CN110055201A - 一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 - Google Patents

一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明选择yoyJ‑yoyA、lytH、lytD、lytG、lytC作为整合位点，将途径基因glmM、glmS、glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal整合到枯草芽孢杆菌基因组中，不仅提高了透明质酸寡糖的产量，还提高了生物量、有利于后期进行透明质酸寡糖的分离纯化。在3L发酵罐发酵40h时透明质酸寡糖的产量达36.04g/L。其3L发酵罐水平的透明质酸平均分子量HA Mw约为3.3×104Da。本发明为微生物系统高效发酵制备透明质酸寡糖奠定了基础，适合于工业化生产应用。

Description

一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法
技术领域
本发明涉及一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)，又名玻璃酸，是广泛应用于医学、化妆品、食用等领域的黏多糖，HA的生物活性和使用效果由其相对分子量(Mw)直接决定。相比于高分子量的HA(分子量在100万Da以上)，小分子透明质酸，例如：透明质酸寡糖(分子量低于1万)，具有的更重要生理活性与特殊生理功能，透明质酸寡糖能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管，增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收作用，具有较强的消皱功能，可增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。另外，透明质酸寡糖还具有促血管生成促创伤愈合、免疫调节活性和抗肿瘤活性等作用，其医药学应用前景广泛。
当前，制备小分子透明质酸的方法主要集中于物理法、化学法、酶解法。物理法包括加热、超声波和射线辐射等，物理法操作过程简单，但效率较低，产品稳定性较差。化学法包括水解和氧化降解两类，易引入化学试剂污染，反应条件复杂，产生大量工业废水。酶解法步骤繁琐，需要先得到HA和透明质酸酶后才能进行酶解，并且所用的透明质酸酶市场价格昂贵。因而，这些方法都不是大量合成透明质酸寡糖的高效经济方法。随着合成生物学、代谢工程和分子生物学领域的重大进展，通过合理设计来增强生产目标代谢物的工程菌株已变得越来越普遍，通过基因工程将工程菌直接发酵生产透明质酸寡糖是一个有效方法。但，现有的用于合成透明质酸寡糖的微生物，生产强度不高(发酵100h产量为19.5g/L)。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是在枯草芽孢杆菌中整合表达透明质酸寡糖合成途径的基因，无需诱导，实现从廉价碳源(例如：蔗糖或葡萄糖)一步生产透明质酸寡糖；同时，调控基因表达强度，以提高透明质酸寡糖的产量。
[技术方案]
本发明提供了一种整合表达透明质酸寡糖合成途径的基因的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组yoyJ-yoyA、lytH、lytD、lytG、lytC位点分别整合了基因glmM、glmS、 glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal，均以P43启动子为启动子，同时，表达兽疫链球菌来源和巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA，并用基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统bsrE/sr5下调旁路途径基因zwf、pfkA、mnaA、murAA、murAB的表达水平。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌168为宿主，或者，所述重组枯草芽孢杆菌性状为△lacA::szhasA,△bsrE/sr5::glmM,△lytH::glmS,△lytD::glmU,△lytG::tuaD,△lytC::H6LHyal,△b srE/sr5::szhasA,zwf-opr,pfkA-opr,mnaA-opr,murAA-opr,murAB-opr含有重组质粒pP38-sr5与 pHT01-pmhasA的。
本发明还提供了一种利用所述重组枯草芽孢杆菌生长透明质酸寡糖的方法，是以所述重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，利用发酵培养基生产透明质酸寡糖。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基(g/L)是：葡萄糖80，(NH4)2SO4 1.5，K2HPO4·3H2O 9.15，KH2PO4 3，柠檬酸三钠·2H2O 1，酵母提取物10，MgSO4 2.0，酪蛋白水解液2.5，谷氨酰胺1.0，谷氨酸1.0，1毫升微量元素溶液，pH 7.0；微量元素溶液组成为 (g/L)：CaCl2 2.5，MgCl2 2.8，ZnCl2 0.046，CuSO4·5H2O 0.019，MnCl2·4H2O 1.0。
在本发明的一种实施方式中，将种子培养液接种到发酵培养基中，采用分批补料培养的方式发酵生产透明质酸寡糖。
在本发明的一种实施方式中，将种子培养液按8～10％接种量接种到发酵培养基中，采用发酵罐分批补料培养的方式发酵生产透明质酸寡糖，发酵温度为37℃下、通气速度为2.0vvm、搅拌速度为500rpm pH保持pH为7.0。发酵8h时，开始流加葡萄糖至发酵结束，补料速度为5g/(L·h)。
[有益效果]
(1)本发明选择枯草芽孢杆菌上的基因位点yoyJ-yoyA、lytH、lytD、lytG、lytC作为整合位点，将途径基因glmM、glmS、glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal分别整合到上述位点，以P43启动子为启动子，不仅提高了透明质酸寡糖的产量，减少了菌体自溶现象、提高了生物量，有利于后期进行透明质酸寡糖的分离纯化。细胞自溶减少的原因在于，敲除自溶相关基因后枯草芽孢杆菌形态明显变长，一部分的细胞会呈现出短链状结构，多个短链状结构结合在一起并且处在尚未完全分裂的状态，而这种短链状结构正是细胞分裂时细胞壁尚未完全分裂的状态。
(2)表达兽疫链球菌来源和巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA，可提高透明质酸寡糖的产量。单独表达兽疫链球菌来源的透明质酸合酶的H6Hasz/DUMS菌株，摇瓶发酵24h时，透明质酸寡糖产量为0.85g/L，而同时表达兽疫链球菌来源和巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA的H6Hasz/pm/DUMS菌株，摇瓶发酵24h时，透明质酸寡糖产量比H6Hasz/DUMS 菌株提高105.9％。
(3)用基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统bsrE/sr5下调旁路途径基因zwf、 pfkA、mnaA、murAA、murAB的表达水平，摇瓶发酵24h时，使用调控系统bsrE/sr5下调旁路途径基因zwf、pfkA、mnaA、murAA、murAB的表达水平的H6Hasz/pm/DUMS/sr5菌株比未使用该调控系统的H6Hasz/pm/DUMS菌株的透明质酸寡糖产量高42.9％，达2.50g/L。
(4)在3L发酵罐发酵40h时，透明质酸寡糖的产量达36.04g/L，透明质酸寡糖的平均分子量HA Mw约为3.3×104Da。
(5)本发明提高了发酵合成透明质酸寡糖的生产强度，达0.90136.04g/(L·h)，具有较大的应用优势，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。
附图说明
图1为重组质粒pAOX01-PspovG-szhasA的构建示意图；
图2为重组质粒PHT01-pmhasA的构建示意图；
图3为重组质粒pP38-sr5的构建示意图；
图4为枯草芽孢杆菌重组菌H6Hasz/pm/DUMS/sr5、H6Hasz/pm/DUMS、H6Hasz/DUMS、 H6/DUMS及WT菌摇瓶发酵结果；
图5为H6Hasz/pm/DUMS/sr5重组菌与未敲除自溶相关基因菌株生长情况比较；
图6为H6Hasz/pm/DUMS/sr5重组菌与野生菌株菌体形态比较；(A)：H6Hasz/pm/DUMS/sr5， (B)：野生枯草芽孢杆菌168；
图7为H6Hasz/pm/DUMS/sr5重组菌发酵结果。
具体实施方式
实施例涉及的核苷酸序列信息：
(1)SEQ ID NO.1序列信息为枯草芽孢杆菌来源的tuaD基因编码序列；
(2)SEQ ID NO.2序列信息为枯草芽孢杆菌来源的glmM基因编码序列；
(3)SEQ ID NO.3序列信息为枯草芽孢杆菌来源的glmU基因编码序列；
(4)SEQ ID NO.4序列信息为枯草芽孢杆菌来源的glmS基因编码序列；
(5)SEQ ID NO.5序列信息为巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶pmhasA的基因序列；
(6)SEQ ID NO.6序列信息为PspoVG启动子编码序列；
(7)SEQ ID NO.7序列信息为水蛭来源的透明质酸水解酶H6LHyal[SP(yweA)](H6LHyal的N端含有yweA信号肽)基因编码序列；
(8)SEQ ID NO.8序列信息为枯草芽孢杆菌来源的zwf基因编码序列；
(9)SEQ ID NO.9序列信息为枯草芽孢杆菌来源的pfkA基因编码序列；
(10)SEQ ID NO.10序列信息为枯草芽孢杆菌来源的mnaA基因编码序列；
(11)SEQ ID NO.11序列信息为枯草芽孢杆菌来源的murAA基因编码序列；
(12)SEQ ID NO.12序列信息为枯草芽孢杆菌来源的murAB基因编码序列；
(13)SEQ ID NO.13序列信息为PsigW启动子的编码序列。
