CN108611306A - 一种研究慢生根瘤菌的基因功能的方法 - Google Patents

一种研究慢生根瘤菌的基因功能的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum USDA110)的基因的功能的研究方法。本发明提出一种利用铜绿假单胞菌作为宿主菌的原核表达体系。所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）。本发明直接在背景机制研究比较清楚的铜绿假单胞菌中进行慢生根瘤菌有关胞内信使环鸟苷二磷酸（c‑di‑GMP）合成和降解基因功能的表型研究，观察铜绿假单胞菌性状上变化，初步得到目标基因的功能，提出一种新的原核表达体系。将慢生根瘤菌的基因在该体系中表达，考察菌落形态，运动性，胞外多糖产生和生物膜的形成量，初步得到慢生根瘤菌基因的功能，节约了时间和耗材成本，加快实验研究进度，有利于慢生根瘤菌基因功能的研究。

Description

一种研究慢生根瘤菌的基因功能的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体地，涉及一种慢生根瘤菌胞内信使环鸟苷二磷酸合成与降解基因的功能的研究方法。
背景技术
慢生根瘤菌能够和植物共生，形成有效结瘤，合成氮源，供植物生长利用（张艳华,王惠, 王岩等. 辽宁省慢生根瘤菌的系统发育多样性[J]. 江苏农业科学, 2016, 第44卷(7):67-70.）。但是由于慢生根瘤菌生长周期长，相对于其他细菌几分钟一代，慢生根瘤菌则需要长达8-10小时才能繁殖一代（固氮菌的生产应用现状及研究方向）。实验周期较长，筛选功能基因耗时大。有关慢生根瘤菌USDA110 胞内信使环鸟环鸟苷二磷酸合成与降解基因，胞外多糖，以及生物固氮三者之间的联系还没有人研究。
传统方法研究慢生根瘤菌基因功能，都是直接在根瘤菌中验证，但是这种方法耗时较长。另外，在根瘤菌中，有很多基因行使同一种功能（冗余基因），使用基因敲除的方法，无法达到目的( Per S S, Krol E, Skotnicka D, et al. Cyclic Di-GMP RegulatesMultiple Cellular Functions in the Symbiotic AlphaproteobacteriumSinorhizobium meliloti[J].)。因为敲除了某个基因，另一个基因会回补此基因的功能。只有把行使这一功能的基因全敲除，菌株才会发生表型变化。但对于研究者来说有非常困难。
由于没有合适的研究方法，严重的制约了慢生根瘤菌基因功能的研究。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种直接在背景机制研究比较清楚的铜绿假单胞菌中研究基因的功能的方法，提出一种新的原核表达体系。
本发明的第一个目的是提供一种利用铜绿假单胞菌作为宿主菌的原核表达体系。
本发明的第二个目的是提供一种研究基因功能的方法。
本发明的第三个目的是提供一种铜绿假单胞菌的感受态细胞的制备方法。
本发明的第四个目的是提供所述制备方法制备得到的铜绿假单胞菌的感受态细胞。
本发明的第五个目的是提供铜绿假单胞菌、所述原核表达体系、所述方法、或所述感受态细胞在研究慢生根瘤菌的基因功能中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种利用铜绿假单胞菌的原核表达体系，以铜绿假单胞菌作为宿主菌进行原核表达。
优选地，所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO1。
一种研究基因功能的方法，将目标待测基因在铜绿假单胞菌表达，研究基因的功能
所述的方法，包括以下步骤：
S1. 克隆待测基因；
S2. 将待测基因连入原核表达载体，得到重组原核表达载体；
S3. 制备铜绿假单胞菌的感受态细胞；
S4. 将重组原核表达载体转化铜绿假单胞菌的感受态细胞；
S5. 筛选阳性重组菌株进行培养，同时培养转入空载质粒的的铜绿假单胞菌；
S6. 将阳性重组菌株与转入空载质粒的铜绿假单胞菌进行比较，分析待测基因的功能。
优选地，步骤S4中采用电击法转化铜绿假单胞菌的感受态细胞。
更优选地，进行电击法转化的过程包括以下步骤：
S1.将携带有慢生根瘤菌基因的质粒 DNA加到PAO1感受态中，混合均匀；
S2.转移到电击杯中，脉冲18kV/cm，电压：1800V，电阻200 Ω，电容：25μF进行电击；
S3.电击之后的菌液，迅速向电击杯中加入无抗生素的LB液体培养基，转移到无菌离心管中复苏，之后吸取菌液涂到含有抗性筛选的LB固体培养基平板中。
优选地，步骤S1中，质粒 DNA 与 PAO1感受态细胞的用量比为1:1（w/t）。
优选地，步骤S3中，复苏为1~10h。
更优选地，步骤S3中，复苏为1h。
优选地，步骤S3中无抗生素的LB液体培养基与步骤S1中PAO1感受态细胞的体积比为3～10:1。
更优选地，步骤S3中无抗生素的LB液体培养基与步骤S1中PAO1感受态细胞的体积比为5:1.
