CN110055271B - 一种促进根瘤菌和植物之间的共生效应方法 - Google Patents

一种促进根瘤菌和植物之间的共生效应方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进根瘤菌和植物之间的共生效应方法。本发明构建慢生根瘤菌USDA110 bll4347基因过表达菌株，其接种豆科植物进行共生，与不接种菌的空白对照豆科植物相比，能够明显增强豆科植物株高，鲜重，统计学分析具有极显著差异；bll4347基因过表达菌株与豆科植物根毛早期粘附(共培养4h)实验表明，比空载表达质粒菌株具有更强的粘附根毛能力；bll4347基因过表达菌株接种豆科植物，测定结瘤中菌总固氮酶活表明，与空载表达质粒菌株接种的豆科植物相比，能够明显的提高结瘤中总固氮酶活，可以显著提升植物的固氮能力，可作为生物固氮的新技术应用于工、农业生产，有很大的价值，值得大面积推广应用。

Description

一种促进根瘤菌和植物之间的共生效应方法
技术领域
本发明涉及根瘤菌技术领域，更具体地，涉及一种促进根瘤菌和植物之间的共生效应方法。
背景技术
根瘤菌是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌，能促使植物异常增生的一类革兰氏染色阴性需氧杆菌。根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤。
这种共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。根瘤菌进入这些宿主细胞后被一层膜套包围，有些菌在膜套内能继续繁殖，大量增加根瘤内的根瘤菌数，以后停止增殖，成为成熟的类菌体；宿主细胞与根瘤菌共同合成豆血红蛋白，分布在膜套内外，作为氧的载体，调节膜套内外的氧量。类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH4+，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。
虽然空气成分中约有80%的氮，但一般植物无法直接利用，仅仅花生、大豆、苜蓿等豆科植物，可以通过与微生物的共生固氮作用，才可以把空气中的分子态氮转变为植物可以利用的氨态氮。而人工施用化学氮肥流失率往往大于50%。这远远不能满足目前当今农业发展的需要。
因此急需一种促进植物利用分子氮的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种促进根瘤菌和植物之间的共生效应方法，以促进植物利用分子氮。
本发明的第一个目的是提供bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在促进根瘤菌和植物之间的共生效应的应用。
本发明的第二个目的是提供bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在促进植物根瘤形成中的应用。
本发明的第三个目的是提供bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在提高在植物根毛早期的黏附能力中的应用。
本发明的第四个目的是提供bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在促进植物生长中的应用。
本发明的第五个目的是提供bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在促进固氮酶活性的应用。
本发明的第六个目的是提供一种促进根瘤菌和植物之间的共生效应、促进植物根瘤形成、提高在植物根毛早期黏附能力和/或促进植物生长方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明将bll4347基因过表达到慢生根瘤菌USDA110中，和华夏三号豆科植株共生（流程如图1），表明过表达bll4347的菌株比对照空载质粒表达菌株与植物共生具有更强的固氮能力，同时具有更强的粘附效果，为未来生产更高效的固氮菌株提供了理论支持。
因此本发明要求保护以下内容：
bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在促进根瘤菌和植物之间的共生效应的应用。
bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在促进植物根瘤形成中的应用。
bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在提高在植物根毛早期黏附能力中的应用。
所述早期为植物根毛与固氮微生物接触的早期。
bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在促进植物生长中的应用。
优选地，所述促进植物生长为提高株高、提高鲜重、提高根部结瘤数量，结瘤鲜重和/或提高根鲜重中的一种或几种。
优选地，所述植物为豆科植物。
优选地，所述豆科植物为大豆华夏三号。
优选地，所述根瘤菌为慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum USDA110。
本发明还要求保护bll4347基因、bll4347蛋白、bll4347基因的激活剂和/或bll4347蛋白的激活剂在促进固氮酶活性的应用。
本发明还要求保护一种促进根瘤菌和植物之间的共生效应、促进植物根瘤形成、提高在植物根毛早期黏附能力和/或促进植物生长方法，提高植物体内bll4347基因/蛋白的表达量，并将植物与根瘤菌共生培养。
优选地，提高植物体内bll4347基因/蛋白的表达量的方法为将bll4347基因遗传转化植物。
优选地，将bll4347基因遗传转化的方法，包括以下步骤：
S1. 扩增慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum USDA110 bll4347基因；
S2. 将克隆产物连接入原核表达载体，得到重组原核表达载体；
S3. 重组原核表达载体转化宿主菌，得到重组菌株；
S4. 重组菌株与植物共培养。
优选地，步骤S1中，PCR扩增程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1min，34个循环；72℃ 5min；12℃，∞。
优选地，步骤S1中，PCR扩增引物为：
上游引物CGTGGTCAAGGTGCTTGACGAACACG；
下游引物TCAATGATGATGATGATGATGCGCCACCCGGCTGTGCGTCTC。
优选地，步骤S2中，原核表达载体为pBBR1MCS-5。
优选地，步骤S3中，宿主菌为慢生根瘤菌。
优选地，步骤S3中，电击法转化宿主菌。
更优选地，步骤S3中，电击法转化慢生根瘤菌的方法为：重组原核表达载体质粒与宿主菌感受态细胞混合均匀；转移到电击杯中，脉冲18kV/cm，电压：1800V，电阻200 Ω，电容：25μF进行电击；电击之后的菌液，迅速转移到不加抗生素的AG液体培养基中复苏，之后涂到含有相应抗生素的AG固体培养基平板中。
更优选地，步骤S3中，复苏的条件为28～30℃，200～220rpm，12～20h。
更优选地，步骤S3中，复苏的条件为30℃，200rpm，20h。
更优选地，步骤S3中，无抗生素的AG液体培养基与感受态细胞的体积比为3～10：1。
更优选地，步骤S3中，无抗生素的AG液体培养基与感受态细胞的体积比为5：1。
一种慢生根瘤菌的感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1. 慢生根瘤菌原始菌株在AG固体培养基上培养，28～30℃培养箱培养5～6天，长出单菌落后转入100mlAG液体培养基培养，220 rpm，30℃，培养至OD600约为0.8～1.0；
S2. 分装成45ml菌液两管，取菌液预冷，离心去上清；
S3. 加入预冷的ddH2O，并离心去上清；
S4. 重复S3两次；
S5. 加入10%甘油溶液，离心去上清，
S6. 加入10%甘油溶液，离心去上清，分装成100ul感受态菌液，进行-80℃保存。
优选地，步骤S2全程冰上进行。
优选地，离心4℃，7000～8000g，7～15min
更优选地，离心4℃，8000g，10min。
优选地，以体积计，菌液：预冷的ddH2O：步骤S5中加入的甘油：步骤S6中加入的甘油=90～100：40～60：2～4：1～2。
更优选地，以体积计，菌液：预冷的ddH2O：步骤S5中加入的甘油：步骤S6中加入的甘油=95:50:2:1
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
