CN106520653B - 高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌 - Google Patents

高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，将铜绿假单胞菌PAO1基因组中乳酸脱氢酶基因ldhA敲除，获得PAO1敲除菌株；再将耐辐射异常球菌的全局调控因子IrrE导入ldhA‑中，获得基因工程菌株ldhA‑‑irrE。经过化学剂处理后的菌体接种接种微生物燃料电池后，产生的电压和功率密度分别比野生型菌株提高了46.76％和53.33％，系统达到稳定的时间缩短了28.57％，系统内阻降低了12.66％，聚乙二醇处理下的电压为543，功率密度为207，稳定时间130h，内阻达到420.32。且工程菌株在饥饿条件、高酸碱条件、高盐条件下的存活率较野生型菌株均提高1倍。

Description

高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种用于微生物燃料电池的高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌的构建及其应用。
背景技术
随着能源短缺和环境恶化等问题的加剧，废弃生物质能的开发和利用受到普遍重视。微生物燃料电池(Microbial fuel cells,MFCs)是利用微生物为阳极催化剂将储存在有机物(包括废水中的有机污染物)中的化学能直接转化为电能的新型装置，具有能量转化率高、燃料来源多样、反应条件温和、经济和无污染等优点。2004年，美国宾夕法尼亚州立大学的Logan教授研究小组报道了MFCs在产电和污水处理方面的同步应用情况。之后，MFCs以其具有联产电能与处理废水的双重功效，成为清洁能源生产和废水资源化处理等领域的研究热点。但较低的电功率输出是限制微生物燃料电池实际应用进程的主要瓶颈。
MFCs中，微生物能够氧化各种有机物产生电子并将其传递至胞外，再直接或间接地传递到电极上产生电流。因此，微生物是影响微生物燃料电池产电性能的核心因素。微生物燃料电池在废水资源化处理的实际应用中常常会遇到各种不利于微生物生长的环境条件，例如饥饿条件、酸碱条件、高盐条件等。因此，获得高产电活性和环境胁迫耐受性的微生物对于提高MFCs的功率密度输出，推进MFCs在废水资源化处理方面的实际应用进程具有重要的指导意义。
产电微生物常规的筛选方式有两种：一是从环境中分离得到的纯培养菌株在电化学系统中验证其是否具有电化学活性；另一种是直接在电化学系统中富集，然后进行分离和验证。这种方式在发现高产电活性微生物时具有随机性、概率小、工作量大、耗时长等缺点。与常规筛选方式相比，利用现代分子生物学技术改造菌种具有定向、快速、效果显著等优点，是获得高效产电微生物的更有效的途径。其中，提高微生物胞外的电子释放量(增加胞内电子的产生和减少胞内电子的利用)和强化微生物与电极之间的电子传递效率是菌种改造的主要方向。
P.aeruginosa PAO1是典型的产电微生物模式菌株，碳源被其吸收后，经过糖酵解途径转化生成丙酮酸参与代谢过程，P.aeruginosa中，丙酮酸在乳酸脱氢酶(ldhA)作用下生成D-乳酸(From KEGG)，该过程消耗NADH，间接导致微生物胞外电子释放量的减少。因此，该基因的敲除在提高微生物胞外电子释放量方面表现出潜在的应用价值。大量的文献已经证明，微生物的产电性能和环境耐受性能是受到多个基因共同控制、互相影响的复杂表型。IrrE是来源于D.radiodurans R1的一个全局调控因子，在菌株DNA损伤修复和辐射抗性中发挥着重要作用，并对耐辐射异常球菌的整个代谢网络产生影响。但目前利用该转录因子提高微生物产电活性和环境胁迫耐受性的改造思路尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建同时具备高产电活性和环境胁迫耐受性的工程菌的方法和菌株，为微生物燃料电池中铜绿假单胞菌的分子改造研究提供新思路和新方法。
本发明采用的技术方案是：
一种高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，敲除铜绿假单胞菌PAO1基因组的乳酸脱氢酶基因ldhA，然后导入来源于极端微生物耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)的全局调控因子IrrE。
而且，构建方法如下：
⑴以野生型铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，扩增ldhA在内的1485bp DNA片段，引物增加XmaI、SphI酶切位点；以质粒pBBR1MCS-5为模板扩增庆大抗性基因Gmr，引物增加PstI酶切位点；
⑵纯化回收ldhA片段，过夜连接T-Vector pMDTM19(simple)，构建质粒pMD19T-ldhA；
⑶PstI单酶切pMD19T-ldhA，回收大片段，与Gmr过夜连接，构建质粒pMD19T-ldhA::Gmr；
⑷XmaI、SphI双酶切pMD19T-ldhA::Gmr回收小片段，XmaI、SphI双酶切pEX100T，回收大片段，过夜连接，构建铜绿假单胞菌敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr；
