃である
。２５℃を下回る温度および４０℃を上回る温度では、細菌の明瞭な増殖が認め
られない。温度が２５℃を下回る場合には、引き続き加熱することにより増殖お
よび生産性は平常値に復帰し、温度が４０℃を上回る場合には、細胞の増殖およ
び生産性に永久的な損傷を与える。

【００２２】さらに、本発明では、培地１ｌおよび１分あたり、大気０.５〜１.５ｌを供給
して発酵を行うのが有利である。細菌増殖およびＤ−ソルビトールの発酵変換は
、実質的に例えば約２０体積％までの酸素で大気を富裕させる公知の方法により
さらに向上する。酸素の導入は、実質的に圧力を変化させる公知の方法で調整で
きる。攪拌発酵における酸素導入は、使用する撹拌機の攪拌力に影響される。攪
拌力は、培地１ｍ^３に対して０.５〜４ｋＷであるのが有利である。常用される
攪拌装置の種類は、パドル撹拌機である。

【００２３】前記のように、本発明の好適な細菌は、ｐＨ４.５〜５.０で至適増殖を示す。
６〜約７.５までのｐＨでは増殖および生産性が可逆的に阻害され、他方、発酵
中のｐＨは一時的に３.５を下回る値、例えば約３.０を示すこともあるが、処理
バッチのソルビトール酸化に悪影響を及ぼすことも、または次の発酵サイクルの
増殖および生産性に影響することもない。

【００２４】さらに有利には、ソルビトール基質が過度のＤ−グルコース不純物を含有しな
いように処理すべきである、というのも、このような不純物により、発酵中にＤ
−グルコースがＤ−グルコン酸へと酸化されて、本来は生じないはずのｐＨ低下
を招くからである。

【００２５】本発明の発酵で有利に使用される微生物の世代時間は、培地中のソルビトール
濃度の増加に伴って延長する。従って、例えばその他の発酵パラメーターが同一
である場合、１０％濃度の培地よりも２７％濃度の培地の方が３倍長い世代時間
を示す。約３０〜３２％を上回る範囲のソルビトール濃度では、世代時間が急激
に延長する。約４０質量％濃度では増殖が停止する。２７質量％濃度ソルビトー
ル培地において、接種後約１２〜１８時間の範囲で、１：５.６の割合（接種物
対培地）で、細菌は至適細菌濃度に達する。Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボー
スへの酸化は、培地がある細胞密度、例えば終密度３０〜５０％に到達しないと
開始されない。

【００２６】Ｌ−ソルボースを結晶体で単離する場合、使用されるＤ−ソルビトールはＤ−
マンニトール不純物を有さないのが有利である。Ｄ−マンニトールは、酵素によ
りＤ−フルクトースへと変換されるからである。後者は少量でも結晶化法を阻害
する。

【００２７】本発明の別の利点は、発明性を有する製法を、比較的単純で安価な栄養培地ま
たは培養培地を使用して実施できる点である。有利には、この培地は、液体培地
１ｋｇあたり以下のものを有する：ａ）Ｄ−ソルビトール約１００〜３００ｇｂ）コーンスチープリカー（５０％乾燥物）約４〜５ｇｃ）（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４約０.４〜０.６ｇｄ）（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４約０.１〜０.１５ｇｅ）ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ約０.０６〜０.１ｇｆ）ＣａＣＯ_３約０.５〜０.９ｇｇ）活性量の脱泡剤、含有してもしなくてもよい。

【００２８】接種前に培地を自体公知の方法で滅菌処理する。この目的のために、滅菌処理
前に、例えば約７０〜８０％濃度の酢酸を使用して、培地をｐＨ５.５に調整す
る。発酵中、ｐＨを炭酸カルシウムの添加のみにより調整する。実施中の発酵工
程へ、例えば水酸化ナトリウム溶液を添加するような付加的な操作は必要ない。
最初の増殖期において、培地のｐＨは約５.５〜６であり、対数増殖期（細菌の
対数的な増殖）においてｐＨは約４.０〜４.５の範囲に低下する。

【００２９】自体の発酵には全く十分な前記必須成分への補足に関して、必要であれば、本
発明で使用される栄養培地へ別の成分を添加してよい。

【００３０】従って、例えば、１つ以上の別の炭化水素源、例えばデンプン水解物、セルロ
ース水解物、糖蜜；およびアルコール、例えばグリセロールを含有していてもよ
い。

