CN103215301A - 一种用于微生物燃料电池的产电基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物燃料电池产电基因工程菌的构建、菌株及其应用。通过分子生物学手段在铜绿假单胞菌PAO1中异源表达大肠杆菌中NAD+从头合成途径与回补途径中共同的关键基因nadE，获得产电量高的基因工程菌株铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）PA-nadE，应用于微生物燃料电池领域的发展，并且为产电铜绿假单胞菌的基因工程研究奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物燃料电池产电基因工程菌的构建、菌株及其应用。
背景技术
随着全球人口和经济规模的不断增长，能源与环境问题成为21世纪人类面临的最严重挑战。我们必须开发一个全新的能量平台，在确保产生足够能量的同时降低CO2的释放问题。微生物燃料电池的问世让我们看到了曙光。微生物燃料电池因其降解有机污染物的同时收获电能的突出特点受到广泛关注，可应用于污水处理、能源再生、生物传感、生物修复等方面。
微生物燃料电池（Microbial Fuel Cells，MFC）是一种利用微生物分解代谢各种生物质燃料，将储存在燃料中的化学能直接转化为电能的装置，在生物质转化中具有突出的应用前景。铜绿假单胞菌是已被应用在微生物燃料电池中的电化学效率高的细菌之一。Rabaey等以铜绿假单胞菌为阳极微生物，以铁氰化钾为阴极电子受体，功率密度达到3.1～4.2W/m2，研究表明假单胞菌可以通过自身分泌物或代谢产物作为电子传递介体。之后发现铜绿假单胞菌可以产生的电子传递体-绿脓菌素，所以铜绿假单胞菌可以更有效的将电子从细胞传递到电子受体阳极上。因此，铜绿假单胞菌应用于微生物燃料电池上会有更加优良的电化学效率。另外，铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)是一株模式微生物菌株，由于其遗传操作系统简单清晰，基因操作工具全面，是常用于基因克隆、表达的革兰氏阴性菌株之一。
产电微生物催化消耗碳源，转移释放的电子到微生物燃料电池的阳极是通过细胞外电子传递机制（EET）。2011年，Yang-Chun Yong研究了过表达铜绿假单胞菌的群体效应机制的相关基因可以提高菌体的电子传递效率。T. Zhang 构建了大肠杆菌基因工程菌来提高EET，以提高其产电能力。然而，微生物内低的电量输出却是微生物燃料电池产能的一个主要瓶颈。2012年，Yang-Chun Yong研究表明增加微生物本身可释放电子量和产电能力是一个关键，而提高NAD（H）的水平可以增加微生物自身的产电子能力。Sorci, L., D通过研究提出nadE在NAD+的合成中起着关键的作用，其过表达可以提高2倍的NAD（H）水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的用于微生物燃料电池的产电基因工程菌的构建方法和菌株，为微生物燃料电池铜绿假单胞菌的基因工程研究奠定基础。
本发明的另一个目的是提供上述基因工程菌的应用。
为实现本发明的技术目的，本发明以铜绿假单胞菌PAO1为出发菌，重组表达NAD+从头合成途径与回补途径中共同的关键基因nadE，获得产电基因工程菌，重组菌株的NAD+合成途径如图1所示。具体步骤如下：
1）以大肠杆菌基因组DNA为模板，纯化扩增出nadE基因，经T-A克隆插入到T载体pMD19-T Simple相应的位点之间、经测序，比对正确，获得中间重组质粒pMD19-T-nadE；
2）以中间重组质粒pMD19-T-nadE为模板，纯化扩增出nadE基因，插入到表达质粒pBBR1MCS-5相应的酶切位点之间、连接获得重组质粒pBBR1MCS-nadE；
3）将构建重组质粒pBBR1MCS-nadE经电击转化导入出发菌铜绿假单胞菌PAO1的感受态，经50 μg/mL的庆大霉素筛选得到阳性转化子即为产电基因工程菌。
上述的构建方法构建得到的一株产电基因工程菌菌株，其分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA-nadE，已于2013年1月20日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号编号为：CCTCC NO：M 2013028。
所述产电基因工程菌菌株的应用，其特征在于包括如下步骤：
1）菌种活化：将产电基因工程菌的菌液划线到含有庆大霉素的LB平板，挑取平板上长出的单菌落到LB培养基的试管，在37℃下培养过夜；其中，所述的LB培养基为：蛋白胨 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，pH=7.0，如果需要固体培养基，则另加入15 g·L-1琼脂粉；含有庆大霉素的平板是在LB培养基中加入50μg/mL庆大霉素和15 g·L-1琼脂配置而成；