发明人通过分子生物学实验构建慢生根瘤菌USDA110 bll4347基因过表达菌株，bll4347基因过表达菌株接种豆科植物共生实验表明，与不接种菌的空白对照豆科植物相比，能够明显增强豆科植物株高，鲜重，统计学分析具有极显著差异；bll4347基因过表达菌株与豆科植物根毛早期（共培养4h）粘附实验表明，比空载表达质粒菌株具有更强的粘附根毛能力；bll4347基因过表达菌株接种豆科植物，测定结瘤中菌总固氮酶活表明，与空载表达质粒菌株接种的豆科植物相比，能够明显的提高结瘤中总固氮酶活，可以显著提升植物的固氮能力，可作为生物固氮的新技术应用于工、农业生产，有很大的价值，值得大面积推广应用。
附图说明
图1为研究流程图。
图2为过表达慢生根瘤菌bll4347基因的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5的菌落形态测定；1为对照空载表达质粒菌株PAO1-pBBR1MCS-5；2为过表达菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347。
图3为过表达了慢生根瘤菌bll4347基因的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5生长曲线测定。
图4为过表达了慢生根瘤菌bll4347基因的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5刚果红染色实验分析；1为对照空载表达质粒菌株PAO1-pBBR1MCS-5；2为过表达菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347。
图5为过表达了慢生根瘤菌bll4347基因的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5生物膜分析；1为对照空载表达质粒菌株PAO1-pBBR1MCS-5；2为过表达菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347。
图6为根瘤菌粘附大豆根芽实验，使用paired t test，双侧检验P=0.0032,即P<0.05，具有显著差异。
图7为根瘤菌和植物共生实验模式图；CK为接种了等量培养基的植株；1为接种慢生根瘤菌的植株。
图8为根瘤菌和植物共生实验；A共培养40天后植株；B 植株同一位置叶子；C共培养40天后植株根；CK为接种了等量培养基的植株；1为接种对照空载表达质粒菌株USDA110-pBBR1MCS-5的植株；2为接种过表达菌株USDA110-pBBR1MCS-5-bll4347的植株。
图9为根瘤菌和豆科植物共生统计学数据分析；A为株高；B为植物鲜重；C为瘤重D为固氮酶活实验；CK为接种了等量培养基的植株，1为接种对照空载表达质粒菌株USDA110-pBBR1MCS-5的植株，2为接种过表达菌株USDA110-pBBR1MCS-5-bll4347的植株。
图10为结瘤根瘤菌分离实验；A:在AG固体平板涂布结瘤表面细菌；B：AG固体平板涂布结瘤表面消毒后的细菌；C：在含有200ug/ml硫酸庆大霉素和100ug/ml壮观霉素抗生素AG固体平板涂布结瘤表面消毒后的细菌；D：在含有200ug/ml硫酸庆大霉素和100ug/ml壮观霉素抗生素AG固体平板涂布结瘤内部共生菌。
图11为结瘤内部共生菌检测；2000bp marker左：16sDNA通用引物检测电泳图；2000bp marker右：pBBR1MCS-5质粒通用引物检测电泳图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 bll4347基因的扩增
一、bll4347基因的扩增
（1）实验方法
利用NEB高保真Q5聚合酶，以慢生根瘤菌B. japonicum USDA110基因组为模板，进行PCR扩增。
PCR扩增程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1min，34个循环；72℃5min；12℃，∞。
PCR扩增引物为：
上游引物为
CCCAAGCTTCGTGGTCAAGGTGCTTGACGAACACG；
下游引物为
AAAACTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGCCACCCGGCTGTGCGTCTC。
（2）实验结果
扩增得到含有慢生根瘤菌USDA110 bll4347（Gene ID: 1052137，即NC_004463.1:c 4803313- 4804380)基因的产物。
