CN105087456A - 一种产特定分子量透明质酸的重组枯草芽孢杆菌构建的方法 - Google Patents

一种产特定分子量透明质酸的重组枯草芽孢杆菌构建的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产特定分子量透明质酸的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明采用兽疫链球菌来源的透明质酸合酶hasA整合于枯草芽孢杆菌实现了透明质酸的生产；同时，对HA的合成途径关键基因进行过表达实现HA在枯草芽孢杆菌的高产。在此基础上，引入水蛭来源的透明质酸酶整合至枯草芽孢杆菌基因组上，从基因表达翻译水平上对核糖体结合位点RBS序列进行突变文库构建，高通量筛选获得了一系列透明质酸酶表达水平不同的突变体。实现了透明质酸高达制备19.38g/L的产量，分子量范围从103到106道尔顿，为高效制备小分子透明质酸奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。

Description

一种产特定分子量透明质酸的重组枯草芽孢杆菌构建的方法
技术领域
本发明涉及一种产特定分子量透明质酸的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
透明质酸(HyaluronicAcid，HA)，最早是从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性多糖，由于具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。近年来研究发现，低分子量的HA(低于1×104道尔顿)和透明质酸寡糖具有独特的生物学功能，例如低于10000道尔顿的小分子寡糖具有促进创伤的愈合，抑制肿瘤细胞等。此外，HA寡糖容易被人体吸收而用于人体自身HA等多糖合成的前体，因此，HA寡糖在食品保健以及医药领域具有重要的应用前景。
HA广泛地存在于各种动物组织内，如鸡冠、关节滑液、软骨、眼玻璃体等，同时发现HA也存在于产气杆菌、绿脓杆菌和A、B、C溶血性链球菌等部分细菌中。由于动物提取工艺复杂、效率低以及存在病毒种间交叉感染和其它风险性的感染，近些年以来，透明质酸的获取已经普遍由传统的动物组织提法转变为微生物发酵法，而应用最广的是致病性弱的溶血性链球菌C族菌，如Streptococcusequi和S.zooepidemicus，而且微生物发酵法获得的HA多为大分子量的HA。面对越来越高的卫生安全要求，寻找安全可靠的微生物宿主生产透明质酸显得越来越迫切。
目前，虽然已有报道采用从头合成的方法来制备HA寡糖，但由于化学合成存在底物昂贵、步骤繁琐以及合成效率低等多问题，难以实现HA寡糖制备应用。目前，HA降解的方法主要有物理降解和化学降解，但产生的分子量范围分布较大，产品稳定性较差，且分离纯化成本高，高能耗和高污染等，相比较，酶法催化合成HA寡糖是一种很有潜力的方法，但需要制备大量的透明质酸酶液和控制反应条件。因此，将微生物发酵生产HA和透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)相偶联，实现一菌发酵直接生产获取HA寡糖和透明质酸酶两种产物，具有一定的研究意义和工业化潜力。
透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)，是广泛分布于自然界中的一类可降解透明质酸的酶的总称。根据HAase的来源、结构和作用机制，HAase可以分为三类：内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.35，主要存在于哺乳动物以及蜜蜂、蛇、蜘蛛等毒液)、内切-β-葡萄糖醛酸苷酶(EC3.2.1.36，主要存在于水蛭)以及透明质酸裂解酶(EC4.2.2.1，主要存在于细菌、噬菌体以及真菌)。透明质酸酶作为“扩散因子”在临床上被广泛应用于药物扩散助剂,而目前商品化的透明质酸酶主要以牛睾丸组织提取制备，产品质量差，价格昂贵和具有动物疫源感染风险。
本发明在食品级微生物Bacillussubtilis中构建HA的合成途径，通过对合成HA的途径中的关键基因进行调控表达(UDP-GlcNAc和UDP-GlcA两个前体物的合成途径关键基因)，实现HA在食品级微生物Bacillussubtilis中的高产。同时，在构建的合成HA工程菌中进行分泌表达水蛭HAase，实现一菌同步发酵生产HA和HAase。特别是，采用基因工程手段，在翻译水平上精确调控HAase的表达分泌水平，实现了特定分子量HA的发酵生产，这一偶联模式不仅解决了当前微生物生产HA过程中由于粘度过高导致发酵停滞，产量难以获得大幅度突破的瓶颈问题，尤其是本项目首次实现微生物高效合成特定分子量的HA，这具有巨大的应用价值和经济效益。
发明内容
本发明提供一种产特定分子量透明质酸的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌内构建了产透明质酸的途径，偶联分泌表达透明质酸酶，并通过不同强度的RBS来调控透明质酸酶的表达量。