最优选地，进行电击法转化的过程包括以下步骤：
S1.将携带有慢生根瘤菌基因的质粒 DNA加到PAO1感受态中，混合均匀；
S2.转移到电击杯中，脉冲18kV/cm，电压：1800V，电阻200 Ω，电容：25μF进行电击；
S3.电击之后的菌液，迅速向电击杯中加入无抗生素的LB液体培养基，转移到无菌离心管中复苏1h，之后吸取菌液涂到含有抗性筛选的LB固体培养基中；
其中，步骤S1中，质粒 DNA 与 PAO1感受态细胞的用量比为1:1（w/t）；
步骤S3中无抗生素的LB液体培养基与步骤S1中PAO1感受态细胞的体积比为5:1。
如果S1中的质粒DNA 太少可延长时间，增加目的菌株中质粒的拷贝数。
一种铜绿假单胞菌的感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.将-80℃保存的菌株铜绿假单胞菌PAO1在LB固体培养基上培养，长出单菌落后转入液体培养基培养，摇菌8～10 h；
S2. 取菌液，温离心去上清；
S3. 用8～12%的蔗糖溶液重悬菌体，并离心去上清；
S4. 重复S3两次；
S5. 加入10%甘油溶液，进行-80℃保存。
优选地，室温制作感受态细胞，菌液无绿色代谢产物产生前结束摇菌开始进行步骤S2，感受态细胞先做现用；
优选地，在OD600 0.6～0.8时结束摇菌开始进行步骤S2全程冰上进行。
所述制备方法制备得到的铜绿假单胞菌的感受态细胞，也属于本发明的保护范围。
铜绿假单胞菌、所述原核表达体系、所述方法或所述感受态细胞在研究慢生根瘤菌的基因功能中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明上述的利用铜绿假单胞菌作为原核表达体系来研究慢生根瘤菌的基因功能的方法，可以便捷、快速地初筛慢生根瘤菌的基因功能，如慢生根瘤菌胞内信使环鸟苷二磷酸合成或降解相关基因（例如：bll5123，其核苷酸序列Gene ID：1051644，即NC_004463.1:c5683715-5682342 Bradyrhizobium japonicum USDA 110 chromosome,complete genome ），利用菌落形态，胞外多糖，运动性和生物膜的形成量，初步得到出慢生根瘤菌基因的功能。
本发明具有如下有益效果：
本发明直接在背景机制研究比较清楚的铜绿假单胞菌中做基因的表型研究，观察铜绿假单胞菌性状上变化，初步得到目标基因的功能，提出一种新的原核表达体系。将慢生根瘤菌的基因在该体系中表达，考察菌落形态，运动性和生物膜的形成量，初步得到出慢生根瘤菌基因的功能，节约了时间和耗材成本，加快实验研究进度，有利于慢生根瘤菌基因功能的研究。
附图说明
图1为重组PAO1菌株菌落形态；过表达空载质粒PAO1-pBBR1MCS-5菌株（左图）和过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123（右图）PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123菌株在LB固体培养平板上的菌落形态；比例尺左图右图同为0.5mm。
图2为重组PAO1菌株生长曲线；过表达空载质粒PAO1-pBBR1MCS-5菌株和过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123 PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123菌株在LB液体培养基中培养3天，记录OD600变化。
图3为重组PAO1菌株胞外多糖产量；过表达空载质粒PAO1-pBBR1MCS-5菌株（左图）和过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123（右图）PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123菌株在含有0.04%的刚果红LB固体培养基表面的菌落形态。
图4为重组PAO1菌株运动性；表达空载质粒PAO1-pBBR1MCS-5菌株（左图）和过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123（右图）PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123菌株在含有0.3%琼脂的半固体培养基表面培养48h结果。