实施例2 重组原核表达载体的构建及重组原核表达载体转化铜绿假单胞菌PAO1
一、实验方法
1、重组原核表达载体的构建
将实施例1的扩增产物连接至克隆载体，并转化至大肠杆菌进行培养后测序，保留阳性菌株，提取质粒。
用Hind III和Pst I 内切酶同时切割基因片段产物和pBBR1MCS-5原核表达载体质粒。然后用T4连接酶连接。
得到重组原核表达载体pBBR1MCS-5-bll4347。转化大肠杆菌之后筛选得到阳性重组菌株。
2、重组原核表达载体转化铜绿假单胞菌PAO1
上一步制备得到的阳性重组原核表达载体pBBR1MCS-5-bll4347和空载体pBBR1MCS-5转化铜绿假单胞菌PAO1。
铜绿假单胞菌PAO1电击感受态细胞的制备，包括以下步骤：
（1）铜绿假单胞菌PAO1过夜摇8h，取6mL做感受态，分装到3个2mL灭菌的离心管中，室温10000rpm，2min，去上清；
（2）用过滤除菌的10%蔗糖重悬，洗一次，室温10000rpm，1min，去上清；
（3）重复2步骤两次；
（4）用10%甘油浓缩成100μl，用于电击构建好的质粒。
连接产物pBBR1MCS-5-bll4347 和空载体pBBR1MCS-5分别转化制备的铜绿假单胞菌PAO1电击感受态细胞，具体步骤为：
（1）构建的慢生根瘤菌质粒DNA 100ng加到制备的100μL PAO1感受态中，混合均匀；
（2）取全部，转移到0.1cm的电击杯中，脉冲18kV/cm（参数：电压：1800V，电阻200Ω，电容：25uF）；
（3）电击之后的菌液，迅速转移到500μl不加抗生素的LB液体培养基中37℃，200rpm复苏1h。
（4）取100μl涂在有50ug/ml庆大霉素抗生素的LB固体培养基上，置37℃培养箱中培养。
二、实验结果
得到过表达了慢生根瘤菌bll4347基因的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5。
实施例3 过表达bll4347基因对铜绿假单胞菌的影响
一、菌落形态测定
1、实验方法
将实施例2中构建好的转化子PAO1-pBBR1MCS-5 和PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347单克隆于含50μg/mL庆大霉素LB 液体培养基中220rpm，37℃过夜培养，再1:100稀释，取2ul垂直滴加在含有刚果红LB抗性平皿上，培养36h，用体视显微镜拍摄过表达组和对照组的菌落状态。
2、实验结果
结果如图2所示，过表达了慢生根瘤菌bll4347基因的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5相比，能够直接影响PAO1菌落的表型，表面粗糙且菌落不光滑。
二、生长曲线的测定
1、实验方法
将实施例2中构建好的转化子PAO1-pBBR1MCS-5 和PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347单克隆于含50μg/mL庆大霉素LB 液体培养基中220rpm，37℃过夜培养，然后按照1:100的比例加入含有50μg/mL庆大霉素LB 液体中，取200μl加到测生长曲线的平板中，用测生长曲线的仪器检测，每组8个重复，重复三次实验结果。
2、实验结果
结果如图3所示，过表达了慢生根瘤菌USDA110 bll4347的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347 和空白质粒菌株PAO1-pBBR1MCS-5相比，生长速率没有影响。后面的实验，排除了生长速率的影响。
三、刚果红染色实验分析
1、实验方法
将构建的转化子PAO1-pBBR1MCS-5 、PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347单克隆于含50μg/mL庆大霉素LB 液体培养基中220rpm，37℃过夜培养，按照1:100稀释加入到含50μg/mL庆大霉素LB 液体培养基中。吸取2μl垂直滴到含有0.04%的刚果红及50μg/mL庆大霉素LB固体培养基表面于37℃培养箱培养。
2、实验结果