⑸通过接合的方式将敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr转入铜绿假单胞菌PAO1，根据敲除菌株带有庆大霉素抗性而不带有氨苄抗性，并且不具有蔗糖敏感性筛选出阳性转化子，进行基因组的PCR验证，验证结果符合预期的转化子即为ldhA敲除菌株ldhA-；
⑹以耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans R1基因组DNA为模板，扩增出irrE基因，切胶回收irrE基因，酶切纯化后与同样经酶切纯化的表达质粒pHERD20T连接，获得重组表达质粒pHERD20T-irrE；
⑺将构建的重组表达质粒pHERD20T-irrE经电转化导入宿主菌ldhA-感受态细胞，经200～400μg/mL羧苄青霉素筛选得到阳性转化子，重提质粒进行PCR、双酶切和测序分析，，验证结果符合预期的转化子即为高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌。
而且，所述基因工程菌株耐受饥饿的时间0～6天；所述基因工程菌株耐受pH的范围为3.0～11.0；所述基因工程菌株耐受NaCl浓度范围为2％～6％。
而且，菌体制备时的接种量为2％～10％(V/V)；诱导温度30℃～37℃；诱导时菌体的OD600＝0.8～1.0；诱导剂L-阿拉伯糖浓度0.5％～3.0％；接种MFCs的接种液浓度OD600＝1.0～3.0；用于菌体处理的化学剂有聚乙二醇、氨基三乙酸、青霉素G、CaCl2。
高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌在微生物燃料电池中的应用。
而且，应用步骤如下：
⑴菌种活化：将基因工程菌ldhA--irrE接种到LB斜面上，于培养箱内过夜静置培养，从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜振荡培养，含质粒的菌株培养基中需要添加200～400μg/mL羧苄青霉素；
⑵诱导培养：将上述培养液以2％～10％(V/V)的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，30℃～37℃振荡培养至OD600为0.8～1.0时，向含质粒的菌株培养基中添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体的对数期后期，含质粒的菌株培养基中需要添加200～400μg/mL羧苄青霉素；
⑶产电活性检测：诱导培养液经5000r/min离心5min后收集菌体，菌体经化学剂在37℃、200r/min条件下振荡处理后，用阳极液重悬制备成OD600≈1.0～3.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，观察输出电压的变化情况，并待系统达到稳定后测定功率密度和计算系统内阻；
其中，所用阳极液配比L-1为100mM PBS缓冲溶液980mL，缓冲溶液成分为：NH4Cl0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O 2.452g，蒸馏水1000mL，、维生素溶液10mL、矿物质溶液10mL、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2，实验中，含质粒的菌株阳极液中添加200～400μg/mL羧苄青霉素和0.5％～3％的L-阿拉伯糖。
而且，步骤(3)中使用的化学剂为聚乙二醇、其中，处理条件为：0～12％聚乙二醇处理0～2h。
而且，步骤(3)中使用的化学剂为氨基三乙酸、其中，处理条件为：0～50mM氨基三乙酸处理0～75min。
而且，步骤(3)中使用的化学剂为青霉素G和CaCl2，处理条件为：0～100μg/mL青霉素G处理0～90min；0～150mM CaCl2处理0～60min。
本发明具有的有益效果：
本发明采用分子生物学手段敲除铜绿假单胞菌PAO1基因组的乳酸脱氢酶基因ldhA，然后导入来源于极端微生物耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)的全局调控因子IrrE。获得的工程菌株一方面具有明显提高的产电活性。经过化学剂处理后的菌体接种接种微生物燃料电池后，产生的电压和功率密度分别比野生型菌株提高了46.76％和53.33％，系统达到稳定的时间缩短了28.57％，系统内阻降低了12.66％。另一方面，工程菌株对饥饿条件、高酸碱条件和高盐条件等环境胁迫条件的耐受性明显增强。这种同时具有高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌的获得为微生物燃料电池在废水资源化处理方面的应用提供了重要的实验材料，其改造思路为高效产电微生物的获得提供了一种新思想和新方法。
附图说明
图1为铜绿假单胞菌ldhA基因敲除菌株ldhA-基因组PCR验证图；
其中，M:DL5000DNA Marker；1,3:PAO1基因组中ldhA,Gmr基因的PCR验证；2,4:PAO1基因组中ldhA,Gmr基因的PCR验证.
