JP2021517806A - 組換え微生物、その製造方法及び補酵素q10の生産における使用 - Google Patents
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Abstract
Description
a.グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を含む親菌株から、クローニングにより、前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を取得する工程と、
b.前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子をベクターに連結し、前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築する工程と、
c.組換えベクターを宿主細胞に導入することで、組換え微生物を得る工程と、
を含む組換え微生物の製造方法を提供する。
上述した本発明の方法において、前記工程aにおける前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子は、SEQ ID NO:1の少なくとも100個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも600個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列、最も好ましくはSEQ ID NO:1の完全なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド配列から得られたものである。前記ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも80%の相同性、より好ましくは少なくとも90%の相同性を有し、好ましくは前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子はSEQ ID NO:1で表されるヌクレオチド配列である。前記親菌株は細菌であり、好ましくはデイノコッカス(Deinococcus)属で、より好ましくはデイノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)、デイノコッカス・デゼルティ(Deinococcus deserti)、デイノコッカス・ゴビエンシス(Deinococcus gobiensis)、デイノコッカス・プロテオリチクス(Deinococcus proteolyticus)からなる群より選ばれたものであり、最も好ましくはデイノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)である。
本発明は、グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を外因的に導入することにより、過酷な環境に対する補酵素Q10生産菌の耐性を改善し、発酵法による補酵素Q10の生産、特に酸化型補酵素Q10の生産に適する組換え微生物を構築する。
本発明者らは、補酵素Q10を生産する微生物を遺伝子工学により改変することによって、補酵素Q10の生産を最適化する。
a.グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を含む親菌株から、クローニングにより、前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を取得する工程と、
b.前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子をベクターに連結し、前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築する工程と、
c.ベクターを宿主細胞に導入するのに適する方法、例えば、形質転換、形質導入、接合伝達及び/又は電気穿孔により、前記宿主細胞が本発明の組換え微生物となるように、グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を含む組換え微生物を構築する工程と、
を含む。
(i) 当業界で公知の方法により、本明細書に開示するDNA配列に基づいて設計したプライマーを用いて、PCRにより目的遺伝子を取得する。
(ii) 制限酵素を用いてゲノムをいくつかの断片に分割した後、標識核酸プローブを用いて、目的遺伝子を選び出す。
(iii) 当業界で公知の方法により、例えばDNAシンセサイザーを用いて目的遺伝子を合成する。
本発明の補酵素Q10を生産する微生物による発酵方法は、上記組換え微生物を用いて発酵生産を行うことを特徴とする。本発明の組換え微生物は、浸透圧、酸化、放射線及び熱等の様々なストレスに対する微生物の耐性を高めることができるため、従来の補酵素Q10の発酵方法に比較して、菌の対数増殖期を延長し、バイオマスのさらなる蓄積を促進するとともに、菌の活発な成長および代謝を維持することができ、補酵素Q10の力価を著しく向上させる。本発明の方法における組換え微生物を用いて補酵素Q10を生産する発酵プロセスの条件は特許文献1を参照してもよい。詳細な方法は以下のとおりである。
前述のように、従来の技術に比較して、本発明の組換え微生物は、酸化型補酵素Q10の収量をさらに改善できる点にも特徴づけている。
斜面培地の組成(100ml)は、酵母エキス 0.8g、FeSO4 0.01g、K2HPO4 0.13g、CoCl2 0.003g、NaCl 0.2g、MnSO4 0.0001g、MgSO4 0.025g、グルコース0.3g、ビタミンB1 0.1μg、ビタミンK 0.1μg、ビタミンA 0.15μg、寒天粉1.5gであり、pHを7.2とした。
シード液の組成(100ml)は、(NH4)2SO4 0.25g、コーンスティープリカー 0.05g、酵母エキス 0.14g、NaCl 0.2g、グルコース 0.3g、K2HPO4 0.05g、KH2PO4 0.05g、MgSO4 0.1g、FeSO4 0.01g、CoCl2 0.003g、MnSO4 0.0001g、CaCO3 0.8g、ビタミンB1 0.1μg、ビタミンK 0.1μg、ビタミンA 0.15μgであり、pHを7.2とした。