透明质酸寡糖样品的分离纯化：采用乙醇沉淀法分离提取透明质酸寡糖(参见Peng J,Zhen K,Yuan P,et al.Production of specific-molecular-weight hyaluronanby metabolically engineered Bacillus subtilis,168[J].Metabolic Engineering,2016,35:21-30.)。具体地，向发酵液中加入终浓度为0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)，颠倒混匀后室温下静置10min。在10000r/min 下离心10min，上清液加入八倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后置于4℃静置6-12h，使透明质酸寡糖沉淀。将醇沉和溶解操作重复两遍。分离纯化得到的样品将用于测定HA的浓度和分子量。
透明质酸寡糖含量测定：采用Bitter-Muir氏法定量测定HA含量(参见Peng J,Zhen K, Yuan P,et al.Production of specific-molecular-weight hyaluronan bymetabolically engineered Bacillus subtilis,168[J].Metabolic Engineering,2016,35:21-30.)。
透明质酸寡糖的分子量：采用高效液相色谱-体积排阻色谱(HPSEC-MALLS-RI)测定透明质酸寡糖的质量平均分子量(Mw)、数量平均分子量(Mn)和多分散性系数Ip(Ip＝Mw/Mn) (参见Peng J,Zhen K,Yuan P,et al.Production of specific-molecular-weighthyaluronan by metabolically engineered Bacillus subtilis,168[J].MetabolicEngineering,2016,35:21-30.)。
实施例1重组质粒及H6Hasz/pm/DUMS/sr5重组菌的构建
1.1整合表达基因glmM、glmS、glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal
选择枯草芽孢杆菌基因组中yoyJ-yoyA、lytH、lytD、lytG、lytC作为整合位点，将途径基因glmM、glmS、glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal分别整合到这些位点，均以P43启动子为启动子。
以整合H6LHyal基因至基因组lytC位点为例，整合方法是：首先，通过同源重组构建一个包含5个模块的DNA重组片段lytC(shang)-lox71-zeocin-lox66-P43-H6LHyal[SP(yweA)]--lytC(xia)，它分别包括：①B. subtilis168基因组上lytC位点上游大于500bpDNA片段(使用引物lytC(shang)-F/lytC(shang)-R 从B.subtilis168基因组上通过PCR获得)；②lox71-zeocin-lox66 DNA片段[使用引物 Lox(H6)-F/Lox(h6)-R从质粒p7Z6(Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D].江南大学,2017.)上通过PCR获得]；③P43启动子DNA片段[使用引物 pP43(H6)-F/pP43(H6)-R从质粒pP43NMK(透明质酸寡聚糖生物合成与DNA编辑组装工具构建[D].2016.)上获得]；④H6LHyal[SP(yweA)](H6LHyal的N端含有yweA信号肽，其他基因没有)DNA片段[使用引物H6sp(p43)-F/H6sp(p43)-R从质粒pMA05-sp-H6LHyal(Peng J,Zhen K, Yuan P,etal.Production of specific-molecular-weight hyaluronan by metabolicallyengineered Bacillus subtilis,168[J].Metabolic Engineering,2016,35:21-30.)上通过PCR获得]；⑤B. subtilis168基因组上lytC位点下游大于500bp DNA片段(使用引物lytC(xia)-F/lytC(xia)-R从 B.subtilis168基因组上通过PCR获得。涉及的引物信息如下表1：
表1引物序列5’-3’方向
将重组DNA片段lytC(shang)-lox71-zeocin-lox66-P43-H6LHyal[SP(yweA)]--lytC(xia)转移到枯草芽孢杆菌168感受态中并在含有博来霉素的LB平板上筛选。通过菌落PCR验证和基因测序来确定正确的重组子。将含有lox71-zeoR-lox66抗性标记的重组子菌株制备成感受态，然后转入pTSC质粒(Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D].江南大学,2017.)，通过在含有卡那霉素的LB平板上进行筛选，获得了阳性转化子。将该转化子在含有卡那霉素和IPTG的LB培养基中培养12h以消除zeoR。菌液稀释后涂布于LB平板上，将长出的单菌落分别转接至新的LB平板和含有博来霉素的LB平板。将只在LB平板上长出的单菌落通过PCR产物测序验证，验证正确的即为消除了zeoR基因的菌株。然后将获得菌株在LB培养基中50度培养12h以消除质粒pTSC，菌液稀释后涂布于LB平板。将长出的单菌落分别转接至LB平板和含有卡那霉素的LB平板，所获得的只能在LB平板上长出的菌落即为消除了质粒pTSC的已整合了水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal的重组菌株。
同理，根据上述整合方法继续在基因组上整合途径基因glmM、glmS、glmU、tuaD就得到枯草芽孢杆菌重组菌H6/DUMS。
1.2异源表达兽疫链球菌来源和巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA
重组质粒pAOX01-PspovG-szhasA的构建：使用引物PspovG-F/PspovG-R通过PCR扩增PspovG DNA片段，将所得的PspovG DNA片段与骨架pAX01-hasA(Peng J,Zhen K,Yuan P,etal. Production of specific-molecular-weight hyaluronan by metabolicallyengineered Bacillus subtilis, 168[J].Metabolic Engineering,2016,35:21-30.)组装(使用引物pAX01-hasA-F/pAX01-hasA-R 扩增)以产生pAOX01-PspovG-szhasA。
重组质粒pHT01-pmhasA的构建：使用引物pmhasA-F/pmhasA-R通过PCR扩增pmhasADNA片段，将所得的pmhasA DNA片段与骨架pHT01(Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D].江南大学,2017.)组装(使用引物pHT01-F/pHT01-R扩增)以产生pHT01-pmhasA。涉及的引物信息如下表2。
表2引物序列5’-3’方向
将重组质粒pAOX01-PspovG-szhasA导入枯草芽孢杆菌重组菌H6/DUMS感受态中，就得到枯草芽孢杆菌重组菌H6Hasz/DUMS，再将pHT01-pmhasA分别导入枯草芽孢杆菌重组菌H6/DUMS感受态中，就得到枯草芽孢杆菌重组菌H6Hasz/pm/DUMS。
1.3进一步用bsrE/sr5系统下调旁路途径基因的表达
旁路途径zwf、pfkA、mnaA、murAA、murAB等基因后插入调控操作区opr5的重组菌株的构建：在重组菌H6Hasz/pm/DUMS的基础上，在旁路途径zwf、pfkA、mnaA、murAA、murAB 等基因后插入调控操作区opr5。
以zwf基因后插入调控操作区opr5为例，插入调控操作区opr5的方法：首先，通过同源重组构建一个包含四个模块的重组DNA片段，分别是：①B.subtilis168基因组上zwf基因终止密码子上游大于500bp DNA片段(使用引物zwf-FF/zwf-FR从B.subtilis168基因组上通过PCR获得)②与调控RNA sr5配对的区域opr5 DNA片段(使用引物opr5-F/opr5-R从B.subtilis168基因组上通过PCR获得)；③使用引物lox(opr)-F/lox(opr)-R从质粒p7Z6上通过PCR获得的lox71-zeoR-lox66 DNA片段；④B.subtilis168基因组上zwf基因终止密码子下游大于500bp DNA片段(使用引物zwf-RF/zwf-RR从B.subtilis168基因组上PCR获得)。zwf基因后插入调控操作区opr5涉及的引物信息如下表3：
表3引物序列5’-3’方向
将该片段转入重组菌H6Hasz/pm/DUMS感受态中并在博来霉素抗性平板上筛选。通过菌落 PCR验证和基因测序来确定正确的重组子。将含有lox71-zeoR-lox66抗性标记的重组子菌株制备成感受态，然后转入pTSC质粒(Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D].江南大学,2017.)，通过在含有卡那霉素的LB平板上进行筛选，获得了阳性转化子。将该转化子在含有卡那霉素和IPTG的LB培养基中培养12h以消除zeoR。菌液稀释后涂布于LB平板上，将长出的单菌落分别转接至新的LB平板和含有博来霉素的LB平板。将只在LB平板上长出的单菌落通过PCR产物测序验证，验证正确的即为消除了zeoR基因的菌株。然后将获得菌株在LB培养基中50度培养12h以消除质粒pTSC，菌液稀释后涂布于LB平板。将长出的单菌落分别转接至LB平板和含有卡那霉素的LB平板，所获得的只能在 LB平板上长出的菌落即为消除了质粒pTSC的已在zwf基因后插入调控操作区opr5的重组菌株。