所述透明质酸酶表达量越高，重组枯草芽孢杆菌生产所得HA的分子量越小，产量相应提高。
在本发明的一种实施方式中，所述分泌表达透明质酸酶是将组成型启动子PlepA、RBS和信号肽的融合片段，以及透明质酸酶基因，整合到构建了产透明质酸途径的枯草芽孢杆菌中；所述PlepA、RBS和信号肽的融合片段的核苷酸序列如SEQIDNO.8或SEQIDNO.12或SEQIDNO.13所示。所述整合可通过质粒pBlueScriptSK(+)介导。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌宿主为Bacillussubtilis168。
在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸酶的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸合酶的基因hasA可以来源于兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)、马链球菌(Streptococcusequi)或类马链球菌(Streptococcusequissp)。在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸合酶的基因hasA来源于兽疫链球菌，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述产透明质酸的途径，是在重组表达透明质酸合酶的基础上，进一步构建了透明质酸前体物质UPD-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)以及UDP-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的合成途径。
在本发明的一种实施方式中，所述UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的合成途径基因来源于链球菌属(Streptococcusspecies)、大肠杆菌(Escherichiacoli)或芽孢杆菌(Bacillus)。在本发明的一种实施方式中，编码所述途径的基因来源于枯草芽孢杆菌，包括核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的编码变位酶的基因glmM，核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的编码氨基转移酶的基因glmS。
在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸酶来源于水蛭，融合信号肽和启动子后重组整合到产HA的枯草芽孢杆菌基因组上进行表达。
本发明提供一种构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法，主要包括以下步骤：
(1)构建透明质酸的合成途径：将编码透明质酸合酶的基因hasA连接到质粒pAX01，使hasA置于木糖诱导型启动子Pxyl控制下整合于枯草芽孢杆菌基因组上表达；将编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD与P43RBS序列融合，UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU与P43RBS序列融合，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB与启动子Pveg和P43RBS融合，变位酶的基因glmM与P43RBS融合，氨基转移酶的基因glmS与P43RBS序列融合，将5个片段串联重组至表达载体pP43NMK，转化枯草芽孢杆菌得到含透明质酸合成途径的重组菌株；
(2)偶联表达透明质酸酶：将透明质酸酶基因融合启动子PlepA、RBS和信号肽后整合到步骤(1)所得重组枯草芽孢杆菌的基因组中，获得偶联表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌。
所述步骤(2)中的透明质酸酶的表达量，可采用不同翻译强度RBS突变体来精细控制，RBS启动翻译的强度越大，重组枯草芽孢杆菌产的HA的分子量就越小。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)选定枯草芽孢杆菌基因组上β-半乳糖苷酶基因lacA为整合位点。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)选定枯草芽孢杆菌基因组上葡糖胺-6-磷酸脱氨酶1(nagA-nagBA)基因作为透明质酸酶整合位点。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)将水蛭透明质酸酶基因采用野生型RBS(包含于SEQIDNO.8所示融合片段)来控制表达，所得重组菌株发酵生产的HA平均分子量为6628道尔顿，酶活达到1.62╳106U/mL，HA的产量达到19.38g/L。所述野生型RBS的核苷酸序列为aggaggaa。