発酵液の組成(100ml)は、(NH4)2SO4 0.3g、NaCl 0.28g、グルコース 4g、KH2PO4 0.15g、味の素 0.3g、MgSO4 0.63g、コーンスティープリカー 0.4g、FeSO4 0.12g、CoCl2 0.005g、CaCO3 0.6g、ビタミンB1 0.1μg、ビタミンK 0.1μg、ビタミンA 0.15μgであり、pHを7.2とした。
(試料の調製)
窒素ガス雰囲気下で、発酵液1mlを10ml遠心管に入れ、1mol/LのHCl 180μlを加えて、均一に混合し、3〜5min静置した後、92℃の水浴下で30min加熱した。上清を遠心除去し、浸出液(酢酸エチル:エタノール=5:3)8mlを加え、2時間の浸出を行い、逆相HPLCで分析した。
C18カラム:150mm×4.6mm
移動相:メタノール:イソプロパノール=75:25(体積基準)
流量:1.00ml/min
測定波長:275nm
注入量:40μl
保持時間:12min
(試料の調製)
窒素ガス雰囲気下で、発酵液1mlを10ml遠心管に入れ、1mol/LのHCl 180μlを加えて、均一に混合し、3〜5min静置した後、92℃の水浴下で30min加熱した。上清を遠心除去し、浸出液(酢酸エチル:エタノール=5:3)8mlを加え、2時間の浸出を行い、逆相HPLCで分析した。
カラム:YMC−Pack 250mm×4.6mm
移動相:メタノール/n−ヘキサン=85:15(体積基準)
流量:1mL/min
測定波長:275nm
注入量:40μl
保持時間:還元型補酵素Q10は13.5minであり、酸化型補酵素Q10は22.0minである。
キットの取扱明細書に従って、デイノコッカス・ラディオデュランスのゲノムを抽出した(試薬は、上海生物工程有限公司製Ezupカラム用細菌ゲノムDNA抽出キットに由来するものである)。
ヒートショック法により組換えベクターpBBR1MCS−2−irrEを大腸菌BL21コンピテントセルに形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含むLB平板培地上で成長可能なコロニーを当該LB平板培地において連続培養して、遺伝的に安定な組換え大腸菌を得た。
ヒートショック法により組換えベクターpBBR1MCS−2−G−proPB−irrを大腸菌S17−1コンピテントセルに形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含むLB平板培地上で成長可能なコロニーを当該LB平板培地において連続培養して、組換え大腸菌を得た。組換え大腸菌のゲノムを抽出し、プライマーproPB−F及びirrE−Rを用いてPCR検証を行った結果、約1.2kbの断片を得たことから、proPBプロモーター及びグローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子が組換え大腸菌に導入されたと確認できた。そして、上海生物工程公司によるプラスミドの配列決定検証により、配列がNCBI上の配列に一致すると確認した。
コンピテント大腸菌S17−1を含むチューブを10分間冰浴した後、組換えプラスミドpBBR1MCS−2−G−proPB−irrEを加え、さらに20分間冰浴して、90秒ヒートショックし、5分間冰浴して、600μlのLB液体培地を加えた。37℃で45分間培養した後、5000rpmで5分間遠心し、500μlの上清を除去して、残りの液を、カナマイシンを含む平板培地に塗布した。
10mlの液体培地を含む試験管にロドバクター・スフェロイデスを播種し、30℃、200rpmで50時間培養した。
平板上で約7日培養した組換えロドバクター・スフェロイデスRSP−BEのシングルコロニーを選んで、小試験管の斜面培地に移して培養し、培養済の斜面を滅菌水で洗浄し、菌濃度が細胞108〜109個/mlである菌懸濁液とした。得られた菌懸濁液を2%の播種量でシード培地に播種してシード培養した。ここで、培地は100ml、32℃、回転速度180rpmとし、培養時間は22〜26時間とした。
平板上で約7日培養した組換えロドバクター・スフェロイデスRSP−BEのシングルコロニーを選んで、小試験管の斜面培地に移して培養し、培養済の斜面を滅菌水で洗浄し、菌濃度が細胞108〜109個/mlである菌懸濁液とした。得られた菌懸濁液を2%の播種量でシード培地に播種してシード培養した。ここで、培地は100ml、32℃、回転速度180rpmとし、培養時間は22〜26時間とした。
浸透圧調節型プロモーターproPB入れ替え無しの組換え微生物の構築
実施例1で構築した組換えベクターpBBR1MCS−2−irrEを、浸透圧調節型プロモーターproPBの入れ替えを行わずに、実施例3と同様に大腸菌S17−1コンピテントセルに形質転換し、カナマイシンを含むLB培地上で24時間培養し、組換え大腸菌を得た。組換え大腸菌のプラスミドを抽出し、プライマーirrE−F及びirrE−Rを用いてPCR検証を行い、約1.0kbの断片を得たことから、グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子が大腸菌S17−1に導入されたと確認できた。
補酵素Q10の発酵における組換え微生物の比較
実施例4の発酵方法と同様にロドバクター・スフェロイデスの元の菌株、組換えロドバクター・スフェロイデスRSP−BE及びRSP−CEの発酵を行った。発酵結果を以下に示す。
酸化型補酵素Q10の発酵における組換え微生物の比較
実施例5の発酵方法と同様にロドバクター・スフェロイデスの元の菌株、組換えロドバクター・スフェロイデスRSP−BE及びRSP−CEの発酵を行った。発酵結果を以下に示す。
Claims (13)
- a.グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を含む親菌株から、クローニングにより、前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を取得する工程と、
b.前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子をベクターに連結し、前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築する工程と、
c.前記組換えベクターを宿主細胞に導入することで、組換え微生物を得る工程と、
を含むことを特徴とする、組換え微生物の製造方法。 - 前記工程bは、プロモーター入れ替えにより、前記組換えベクター上の前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターをノックアウトした後、異なる別のプロモーターを挿入し、前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子の発現をさらに調節することを含むことを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物の製造方法。