图5为重组PAO1菌株生物膜产量；表达空载质粒PAO1-pBBR1MCS-5菌株（左图）和过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123（右图）PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123菌株在96孔板静置12h数据分析结果。
图6为当在铜绿假单胞菌PAO1中过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123，与过表达空载质粒PAO1-pBBR1MCS-5菌株相比，能够使PAO1菌株表面变得不平滑，细菌由游动状态变为停滞状态，聚集在一起，产生较多的生物膜，从而固定在生物或非生物表面，为下一步侵染生物做准备。
图7为重组DH5ɑ菌株菌落形态；过表达空载质粒DH5ɑ-pBBR1MCS-5菌株（左图）和过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123（右图）DH5ɑ-pBBR1MCS-5-bll5123菌株同时在LB固体培养平板上的菌落形态；比例尺为1mm。
图8为重组DH5ɑ菌株胞外多糖产量；过表达空载质粒DH5ɑ-pBBR1MCS-5菌株（左图）和过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123（右图）DH5ɑ-pBBR1MCS-5-bll5123菌株同时在含有0.04%的刚果红LB固体培养基表面的菌落。
图9为重组DH5ɑ菌株运动性；表达空载质粒DH5ɑ-pBBR1MCS-5菌株（左图）和过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123（右图）DH5ɑ-pBBR1MCS-5-bll5123菌株同时在含有0.3%琼脂的半固体培养基表面培养48h结果。
图10为重组DH5ɑ菌株生物膜产量；表达空载质粒DH5ɑ-pBBR1MCS-5菌株（左图）和过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123（右图）DH5ɑ-pBBR1MCS-5-bll5123菌株在96孔板静置12h数据分析结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1铜绿假单胞菌PAO1电击感受态细胞的制备
铜绿假单胞菌PAO1电击感受态细胞的制备，包括以下步骤：
（1）铜绿假单胞菌PAO1过夜摇8h，取6mL做感受态，分装到3个2mL灭菌的离心管中，室温10000rpm，2min，去上清；
（2）用过滤除菌的10%蔗糖重悬，洗一次，室温10000rpm，2min，去上清；
（3）重复2步骤两次；
（4）用10%甘油浓缩成100μl，用于电击构建好的质粒。
实施例2 构建慢生根瘤菌USDA110 bll5123基因过表达菌株及菌落表型观察
1、DNA的提取
利用北京全式金生物技术有限公司基因组试剂盒（EE161-01），提取慢生根瘤菌USDA110全基因组。
2、bll5123基因的扩增
利用NEB高保真Q5聚合酶，进行下列PCR扩增，得到含有慢生根瘤菌USDA110 bll5123(Gene ID：1051644，即NC_004463.1:c5683715-5682342 Bradyrhizobium japonicum USDA110 chromosome, complete genome)基因的产物，将扩增产物连接至克隆载体转化至大肠杆菌进行培养后测序，保留阳性菌株，提取质粒。
根据NCBI记载USDA110 bll5123的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，为：
GTGTCCGCGCGTATCCTGGTTGTCGATGACGTTCCTGCCAACGTCAAACTCCTCGAGGCCCGGCTTTCCGCCGAATATTTCGACGTGATGACCGCCTCGAACGGCACCGAGGCGCTGGCGATCTCTCGCCGCGCCGAATGCGACATCATCCTGCTCGACGTGATGATGCCCGACATGGACGGCTTCGAGGTCTGCCGCCGTCTGAAGACCGATCCGGCGACGCACCACATCCCCGTCGTGATGGTGACGGCGCTCGACAGCCCGTCCGACCGCAACCGCGGGCTGGAAGCGGGCGCCGACGATTTCCTGACCAAACCCGTCTCCGACGTCGTGCTGATCGCACGCGTGCGCTCGCTGACGCGGCTGAAGATGATGACCGACGAGCTGCGCATGCGCGCCATCACCTCGCTCGAGATCGGCATGCAGGCGCCGGAGCGCACTGCGGTCGCCGACACCGGCAAGGGCGGCCGCATCCTGCTGGTCGACGACCGCCAGTCCTCCTATGAGCGGCTGGCGAGCCTGCTCGCCGCCGAGCACACCGTCGATGTCGAGCCGAACCCGACCGAAGCGCTGTTCCACGCCGCCGAGGGCAATTACGACCTGCTGATCGTCTCGCTCGACCTCAACAATTTCGATGGCCTCAGGCTGTGCAGCCAGGCGCGCTCGCTGGAGCGCACGCGCCACGTGCCGATCCTGGCGATCGCGGACCCCGAGAATTCGACGCGGCTGCTCCGCGGCCTCGAGATCGGCGTCAACGACTATCTGCTGCGACCAATCGACAAGACCGAACTCTTGGCCCGCGCCCGCACCCAGATCCGCCGCCGCCGCTACACCGATCATCTGCGCGACAACGTGCAGAACTCGATCGAGATGGCGATCACCGACACGCTCACCGGCCTGCACAATCGCCGCTACATGGAGAGCCATCTGGCGACGCTCGCCGAGCAGGCCGCAACCCGCGGCAAGCCGCTCGCGCTGATGATCCTGGACATCGACTATTTCAAGTCGATCAACGACAATTACGGCCACGATGCCGGCGACGACGTGCTGCGCGAATTCGCGGTGCGCGTGCGCAAGTCGATCCGCGGCATTGATCTCGCCTGCCGCTATGGCGGCGAGGAGTTCGTCATCGTGATGCCGGAGACCGATCTCCACGTCGCCGGCATGGTCGCCGAGCGCCTGCGCCGCTCGATCGCGGGCGAGCCGTTCGCGATCCACAAGGGCACCAAGCGCATCGAGGTCACGATCTCGATCGGCCTCACAACGCTGGAGCAGAAGGGCGAGGCGGTCACCGACGTCCTCAAGCGCGCCGACACCGCGCTGTACCGCGCCAAGCACGACGGCCGCAACCGGGTGGTGTCGCAGGCGGCGTGA
PCR扩增体系为：98℃ 30s；98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1min，34个循环；72℃ 5min；12℃，∞。
PCR扩增引物为：
上游引物为AAAACTGCAGAGTGTCCGCGCGTATCCTGGTTG；
下游引物为GCGGATCCTCAATGATGATGATGATGATGCGCCGCCTGCGAC。
3、重组原核表达载体的构建
用Pst I和BamH I 内切酶同时切割步骤2制备的产物质粒和pBBR1MCS-5原核表达载体质粒。然后用T4连接酶连接。
4、重组原核表达载体转化铜绿假单胞菌PAO1
（1）连接产物2μl直接电击制作的实施例1制备的铜绿假单胞菌PAO1电击感受态细胞中，
S1.构建的慢生根瘤菌质粒DNA 100ng加到制备的100μL PAO1感受态中，混合均匀；
S2.取全部，转移到0.1cm的电击杯中，脉冲18kV/cm（参数：电压：1800V，电阻200 Ω，电容：25uF,）；
S3.电击之后的菌液，迅速转移到500ml不加抗生素的LB液体培养基中37℃，200rpm复苏1h，之后取100μL 涂到含有50ug/ml庆大霉素的LB固体培养基平板中。
（2）加入500μl没有抗生素的LB液体培养基中摇菌1小时。
（3）取100μl涂在有庆大霉素抗生素的LB固体培养基上，置37℃培养箱中培养。
得到过表达了慢生根瘤菌bll5123基因的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5。
5、结果