在本发明的另一种实施方式中，步骤(2)将水蛭透明质酸酶基因采用RBS突变体R1(包含于SEQIDNO.12所示融合片段)来控制，所得重组枯草芽孢杆菌发酵生产的HA平均分子量为18000道尔顿，酶活达到8.8╳105U/mL，HA的产量达到9.18g/L。所述RBS突变体R1的核苷酸序列为aagaggag。
在本发明的另一种实施方式中，步骤(2)将水蛭透明质酸酶基因采用RBS突变体R2(包含于SEQIDNO.13所示融合片段)来控制，所得重组枯草芽孢杆菌发酵生产的HA平均分子量为49600道尔顿，酶活达到6.4╳104U/mL，HA的产量达到7.13g/L。所述RBS突变体R2的核苷酸序列为acgtagac。
在本发明的另一种实施方式中，不表达水蛭透明质酸酶，所得步骤(1)中重组枯草芽孢杆菌发酵生产的HA平均分子量为1420000道尔顿，HA的产量达到5.96g/L。
本发明提供一种应用所述重组枯草芽孢杆菌发酵产特定分子量透明质酸(103Da<Mr<106Da)的方法，以蔗糖或葡萄糖作为碳源的无机盐培养基：5％酵母粉，2％蔗糖，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L。在3L发酵罐上进行补料分批发酵培养，37℃下，发酵56-96h获得分子量范围在6628到1420000Da之间的特定分子量透明质酸，发酵结束后继续反应，也可获得主要产物为低分子量或者HA-4、HA-6、HA-8、HA-10等透明质酸寡糖。
在本发明的一种实施方式中，碳源采用蔗糖。
在本发明的一种实施方式中，发酵温度控制为37℃。
在本发明的一种实施方式中，发酵时间控制根据不同的工程菌来设定。
所得发酵液中的透明质酸酶分离纯化后可用于食品、医药或临床等用途。
本发明利用枯草芽孢杆菌产透明质酸，与其他工程菌相比，该发明具有非常大的应用优势。首先，本发明过程中使用的宿主为食品级，完全满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险，不会对产物的医用食品安全带来隐患；其次，在产高分子HA的过程中，HA被同时分泌至胞外的透明质酸酶降解为小分子透明质酸，具有直接的目的性。本发明偶联表达透明质酸酶，降低了发酵液粘稠度，增加了溶氧和提高了HA的产量；其次，发酵液中酶水解制备的透明质酸的分子量可以精确的进行控制，产物的分子量调控范围大(103到106Da)，易于纯化回收。基于应用分析，本发明方法在工业上用于制备特定小分子的透明质酸具有潜在而非常广泛的价值。
附图说明
图1所示为水蛭透明质酸酶整合片段的构建示意图。
图2所示为从RBS突变文库筛中高通量筛选不同表达量的水蛭透明质酸酶平板图。
图3所示为含有透明质酸酶不同表达水平的突变体在3L发酵罐上补料发酵的溶氧时间曲线图。
图4所示为含有透明质酸酶不同表达水平的突变体在3L发酵罐上补料发酵的透明质酸酶活产量。
图5所示为含有透明质酸酶不同表达水平的突变体在3L发酵罐上补料发酵的透明质酸产量。
图6所示为含有透明质酸酶不同表达水平的突变体在3L发酵罐上补料发酵的透明质酸分子量。
具体实施方式
序列表中为相关核苷酸序列信息：
(1)SEQIDNO.1为兽疫链球菌来源的透明质酸合酶hasA基因编码序列；
(2)SEQIDNO.2为枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶tuaD基因编码序列；
(3)SEQIDNO.3为枯草芽孢杆菌来源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶glmU基因编码序列；
(4)SEQIDNO.4序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB编码序列；
(5)SEQIDNO.5序列信息为枯草芽孢杆菌来源的变位酶的基因glmM的编码序列；
(6)SEQIDNO.6为枯草芽孢杆菌来源的氨基转移酶glmS基因编码序列；
(7)SEQIDNO.7序列信息为水蛭来源的透明质酸酶基因序列；
(8)SEQIDNO.8序列信息为人工构建片段PlepA-RBS-信号肽yewA序列；
(9)SEQIDNO.9序列信息为博来霉素抗性基因片段序列
(10)SEQIDNO.10序列信息为枯草芽孢杆菌组成型启动子P43的基因序列；
(11)SEQIDNO.11序列信息为枯草芽孢杆菌诱导型启动子Pveg的基因序列。
(12)SEQIDNO.12序列信息为人工构建片段PlepA-RBS1-信号肽yewA序列。
(13)SEQIDNO.13序列信息为人工构建片段PlepA-RBS2-信号肽yewA序列。
采用硫酸咔唑比色法测定透明质酸中的葡萄糖醛酸含量，再乘以2.067倍即获得透明质酸的含量。