图2为重组表达质粒pHERD20T-irrE构建流程图；
图3为重组表达质粒pHERD20T-irrE菌液PCR及双酶切验证图；
其中，M:DL10000DNA Marker；1:pHERD20T双酶切；2:菌液PCR；3:重组质粒双酶切
图4为基因工程菌株ldhA--irrE中的IrrE蛋白表达图；
其中，M:蛋白Marker；1:野生型菌株全菌蛋白；2:ldhA--irrE菌株全菌蛋白；3:野生型菌株纯化后的蛋白；4:ldhA--irrE菌株纯化后的蛋白
图5为铜绿假单胞菌在持续饥饿条件下的存活情况；
其中，●：野生型菌株；○：ldhA--irrE菌株；
图6为铜绿假单胞菌对不同环境胁迫条件的耐受性；
其中，野生型菌株ldhA--irrE菌株
图6-1:pH＝3.0；图6-2:pH＝11.0；图6-3:2％NaCl；图6-4:6％NaCl；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明的生物材料的来源说明：
1.质粒来源：pHERD20T：购自宝生物工程(大连)有限公司(CHN)，pBBR1MCS-5,pEX100T：本实验室保存
2.耐辐射异常球菌基因组模板来源：自行通过北京庄盟国际生物基因科技有限公司购买的基因组提取试剂盒提取。
3.各种限制性内切酶、连接酶：购自宝生物工程(大连)有限公司(CHN)
实施例1
本实施例说明构建铜绿假单胞菌ldhA基因敲除菌株ldhA-。具体过程包括：
1、设计带有酶切位点的上下游引物
ldhA-F：5’TCCCCCCGGGCGGCATGGACGACTACCTGA 3’
ldhA-R：5’ACATGCATGCTCAGGCCCGGACCCGAT 3’
GmR-F：5’AACTGCAGATGAACCTGAATCGCCAGCG 3’
GmR-R：5’AACTGCAGTAGGTGGCGGTACTTGGGTCG 3’
以野生型铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，扩增ldhA在内的1485bp DNA片段(以下简称ldhA)；以质粒pBBR1MCS-5为模板扩增庆大抗性基因Gmr(850bp)，反应体系见表1。
表1 PCR反应体系
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s、64℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。
3、胶回收ldhA片段，16℃与T-Vector pMDTM19(Simple)过夜连接，热激法将连接产物导入E.coli JM109，提取质粒pMD19T–ldhA，进行PCR验证及Xma I、Sph I双酶切验证，选择验证结果符合预期的阳性转化子测序，测序结果符合预期的即为pMD19T–ldhA。
4、PstI单酶切pMD19T-ldhA，回收大片段，16℃与Gmr过夜连接，热激法将连接产物导入E.coli JM109，提取质粒pMD19T-ldhA::Gmr，进行PCR验证及Xma I、Sph I双酶切验证，选择验证结果符合预期的阳性转化子测序，测序结果符合预期的即为pMD19T-ldhA::Gmr。
5、XmaI、SphI双酶切pMD19T-ldhA::Gmr回收小片段，XmaI、SphI双酶切pEX100T，回收大片段，16℃过夜连接，热激法将连接产物导入E.coli S17-1，提取质粒pEX100T-ldhA::Gmr，进行PCR验证及Xma I、Sph I双酶切验证，结果符合预期的即为铜绿假单胞菌敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr。
6、通过接合的方式将敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr转入铜绿假单胞菌PAO1，根据敲除菌株带有庆大霉素抗性而不带有氨苄抗性，并且不具有蔗糖敏感性筛选出阳性转化子，进行基因组PCR验证，验证结果符合预期的转化子(如图1所示)，即为ldhA敲除菌株(简称ldhA-)。
实施例2
本实施例说明构建重组表达质粒pHERD20T-irrE。具体过程包括：
1、设计合成带有酶切位点的上下游引物(下游引物带有his标签)
上游引物irrE-F：5’-CCGGAATTCGTGCCCAGTGCCAACGTCAG-3’
下游引物irrE-R：5’-CCCAAGCTTGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGTGCAGCGTCCTGC-3’
2、以耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans R1基因组为模板，PCR扩增目的片段，反应体系见表2。
表2 PCR反应体系
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s、58℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。
PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收大小为982bp的片段，通过HindIII和EcoR I进行双酶切，纯化，将回收目的片段与同样通过Hind III和EcoR I双酶切后纯化回收的载体pHERD20T连接(如图2所示)，然后通过热激法将重组表达质粒pHERD20T-irrE导入大肠杆菌中，涂布于含有300μg/mL羧苄青霉素的LB平板上，37℃过夜静置培养，挑取转化子进行PCR验证及双酶切验证，选择验证结果符合预期的阳性转化子测序，测序结果符合预期的即为重组表达质粒pHERD20T-irrE。