附图1显示，过表达了慢生根瘤菌USDA110bll5123基因的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5相比，能够直接影响PAO1菌落的表型，菌落形态发生了变化，菌落表面会有好多沟壑状凸起，表面粗糙且菌落不光滑（Starkey M, Hickman JH,Ma L, Zhang N, De Long S, Hinz A, et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants have adaptations that likely promote persistence in thecystic fibrosis lung. J Bacteriol. 2009;3492–503. https://doi.org/10.1128/JB.00119-09 PMID: 19329647。）在PAO1中，增加c-di-GMP能够出现小、皱缩的菌落表型（Malone JG, Jaeger T, Spangler C, Ritz D, Spang A, Arrieumerlou C, et al.YfiBNR mediates cyclic diGMP dependent small colony variant formation andpersistence in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Pathog. 2010;），初步判断在PAO1中表达bll5123也能得到这种表型。即bll5123可能和合成c-di-GMP相关。
实施例3 生长曲线的测定
1、将实施例2中构建好的转化子PAO1-pBBR1MCS-5和PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123过夜摇菌8h（LB 庆大霉素50μg/mL），然后按照1:100的比例加入LB 庆大霉素50μg/mL液体中，取200μl加到测生长曲线的平板中，用测生长曲线的仪器检测，每组8个重复，重复三次实验结果。
2、结果
通过生长曲线测定，图2显示过表达了慢生根瘤菌USDA110 bll5123的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123 和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5生长速率没有影响，后面的实验，排除了生长速率的影响。
实施例4 刚果红实验分析
1、步骤
将实施例2中构建好的转化子PAO1-pBBR1MCS-5和PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123过夜培养，然后按照1:100稀释加入到LB加相应抗生素的液体培养基中。吸取2μl垂直滴到含有0.04%的刚果红LB固体培养基表面（已加入相应抗生素）。
2、结果
图3显示36小时后，过表达了慢生根瘤菌USDA110胞内信使环鸟苷二磷酸合成基因bll5123能够更好的结合培养基中刚果红成分。由于刚果红是结合细菌胞外多糖（EPSII ）成分的一种染料(Friedman L, Kolter R. Genes involved in matrix formation inPseudomonas aeruginosa PA14 biofilms[J]. Molecular Microbiology, 2004,51(3):675-690.)，从而说明了，在PAO1中过表达了的bll5123能够增加胞外多糖的产生。而胞外多糖的产生，受到c-di-GMP的调控。从而进一步推测bll5123可能合成c-di-GMP，进而调控胞外多糖的产生。
实施例5 运动性分析
1、步骤
将实施例2中构建好的转化子PAO1-pBBR1MCS-5和PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123过夜培养，然后按照1:100稀释加入到LB加相应抗生素的液体培养基中。吸取2μl垂直滴到含有0.3%琼脂的半固体培养基(10 g/Ltryptone, 5 g l/L NaCl )表面（已加入相应抗生素），至于37°培养箱静置培养48h。
2、结果
图4显示，16小时后，发现过表达了慢生根瘤菌USDA110胞内信使环鸟苷二磷酸合成的基因bll5123，运动性与对照相比，明显降低。并且在运动性平板上发现菌落颜色发生改变，不同于对照菌株。在PAO1中，高浓度c-di-GMP能够使PAO1由游离态转变为固着态，从而聚集在细胞表面，降低运动性，进行侵染(Lo Y, Shen L, Chang C, et al. Regulation ofMotility and Phenazine Pigment Production by FliA Is Cyclic-di-GMP Dependentin Pseudomonas aeruginosa PAO1[J]. PLOS ONE, 2016,11(5):e155397.)。与表到了bll5123，产生了高浓度c-di-GMP结论相符。
实施例6 生物膜分析
1、步骤