透明质酸酶酶活采用3，5—二硝基水杨酸比色法测量水解透明质酸产生的还原糖当量，用分析纯葡萄糖作标准曲线，用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，求出酶的比活力。反应体系为1ml，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/ml的HA，反应体系加入800μl的HA溶液、适量的发酵上清液酶液，缓冲液补足至1ml；对照组采用不含透明质酸酶基因的枯草芽孢杆菌发酵上清液，在38℃反应20min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量(相当于等量葡萄糖的还原力)，计算发酵液产生的酶活单位数。
发酵产物HA分子量检测分析方法：使用安捷伦公司的高效液相色谱仪1260进行分析，选择示差检测器RID，使用凝胶色谱柱UltrahydrogelLinear进行分析。流动相选择0.1M硝酸钠进行洗脱，柱子温度设定为40摄氏度，进样量40μL，每个样品洗脱时间25min，使用中国食品药品检定研究院出产的右旋糖酐作为标准品，利用GPC软件进行平均分子质量的计算。
实施例1整合重组质粒pAX01-hasA的构建
本发明所用的透明质酸合酶hasA基因来源于为兽疫链球菌StreptococcuszooepidemicusATCC35246，S.zooepidemicus菌株接种于5mlM17液体培养基，在37℃200rpm培养16h。收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取兽疫链球菌株的基因组DNA。
根据已公布的基因组信息序列，分别设计引物hasA-F/hasA-R，以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取hasA基因。
引物序列信息：5’-3’方向
hasA-F：CGCGGATCCATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
hasA-R：TGCATGCATTTATAATAATTTTTTACGTGTTCC
在上下游引物两端分别引入BamHI和SacII限制性酶切位点。PCR扩增获取的hasA片段和质粒pAX01分别采用BamHI和SacII进行双酶切，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μlSolution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，重组质粒pAX01-hasA构建成功。重组质粒转化Bacillussubtilis168，以20μg/ml的红霉素平板进行筛选整合重组子，并对重组菌株进行PCR验证和测序验证，对成功整合Pxyl-hasA的枯草芽孢杆菌菌株命名为E168T。
实施例2重组质粒pP43NMK/pP43-DU-PBMS的构建
Bacillussubtilis168菌株接种于5mlLB培养基，37℃，200rpm培养16h。收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌菌株的基因组DNA。根据已公布的Bacillussubtilis168基因组信息序列，分别设计引物tuaD-F/tuaD-R、glmU-F/glmU-R。在上游引物tuaD-F的5端引入KpnI限制性酶切位点和P43RBS序列(SEQIDNO.14)，在下游引物tuaD-R的5端引入SacI限制性酶切位点；在上游引物glmU-F的5端引入SacI限制性酶切位点和P43RBS序列，在下游引物glmU-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点。PCR扩增产物纯化后，tuaD和glmU片段分别采用KpnI/SacI和SacI/XhoI双酶切，载体pP43NMK采用KpnI/XhoI双酶切，三个片段纯化回收后，进行DNA连接反应，连接产物直接转化大肠杆菌JM109感受态，涂布卡那霉素平板筛选，挑取克隆进行PCR验证并测序正确，获得pP43-DU重组质粒。
设计引物Pveg-F和Pveg-R扩增启动子Pveg片段，设计引物Pveg-gtaB-F(带有P43RBS)和gtaB-R扩增gtaB片段，采用融合PCR方法，将Pveg片段和gtaB片段融合，并且上游带有SpeI和下游带有XbaI-XhoI限制性酶切位点，采用SpeI和XhoI双酶切后，与经XbaI(与SpeI同尾酶)和XhoI双酶切的载体pP43-DU进行连接重组，获得质粒pP43-DU-PB，同理，设计引物glmM-F/glmM-R、glmS-F/glmS-R，分别在上游引物glmM-F和glmS-F的5端引入SpeI限制性酶切位点和P43RBS序列，下游引物glmM-R和glmS-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点。采用同尾酶策略，先后将glmM和glmS分别连入质粒，最后获得重组质粒pP43-DU-PBMS，并转化枯草芽孢杆菌E168T感受态细胞，获得高产HA的重组菌株E168T/pP43-DU-PBMS。