实施例3
本实施例说明构建基因工程菌株ldhA--irrE，具体过程包括：
重提测序正确的pHERD20T-irrE，通过电击转化法导入铜绿假单胞菌ldhA敲除菌株感受态细胞中，之后涂布于含有300μg/mL羧苄青霉素的LB平板上37℃过夜静置培养，挑取阳性转化子进行基因水平验证(PCR和双酶切)，选取基因水平验证正确的转化子收集菌体，经超声破碎、His-tag蛋白纯化后得到蛋白样品，加入蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳，进行蛋白水平验证(如图4所示)，验证符合预期的即为铜绿假单胞菌基因工程菌株ldhA--irrE。
实施例4
本实施例说明构建成功的基因工程菌ldhA--irrE与野生型菌株产电能力比较。
具体过程包括：
1、菌种活化：将基因工程菌ldhA--irrE接种到LB斜面上，于培养箱内过夜静置培养，从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜振荡培养。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素。
2、诱导培养：将上述培养液以4％的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，30℃振荡培养至OD600为0.8时，向含质粒的菌株培养基中添加1.0％L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体生长对数期的后期。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素。
3、产电：上述培养液经5000r/min离心5min收集的菌体，菌体经100mM CaCl2溶液，在37℃、200r/min条件下振荡处理30min。悬浮液经5000r/min离心5min重新收集菌体，用阳极液重悬后制备成OD600≈1.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，观察输出电压的变化情况并待系统达到稳定后测定功率密度和计算系统内阻。其中，所用阳极液配比(L-1)为100mM PBS缓冲溶液(NH4Cl 0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸馏水1000mL)980mL、维生素溶液10mL(0.22μm的滤膜过滤灭菌后加入)、矿物质溶液10mL、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。实验中，含质粒的菌株阳极液中添加终浓度为300μg/mL的羧苄青霉素和1％L-阿拉伯糖作为诱导剂。
由表3可知，基因工程菌接种的MFCs产生的电压和功率密度分别比野生型菌株提高了70％和78.57％，系统达到稳定的时间缩短了20％，系统内阻降低了16.96％。
表3野生型菌株基因工程菌株MFCs产电性能对比
菌株 电压(mV) 功率密度(mW/m<sup>2</sup>) 稳定时间(h) 内阻(Ω)
P.aeruginosa PAO1 200.00 50.40 250 602.34
ldhA<sup>-</sup>-irrE 340.00 90.00 200 500.20
注：此产电结果所用电阻为1000Ω。
实验证明，通过本发明的基因工程菌的构建方法，构建得到的铜绿假单胞菌基因工程菌株ldhA--irrE较野生型菌株产电性能大幅提高。
实施例5
本实施例说明构建成功的基因工程菌ldhA--irrE与野生型菌株产电能力比较。具体过程包括：
1、菌种活化：将基因工程菌ldhA--irrE接种到LB斜面上，于培养箱内过夜静置培养，从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜振荡培养。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素。
2、诱导培养：将上述培养液以8％的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，34℃振荡培养至OD600为1.0时，向含质粒的菌株培养基中添加2.5％L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体生长对数期的中期。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素。
3、产电：上述培养液经5000r/min离心5min收集的菌体，菌体经70μg/mL的青霉素G，在37℃、200r/min条件下振荡处理1h。悬浮液经5000r/min离心5min收集菌体，用阳极液重悬后制备成OD600≈2.5的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，观察输出电压的变化情况并待系统达到稳定后测定功率密度和计算系统内阻。其中，所用阳极液配比(L-1)为100mM PBS缓冲溶液(NH4Cl 0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸馏水1000mL)980mL、维生素溶液10mL(0.22μm的滤膜过滤灭菌后加入)、矿物质溶液10mL、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。实验中，含质粒的菌株阳极液中添加300μg/mL羧苄青霉素和1％L-阿拉伯糖。