同理，根据上述整合方法继续在基因组上pfkA、mnaA、murAA、murAB等基因后插入调控操作区opr5，然后，导入重组质粒pP38-sr5就得到枯草芽孢杆菌重组菌H6Hasz/pm/DUMS/sr5。重组质粒pP38-sr5的构建过程如下：以重组质粒pSTOP1622-sr5(Sen Y,Yang W,Chaobao W,et al.A new sRNA-mediated posttranscriptional regulation system forBacillus subtilis[J].Biotechnology and Bioengineering,2016,12:2986-2995.)为模板使用引物sr5-F/sr5-R 通过PCR扩增sr5DNA片段，使用引物PsigW-F/通过PCR扩增PsigW启动子DNA片段，将所得的sr5DNA片段、PsigW启动子DNA片段与骨架pP38(Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D].江南大学,2017.)组装(使用引物pP38-F/pP38-R扩增)以产生pP38-sr5。构建质粒pP38-sr5涉及的引物信息如下表4：
表4引物序列5’-3’方向
实施例2 H6Hasz/pm/DUMS/sr5重组菌发酵结果
2.1培养方法
种子培养：将50ml摇菌管中的种子(用LB培养基)接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养一开始就加入终浓度为50μg/ml卡那霉素，5μg/ml红霉素，20μ g/ml博来霉素，25μg/ml氯霉素和1.5mmol/L IPTG诱导剂，37℃、200r/min培养时间12-16 h。
摇瓶发酵：将种子培养液按10％的接种量转接至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，加入终浓度为50μg/ml卡那霉素，5μg/ml红霉素，20μg/ml博来霉素，25μg/ml 氯霉素和1.5mmol/L IPTG诱导剂，37℃、200r/min培养24h。
3L发酵罐发酵：按10％的接种量将种子液接入含1.35L发酵培养基的3L发酵罐中，加入终浓度为50μg/ml卡那霉素，5μg/ml红霉素，20μg/ml博来霉素，25μg/ml氯霉素和1.5mmol/L IPTG诱导剂，在37℃下培养,通气速度为2.0vvm(空气体积/培养基体积/分钟)和500rpm的搅拌速度。用5M NaOH或HCl调节pH保持pH为7.0，在8h期间开始流加葡萄糖,保持5g/(L·h)的流速至发酵结束。
2.2实验结果
分别挑取上述构建的枯草芽孢杆菌重组菌H6Hasz/pm/DUMS/sr5、H6Hasz/pm/DUMS(转化pP38空质粒)、H6Hasz/DUMS(转化pHT01空质粒、pP38空质粒)、H6/DUMS(转化pAX01 空质粒、pHT01空质粒、pP38空质粒)菌株及WT菌(转化pAX01空质粒、pHT01空质粒、 pP38空质粒)的单克隆接种于5mL种子培养基中，进行种子液的制备，然后进行摇瓶发酵。
摇瓶发酵发酵结果如图4所示，H6/DUMS菌株及WT菌株由于没有表达透明质酸合酶，菌没有合成透明质酸；H6Hasz/DUMS菌株单独表达兽疫链球菌来源的透明质酸合酶，24h时透明质酸寡糖产量为0.85g/L，H6Hasz/pm/DUMS菌株同时表达兽疫链球菌来源和巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA，透明质酸寡糖产量比H6Hasz/DUMS菌株提高105.9％；用基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统bsrE/sr5下调旁路途径基因zwf、pfkA、mnaA、murAA、murAB表达的H6Hasz/pm/DUMS/sr5菌株的透明质酸寡糖产量，则比H6Hasz/DUMS 菌株提高194.1％。
培养24h时，H6Hasz/pm/DUMS/sr5菌株与WT菌株的生长情况比较如图5所示，H6Hasz/pm/DUMS/sr5菌株的OD600还能维持在9.5左右，而WT菌株因为自溶而生物量下降。说明选择整合位点yoyJ-yoyA、lytH、lytD、lytG、lytC作为整合位点，将途径基因glmM、glmS、glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal整合到枯草芽孢杆菌基因组中，不仅提高了透明质酸寡糖的产量，也有利于后期进行透明质酸寡糖的分离纯化，更意外的收获是提高了生物量。
图6所示为H6Hasz/pm/DUMS/sr5菌株与WT菌株在相差显微镜观察到的形态，可以发现， H6Hasz/pm/DUMS/sr5菌株形态明显变长，一部分的细胞会呈现出短链状结构，多个短链状结构结合在一起并且处在尚未完全分裂的状态，而这种短链状结构正是细胞分裂时细胞壁尚未完全分裂的状态。将H6Hasz/pm/DUMS/sr5菌株进行3L发酵罐发酵40h时透明质酸寡糖的产量如图7所示，3L发酵罐发酵40h时透明质酸寡糖的产量达36.04g/L，生产强度达0.90136.04 g/(L·h)。如表5所示，3L发酵罐水平的透明质酸平均分子量HA Mw约为3.3×104Da。
表5 H6Hasz/pm/DUMS/sr5重组菌的透明质酸的平均分子量
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法
<160> 45
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
gtgaaaaaaa tagctgtcat tggaacaggt tatgtaggac tcgtatcagg cacttgcttt 60
gcggagatcg gcaataaagt tgtttgctgt gatatcgatg aatcaaaaat cagaagcctg 120
aaaaatgggg taatcccaat ctatgaacca gggcttgcag acttagttga aaaaaatgtg 180
ctggatcagc gcctgacctt tacgaacgat atcccgtctg ccattcgggc ctcagatatt 240
atttatattg cagtcggaac gcctatgtcc aaaacaggtg aagctgattt aacgtacgtc 300
aaagcggcgg cgaaaacaat cggtgagcat cttaacggct acaaagtgat cgtaaataaa 360
agcacagtcc cggttggaac agggaaactg gtgcaatcta tcgttcaaaa agcctcaaag 420
gggagatact catttgatgt tgtatctaac cctgaattcc ttcgggaagg gtcagcgatt 480
catgacacga tgaatatgga gcgtgccgtg attggttcaa caagtcataa agccgctgcc 540
atcattgagg aacttcatca gccattccat gctcctgtca ttaaaacaaa cctagaaagt 600
gcagaaatga ttaaatacgc cgcgaatgca tttctggcga caaagatttc ctttatcaac 660
gatatcgcaa acatttgtga gcgagtcggc gcagacgttt caaaagttgc tgatggtgtt 720
ggtcttgaca gccgtatcgg cagaaagttc cttaaagctg gtattggatt cggcggttca 780
tgttttccaa aggatacaac cgcgctgctt caaatcgcaa aatcggcagg ctatccattc 840
aagctcatcg aagctgtcat tgaaacgaac gaaaagcagc gtgttcatat tgtagataaa 900
cttttgactg ttatgggaag cgtcaaaggg agaaccattt cagtcctggg attagccttc 960
aaaccgaata cgaacgatgt gagatccgct ccagcgcttg atattatccc aatgctgcag 1020
cagctgggcg cccatgtaaa agcatacgat ccgattgcta ttcctgaagc ttcagcgatc 1080
cttggcgaac aggtcgagta ttacacagat gtgtatgctg cgatggaaga cactgatgca 1140
tgcctgattt taacggattg gccggaagtg aaagaaatgg agcttgtaaa agtgaaaacc 1200
ctcttaaaac agccagtcat cattgacggc agaaatttat tttcacttga agagatgcag 1260
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gacaagtatt ttccgggctt gccgcttgaa gaattggcta aagacttggg aagcgtcaat 1380
ttataa 1386
<210> 2
<211> 1347
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 2
atgggcaagt attttggaac agacggtgta agaggtgtcg ccaatagtga gcttacacct 60
gagctggcct ttaaagtcgg acgtttcggc ggttatgtgc tgacaaaaga caaacaacgt 120
ccaaaagtgc tgataggccg cgatacacgc atctccggcc atatgctgga gggagccctt 180
gtcgccggac ttttatccat tggcgcagaa gtcatgcgcc tgggtgtcat ttctacacca 240
ggtgtatctt atttgacaaa agcgatggat gcagaggcgg gcgtcatgat ttccgcttct 300
cataacccag tgcaggataa cggcatcaaa ttctttgggg gagatggatt taagctttct 360
gatgaacagg aggctgaaat tgagcgcctg atggacgaac ctgaggataa gctgccaaga 420
cctgtcggag cagaccttgg acttgtaaac gattattttg aaggcggaca aaaatatctg 480
caattcttaa aacagacagc tgatgaagat ttcacaggca ttcatgtggc attggactgt 540
gccaatggcg caacgtcatc cttggcgaca cacctgtttg ctgatttaga tgcagatgtt 600