引物信息如下：
tuaD-F：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGG
tuaD-R：CCGGAGCTCTTATAAATTGACGCTTCCCAAG
glmU-F:CGGGAGCTCAAGAGAGGAATGTACACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG
glmU-R：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCAC
Pveg-F：GGACTAGTGGAGTTCTGAGAATTGGTATGC
Pveg-R：ATGTAAATCGCTCCTTTTTAACTAC
Pveg-gtaB-F：GTAGTTAAAAAGGAGCGATTTACATATGAAAAAAGTACGTAAAGC
glmM-F：GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGGGCAAGTATTTTGGAACAGACGG
glmM-R：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCTAATCCCATTTCTGACCGGAC
glmS-F：GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGTGTGGAATCGTAGGTTATATCGG
glmS-R：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCCACAGTAACACTCTTCGC
DNA操作技术：以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，分别扩增获取上述基因片段。回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μlSolution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确。
实施例3水蛭透明质酸酶LHyal基因整合片段的构建
以博来霉素抗性基因Zeocin作为选标记，选定枯草芽孢杆菌基因组上葡糖胺-6-磷酸脱氨酶1(nagA-nagBA)基因位点作为透明质酸酶整合位点。采用整合质粒同源重组技术，构建整合片段(见附图1)。此实施例引物信息序列如下：
H6LHyal-F：ATGCACAGTCTGCAGAATTCCACCACCACCACCACCACATG
H6LHyal-R：TTACTTTTTGCACGCTTCAACAT
ZHLHPlepA-F：CGCAGCCAAAGGAGTGGATTGCCTCAATCCTAGGAGAAACAG
ZHLHPlepA-R：GAATTCTGCAGACTGTGCATGAGC
ZHLH-front-F：TCAGCTGGTCTAGATCACTAGTC
ZHLH-front-R：AATCCACTCCTTTGGCTGCGCTC
ZHLH-zeocin-F：TTGAAGCGTGCAAAAAGTAAGAGCTCGGTACCCGGGGATCC
ZHLH-zeocin-R：GCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC
ZHLH-back-F：CGACCTGCAGGCATGCAAGCCACTTCTTTCAGACGGAACCCTTGC
ZHLH-back-R：CGGTCGTTCATATAGAAGTGATAG
ZHLH-pSK-F：CACTTCTATATGAACGACCGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC
ZHLH-pSK-R：TAGTGATCTAGACCAGCTGAGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC
采用引物H6LHyal-F/H6LHyal-R和ZHLH-zeocin-F/ZHLH-zeocin-R分别扩增透明质酸酶和博来霉素基因片段；引物ZHLHPlepA-F/ZHLHPlepA-F以基因合成的片段为模板扩增包含启动子PlepA、RBS和信号肽yewA的片段；引物ZHLH-front-F/ZHLH-front-R、ZHLH-back-F/ZHLH-back-R以枯草芽孢杆菌基因组为模板分别扩增片段作为整合用的上下游同源臂；ZHLH-pSK-F/ZHLH-pSK-R以质粒pBlueScriptSK(+)为模板扩增片段作为重组载体。上述5个片段和一个载体采用同源重组技术进行一步组装，产物转化大肠杆菌JM109感受态，在布含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，置于37℃培养12h，在LB平板上能生长的菌进行PCR验证和测序，正确的重组质粒命名为pSKZHLH。