由表4可知，基因工程菌接种的MFCs产生的电压和功率密度分别比野生型菌株提高了62.27％和51.73％，系统达到稳定的时间缩短了20％，系统内阻降低了15.32％。
表4野生型菌株基因工程菌株MFCs产电性能对比
菌株 电压(mV) 功率密度(mW/m<sup>2</sup>) 稳定时间(h) 内阻(Ω)
P.aeruginosa PAO1 220 66.5 225 562.14
ldhA<sup>-</sup>-irrE 357 100.9 180 476.00
注：此产电结果所用电阻为1000Ω。
实验证明，通过本发明的基因工程菌的构建方法，构建得到的铜绿假单胞菌基因工程菌株ldhA--irrE较野生型菌株产电性能大幅提高。
实施例6
本实施例说明构建成功的基因工程菌ldhA--irrE与野生型菌株产电能力比较。具体过程包括：
1、菌种活化：将基因工程菌ldhA--irrE接种到LB斜面上，于培养箱内过夜静置培养，从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜振荡培养。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素。
2、诱导培养：将上述培养液以6％的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养至OD600为0.9时，向含质粒的菌株培养基中添加3.0％L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体生长对数期的后期。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素。
3、产电：上述培养液经5000r/min离心5min收集菌体，菌体经30mM氨基三乙酸，在37℃、200r/min条件下振荡处理30min。悬浮液经5000r/min离心5min重新收集菌体，用阳极液重悬后制备成OD600≈2.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，观察输出电压的变化情况并待系统达到稳定后测定功率密度和计算系统内阻。其中，所用阳极液配比(L-1)为100mM PBS缓冲溶液(NH4Cl 0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸馏水1000mL)980mL、维生素溶液10mL(0.22μm的滤膜过滤灭菌后加入)、矿物质溶液10mL、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。实验中，含质粒的菌株阳极液中添加300μg/mL羧苄青霉素和1％L-阿拉伯糖。
由表5可知，基因工程菌接种的MFCs产生的电压和功率密度分别比野生型菌株提高了42.19％和49.91％，系统达到稳定的时间缩短了21％，系统内阻降低了16.85％。
表5野生型菌株基因工程菌株MFCs产电性能对比
菌株 电压(mV) 功率密度(mW/m<sup>2</sup>) 稳定时间(h) 内阻(Ω)
P.aeruginosa PAO1 320 108.6 200 520.31
ldhA<sup>-</sup>-irrE 455 162.8 158 432.66
注：此产电结果所用电阻为1000Ω。
实验证明，通过本发明的基因工程菌的构建方法，构建得到的铜绿假单胞菌基因工程菌株ldhA--irrE较野生型菌株产电性能大幅提高。
实施例7
本实施例说明构建成功的基因工程菌ldhA--irrE与野生型菌株产电能力比较。具体过程包括：
1、菌种活化：将基因工程菌ldhA--irrE接种到LB斜面上，于培养箱内过夜静置培养，从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜振荡培养。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素。
2、诱导培养：将上述培养液以10％的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养至OD600为1.0时，向含质粒的菌株培养基中添加1％L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体生长对数期的后期。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素。
3、产电：上述培养液经5000r/min离心5min收集菌体，菌体经8％聚乙二醇，在37℃、200r/min条件下振荡处理50min，悬浮液经5000r/min离心5min重新收集菌体，用阳极液重悬后制备成OD600≈3.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，观察输出电压的变化情况并待系统达到稳定后测定功率密度和计算系统内阻。其中，所用阳极液配比(L-1)为100mM PBS缓冲溶液(NH4Cl 0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸馏水1000mL)980mL、维生素溶液10mL(0.22μm的滤膜过滤灭菌后加入)、矿物质溶液10mL、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。实验中，含质粒的菌株阳极液中添加300μg/mL羧苄青霉素和1％L-阿拉伯糖。