将实施例2构建的转化子PAO1-pBBR1MCS-5和PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123过夜培养，然后按照1:100稀释加入到M63（0.2% D-glucose；1 mM MgSO4；0.5% casamino acids）加入庆大霉素的培养基中，吸取200μl 加到96孔板中，每个组6个重复，重复三次实验，于37℃培养箱中静置培养12小时；用排枪垂直插入96孔板底部，除去没有结合在96孔板壁上的细胞；用ddH2O洗一次，除去结合不充分的细胞；加入已灭菌0.4%的结晶紫，用于结合细胞的膜成分，静置培养20min；用ddH2O洗3次，除去没有结合在膜上多余的结晶紫；放烘箱烘干，40min，加入75%的酒精溶解与细胞膜成分结合的结晶紫，静置20min，测OD570。
2、结果
图5显示，通过实验分析，过表达了慢生根瘤菌USDA110 bll5123的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll5123 和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5相比，能够明显增加铜绿假单胞菌PAO1生物膜的形成。
当在铜绿假单胞菌PAO1中过表达USDA110环鸟苷二磷酸合成基因bll5123，与过表达空载质粒PAO1-pBBR1MCS-5菌株相比，能够使PAO1菌株表面变得不平滑，细菌由游动状态变为停滞状态，聚集在一起，产生较多的生物膜，从而固定在生物或非生物表面，为下一步侵染生物做准备（图6）。
对比例
1、步骤
将实施例2步骤3构建的重组原核表达载体转化入模式菌株大肠杆菌DH5ɑ，构建了表达菌株DH5ɑ-pBBR1MCS-5-bll5123，并按照实施例2～5的做法分别进行菌落表型观察、刚果红实验分析、运动性分析及生物膜分析。
2、结果
图7显示，过表达菌株DH5ɑ-pBBR1MCS-5-bll5123 和对照菌株DH5ɑ-pBBR1MCS-5的菌落形态基本相似；图8显示，过表达菌株DH5ɑ-pBBR1MCS-5-bll5123 和对照菌株DH5ɑ-pBBR1MCS-5没有明显变化；图9显示，过表达菌株DH5ɑ-pBBR1MCS-5-bll5123 和对照菌株DH5ɑ-pBBR1MCS-5相比并没有变现出运动性的差别；图10显示，过表达菌株DH5ɑ-pBBR1MCS-5-bll5123 和对照菌株DH5ɑ-pBBR1MCS-5相比生物膜量没有明显变化。
结果显示：相对于模式菌株大肠杆菌DH5ɑ，铜绿假单胞菌PAO1更适合用于研究慢生根瘤菌环鸟苷二磷酸合成和降解基因的功能。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种研究慢生根瘤菌的基因功能的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1374
<212> DNA
<213> Bradyrhizobium japonicum
<400> 1
gtgtccgcgc gtatcctggt tgtcgatgac gttcctgcca acgtcaaact cctcgaggcc 60
cggctttccg ccgaatattt cgacgtgatg accgcctcga acggcaccga ggcgctggcg 120
atctctcgcc gcgccgaatg cgacatcatc ctgctcgacg tgatgatgcc cgacatggac 180
ggcttcgagg tctgccgccg tctgaagacc gatccggcga cgcaccacat ccccgtcgtg 240
atggtgacgg cgctcgacag cccgtccgac cgcaaccgcg ggctggaagc gggcgccgac 300
gatttcctga ccaaacccgt ctccgacgtc gtgctgatcg cacgcgtgcg ctcgctgacg 360
cggctgaaga tgatgaccga cgagctgcgc atgcgcgcca tcacctcgct cgagatcggc 420
atgcaggcgc cggagcgcac tgcggtcgcc gacaccggca agggcggccg catcctgctg 480
gtcgacgacc gccagtcctc ctatgagcgg ctggcgagcc tgctcgccgc cgagcacacc 540