- 前記工程bにおいて、挿入するプロモーターは誘導型プロモーターであり、好ましくは浸透圧調節型プロモーターproPBであり、
前記浸透圧調節型プロモーターproPBは、SEQ ID NO:2の少なくとも70個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも100個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも150個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列、最も好ましくはSEQ ID NO:2の完全なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド配列から得られたものであり、前記ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:2と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも80%の相同性、より好ましくは少なくとも90%の相同性を有し、好ましくは前記浸透圧調節型プロモーターproPBはSEQ ID NO:2で表されるヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の組換え微生物の製造方法。 - 前記浸透圧調節型プロモーターproPBは、細菌、好ましくはエシェリキア(Escherichia)属、より好ましくは大腸菌(Escherichia coli)から分離されたものであることを特徴とする、請求項3に記載の組換え微生物の製造方法。
- 前記工程bのベクターは、pBR322及びその誘導体、pACYC177、pACYC184及びその誘導体、RK2、pBBR1MCS−2、コスミドベクター及びその誘導体から選ばれたものであり、好ましくはpBBR1MCS−2であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。
- 前記工程aは、SEQ ID NO:1で表されるDNA配列に基づいてプライマーを設計し、前記親菌株から抽出したゲノムDNAをテンプレートとして、PCR法により、前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子を合成することを含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。
- 前記工程aにおける前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子は、SEQ ID NO:1の少なくとも100個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも600個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列、最も好ましくはSEQ ID NO:1の完全なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド配列から得られたものであり、前記ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1と少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも80%の相同性、より好ましくは少なくとも90%の相同性を有し、好ましくは前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子はSEQ ID NO:1で表されるヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。
- 前記親菌株は、細菌であり、好ましくはデイノコッカス(Deinococcus)属で、より好ましくはデイノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)、デイノコッカス・デゼルティ(Deinococcus deserti)、デイノコッカス・ゴビエンシス(Deinococcus gobiensis)、デイノコッカス・プロテオリチクス(Deinococcus proteolyticus)からなる群より選ばれたものであり、最も好ましくはデイノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。
- 前記工程cの導入方法は、形質転換、形質導入、接合伝達及び電気穿孔から選ばれたものであり、前記宿主細胞は、細菌又は真菌から選ばれたものであり、好ましくはロドバクター属の細菌であり、より好ましくはロドバクター・スフェロイデスであり、
好ましくは、前記工程cは、工程bで得られた組換えベクターを大腸菌S17−1コンピテントセルに形質転換した後、接合伝達により宿主細胞に導入することで、遺伝的に安定な組換え微生物を得ることを含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。 - 請求項7に記載のグローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子と、請求項3に記載の浸透圧調節型プロモーターproPBとを含むことを特徴とする、組換えベクター。
- 請求項7に記載の前記グローバルレギュレーターirrEをコードする遺伝子と、請求項3に記載の浸透圧調節型プロモーターproPBとを含むことを特徴とする、組換え微生物。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の方法により組換え微生物を製造し、前記組換え微生物を用いて補酵素Q10を生産することを含むことを特徴とする、補酵素Q10の生産方法。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の方法により組換え微生物を作製し、前記組換え微生物を用いて酸化型補酵素Q10を生産することを含むことを特徴とする、酸化型補酵素Q10の生産方法。
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