由表6可知，基因工程菌接种的MFCs产生的电压和功率密度分别比野生型菌株提高了46.76％和53.33％，系统达到稳定的时间缩短了28.57％，系统内阻降低了12.66％。
表6野生型菌株基因工程菌株MFCs产电性能对比
菌株 电压(mV) 功率密度(mW/m<sup>2</sup>) 稳定时间(h) 内阻(Ω)
P.aeruginosa PAO1 370 135 182 481.27
ldhA<sup>-</sup>-irrE 543 207 130 420.32
注：此产电结果所用电阻为1000Ω。
实验证明，通过本发明的基因工程菌的构建方法，构建得到的铜绿假单胞菌基因工程菌株ldhA--irrE较野生型菌株产电性能大幅提高。
实施例8
本实施例说明构建成功的基因工程菌ldhA--irrE与野生型菌株环境胁迫耐受能力分析，具体过程包括：
1.菌种活化：将基因工程菌ldhA--irrE接种到LB斜面上，于培养箱内过夜静置培养，从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜振荡培养。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加终浓度为300μg/mL的300μg/mL羧苄青霉素。
2.诱导培养：将1所述培养液以2％的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养至OD600为0.8时，向含质粒的菌株培养基中添加1％L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体生长对数期的后期(饥饿条件耐受能力检测实验培养至稳定期)。实验中，含质粒的菌株培养基中需要添加终浓度为300μg/mL的羧苄青霉素。
3.耐饥饿能力检测：取诱导培养至稳定期初期的培养液1mL，梯度稀释至适当浓度涂布LB平板，活菌计数(此时定义为耐饥饿第0天)，37℃200r/min继续振荡培养，每隔一定时间取样测定菌体存活率。
4.耐酸碱能力检测：诱导培养至对数生长期后期的培养液经5000r/min离心5min，收集的菌体用PBS(KH2PO413.6g、NaOH 2.8g、蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2)充分洗涤3次，并重悬于等体积的pH值分别为3.0和11.0的以葡萄糖为唯一碳源的基本无机盐培养基中，每隔一定时间取样测定存活率。
5.耐盐能力检测：诱导培养至对数生长期后期的培养液经5000r/min离心5min，收集的菌体用PBS(KH2PO413.6g、NaOH 2.8g、蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2)充分洗涤3次，并重悬于等体积分别含有2％和6％的NaCl的以葡萄糖为唯一碳源的基本无机盐培养基中，每隔一定时间取样测定菌体存活率。
实验结果如图5、图6所示，基因工程菌株在饥饿条件、高酸碱条件、高盐条件下的存活率较野生型菌株均提高1倍。证明通过本发明的基因工程菌的构建方法，构建得到的铜绿假单胞菌基因工程菌株ldhA--irrE较野生型菌株环境胁迫耐受能力大幅提高。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌
<130> 2016-12-02
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> ldhA-F
<400> 1
tccccccggg cggcatggac gactacctga 30
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> ldhA-R
<400> 2
acatgcatgc tcaggcccgg acccgat 27
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> GmR-F
<400> 3
aactgcagat gaacctgaat cgccagcg 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> GmR-R
<400> 4
aactgcagta ggtggcggta cttgggtcg 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 上游引物irrE-F
<400> 5
ccggaattcg tgcccagtgc caacgtcag 29
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 下游引物irrE-R
<400> 6
cccaagcttg tggtggtggt ggtggtgctg tgcagcgtcc tgc 43

Claims (9)