2）种子培养：将步骤1）活化的菌种按照体积比2%的接种量接入LB培养基中，在37℃有氧培养菌体OD600至0.43时加入终浓度0.69mM的IPTG在30℃情况下诱导至OD600=6；
3）微生物燃料电池中产电：将步骤2）中的种子液按接种量体积比85%转接至微生物燃料电池阳极液中，之后将20ml混合液（混合液是菌液与阳极液的混合液）接入单室微生物燃料电池中，产电；其中，阳极液为：葡萄糖10 g/L，PBS缓冲液50mmol/L。
有益效果：采用基因工程手段将大肠杆菌NAD+从头合成途径与回补途径中共同的关键基因nadE在铜绿假单胞中进行重组表达，获得产电量高的基因工程菌株，应用于微生物燃料电池领域的发展，并且为产电铜绿假单胞菌的基因工程研究奠定了良好的基础。
附图说明
图1 重组菌株NAD+从头合成途径与回补途径图。
图2 NAD合成酶基因nadE PCR扩增产物的电泳图。
图3 中间重组质粒pMD19-T-nadE构建图谱。
图4 重组质粒pBBR1MCS-nadE的构建图谱。
图5 中间重组质粒pMD19-T-nadE的目的基因PCR鉴定图。
图6 重组质粒pBBR1MCS-nadE的目的基因PCR鉴定图。
图7 重组质粒pBBR1MCS-nadE的BsiWⅠ和PvuⅠ双酶切鉴定图，其中：1：pBBR1MCS-nadE，2~5：pBBR1MCS-nadE双酶切，M：DL15000 DNAMarker。
图 8 NADH标准曲线。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来对本发明作详细说明，这些实施例仅用于说明本发明，其对本发明没有任何方式的限制。
以下实施例中所使用的技术，包括PCR、酶切等分子生物学手段，以及菌株培养、转化、保存等，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、菌株等，除非本说明特别说明，均为本领域的研究与技术人员可以通过公共途径获得的。
本发明的生物材料的来源的说明：
1、质粒来源：
（1） pMD19-T Simple：购自TaKaRa公司；
（2）pBBR1MCS-5：购自Biovector公司；
2、基因组模板来源：自行通过TIANGEN公司购买的基因组提取试剂盒提取。
3、引物的设计及合成：自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。
实施例1
本实施例说明构建包含目的基因nadE的中间质粒pMD19-T-nadE。其过程包括：
1、设计合成上游、下游引物，
Primer1上游引物：5’-CGCTGTCTGGAGGGTTCAATGAC -3’
Primer2下游引物：5’- CGCACAATCCAATATGTGC -3’。
2、以大肠杆菌E.coliDH5α基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94 °C预变性3min；94 °C 30s，52 °C 30s，72 °C 70s，72 °C 5 min，30个循环。PCR产物经0.8%的琼脂糖电泳检测（图2），回收828bp的片段，通过Genray公司的试剂盒纯化扩增出的nadE基因（Gene ID: 946946）后，根据购买的PMD19-T Simple质粒操作说明书进行T-A克隆,将目的基nadE连接到测序载体PMD19-T Simple质粒，之后按常规的化学转化方法导入大肠杆菌中，涂布于含10 μg/mL氨苄霉素的LB平板上37℃培养，挑取平板上单菌落转化子进行PCR验证见图3，选择正确的转化子测序，比对正确。
实施例2
本实施例说明构建包含表达基因nadE重组质粒pBBR1MCS-nadE。其过程为基因nadE的重组质粒pBBR1MCS-nadE的构建：
1、合成带有HindIII酶切位点的上游引物和带有BamHI酶切位点的下游引物：
Primer3上游引物：5’- CCCAAGCTTATGACATTGCAACAAC -3’（下划线部分为HindIII酶切位点）；
Primer4下游引物：5’- CGCGGATCCTTACTTTTTCCAGAAATC -3（下划线部分为BamHI酶切位点）；
2、以pMD19-T-nadE为模板，PCR扩增目的基因nadE（Gene ID: 946946），反应条件为：95℃，10 min；(95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 70s，30个循环)；72℃，10 min。通过Genray公司的纯化试剂盒纯化扩增出的带酶切位点的nadE基因后，与经同样酶切位点酶切的pBBR1MCS-5表达质粒连接，经电击转化导入出发菌铜绿假单胞菌PAO1的感受态，感受态及电转条件参照Biorad公司电转仪说明书，之后涂布于50μg/mL庆大霉素的LB平板上37℃培养，提取平板上单菌落阳性转化子，经PCR验证和酶切验证结果见图6、7表明，重组质粒pBBR1MCS-nadE构建成功，获得的产电基因工程菌。