结果如图4所示，36小时后，过表达了慢生根瘤菌USDA110bll4347基因的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347能够更好的结合培养基中刚果红成分。由于刚果红是结合细菌胞外多糖（EPSII）成分的一种染料，从而说明了，在PAO1中过表达了的bll4347能够增加胞外多糖的产生。
四、生物膜分析
1、实验方法
将构建的转化子PAO1-pBBR1MCS-5 、PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347单克隆于含50μg/mL庆大霉素LB 液体培养基中220rpm，37℃过夜培养，然后按照1:100稀释加入到含有2ml50μg/mL庆大霉素LB培养基的无菌玻璃试管中，每个组3个重复，重复三次实验，于37℃，450rpm培养12小时；用ddH2O洗一次，除去结合不充分的细胞；加入已灭菌0.4%的结晶紫，用于结合细胞的膜成分，静置培养20min；用ddH2O洗3次，除去没有结合在膜上多余的结晶紫；放烘箱烘干，实验结果拍照。
2、实验结果
结果如图5所示，过表达了慢生根瘤菌USDA110 bll4347的菌株PAO1-pBBR1MCS-5-bll4347 和对照菌株PAO1-pBBR1MCS-5相比，能够明显增加铜绿假单胞菌PAO1生物膜的形成。
实施例4重组原核表达载体转化电击慢生根瘤菌
一、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum USDA110)电击感受态的制备
（1）实验方法
慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum USDA110)原始菌株在AG（yeastextract 1g，L-(+)-Arabinose 1g，Gluconic acid sodium salt 1g，15g Agar；1000mlddH2O）固体平板上划线，至于30℃培养箱培养5～6天，挑取单克隆菌株，接种到100ml AG液体培养基中，220 rpm，30℃，培养至OD600约为0.8～1.0，制备感受态；
以下所有步骤均在冰上，超净工作台中操作：
100ml菌液和ddH2O分别冰上预冷半小时，分装至50ml无菌管中，8000g 4℃离心10min，去上清，加入25ml预冷 ddH2O，8000g 4℃离心10min，去上清，重复两次
加入2ml 10%甘油，转移至2ml无菌管中，8000g 4℃离心5min，去上清，最后加入1ml 10%甘油，制备成感受态菌液，每管100μl。
二、重组原核表达载体转化电击慢生根瘤菌
（1）实验方法
实施例2制备得到的pBBR1MCS-5-bll4347和空载体pBBR1MCS-5分别转化慢生根瘤菌，电击慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum USDA110)，操作如下：
构建的慢生根瘤菌质粒DNA 100ng加到制备的100μL慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicumUSDA110)感受态中，混合均匀；
取全部，转移到0.1cm的电击杯中，脉冲18kV/cm（参数：电压：1800V，电阻200 Ω，电容：25uF）；
电击之后的菌液，迅速转移到500μl不加抗生素的AG液体培养基中30℃，200rpm复苏20h，之后取100μL 涂到含有200μg/ml庆大霉素的AG固体培养基平板中。
二、实验结果
得到过表达了慢生根瘤菌bll4347基因的菌株USDA110-pBBR1MCS-5-bll4347和空白质粒菌株USDA110-pBBR1MCS-5。
实施例5 根瘤菌和植物共生实验
一、实验方法
1、种子消毒
（1）挑选质量大小接近的华夏三号大豆种子置于50ml无菌离心管中，用25ml无菌ddH2O洗三次，洗去浮尘和表面杂质；
（2）再用25ml 100%酒精和30%双氧水混合液（V:V=3:1）在摇床上轻微震荡10min进行种子表面消毒；
（3）最后用25ml无菌的ddH2O洗三次，把洗好的种子置于25ml无菌水中，4℃过夜萌发。
2、种子培养
第二天转移到含有1% agar 固体培养皿中，置于20℃黑暗环境中培养3～5天。
3、共培养