1.一种高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，其特征在于：敲除铜绿假单胞菌PAO1基因组的乳酸脱氢酶基因ldhA，然后导入来源于极端微生物耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans的全局调控因子IrrE。
2.根据权利要求1所述的高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，其特征在于：构建方法如下：
⑴以野生型铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，扩增ldhA在内的1485bp DNA片段，引物增加XmaI、SphI酶切位点；以质粒pBBR1MCS-5为模板扩增庆大抗性基因Gmr，引物增加PstI酶切位点；
⑵纯化回收ldhA片段，过夜连接T-Vector pMDTM19(simple)，构建质粒pMD19T-ldhA；
⑶PstI单酶切pMD19T-ldhA，回收大片段，与Gmr过夜连接，构建质粒pMD19T-ldhA::Gmr；
⑷XmaI、SphI双酶切pMD19T-ldhA::Gmr回收小片段，XmaI、SphI双酶切pEX100T，回收大片段，过夜连接，构建铜绿假单胞菌敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr；
⑸通过接合的方式将敲除质粒pEX100T-ldhA::Gmr转入铜绿假单胞菌PAO1，根据敲除菌株带有庆大霉素抗性而不带有氨苄抗性，并且不具有蔗糖敏感性筛选出阳性转化子，进行基因组的PCR验证，验证结果符合预期的转化子即为ldhA敲除菌株ldhA-；
⑹以耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans R1基因组DNA为模板，扩增出irrE基因，切胶回收irrE基因，酶切纯化后与同样经酶切纯化的表达质粒pHERD20T连接，获得重组表达质粒pHERD20T-irrE；
⑺将构建的重组表达质粒pHERD20T-irrE经电转化导入宿主菌ldhA-感受态细胞，经300μg/mL羧苄青霉素筛选得到阳性转化子，重提质粒进行PCR、双酶切和测序分析，验证结果符合预期的转化子即为高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌ldhA--irrE。
3.根据权利要求1所述的高产电活性和环境胁迫耐受性的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌株耐受饥饿的时间0～6天；所述基因工程菌株耐受pH的范围为3.0～11.0；所述基因工程菌株耐受NaCl浓度范围为2％～6％。
4.权利要求1所述基因工程菌株在微生物燃料电池中的应用。
5.权利要求4所述基因工程菌株在微生物燃料电池中的应用，其特征在于：步骤如下：
⑴菌种活化：将基因工程菌ldhA--irrE接种到LB斜面上，于培养箱内过夜静置培养，从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜振荡培养，含质粒的菌株培养基中需要添加200～400μg/mL羧苄青霉素；
⑵诱导培养：将上述培养液以2％～10％(V/V)的接种量接种到装有50mLLB液体培养基的三角瓶中，30℃～37℃振荡培养至OD600为0.8～1.0时，向含质粒的菌株培养基中添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体的对数期后期，含质粒的菌株培养基中需要添加200～400μg/mL羧苄青霉素；
⑶产电活性检测：诱导培养液经5000r/min离心5min后收集菌体，菌体经化学剂在37℃、200r/min条件下振荡处理后，用阳极液重悬制备成OD600≈1.0～3.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，观察输出电压的变化情况，并待系统达到稳定后测定功率密度和计算系统内阻。
6.权利要求5所述基因工程菌株在微生物燃料电池中的应用，其特征在于：步骤(3)中使用的化学剂为聚乙二醇、其中，处理条件为：0～12％聚乙二醇处理0～2h。
7.权利要求5所述基因工程菌株在微生物燃料电池中的应用，其特征在于：步骤(3)中使用的化学剂为氨基三乙酸、其中，处理条件为：0～50mM氨基三乙酸处理0～75min。
8.权利要求5所述基因工程菌株在微生物燃料电池中的应用，其特征在于：步骤(3)中使用的化学剂为青霉素G和CaCl2，处理条件为：0～100μg/mL青霉素G处理0～90min；0～150mM CaCl2处理0～60min。
9.权利要求5所述基因工程菌株在微生物燃料电池中的应用，其特征在于：所述所用阳极液配比为100mM PBS缓冲溶液980mL，缓冲溶液成分为L-1：NH4Cl 0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O 2.452g，蒸馏水1000mL，维生素溶液10mL、矿物质溶液10mL、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2，实验中，含质粒的菌株阳极液中添加200～400μg/mL羧苄青霉素和0.5％～3％的L-阿拉伯糖。
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