实施例3
本实施例说明构建的产电基因工程菌的全细胞蛋白液的NAD+合成酶的酶活。
1、蛋白浓度的测定
蛋白浓度采用Bradford（1976）的方法测定。
2、NADH标准曲线的制作。
用50mmol/L Tris-HCl缓冲液中将NADH稀释成8个不同浓度梯度（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.1mM），分别测定340nm的吸光度值，然后以OD340值为纵坐标，NADH浓度为横坐标，绘制标准曲线（见图8）。
3、NAD+合成酶的酶活测定
1）菌种活化：划线保藏的产电基因工程菌PA-nadE的菌液到含有50μg/mL庆大霉素的LB平板，挑取平板上长出的单菌落到5mL LB培养基(pH=7.0)的试管，在37℃下培养过夜；
其中，所述的LB培养基为：蛋白胨 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1， pH=7.0。含有庆大霉素的LB平板的配方为：蛋白胨 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，庆大霉素50μg/mL，15 g·L-1琼脂。
2）种子培养：按照体积比2%的接种量接入LB培养基中，在37℃有氧培养菌体OD600至0.43时加入终浓度0.69mM的IPTG在30℃情况下诱导诱导5.7h和10.2h时，取菌样制备粗酶液；
3）酶活测定：总体积100ul，50mmol/L Tris-HCl（pH8.5）缓冲液中含有2 mM ATP、1 mM nicotinic acid dinucleotide(NaAD)、 20 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM NH4Cl、0.2 mg/ml BSA，加40ul酶溶液在37°C反应5min，加入等体积的0.1 M 焦磷酸钠缓冲液（包含0.5%（w/v）盐酸氨基脲）终止反应，再加入1%乙醇，加2ul的乙醇脱氢酶，取上清在340nm测吸光率。结果见表1。由表1中数据可以看出，重组 P. aeruginosa PA-nadE中NAD合成酶的酶活较出发菌株P. aeruginosa PAO1的酶活高出约3倍。
表1
实施例4
本实施例说明构建的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA-nadE在微生物燃料电池中的应用。
以出发菌株P.aeruginosa PAO1作为对照，考察两者在微生物燃料电池中的产电能力。
1）菌种活化：将保藏的产电基因工程菌PA-nadE的菌液划线到含有50μg/mL庆大霉素的LB平板，挑取平板上长出的单菌落到5mL LB培养基(pH=7.0)的试管，在37℃下培养过夜；
其中，所述的LB培养基为：蛋白胨 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1。固体培养基中另加入15 g·L-1琼脂粉；含有庆大霉素的LB平板是在LB培养基中加入50μg/mL庆大霉素和15 g·L-1琼脂配置而成；
2）种子培养：按照体积比2%的接种量接入LB培养基中，在37℃有氧培养菌体OD600至0.43时加入终浓度0.69mM的IPTG在30℃情况下诱导至OD600=6；
3）微生物燃料电池中产电：按接种量体积比85%转接至微生物燃料电池阳极液中，之后将20ml混合液接入单室微生物燃料电池中，待产电稳定时测定产电能力；其中，阳极液为：葡萄糖10 g/L，PBS缓冲液50mmol/L。
微生物燃料电池中各种参数的测定结果见表2。
表2
| 菌株 | 电压(mV) | 功率密度(mW/m2) |
| P. aeruginosa PAO1 | 200.03 | 57.16 |
| P. aeruginosa PA-nadE | 525.75 | 394.87 |
注：此产电结果所用电阻为1000Ω。
实验证明，通过本发明的基因工程菌的构建方法，构建得到的重组铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA-nadE较出发菌株P.aeruginosa PAO1产电性能大幅提高。
实施例5
本实施例说明构建的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA-nadE在微生物燃料电池中的应用。
以出发菌株P.aeruginosa PAO1作为对照，考察两者在微生物燃料电池中的产电能力。