tctacaatgg ggacttcccc gaacggatta aacattaatg acggcgtcgg ttcgactcat 660
cccgaagcgc tcagcgcgtt tgtcaaagag aaaaacgcgg atctcggtct tgcgttcgac 720
ggtgacggcg accgcctgat tgctgtcgat gaaaaaggaa atattgtaga cggcgaccaa 780
atcatgtaca tatgctcaaa acatctgaaa tcagagggcc gtttaaagga tgatacagtg 840
gtttcaaccg tgatgagcaa cctcggcttc tataaggcgc tcgaaaaaga aggcatcaaa 900
agcgtgcaga cagctgtcgg cgaccgctac gtagtagaag caatgaaaaa agacggctac 960
aacgtcggcg gagagcagtc aggacatctt attttccttg attacaacac gacaggggac 1020
ggattattgt ctgctattat gctgatgaac actttaaaag caacaggcaa gccgctgtca 1080
gagcttgcag ctgaaatgca gaagttcccg cagctgttag tcaatgtgag agtgactgat 1140
aaatataaag ttgaagaaaa tgaaaaagta aaagcagtta tttctgaagt tgaaaaagaa 1200
atgaacggcg acggccggat tttggtgcgc ccttcaggaa ctgaaccgct cgtccgtgtc 1260
atggctgaag cgaagacgaa agagctgtgc gatgagtatg tcaatcgcat tgttgaagtc 1320
gtccggtcag aaatgggatt agagtaa 1347
<210> 3
<211> 1371
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 3
atggataagc ggtttgcagt tgttttagcg gctggacaag gaacgagaat gaaatcgaag 60
ctttataaag tccttcatcc agtttgcggt aagcctatgg tagagcacgt cgtggacgaa 120
gccttaaaat tatctttatc aaagcttgtc acgattgtcg gacatggtgc ggaagaagtg 180
aaaaagcagc ttggtgataa aagcgagtac gcgcttcaag caaaacagct tggcactgct 240
catgctgtaa aacaggcaca gccatttctt gctgacgaaa aaggcgtcac aattgtcatt 300
tgcggagata cgccgctttt gacagcagag acgatggaac agatgctgaa agaacataca 360
caaagagaag cgaaagctac gattttaact gcggttgcag aagatccaac tggatacggc 420
cgcattattc gcagcgaaaa cggagcggtt caaaaaatag ttgagcataa ggacgcctct 480
gaagaagaac gtcttgtaac tgagatcaac accggtacgt attgttttga caatgaagcg 540
ctatttcggg ctattgatca ggtgtctaat gataatgcac aaggcgagta ttatttgccg 600
gatgtcatag agattcttaa aaatgaaggc gaaactgttg ccgcttacca gactggtaat 660
ttccaagaaa cgctcggagt taatgataga gttgctcttt ctcaggcaga acaatttatg 720
aaagagcgca ttaataaacg gcatatgcaa aatggcgtga cgttgattga cccgatgaat 780
acgtatattt ctcctgacgc tgttatcgga agcgatactg tgatttaccc tggaactgtg 840
attaaaggtg aggtgcaaat cggagaagat acgattattg gccctcatac ggagattatg 900
aatagtgcca ttggcagccg tacggttatt aaacaatcgg tagtcaatca cagtaaagtg 960
gggaatgatg taaacatagg accttttgct cacatcagac ctgattctgt catcgggaat 1020
gaagtgaaga tcgggaattt tgtagaaatt aaaaagactc aattcggaga ccgaagcaag 1080
gcatctcatc taagctatgt cggcgatgct gaggtaggca ctgatgtaaa cctgggctgc 1140
ggttcaatta ctgtcaatta tgatggaaag aataagtatt tgacaaaaat tgaagatggc 1200
gcgtttatcg gctgcaattc caacttggtt gcccctgtca cagtcggaga aggcgcttat 1260
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gcgagacaag taaataaaga cgattatgtg aaaaatattc ataaaaaata a 1371
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<211> 1803
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 4
atgtgtggaa tcgtaggtta tatcggtcag cttgatgcga aggaaatttt attaaaaggg 60
ttagagaagc ttgagtatcg cggttatgac tctgctggta ttgctgttgc caacgaacag 120
ggaatccatg tgttcaaaga aaaaggacgc attgcagatc ttcgtgaagt tgtggatgcc 180
aatgtagaag cgaaagccgg aattgggcat actcgctggg cgacacacgg cgaaccaagc 240
tatctgaacg ctcacccgca tcaaagcgca ctgggccgct ttacacttgt tcacaacggc 300
gtgatcgaga actatgttca gctgaagcaa gagtatttgc aagatgtaga gctcaaaagt 360
gacaccgata cagaagtagt cgttcaagta atcgagcaat tcgtcaatgg aggacttgag 420
acagaagaag cgttccgcaa aacacttaca ctgttaaaag gctcttatgc aattgcttta 480
ttcgataacg acaacagaga aacgattttt gtagcgaaaa acaaaagccc tctattagta 540
ggtcttggag atacattcaa cgtcgtagca tctgatgcga tggcgatgct tcaagtaacc 600
aacgaatacg tagagctgat ggataaagaa atggttatcg tcactgatga ccaagttgtc 660
atcaaaaacc ttgatggtga cgtgattaca cgtgcgtctt atattgctga gcttgatgcc 720
agtgatatcg aaaaaggcac gtaccctcac tacatgttga aagaaacgga tgagcagcct 780
gttgttatgc gcaaaatcat ccaaacgtat caagatgaaa acggcaagct gtctgtgcct 840
ggcgatatcg ctgccgctgt agcggaagcg gaccgcatct atatcattgg ctgcggaaca 900
agctaccatg caggacttgt cggtaaacaa tatattgaaa tgtgggcaaa cgtgccggtt 960
gaagtgcatg tagcgagtga attctcctac aacatgccgc ttctgtctaa gaaaccgctc 1020
ttcattttcc tttctcaaag cggagaaaca gcagacagcc gcgcggtact cgttcaagtc 1080
aaagcgctcg gacacaaagc cctgacaatc acaaacgtac ctggatcaac gctttctcgt 1140
gaagctgact atacattgct gcttcatgca ggccctgaga tcgctgttgc gtcaacgaaa 1200
gcatacactg cacaaatcgc agttctggcg gttcttgctt ctgtggctgc tgacaaaaat 1260
ggcatcaata tcggatttga cctcgtcaaa gaactcggta tcgctgcaaa cgcaatggaa 1320
gctctatgcg accagaaaga cgaaatggaa atgatcgctc gtgaatacct gactgtatcc 1380
agaaatgctt tcttcatcgg acgcggcctt gactacttcg tatgtgtcga aggcgcactg 1440
aagctgaaag agatttctta catccaggca gaaggttttg ccggcggtga gctaaagcac 1500
ggaacgattg ccttgatcga acaaggaaca ccagtattcg cactggcaac tcaagagcat 1560
gtaaacctaa gcatccgcgg aaacgtcaaa gaagttgctg ctcgcggagc aaacacatgc 1620