重组质粒pSKZHLH直接转化枯草芽孢杆菌改造的HA生产菌株E168T/pP43-DU-PBMS感受态细胞，涂布含有25ug/mlZeocin的LB平板，置于37℃培养12h，在LB平板上能生长的菌为成功重组H6LHyal的宿主，通过提取基因组进行PCR验证和测序，该宿主改造成功，含有水蛭透明质酸酶的重组菌株命名为E168TH/pP43-DU-PBMS。
实施例4构建调控不同表达强度的透明质酸酶的RBS文库
在核糖体(RBS)翻译水平上进行基因工程技术改造，构建一个调控范围差异大的文库。以质粒pSKZHLH为模板，在RBS处设计两条方向相反的引物，其中一条含有RBS区域，并且在该区域引入高度简并序列即引物JB/lepA-RBS-R，引物5端引入KpnI限制性酶切位点，反向引物ZHLH-H6F5端同样引入KpnI限制性酶切位点，引入信息如下：
JB/lepA-RBS-R：ACGGGGTACCACTNTNYNHBYACTATTAAACGCAAAATACACTAGCTTAG
ZHLH-H6F：ACGGGGTACCATGCTAAAAAGAACTTCATTCG
采用两条引物扩增整个质粒，获得片段经DpnI酶切去除质粒模板，纯化回收后，在进行KpnI酶切。回收产物进行连接反应，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μlSolution连接酶，16℃连接过夜。连接产物直接转化E168T/pP43-DU-PBMS感受态细胞，涂布含有25ug/mlZeocin的LB平板，置于37℃培养12h。从平板上随机挑取500个克隆，进行96孔板高通量培养，发酵培养基为无机盐培养基：2％酵母粉，7％蔗糖，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L，置于200rpm37℃培养60h。
为快速高效检测透明质酸酶活的表达差异，采用平板透明圈显色法：底物透明质酸溶于pH5.5的柠檬酸缓冲液配成2mg/ml的浓度，1.5％的琼脂糖用pH5.5的柠檬酸缓冲液配置，加热溶化后，与等体积的透明质酸底物溶液充分混匀，倒入平板中，凝固后进行打孔。96孔板培养的发酵液4000rpm5min离心后，上清液各取150μl注入平板孔内，37℃培养10h。再加入2.5g/L的十六烷基溴化胺溶液显色30min。结果如图2所示，改造RBS后的突变体表现出非常明显的酶活表达差异。
实施例5重组菌株在3L发酵罐进行分批补料发酵
挑取E168T/pP43-DU-PBMS、E168TH/pP43-DU-PBMS、E168THR1/pP43-DU-PBMS和E168THR2/pP43-DU-PBMS4个重组菌分别进行上罐发酵。单克隆接种于3瓶50ml(500ml摇瓶)含有50μg/mlKan的LB培养基作为上罐种子，置于200rpm37℃过夜培养12h。发酵罐装液量1.35L，发酵培养基为无机盐培养基：2％酵母粉，1.5％蔗糖，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L，pH7.0。按10％的接种量进行接种发酵罐，在接种后第2h添加2g/L的木糖进行诱导hasA基因表达，发酵过程中第8h进行补料碳源(蔗糖)，前4个小时按7.5,7.5,15.0,10.0gh-1L-1，后面以恒定的速率5gh-1L-1补料至发酵结束，在间隔的时间进行取样测定HA产量，透明质酸酶活表达水平。为测定HA的产量和分子量。收集发酵液，10000rpm下室温离心10min。发酵液上清转移置另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇充分混匀沉淀发酵液中的透明质酸。室温下静置1h，再10000rpm下室温离心20min，去除干净液体，白色沉淀加入发酵液等体积的1MNaCl溶液充分溶解，下一步用于产量和分子量的测定。
由于重组菌株E168T/pP43-DU-PBMS不含有透明质酸酶，所以发酵到15小时后，透明质酸的含量增大，导致粘稠度增加，如图3所示，溶氧急剧下降，到40小时基本溶氧为0，严重影响了细胞的生长和透明质酸的积累，而其他三个表达有透明质酸酶不同酶活的重组菌株E168TH/pP43-DU-PBMS、E168THR1/pP43-DU-PBMS和E168THR2/pP43-DU-PBMS4，发酵液不粘稠，在发酵后期溶氧维持在较高的水平，有利于透明质酸产量的积累。同时，对三个重组菌株的胞外透明质酸酶进行测定产量，结果如图4所示，三个重组菌株的透明质酸酶最高产量分别为1.62×106、8.8×105和6.4×104U/ml。对透明质酸的产量分别进行测定，结果如图5所示，不表达透明质酸酶的菌株E168T/pP43-DU-PBMS由于粘度变稠，最大产量达到5.96g/L，而表达透明质酸酶最高的E168TH/pP43-DU-PBMS菌株，HA的产量提高到19.38g/L，另外两个透明质酸酶表达较低的菌株E168THR1/pP43-DU-PBMS和E168THR2/pP43-DU-PBMS4，透明质酸的最大产量分别为9.18和7.13g/L。这一结果说明，透明质酸酶的表达越高，越有助于提高透明质酸的产量。