【００３１】さらに、１つ以上の窒素源を付加的に含有してよく、例えばアンモニア、無機
酸または有機酸のアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム；尿素、硝酸
塩、亜硝酸塩および他の窒素−含有材料、例えばアミノ酸、ミートエキストラク
ト、ペプトン、魚粉、魚水解物、カゼイン水解物、大豆水解物、イーストエキス
トラクト、乾燥イースト、エタノールイースト蒸留物、大豆粉末、綿実粉末およ
びその類似物である。

【００３２】さらに、無機塩も付加的に含有されてよく、例えばカリウム塩、カルシウム塩
、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、コバルト塩、亜鉛塩、銅
塩および他の微量元素の塩およびリン酸である。

【００３３】好適な微量元素および増殖因子も同様に、個別でまたは組み合わせて添加して
よく、例えばコエンザイムＡ、パントテン酸、ビオチン、チアミン、リボフラビ
ン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドおよびその他
のビタミン、アミノ酸、例えばシステイン、ナトリウムチオスルフェート、ｐ−
アミノ安息香酸、ナイアシンアミドおよびその類似物である。これらを純粋な形
でまたはこれらの物質を含有する天然材料の形で使用してよい。

【００３４】それぞれの場合に利用される有利な発酵技術は、主にバッチの大きさに依存す
る。バッチが小さい場合には、本発明の工業規模の発酵法を実施するのに、原則
的に好気性振とう培養を実施するのが好適であり、特に水中好気条件が有利であ
る。

【００３５】Ｄ−ソルビトールの変換は慣用の方法、例えば回収サンプルのＨＰＬＣ分析に
より実施される。Ｌ−ソルボース含量の測定に好適な方法では、例えばMerck社
製のＨＰＬＣカラムタイプＯＡＫＣ７.８×３００ｍｍ、移動層０.０５Ｎ硫酸、
流速０.４ｍｌ／ｍｉｎを使用する。

【００３６】形成されるＬ−ソルボースを、連続的にまたはバッチワイズで、慣用の方法に
より単離する。得られた液体培地を、場合により、細胞マスを例えば濾過または
遠心分離により除去した後に、慣用の方法で濃縮する。これは例えば高温、例え
ば５０〜８０℃で、減圧下に、例えば０.０１〜０.１ｂａｒで気化させることに
より実施される。析出した結晶を濾別し、必要であれば再結晶させる。更なる精
製工程、例えば溶剤抽出、クロマトグラフィー、沈殿または塩析を、必要であれ
ば、個別にまたは組み合わせて実施してよい。

【００３７】本発明の特に有利な実施態様を以下の実施例で詳細する。

【００３８】例１：種々の栄養培地の製造：ａ）コーンスチープリカー塩混合物コーンスチープリカー、５０％乾燥物２４０ｇ（約２００ｍｌ）硫酸アンモニウム２２.２ｇリン酸ジアンモニウム６.６ｇ硫酸マグネシウム７水和物３.６ｇ炭酸カルシウム４８.６ｇ培地を製造するために、炭酸カルシウム以外の全ての成分を混合し、２５％濃度
の水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨ約６に調整する。次いで、炭酸カルシウ
ムを添加する。ｐＨを再度測定し、必要であれば６.５に調整する。

【００３９】ｂ）ソルビトール−コーンスチープリカー−塩アガーグルコノバクターオキシダンの実験室での培養を、このアガー傾斜管中の固形培
地上で実施する。発酵槽への第１回接種のための接種培養物を、接種直前にルー
フラスコ中のこの固形培地上で製造する。

【００４０】ソルビトールシロップ、７０質量％乾燥物７５.０ｇ（約５％ソルビトール）
コーンスチープリカー−塩混合物７.５ｇアガー粉末２５.０ｇ脱塩水１０００ｍｌソルビトールシロップ、コーンスチープリカー−塩混合物および水を混合し、６
０℃まで加熱し、濾過する。アガー粉末を次いで、ゆっくりと沸騰した濾液へと
添加する。熱い培地を培養容器へ分注する（３０ｍｌのアガー傾斜管に対して９
ｍｌ、６５０ｍｌのルーフラスコに対して１００ｍｌ）。容器をシールし、１２
１℃で２０分オートクレーブにかける。