1）菌种活化：划线保藏的产电基因工程菌PA-nadE的菌液到含有50μg/mL庆大霉素的LB平板，挑取平板上长出的单菌落到5mL LB培养基(pH=7.0)的试管，在37℃下培养过夜；
其中，所述的LB培养基为：蛋白胨 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1。固体培养基中另加入15 g·L-1琼脂粉；含有庆大霉素的LB平板是在LB培养基中加入50μg/mL庆大霉素和15 g·L-1琼脂配置而成；
2）种子培养：按照体积比2%的接种量接入LB培养基中，在37℃有氧培养菌体OD600至0.43时加入终浓度0.69mM的IPTG在30℃情况下诱导至OD600=6；
3）微生物燃料电池中产电性能：按接种量体积比85%转接至微生物燃料电池阳极液中，之后将20ml混合液接入单室微生物燃料电池中，待产电稳定时测定产电能力；其中，阳极液为：葡萄糖10 g/L，PBS缓冲液50mmol/L。
微生物燃料电池中各种参数的测定结果见表3。
表3
| 菌株 | 电压(mV) | 功率密度(mW/m2) |
| P. aeruginosa PAO1 | 251.8 | 90.58 |
| P. aeruginosa PA-nadE | 580.86 | 482.00 |
注：此产电结果所用电阻为1000Ω。
实验证明，通过本发明的基因工程菌的构建方法，构建得到的重组铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA-nadE较出发菌株P.aeruginosa PAO1产电性能大幅提高。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京工业大学
<120> 一种用于微生物燃料电池的产电基因工程菌及其构建方法和应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgctgtctgg agggttcaat gac 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcacaatcc aatatgtgc 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccaagctta tgacattgca acaac 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcggatcct tactttttcc agaaatc 27
Claims (4)
1.一种产电基因工程菌菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1）以大肠杆菌基因组DNA为模板，纯化扩增出nadE基因，经T-A克隆插入到T载体pMD19-T Simple相应的位点之间、经测序，比对正确，获得中间重组质粒pMD19-T-nadE；
2）以中间重组质粒pMD19-T-nadE为模板，纯化扩增出nadE基因，插入到表达质粒pBBR1MCS-5相应的酶切位点之间、连接获得重组质粒pBBR1MCS-nadE；
3）将构建重组质粒pBBR1MCS-nadE经电击转化导入出发菌铜绿假单胞菌PAO1的感受态，经50 μg/mL的庆大霉素筛选得到的阳性转化子即为产电基因工程菌。
2.权利要求1所述的构建方法构建得到的一株产电基因工程菌菌株，其分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA-nadE，已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号编号为：CCTCC NO：M 2013028。
3.权利要求2所述产电基因工程菌菌株在微生物燃料电池中的应用。
4.根据权利要求3所述的产电基因工程菌菌株在微生物燃料电池中的应用，其特征在于包括如下步骤：
1）菌种活化：将产电基因工程菌的菌液划线到含有庆大霉素的LB平板，挑取平板上长出的单菌落到LB培养基的试管，在37℃下培养过夜；其中，所述的LB培养基为：蛋白胨 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，pH=7.0；含有庆大霉素的LB平板是在LB培养基中加入50μg/mL庆大霉素和15 g·L-1琼脂配置而成；
2）种子培养：将步骤1）活化的菌种按照体积比2%的接种量接入LB培养基中，在37℃有氧培养菌体OD600至0.43时加入终浓度0.69mM的IPTG在30℃情况下诱导至OD600=6；
3）微生物燃料电池中产电：将步骤2）中的种子液按接种量体积比85%转接至微生物燃料电池阳极液中，然后将20ml混合液接入单室微生物燃料电池中，产电；其中，阳极液为：葡萄糖10 g/L，PBS缓冲液50mmol/L。
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