atcatctcac tgaaaggcct agacgatgcg gatgacagat tcgtattgcc ggaagtaaac 1680
ccagcgcttg ctccgttggt atctgttgtt ccattgcagc tgatcgctta ctatgctgca 1740
ctgcatcgcg gctgtgatgt ggataaacct cgtaaccttg cgaagagtgt tactgtggag 1800
taa 1803
<210> 5
<211> 2919
<212> DNA
<213> 巴斯德杆菌
<400> 5
atgaacactt tgtctcaagc tattaaggct tacaactcta acgattatca attggctttg 60
aagttgttcg aaaaatctgc tgaaatttac ggtagaaaga ttgttgaatt tcaaattact 120
aagtgtaagg aaaagttgtc tgctcatcct tctgttaatt ctgctcattt gtctgttaac 180
aaggaagaaa aagttaatgt ttgtgattct cctttggata ttgctactca attgttgttg 240
tctaacgtta aaaagttggt tttgtctgat tctgaaaaaa acactttgaa gaataagtgg 300
aaattgttga ctgaaaagaa gtctgaaaac gctgaagtta gagctgttgc tttggttcct 360
aaagattttc ctaaagattt ggttttggct cctttgccag atcatgttaa cgatttcact 420
tggtacaaaa aaagaaagaa gagattgggt attaaacctg aacatcaaca tgttggtttg 480
tctattattg ttactacttt caacagacct gctattttgt ctattacttt ggcttgtttg 540
gttaaccaaa agactcatta cccattcgaa gttattgtta ctgatgatgg ttctcaagaa 600
gatttgtctc caattattag acaatacgaa aacaagttgg atattagata cgttagacaa 660
aaggataacg gtttccaagc tagtgctgct agaaacatgg gtttgagatt ggctaagtat 720
gattttattg gtttgttgga ttgtgatatg gctcctaatc cattgtgggt tcattcttat 780
gttgctgaat tgttggaaga tgatgatttg actattattg gtcctagaaa atacattgat 840
actcaacata ttgatccaaa ggattttttg aacaacgctt ctttgttgga atctttgcct 900
gaagttaaga ctaataactc tgttgctgct aagggtgaag gtactgtttc tttggattgg 960
agattggaac aatttgaaaa gactgaaaac ttgagattgt ctgattctcc ttttagattc 1020
tttgctgctg gtaatgttgc tttcgctaaa aagtggttga ataaatctgg ttttttcgat 1080
gaagaattta accattgggg tggtgaagat gttgaatttg gttatagatt gttcagatac 1140
ggttcttttt tcaagactat tgatggtatt atggcttatc atcaagaacc accaggtaag 1200
gaaaacgaaa ctgatagaga agctggtaag aacattactt tggatattat gagagaaaag 1260
gttccataca tttacagaaa gttgttgcct attgaagatt ctcatattaa cagagttcct 1320
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gataacactt tggaagttat taacaagttg tacggtaaca atccaagagt tagaattatg 1500
tctaagccta atggtggtat tgcttctgct tctaatgctg ctgtttcttt tgctaaaggt 1560
tactacattg gtcaattgga ttctgatgat tacttggaac ctgatgctgt tgaattgtgt 1620
ttgaaggaat ttttgaagga taagactttg gcttgtgttt atactactaa cagaaatgtt 1680
aacccagatg gttctttgat tgctaacggt tataattggc cagaattttc tcgtgaaaaa 1740
ttgactactg ctatgattgc tcatcatttt agaatgttca ctattagagc ttggcatttg 1800
actgatggtt ttaacgaaaa aattgaaaac gctgttgatt acgatatgtt cttgaagttg 1860
tctgaagttg gtaaattcaa acatttgaat aagatttgtt acaacagagt tttgcatggt 1920
gataacactt ctattaaaaa attgggtatt caaaagaaga accattttgt tgttgttaac 1980
caatctttga acagacaagg tattacttac tacaattacg atgaatttga tgatttggat 2040
gaatctcgta aatacatttt taacaagact gctgaatacc aagaagaaat tgatattttg 2100
aaagatatta agattattca aaacaaggat gctaagattg ctgtttctat tttctatcca 2160
aatactttga acggtttggt taagaagttg aataatatta ttgaatacaa caagaacatt 2220
tttgttattg ttttgcatgt tgataagaac catttgactc cagatattaa aaaggaaatt 2280
ttggcttttt accataagca tcaagttaat attttgttga ataatgatat ttcttattat 2340
acttctaata gattgattaa aactgaagct catttgtcta atattaataa attgtctcaa 2400
ttgaatttga attgtgaata tattattttt gataatcatg attctttgtt tgttaaaaat 2460
gattcttatg cttatatgaa aaaatatgat gttggtatga atttttctgc tttgactcat 2520
gattggattg aaaaaattaa tgctcatcca ccattcaaaa aattgattaa aacttatttt 2580
aatgataatg atttgaaatc tatgaatgtt aaaggtgctt ctcaaggtat gttcatgact 2640
tatgctttgg ctcatgaatt gttgactatt attaaagaag ttattacttc ttgtcaatct 2700
attgattctg ttccagaata taatactgaa gatatttggt tccaattcgc tttgttgatt 2760
ttggaaaaaa aaactggtca tgttttcaat aaaacttcta ctttgactta tatgccttgg 2820
gaaagaaaat tgcaatggac taatgaacaa attgaatctg ctaaaagagg tgaaaatatt 2880
ccagttaata aattcattat taattctatt actttgtaa 2919
<210> 6
<211> 300
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 6
tgcggaagta aacgaagtgt acggacaata ttttgacact cacaaaccgg cgagatcttg 60
tgttgaagtc gcgagactcc cgaaggatgc gttagtcgag atcgaagtta ttgcactggt 120
gaaataataa gaaaagtgat tctgggagag ccgggatcac ttttttattt accttatgcc 180
cgaaatgaaa gctttatgac ctaattgtgt aactatatcc tattttttca aaaaatattt 240
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<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<400> 7
atgctaaaaa gaacttcatt cgtatcttca ttattcatca gttcagctgt tttactatca 60
atcttacttc cttcgggcca agctcatgca atgcaccacc accaccacca catgaaagag 120
atcgcggtga caattgacga taagaacgtt attgcctctg tcagcgagtc attccatggt 180
gttgcctttg atgcgtcgtt attttcaccg aaggggttgt ggagctttgt tgacattacc 240
tcaccgaaat tgtttaaact cttggagggt ctctctcctg gttacttcag ggttggagga 300
acgtttgcta actggctgtt ctttgactta gatgaaaata ataagtggaa agactattgg 360
gcttttaaag ataaaacacc cgagactgca acaatcacaa ggaggtggct gtttcgaaaa 420
caaaacaacc tgaaaaaaga gacttttgac gacttagtca aactaaccaa aggaagcaaa 480