【００４１】ｃ）ソルビトール−グルコース−イーストエキストラクトアガー（ｐＨ５）この培地は、発酵中の培養物の純度を試験するために使用する。この培地はＧ
．オキシダンの増殖に好適でありかつ一般的に出現するコンタミした微生物の多
くに不適である。Ｇ．オキシダンは、３２℃で接種後１〜２日で、培地上に、特
徴的な盛り上がった丸い白−黄色の光沢を有する培養物を形成する。

【００４２】ソルビトールシロップ、７０質量％乾燥物７５.０ｇ（約５％ソルビトール）
グルコース１.０ｇイーストエキストラクト５.０ｇアガー粉末１５.０ｇ脱塩水１０００ｍｌソルビトールシロップ、イーストエキストラクトおよびグルコースを混合し、
次いで水を添加する。ｐＨを１２質量％濃度の酢酸を使用して５.３〜５.４に調
整する。アガー粉末を沸騰した混合物へゆっくりと添加する。培地が熱い間にス
クリュートップガラスボトルに分注し、１２１℃で２０分オートクレーブにかけ
る。約５０℃に冷却した後、培地を滅菌プラスチックペトリ皿上に注ぐ。

【００４３】ｄ）ミートエキストラクト−ペプトンアガー（ｐＨ７）この培地は、発酵中の培養物の純度を試験するために使用する。これは一般的
に出現するコンタミした微生物の多くに適した栄養培地である。これはＧ．オキ
シダンの増殖には不適である。３２℃で接種２日後に、Ｇ．オキシダンは肉眼で
は認めにくい不明瞭なコロニーを培地上に形成するにすぎない。通常、全く増殖
しない。

【００４４】ミートエキストラクト３.０ｇペプトン５.０ｇアガー粉末１５.０ｇ脱塩水１０００ｍｌこの培地を前記培地ｃ）と同様に製造するが、ｐＨは７に調整する。

【００４５】ｅ）生産培地２８％濃度のソルビトール培地１０００ｋｇを調合（密度１０９７ｋｇ／ｍ^３）
：コーンスチープリカー、５０％乾燥物４.３５４ｋｇ硫酸アンモニウム０.４９５ｋｇリン酸ジアンモニウム０.１２４ｋｇ硫酸マグネシウム７水和物０.０８２ｋｇ炭酸カルシウム０.４７２ｋｇ脱泡剤０.１５０ｋｇソルビトールシロップ（７０％乾燥物；ソルビトール４００の等量）を、水道
水で希釈し、コーンスチープリカーを添加する。次いで、予め水道水に溶解また
は懸濁した鉱物塩を添加する。次に、７０〜８０％濃度の酢酸を使用してｐＨ５
.５に調整する。最後に脱泡剤を添加する。培地を自体公知の方法で、１４１℃
で２分滅菌する。

【００４６】例２：Ｇ．オキシダンの接種培養物の製造前培養したＧ．オキシダンを、アガー培養物（培地ｂ）の形で５℃で維持する
。無菌の接種ループを用いて１個のアガー培養物を接種することにより、５個の
新しいアガー培養物を３２℃で２日間かけて製造した。８個のこのようなアガー
培養物の細菌を、ルーフラスコの同様の培地へ接種する。このために、アガー培
養物の細菌を、０.９％濃度の滅菌塩化ナトリウム溶液２×５ｍｌ中に懸濁する
。懸濁液をルーフラスコへ移行する。全部で８個の接種済みフラスコを３２℃で
２日培養し、必要であれば５℃に維持する。２個のルーフラスコ中で増殖した細
菌を、０.９％濃度の滅菌塩化ナトリウム溶液２×５０ｍｌ中に懸濁し、滅菌ガ
ラス容器へ移行する。この培養物を、５０ｍ^３発酵槽中のソルビトール発酵のた
めの接種物として利用する。接種物の細胞密度は、１ｍｌあたり約１０^９細菌で
ある。

【００４７】例３：Ｄ−ソルビトールの発酵ａ）第１発酵工程５０ｍ^３の発酵槽を、生産培地（例１培地ｅ）参照）１５０００ｋｇで満たす
が、ソルビトール濃度は僅か１５質量％であり、コーンスリチープリカーおよび
鉱物塩の含量は２倍である。培地を３５℃にする。例２で製造した接種培養物２
００ｍｌを、無菌下に発酵槽へ導入する。発酵槽に１時間あたり１６００〜１８
００ｍ^３の滅菌大気を通気する。発酵槽の圧力は、約１.３ａｔｍである。初期
ｐＨは約５.５〜６.０である。第１工程の発酵時間は約３０〜４０時間である。
発酵終了時のｐＨは約４.０〜４.５に降下している。得られた液体培地は、後処
理後に形成されたＬ−ソルボースを単離してもよく、あるいは第２発酵工程の接
種物として使用してもよい。