根茎长到4.5cm左右，挑选质量相同状态的种子，自根尖向上剪取根部3cm，用清水洗涤一次，放入含有3ml AT buffer（20×AT buffer：KH2PO 4 214g pH7.3 dH2O 1000 mL）的5ml 离心管中，滴加100μL OD600=0.5的实施例4制备的菌液，于30℃培养箱中共培养4h，除去AT buffer，加入3ml ddH2O于30℃，400rpm 摇床震荡5min，再用3ml ddH2O洗涤2次，转移至新含有3ml ddH2O的5ml离心管中，每管加入3个灭菌的小钢珠，30℃，500rpm震荡20min，每管取100μl涂布在含有200μg/ml硫酸庆大霉素的AG固体平皿中，10天之后，统计平皿中的菌落数，每次3个生物学重复，重复3次。
二、实验结果
结果如图6所示，过表达了慢生根瘤菌USDA110 bll4347的菌株USDA110-pBBR1MCS-5-bll4347 和对照菌株USDA110-pBBR1MCS-5相比，在豆科植物根毛与根瘤菌接触的早期，具有较强的根毛黏附能力。从而更利于菌株定殖到植物根毛周围，为下一步菌侵入根毛，形成结瘤做准备。
实施例6 根瘤菌和植物共生实验
一、实验方法
1、种子消毒
（1）挑选质量大小接近的华夏三号大豆种子置于50ml无菌离心管中，用25ml无菌ddH2O洗三次，洗去浮尘和表面杂质；
（2）再用25ml 100%酒精和30%双氧水（V:V=3:1）在摇床上轻微震荡10min进行种子表面消毒；
（3）最后用25ml无菌的ddH2O洗三次，把洗好的种子置于25ml无菌水中，4℃过夜萌发。
2、种子培养
第二天转移到含有1% agar 固体培养皿中，置于20℃黑暗环境中培养3～5天，根茎长到3～4cm左右，挑选相同状态的种子，转移至灭菌的双层盒中（上层为蛭石，下层为植物培养液），26℃14h，80%光照，20℃10h黑暗，在恒温光照培养箱中培养。
当豆芽接触到盖子时，去盖，加入石英砂覆盖蛭石（石英砂覆盖能够减少水分散失和隔绝细菌和真菌）；当植物长出第一片真叶时，分为4组，直接用移液枪在幼苗真叶两侧接种2ml OD600=0.5的实施例4制备的菌液，打入蛭石中，共培养40天。
植物培养液成分：
无氮培养基：大量元素NaH2PO4 0.6mM、K2SO4 0.3mM、CaCl2·2H2O 0.3mM、MgCl2·6H2O 0.6mM、FeSO4·7H2O 0.045mM、EDTA·2Na 0.045mM；微量元素H3BO3 50μM、MnSO4·5H2O9μM、CuSO4·5H2O 0.3μM、ZnSO4·7H2O 0.7μM、NaMoO4·2H2O 0.1μM，pH=5.5；
有氮培养基：在无氮培养基加入1mM KNO3。
其中在植物生长前期，即前两次灌溉为有氮培养基，其余时间为无氮培养基。
实验设置：
空白对照组：接种根瘤菌培养基培养40天植株；
空载体组：接种转化了空载质粒的根瘤菌USDA110-pBBR1MCS-5共培养40天植株；
过表达组：接种转化bll4347基因的重组根瘤菌株USDA110-pBBR1MCS-5-bll4347共培养40天植株。
接种是指用移液枪在幼苗真叶两侧将2ml OD600=0.5菌液加入蛭石中。
二、实验结果
如图7和8所示，接种根瘤菌培养基的空白对照组植株，生长状态较差，植株矮小，枝叶枯黄，并且叶片较小；与空白对照组相比，接种空载体组和过表达组植株中，明显促进植株生长，改善枝叶枯黄状态；接种过表达组USDA110-pBBR1MCS-5-bll4347植株和接种空载体组USDA110-pBBR1MCS-5植株相比，植株生长状态较好。从而说明慢生根瘤菌USDA110bll4347基因在参与了植物共生过程。
实施例7 根瘤菌和豆科植物共生统计学数据分析
一、实验方法
将实施例6制备的华夏三号大豆植株培养至40天，用剪刀分离植株根部和植株，根部用清水轻轻洗涤，除去粘附在根表面的蛭石，统计株高（土壤以上部分），植物鲜重，瘤重，总固氮酶活。每组三个重复，重复三次实验结果。
二、实验结果
结果如图9所示，空载体组和过表达组中慢生根瘤菌USDA110能够显著促进株高，增加植株鲜重，并且能够有效结瘤；而不加菌的植株，植株矮小，根部没有结瘤产生。从而说明根瘤菌能够和豆科植物有效共生，促进植物生长。接种USDA110-PBBR1MCS-5-bll4347的过表达组与接种USDA110-pBBR1MCS-5的空载体组相比，瘤鲜重，植株地上部性状显示提升。由于实验用的培养液营养元素较少，蛭石的作用也只是固定植物，不提供营养。所以共培养40天后，差异并不会很大，但是足以说明，bll4347在比对照较好的情况下，固氮酶活提高。
实施例8 固氮酶活实验
一、实验方法