atgagactgt tatttgattt aaacgctgaa gtgagaactg gttatgaaat tggaaagaaa 540
atgacatcca cttgggatag ctcggaagct gaaaaattat tcaaatactg tgtgtcaaaa 600
ggttatggag ataatattga ttgggaactt ggtaatgaac cggaccatac ctccgcacac 660
aatcttactg aaaagcaagt tggagaggac tttaaagccc tgcataaagt gctagagaaa 720
tatccgacgt tgaataaagg atcgcttgtt ggacctgacg ttggatggat gggagtctct 780
tatgtgaaag gattagcaga cggggctggt gatcacgtaa ccgcttttac tcttcatcag 840
tattattttg acggcaatac ctcagatgtg tcaacatacc ttgacgctac ttattttaaa 900
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gtgaaagttg tgataagaca aacgatctat aatggatact acggacttct tgataaaaat 1140
actctagagc caaatccgga ttattggcta atgcatgttc acaattctct ggttggaaat 1200
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gcaaaacgaa aattgtatcc gtctattcac cgtttatatc aaaacggaca aatcggagaa 120
gagtttgcag tggtaggagt tggaagaaga ccttggtcta atgaggatct tcgccaaact 180
gttaaaacat ccatttcctc atctgcagat aagcatatag atgatttcac gtctcatttt 240
tactatcacc cgtttgacgt gacaaaccct ggttcttatc aagagctaaa cgtattgctt 300
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cctgaattct tcggaacgat tgcaaaaaca ttaaaatcag agggtgtaac agctacaacc 420
ggctggtccc gccttgtcat cgaaaaaccg ttcggccatg atctgccaag cgcacaggca 480
ttgaataaag aaatccgcga agcatttacg gaagatcaaa tttacagaat cgaccattat 540
ctaggcaaac aaatggttca gaacattgaa gtgattcgat ttgccaatgc gattttcgaa 600
ccgctttgga caaaccgcta catttcaaac attcaaatca catctagcga atcactaggc 660
gttgaagacc gcgcaagata ttacgaaaaa tcaggcgccc ttcgcgacat ggtgcaaaac 720
catattatgc agatggttgc ccttcttgca atggagccgc ctatcaaatt gaacacagaa 780
gaaatccgca gcgagaaagt gaaggtgctg agagcactgc gtcctattgc aaaagacgaa 840
gtggatgaat actttgtgcg cggacaatat catgctggtg aaattgacgg tgtaccggtt 900
cctgcttata cagatgaaga taatgtcgct cctgactcca atacagaaac ctttgttgcc 960
ggcaagctct tgatcgacaa cttcagatgg gctggtgttc cattctacat cagaaccgga 1020
aaacgaatga aagaaaagtc cacaaaaatt gtcgttcaat ttaaggacat tccgatgaac 1080
ctgtactacg gtaatgaaaa caacatgaat ccgaacttgc ttgtcattca tattcagcct 1140
gacgaaggca ttacgcttta cttaaatgct aaaaagcttg gcggagcagc acacgcacag 1200
ccaatcaaac tcgattattg cagcaattgc aatgacgagt tgaacacccc tgaagcatat 1260
gaaaaactaa ttcacgactg tcttcttggc gatgcaacaa actttgcaca ctgggatgaa 1320
gttgcccttt cttggagctt tgtcgactct atttctgaaa catgggcagc aaacaaaacc 1380
ttatctccta actacgaatc aggctcaatg ggaccgaaag aatctgatga tcttttggtg 1440
aaagacggct tacactggtg gaacatataa 1470
<210> 9
<211> 960
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 9
atgaaacgaa taggggtatt aacgagcggc ggggattccc cgggaatgaa cgcagcagtt 60
cgcgcagtag tcagaaaagc gatctatcat gacgttgaag tttacggtat ttacaacgga 120
tacgcgggat tgatcagcgg aaagattgaa aagcttgaac tcggatcagt aggcgatatt 180
atacatcgtg gagggactaa gctttatacg gcgagatgtc ctgaattcaa aacagttgaa 240
ggccgtgaaa aagggatagc aaacttgaag aagcttggta ttgaaggcct tgttgttatc 300
ggtggagacg gttcctatat gggtgcgaaa aaattaacgg aacacgggtt tccatgtgta 360
ggtgtaccgg gtacaattga taatgacatt ccgggcactg attttacaat cggtttcgat 420
acagctttaa atacagtaat tgacgcaatt gataagattc gcgatacagc gacttctcat 480
gaacgtacat atgtaatcga agtaatgggc cgtcatgccg gcgatatcgc attgtgggcc 540
ggtcttgcag ggggcgcaga atcgatctta atccctgagg cagactatga catgcacgaa 600
atcattgccc gcttaaaacg cggccacgaa cgcggcaaga agcacagtat tattattgtt 660
gccgaaggtg taggcagcgg tgttgaattc gggaaacgca ttgaagaaga aacaaatctt 720
gaaactaggg tatctgtatt gggccatatc cagcgcggag gttctccgag tgctgctgac 780
cgtgtgttgg caagccgtct cggcgcatat gcagttgaac tgctgcttga aggaaaaggc 840
ggacgctgtg taggtataca aaacaataag cttgtagacc atgatattat agaaatactt 900
gagacaaaac acacagttga gcaaaacatg tatcagcttt caaaagaact gtctatctaa 960
<210> 10
<211> 1143
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 10
atgaaaaaac taaaagtgat gaccgttttc gggaccaggc ctgaagcgat caagatggca 60
ccgcttgtgc ttgaattgaa aaaatatcct gaaatagatt cctatgtaac ggtaactgca 120
cagcacagac agatgctcga tcaggtgtta gatgcgtttc acatcaagcc tgacttcgat 180
ttgaacatta tgaaggagcg gcagacactg gcagagatta cgtctaacgc acttgtaaga 240
ttggatgagt tgtttaaaga tatcaaaccc gatattgtgc ttgtccatgg tgatacgacg 300
acgacgtttg ccggaagcct agccgctttt taccatcaaa ttgctgtcgg tcatgtggag 360
gcggggctcc gtacagggaa taagtattcc ccgtttccgg aagagctcaa tcgacagatg 420
acaggggcga ttgctgattt gcattttgct ccgacaggcc aggcgaaaga caatttatta 480
aaagaaaaca aaaaggccga ctctattttt gtaacgggca atacagcgat tgacgcactc 540
aacacaacgg ttagggatgg ttactcacat cctgttctcg atcaggtggg tgaggataaa 600
atgattctct tgaccgctca ccgccgggaa aatttgggtg agccaatgga aaacatgttt 660
aaggccatcc gcagaattgt aggggaattt gaagatgtac aagtcgttta ccctgtgcac 720
ctgaatcctg ttgtccggga agcggctcat aagcattttg gtgattctga cagagtgcat 780