【００４８】ｂ）第２発酵工程５０ｍ^３の第２発酵槽を、滅菌生産培地（ソルビトール２８質量％）３３００
０ｋｇで満たし、接種物６４００ｌを接種する（第１発酵工程で得られた培養物
７０００ｋｇに相当）。接種物対生産培地の比は、１：４.７である。次いで、
約１８〜２２時間かけて、ソルビトール濃度が０.１質量％を下回るまで発酵さ
せる。Ｌ−ソルボースの収量は発酵槽１ｍ^３および１時間あたり約８.３ｋｇで
ある。次の発酵サイクルのために、得られた液体培地から６４００ｌの更なる接
種物を分離する。残りの発酵液体培地を後処理してＬ−ソルボースを単離する。

【００４９】例４：Ｌ−ソルボースの単離例３の方法の後に得られる発酵液体培地は、約２５〜２６質量％のＬ−ソルボ
ース、０.１質量％を下回るＤ−ソルビトール、増殖培地（溶液または懸濁液）
の余剰分および１ｌあたり１〜２ｇの細菌マスを含有する。発酵液体培地を約５
０℃に維持することにより、細菌がさらに増殖してソルボースが減少するのを防
ぐ。

【００５０】発酵液体培地を、最初に、常用の流下薄膜型蒸発缶を使用して、６０〜８０℃
および０.０２ｂａｒの圧力で濃縮し、最初の濃縮工程でソルボース濃度を約４
２質量％とする。第２工程では、常用の長管蒸発装置を用いて、５７℃および０
.０２ｂａｒの圧力で、さらに濃縮する。この第２蒸発工程により、濃縮された
Ｌ−ソルボース溶液は過飽和となる。結晶分含量は約３０〜５０体積％である。
このようにして得られた粗結晶懸濁液を、次いで、常用の沈殿容器へ移行する。
その底部において、一定時間後に、実質的に細菌マス不含の非常に高濃度の結晶
懸濁液が形成される。この結晶懸濁液を上清から分別し、遠心し、水で洗浄し、
約９０℃で乾燥し、０.１％を下回る残存湿度含量とする。

【００５１】沈殿容器から得られた母液、洗液および上清を、次いで、場合により別のバッ
チの発酵液体培地と合した後に、前記のようにしてさらに後処理する。

【００５２】使用したＤ−ソルビトールに対する全収量は、後処理後、一般的に８９〜９２
モル％である。この方法で製造された製造物は、Ｌ−アスコルビン酸製造のため
の出発物質となる。

【００５３】例５：グルコノバクターオキシダンの調整ａ）前記培地ｃ）（例１参照）と同様の方法で、Ｄ−ソルビトールを約１０質量
％含有する滅菌アガー不含液体培地（１ｌの倍用容器中８５０ｍｌの総体積）を
製造する。この培地を、新たに製造した非−調整Ｇ．オキシダン株の接種培養物
１５０ｍｌといっしょに接種する。

【００５４】接種培地（ｐＨ５）を好気条件（大気）下に、激しく攪拌（８０ｒｐｍ）しな
がら３２℃でインキュベートする。有意なＬ−ソルボース形成が観察されなくな
るまで、発酵を継続する。発酵液体培地から１５０ｍｌ体積分を回収し、その間
に製造した別の１１質量％のＤ−ソルビトール含量を示す滅菌培地への接種に使
用する。段階的にソルビトール濃度を増加させながら（１％づつ）、約３０質量
％濃度のＤ−ソルビトール培地で増殖する細菌培養物が得られるまで、前記方法
を反復する。