将实施例6制备的华夏三号大豆植株培养至40天，用剪刀将植株根部和植株分离，根部用清水轻轻洗涤，除去粘附在根表面的蛭石。摘取根部全部结瘤，擦干，放入50ml玻璃管中。以电石为材料，用排水法制备乙炔气体，用5ml乙炔换取5ml玻璃管中的空气，密封，放入30℃培养箱静置反应2h。用GC色谱测定乙烯峰面积。
调节氮气、氢气、空气流速比，氮气流速30ml/min。氢气流量:210ml/min；空气(大)流量130ml/min；空气(小)流量70ml/min。
控制面板中，前进样检测温度180℃，柱箱温度160℃，后检测及辅助温度220℃。
先用氮气，乙炔气体标品进行检测，记录标品出峰时间。再注射检测样品，用图峰面积表示固氮酶活相对能力。进样时，用100μl反应气体注入进样孔进行检测。用气相色谱仪的氢火焰离子检测器模块乙烯峰面积。
二、实验结果
如图10所示，用乙烯峰面积间接表示总的固氮酶活，发现过表达了USDA110-PBBRTMCS-5-bll4347的过表达组与接种了USDA110-pBBR1MCS-5空载体菌株的空载体组相比，能够明显的提高总固氮酶活。
实施例9 根瘤菌分离实验
一、实验方法
为了确定目标根瘤菌能够到达植株根部，帮助参与植物根瘤形成，影响豆科植物固氮过程。将实施例6制备的华夏三号大豆植株培养至40天，摘取形成的结瘤，选取6～8个，进行分离验证（以分离空载质粒为例），具体步骤为：
（1）从同一株植株根部摘取6-8不同大小的结瘤放入5ml离心管中，加入1ml无菌水，吸50μl涂布在没有抗性的AG固体平板A上（目的验证结瘤表面有无其他细菌存在）;再加入2ml，用3ml无菌水洗三次；
（2）倒去水，加入100%酒精和30%双氧水各1ml，消毒5min；
（3）倒去液体，用3ml无菌水洗涤5次；加入1ml无菌水，吸取50μl分别涂布在AG、加有含有200ug/ml硫酸庆大霉素和100ug/ml壮观霉素抗生素AG固体平板B和C上（目的是验证是否消毒干净）;
（4）倒去液体，用无菌的涂布棒碾碎，看到结瘤中根瘤菌红色的豆血红蛋白流出。加入1ml无菌水，轻微震荡，悬浮菌体，吸50μl涂布含有200ug/ml硫酸庆大霉素和100ug/ml壮观霉素抗生素AG固体平板D上（目的是得到结瘤内部的目的菌）。
（5）30℃恒温培养7-10天，长出来的D板的单克隆做16sDNA和pBBR1MCS-5质粒引物检测。
16s rDNA通用引物：
27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT
pBBR1MCS-5质粒通用引物：
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R:CAGGAAACAGCTATGACC
二、实验结果
如图10所示，C板无菌落长出，说明结瘤表面消毒干净，D板长出的菌落为结瘤内部菌。
如图11所示，对结瘤内部菌落PCR鉴定，产物送公司测序分析，分析结果比对分析，检测到质粒pBBR1MCS-5存在，16sDNA测序结果分析，为目的菌株USDA110。表明质粒在慢生根瘤菌和豆科植物共生过程中，能够稳定存在，并且慢生根瘤菌USDA110参与了结瘤的形成，并在结瘤中存在。

Claims (3)

1.过表达bll4347基因的载体在促进根瘤菌和植物之间的共生效应中的应用，其特征在于，所述bll4347基因的序列为NC_004463.1:4803313-4804380，所述植物为豆科植物，所述根瘤菌为慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum USDA110，且所述促进根瘤菌和植物之间的共生效应为促进植物根瘤形成、提高植物根毛早期黏附能力、促进植物生长或提高固氮酶活性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述豆科植物为大豆华夏3号。
3.一种促进植物根瘤形成、提高植物根毛早期黏附能力和/或促进植物生长的方法，其特征在于，提高植物体内bll4347基因的表达量，并将植物与根瘤菌共生培养；所述bll4347基因的序列为NC_004463.1:4803313-4804380，所述植物为豆科植物，所述根瘤菌为慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum USDA110。
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