ctgattgaac ctttagaggt gatcgatttc cataactttg cagcgaaatc gcattttata 840
ttgaccgatt cgggcggcgt gcaggaggaa gccccatctc tcgggaaacc ggttcttgtt 900
ctgcgtgata cgacggaacg gcctgaagga gtggaagcgg gaacgctgaa acttgcaggt 960
acggatgagg aaaacattta tcagcttgca aaacagctgt taactgatcc tgatgagtac 1020
aagaaaatgt cccaggcttc taatccgtat ggagatggag aggcttcccg ccggattgtg 1080
gaagaattgc tgtttcatta cgggtatcga aaagaacaac cggattcatt tacaggcaaa 1140
taa 1143
<210> 11
<211> 1311
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 11
ttggaaaaaa tcatcgtccg cggcggtcag aagttaaacg gcacagtcaa agttgaaggc 60
gctaaaaatg ccgttttacc tgttatcgct gcatctttat tagcaagtga agaaaaaagc 120
gtaatttgtg atgtacctac gctctccgat gtatatacaa ttaacgaagt gttgcgtcat 180
ttaggagcag atgtgcattt tgaaaataat gaagtgactg taaatgcttc atacgctttg 240
caaactgaag caccttttga atatgttcgt aaaatgcgtg cgtctgtgct tgtcatgggg 300
ccgcttcttg cgcgtacagg tcatgcaaga gttgcacttc cgggcggatg cgcaattggt 360
tccagaccga ttgatcagca tttaaaaggt tttgaagcaa tgggcgcaga aatcaaagtc 420
ggtaatggct tcattgaagc tgaagtaaaa ggccgactgc aaggcgcaaa aatttatctg 480
gacttcccaa gtgtaggagc tacagagaac ctgattatgg cagccgctct agctgaagga 540
acaacaacgc tggaaaacgt ggcaaaagaa cccgaaatcg ttgatttagc aaactatatc 600
aacggcatgg gcggaaaaat ccgcggagct ggcaccggca ccatcaaaat tgaaggagtc 660
gaaaagcttc acggcgtaaa acaccatatt attcctgacc gtattgaagc gggcacattt 720
atggttgctg ctgcaatcac tgaaggaaac gtattagtaa aaggagcggt tcctgagcac 780
ctcacctctt taattgcaaa aatggaagag atgggtgtaa caattaagga tgaaggtgaa 840
ggtctgcgtg tcatcggccc gaaagagctt aaaccgattg acatcaaaac aatgcctcac 900
ccgggcttcc cgactgatat gcagtcacaa atgatggcgc ttctgcttcg tgcaagcggc 960
acaagcatga ttacagaaac cgtttttgaa aaccgtttta tgcatgcgga agaattccgc 1020
cgtatgaatg gtgatatcaa gattgaagga cgttctgtca tcattaacgg tcctgtacag 1080
cttcagggag ctgaagttgc agcgactgat ttgcgtgcag gtgcagcgct gattcttgcg 1140
gggttagtgg ctgaaggtca cacacgtgtt actgaattga agcacttaga ccgcggttac 1200
gttgatttcc atcagaagct tgccgctctg ggcgcagaca tcgaacgtgt aaatgatgag 1260
tctgcttctg agcaagagaa taaagaagtc gtttctgact taaatgcata a 1311
<210> 12
<211> 1290
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 12
atggaaaagt tgaatattgc cggcggtgac tcgttaaacg gtacagtaca tatcagcggc 60
gctaaaaaca gcgctgttgc gttaatacct gcaaccattt tggcaaattc cgaggtgaca 120
attgaagggc ttccagagat ttcagatatt gaaacgctgc gtgacctgtt aaaggaaatc 180
ggcggcaacg tgcattttga gaatggggaa atggttgttg accctacgtc gatgatcagc 240
atgccgcttc ctaacgggaa agtaaaaaag cttcgcgcgt catattattt aatgggggcg 300
atgctcggcc gcttcaagca ggcggtcatt ggattgcctg gcggctgtca cttagggccc 360
cgtccgattg atcagcatat caaaggcttt gaagcactcg gagctgaagt aaccaatgaa 420
caaggcgcca tttatttgcg agctgaaagg ctgagaggcg cacggattta tttagatgtc 480
gtaagcgttg gggcaacgat taacattatg ctcgccgctg ttttggcaga agggaaaacg 540
atcatcgaaa acgctgccaa ggagcctgag atcattgacg tcgcgacatt gcttaccagc 600
atgggcgcca aaatcaaagg tgcgggcacc aatgtgattc gaatcgacgg cgtgaaggaa 660
ctgcacggct gcaagcatac gatcattccg gacagaattg aagccgggac atttatgatt 720
gcaggggctg caatgggcaa ggaagtcatt atcgataacg tcatccctac tcatcttgag 780
tcgttaacgg caaagctgag agaaatgggc tatcatatcg aaacaagcga cgaccagctc 840
ctcattgtcg gcgggcagaa gaacttaaag ccggttgacg tcaaaaccct cgtatacccg 900
gggtttccga ctgatttaca gcagccgatg acggcgctcc tgacaagggc gaaagggacg 960
agtgtcgtca cagacaccat ctactcggca agattcaagc acattgatga gctgagacga 1020
atgggtgcca atatgaaagt agaaggcaga tctgccatca tcacaggtcc tgtcgagctt 1080
caaggcgcaa aagtgaaggc gagtgatctg cgtgccggag cctgcttggt ggtagccgga 1140
ctgatggctg atggcgtcac ggaaattacg ggactggagc atattgaccg aggatacagc 1200
agccttgaga agaagcttga ggggcttgga gcgacaattt ggcgtgaaag aatgactgac 1260
gaagaaatag aacagcttca aaattcataa 1290
<210> 13
<211> 300
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 13
tgcccccctc caccattatt gggctatagc caagcggtaa ggcaacggac tttgactccg 60
tcatgcgttg gttcgaatcc agctagccca gtcacagaca cctttgatca aaaggtgtct 120
tttttctttt cggaaaaatc attccaactt ctaactgttc agtctgtata ataattttaa 180
aaatatgtta aggtagttta ttcacgaatt accatctaca ccctgccaaa aatttgataa 240
acttatttta taaaaaaatt gaaacctttt gaaacgaagc tcgtatacat acagaccggt 300
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctttggccga taactcagtg aaa 23
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acgtagtcgc actatttata gatgttttat 30
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ataaaacatc tataaatagt gcgactacgt tgataggtgg tatgttttcg cttg 54
<210> 17
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ttctttttag catgtgtaca ttcctctctt tcctctctta cctataatgg taccgc 56
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aagagaggaa tgtacacatg ctaaaaag 28