【００５５】ｂ）このようにして得られ、高いソルビトール濃度に順応したＧ．オキシダンを
、次いで、３０質量％濃度のＤ−ソルビトール培地へ連続して接種することによ
り、Ｌ−ソルボース合成特性を最適化する（培地８５０ｍｌに対して接種物１５
０ｍｌ）。使用するソルビトールの約９０〜９８モル％が培養後約２４時間で変
換される場合に、至適合成特性が確立される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B064 AF02 CA02 CB13 CD10 DA10 4B065 AA28X AC14 BA23 BB15 BC02 BC03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】低−許容性グルコノバクターオキシダン株を逐次的に上昇す
る初期Ｄ−ソルビトール濃度で培養し、培地中の高めたＤ−ソルビトール濃度に
段階を追って順応させて調整することにより取得されることを特徴とする、高い
Ｄ−ソルビトール許容性を有するグルコノバクター属オキシダン種の細菌。
【請求項２】Ｄ−ソルビトール濃度を、段階的に上昇させて、約５〜１０
質量％の初濃度から約２５〜３８質量％の終濃度とする、請求項１で得られる細
菌。
【請求項３】実質的に安定なＬ−ソルボース合成特性を示す、請求項１ま
たは２で得られる細菌。
【請求項４】ソルビトール許容細菌が、高濃度のソルビトールで、Ｌ−ソ
ルボースの形成が完了するまで繰り返し培養することにより得られる、請求項３
で得られる細菌。
【請求項５】グルコノバクターオキシダンＮＲＲＬ−Ｂ７２を用いて調整
を行う、請求項１から４までのいずれか１項で得られる細菌。
【請求項６】ａ）好気性条件下に、Ｄ−ソルビトールをＬ−ソルボースへ
と変換し；ｂ）単位体で、ペアで、または短鎖で、非−運動性、グラム陰性、芽胞非形成桿
菌の形を生じ；ｃ）ソルビトール−グルコース−イーストエキストラクト−アガー培地およびソ
ルビトール−コーンスチープリカー培地上で、ｐＨ３.５〜６、温度２５〜４０
℃、約３８質量％のＤ−ソルビトール濃度において、良好な増殖を示す、請求項１から５までのいずれか１項で得られる細菌。
【請求項７】ａ）Ｄ−ソルビトールを含有する第１培地へ、グルコノバク
ターオキシダン種の細菌を接種し、Ｄ−ソルビトール変換が実質的に終了するま
で培養し；ｂ）変換終了後、得られた液体培地の大部分から、形成されたＬ−ソルボースを
単離し；ｃ）液体培地の残りを、１：４〜１：８の質量比で、第２Ｄ−ソルビトール−含
有培地へ接種し、Ｄ−ソルビトール変換が実質的に終了するまで培養し；ｄ）変換終了後、形成されたＬ−ソルボースを液体培地から単離する；ことから成る、Ｌ−ソルボースの半連続的発酵法において、培地を接種した後の
初期Ｄ−ソルビトール濃度が、それぞれの場合に約３８質量％までであることを
特徴とする、Ｌ−ソルボースの半連続的発酵法。
【請求項８】発酵サイクルが、所望のかぎり反復される工程ａ）〜ｃ）を
含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】発酵温度が約２５〜４０℃である、請求項７または８記載の
方法。
【請求項１０】新たに接種される培地のｐＨを約５〜６に調整し、発酵中
にｐＨ約３.５を下回らない、請求項７から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】培地１ｌおよび１分あたり大気０.５〜１.５ｌを供給して
発酵を実施する、請求項７から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】接種後、培地を約１５〜３０時間培養する、請求項７から
１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】培地１ｋｇに対して以下のものを含有する培地を使用する
、請求項７から１２までのいずれか１項記載の方法：ａ）Ｄ−ソルビトール約１００〜３００ｇｂ）コーンスチープリカー（５０％乾燥物）約４〜５ｇｃ）（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４約０.４〜０.６ｇｄ）（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４約０.１〜０.１５ｇｅ）ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ約０.０６〜０.１ｇｆ）ＣａＣＯ_３約０.５〜０.９ｇｇ）活性量の脱泡剤。
【請求項１４】請求項１から６までのいずれか１項記載の細菌を使用する
、請求項７から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】ａ）請求項７から１４までのいずれか１項記載の方法を用
いた発酵により、Ｄ−ソルビトールをＬ−ソルボースに変換し、ｂ）この方法で得られたＬ−ソルボースを、その場でまたは中間単離後に、慣用
の方法により２−ケト−Ｌ−グルコン酸に変換することを特徴とする、２−ケト
−Ｌ−グルコン酸の製法。
【請求項１６】Ｄ−ソルビトールからＬ−アスコルビン酸を製造すること
を特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の細菌の使用。
【請求項１７】請求項１から５までのいずれか１項の記載に特徴付けられ
るグルコノバクター属オキシダン種の細菌を調整することを特徴とする、高いＤ
−ソルビトール許容細菌の製法。