根据HA产物的分子量测定，结果如图6所示，不同透明质酸酶的表达量，所得重组菌株发酵生产HA的平均分子量之间有显著区别。不表达透明质酸酶的重组菌株E168T/pP43-DU-PBMS，分子量高达142×106道尔顿。而另外三个重组菌株的透明质酸酶最高产量分别为1.62×106、8.8×105和6.4×104U/ml，对应的透明质酸分子量分别为6628、18000和49600道尔顿。
以上结果说明，本发明技术采用基因工程技术，在基因翻译水平上调控透明质酸酶的表达水平，可以精确的控制从103到106道尔顿范围内特定分子量透明质酸的发酵生产。并且，在发酵结束后，离心收集发酵液上清，放置1-3h，继续水解可以获得HA10、HA8、HA6和HA4等寡糖产物。

Claims (10)

1.一种产透明质酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是在枯草芽孢杆菌内构建了产透明质酸的途径，偶联分泌表达透明质酸酶，分别采用不同强度的RBS序列来调控透明质酸酶的表达量，以获得产特定分子量的透明质酸的重组枯草芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述偶联分泌表达透明质酸酶是将组成型启动子、RBS和信号肽的融合片段，以及透明质酸酶基因，整合到构建了产透明质酸途径的枯草芽孢杆菌中。
3.根据权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述组成型启动子、RBS和信号肽的融合片段的核苷酸序列如SEQIDNO.8或SEQIDNO.12或SEQIDNO.13所示。
4.根据权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述整合通过质粒pBlueScriptSK(+)介导，整合到枯草芽孢杆菌基因组上的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶1基因位点。
5.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述产透明质酸的途径，是在重组表达透明质酸合酶的基础上，进一步构建了透明质酸前体物质UPD-N-乙酰氨基葡萄糖以及UDP-D-葡萄糖醛酸的合成途径。
6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述透明质酸合酶的基因hasA来源于兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)、马链球菌(Streptococcusequi)或类马链球菌(Streptococcusequissp)。
7.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述UPD-N-乙酰氨基葡萄糖以及UDP-D-葡萄糖醛酸的合成途径基因来源于链球菌属(Streptococcusspecies)、大肠杆菌(Escherichiacoli)或芽孢杆菌(Bacillus)；包括编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB，编码变位酶的基因glmM，编码氨基转移酶的基因glmS。
8.一种构建权利要求1-7任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)构建透明质酸的合成途径：将编码透明质酸合酶的基因hasA通过pAX01质粒，整合至枯草芽孢杆菌基因组上，得到含透明质酸合成途径的重组菌株；
(2)过表达UPD-N-乙酰氨基葡萄糖以及UDP-D-葡萄糖醛酸的合成途径的关键基因：将编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB，编码变位酶的基因glmM和氨基转移酶的基因glmS，串联重组至pP43NMK质粒上表达，获得高产HA的重组菌株；
(3)偶联表达透明质酸酶：将透明质酸酶基因融合启动子、RBS、信号肽后整合到步骤(2)所得重组枯草芽孢杆菌的基因组中，获得偶联分泌表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌；
(4)调控透明质酸酶的表达水平以获得产特定分子量的透明质酸的重组枯草芽孢杆菌：构建透明质酸酶基因的核糖体结合位点的突变文库，获得不同强度的RBS序列，分别用于调控透明质酸酶的表达量。
9.权利要求1-7任一所述重组枯草芽孢杆菌在生产透明质酸中的应用。
10.一种应用权利要求1-7任一所述重组枯草芽孢杆菌发酵产特定分子量的透明质酸或寡聚透明质酸的方法，其特征在于，是以葡萄糖或者蔗糖作为作为碳源，在30-37℃，pH在6.0-7.0，发酵48-96h。
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