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ttattttttg caggcttcaa cg 22
<210> 20
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gatgctaacg ttgaagcctg caaaaaataa acccggggat cctctagaga ttc 53
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aattttcacc atttgtaaga ataagagatt atgcctgcag gtcgacgatt c 51
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aatctcttat tcttacaaat ggtgaaaatt 30
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggtctctcgt tccaagatta gcc 23
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
attaattcta ttactttgta actagagtcg acgtccccgg gg 42
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ttcatgtgta cattcctctc ttaattggga attgttatcc gct 43
<210> 26
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ataacaattc ccaattaaga gaggaatgta cacatgaaca ctttgtctca agctatta 58
<210> 27
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ccccggggac gtcgactcta gttacaaagt aatagaatta ataatgaatt t 51
<210> 28
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggatccaaag gaggtgaaat gtacacatga gaacattaaa aaacctc 47
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gagctccccg ggacgttctt g 21
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
caagaacgtc ccggggagct ctgcggaagt aaacgaagtg 40
<210> 31
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gtgtacattt cacctccttt ggatccctat ataaaagcat tagtgtatc 49
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ttgatcgaca acttcagatg gg 22
<210> 33
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ttcaggttct gaggctcaag ggaggtctta tatgttccac cagtgtaagc c 51
<210> 34
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
aagacggctt acactggtgg aacatataag acctcccttg agcctcagaa cctgaagg 58
<210> 35
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ctctagagga tccccgggta caccgaggtg ctaccaacac c 41
<210> 36
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gagccggggt gttggtagca cctcggtgta cccggggatc ctctagag 48
<210> 37
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
taaactattt cggctttttt cttcttatgc atgcctgcag gtcgacgatt c 51
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cggtagaatc gtcgacctgc aggcatgcat aagaagaaaa aagccgaaat agtt 54
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tgaagaatac aactgggatc tgaaa 25
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aagctcgtat acatacagac cggtcaatac attacagtgc atttctttaa 50
<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cagctatgac catgattacg ccaagcttga cctcccttga gcctcagaac c 51
<210> 42
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
atctgaccga gatttttttg agcaactgtg cccccctcca ccattattgg gctat 55
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ttaaagaaat gcactgtaat gtattgaccg gtctgtatgt atacgagctt 50
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
aagcttggcg taatcatggt catagctg 28
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cagttgctca aaaaaatctc ggtcagat 28

Claims (10)

1.一种用于生产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，整合表达了透明质酸寡糖合成途径的基因，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组yoyJ-yoyA、lytH、lytD、lytG、lytC位点分别整合了基因glmM、glmS、glmU、tuaD和水蛭来源的透明质酸水解酶基因H6LHyal，均以P43启动子为启动子，同时，表达兽疫链球菌来源和巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA，并用基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统bsrE/sr5下调旁路途径基因zwf、pfkA、mnaA、murAA、murAB的表达水平。
2.根据权利要求1所述的一种用于生产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，利用质粒表达兽疫链球菌来源和巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶HasA。
3.根据权利要求2所述的一种用于生产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以pAOX01为质粒表达兽疫链球菌来源的透明质酸合酶。
4.根据权利要求2所述的一种用于生产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以pHT01为质粒表达巴斯德杆菌来源的透明质酸合酶。
5.根据权利要求1～4任一所述的一种用于生产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述透明质酸寡糖的平均分子量为(3～10)×104Da。
6.一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，利用权利要求1～4任一所述重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，利用发酵培养基生产透明质酸寡糖。
7.根据权利要求6所述的一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基(g/L)是：葡萄糖80，(NH4)2SO4 1.5，K2HPO4·3H2O 9.15，KH2PO4 3，柠檬酸三钠·2H2O1，酵母提取物10，MgSO4 2.0，酪蛋白水解液2.5，谷氨酰胺1.0，谷氨酸1.0，1毫升微量元素溶液，pH7.0；微量元素溶液组成为(g/L)：CaCl2 2.5，MgCl2 2.8，ZnCl2 0.046，CuSO4·5H2O0.019，MnCl2·4H2O 1.0。
8.根据权利要求7所述的一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，在本发明的一种实施方式中，将种子培养液接种到发酵培养基中，采用分批补料培养的方式发酵生产透明质酸寡糖。
9.根据权利要求8所述的一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，将种子培养液按8～10％接种量接种到发酵培养基中，采用发酵罐分批补料培养的方式发酵生产透明质酸寡糖，发酵温度为37℃下、通气速度为2.0vvm、搅拌速度为500rpm pH保持pH为7.0。发酵8h时，开始流加葡萄糖至发酵结束，补料速度为5g/(L·h)。
10.根据权利要求6所述的一种生产透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述透明质酸寡糖的平均分子量为(3～10)×104Da。
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