gtcgatgtcg agccgaaccc gaccgaagcg ctgttccacg ccgccgaggg caattacgac 600
ctgctgatcg tctcgctcga cctcaacaat ttcgatggcc tcaggctgtg cagccaggcg 660
cgctcgctgg agcgcacgcg ccacgtgccg atcctggcga tcgcggaccc cgagaattcg 720
acgcggctgc tccgcggcct cgagatcggc gtcaacgact atctgctgcg accaatcgac 780
aagaccgaac tcttggcccg cgcccgcacc cagatccgcc gccgccgcta caccgatcat 840
ctgcgcgaca acgtgcagaa ctcgatcgag atggcgatca ccgacacgct caccggcctg 900
cacaatcgcc gctacatgga gagccatctg gcgacgctcg ccgagcaggc cgcaacccgc 960
ggcaagccgc tcgcgctgat gatcctggac atcgactatt tcaagtcgat caacgacaat 1020
tacggccacg atgccggcga cgacgtgctg cgcgaattcg cggtgcgcgt gcgcaagtcg 1080
atccgcggca ttgatctcgc ctgccgctat ggcggcgagg agttcgtcat cgtgatgccg 1140
gagaccgatc tccacgtcgc cggcatggtc gccgagcgcc tgcgccgctc gatcgcgggc 1200
gagccgttcg cgatccacaa gggcaccaag cgcatcgagg tcacgatctc gatcggcctc 1260
acaacgctgg agcagaaggg cgaggcggtc accgacgtcc tcaagcgcgc cgacaccgcg 1320
ctgtaccgcg ccaagcacga cggccgcaac cgggtggtgt cgcaggcggc gtga 1374

Claims (9)

1.一种利用铜绿假单胞菌的原核表达体系，其特征在于，以铜绿假单胞菌作为宿主菌进行原核表达。
2.根据权利要求1所述的原核表达体系，其特征在于，所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO1。
3.一种研究基因功能的方法，其特征在于，将待测基因在铜绿假单胞菌表达，研究基因的功能。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 克隆待测基因；
S2. 将待测基因连入原核表达载体，得到重组原核表达载体；
S3. 制备铜绿假单胞菌的感受态细胞；
S4. 将重组原核表达载体转化铜绿假单胞菌的感受态细胞；
S5. 筛选阳性重组菌株进行培养，同时培养转入空载质粒的铜绿假单胞菌；
S6. 将阳性重组菌株与转入空载质粒的铜绿假单胞菌进行比较，分析待测基因的功能。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S4中采用电击法转化铜绿假单胞菌的感受态细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进行电击法转化的过程包括以下步骤：
S1.将携带有慢生根瘤菌基因的质粒DNA加到PAO1感受态细胞中，混合均匀；
S2.转移到电击杯中，脉冲18kV/cm，电压：1800V，电阻200 Ω，电容：25μF进行电击；
S3. 电击之后的菌液，迅速向电击杯中加入无抗生素的LB液体培养基，转移到无菌离心管中复苏，之后吸取菌液涂到含有抗性筛选的LB固体培养基中筛选。
7.一种铜绿假单胞菌的感受态细胞的制备方法，其特征在在于，包括以下步骤：
S1. 取铜绿假单胞菌至新培养基，摇菌8～10 h；
S2. 取菌液，温离心去上清；
S3. 用8～12%的蔗糖溶液重悬菌体，并离心去上清；
S4. 重复S3两次；
S5. 加入甘油溶液，进行保存。
8.权利要求7所述制备方法制备得到的铜绿假单胞菌的感受态细胞。
9.铜绿假单胞菌、权利要求1所述原核表达体系、权利要求3所述方法或权利要求8所述感受态细胞在研究慢生根瘤菌的基因功能中的应用。
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