CN114990174A

CN114990174A - 一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法

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Publication number: CN114990174A
Application number: CN202210557773.4A
Authority: CN
Inventors: 方真; 丁春华; 沙冲; 章文劼
Original assignee: Jiangsu Haifei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Haifei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-19
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-05-19
Also published as: CN114990174B

Abstract

本发明公开了一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法，属于合成生物学领域和生物医药制备技术领域。本发明通过AmgK、GlmU、NodC、NodB的组合，构建了以乙酰氨基葡萄糖为底物单元从头合成壳寡糖的一种多酶催化体外途径；利用该酶组合与辅因子再生系统的偶联，底物磷酸化速率和聚合速率得到调控，壳寡糖聚合度可控(DP<10)、分子量均一(～1000Da)。在此基础上以大肠杆菌为底盘菌，将所述酶组合中的基因整合到表达载体或基因组中进行过表达，同时过表达K‑12自身的GlmS、GlmM、GlmU，获得以单一底物(乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖)为前体从头合成壳寡糖的全细胞，在5L发酵罐中壳聚糖产量可达23.2g/L，在1000L发酵罐体系中壳聚糖产量达到20g/L以上，展现了巨大的工业生产价值。

Description

一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法

技术领域

本发明涉及一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法，属于合成生物学领域和生物医药制备技术领域。

背景技术

壳寡糖(chitooligosaccharide或者chitosan oligomers)是由<20个氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的寡聚物，属于几丁质衍生物。几丁质和壳聚糖都具有重要的生物活性，这使得它们在食品、化妆品、医药和农业工业中很受欢迎。然而，这些生物高聚物的高分子量限制了它们的潜在用途，这使得它们在中性pH下的溶解度很差。有趣的是，这种限制可以通过使用壳低聚糖来克服，β-1-4-连接的GlcNAc或GlcN的同源或异源低聚物，聚合度(DP)从2到10较低。与甲壳素和壳聚糖相比，壳寡糖具有分子量小、溶解度高、吸附能力强、生物相容性好等优点。此外，壳寡糖具有广泛的生物功能，如抗氧化剂、抗炎药、抗菌药、抗肿瘤药、抗高血压药以及益生元特性，因此在营养品、化妆品和制药领域显示出巨大潜力。

小分子量(～1000Da)壳寡糖已被证实具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等多种生物活性。壳寡糖的结构，如聚合度、脱乙酰度及乙酰基位点在寡糖链上的分布都可能影响其与特定受体的结合能力，从而影响其生物活性。传统壳寡糖规模制备中，首先采用溶解性差的高脱乙酰度壳聚糖作为底物，制备方法主要分为物理、化学、酶解法3大类。酶解法具有无污染、产物得率高、产品生物活性高等优点，克服了物理法效率低以及化学法污染环境的缺点。但是，以虾壳来源的壳聚糖为前体生产壳寡糖，仍然存在前体预处理复杂、环境不友好、以及壳聚糖水解酶活性低等缺陷，限制了规模化工业应用。

发明内容

目前的研究发现微生物中存在以乙酰氨基葡萄糖为受体和UDP-乙酰氨基葡萄糖为供体，合成几丁质寡糖的关键酶(几丁质合成酶NodC)。因此，设计特定的从头合成途径，通过多种酶混合的催化反应，直接以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为单糖底物，聚合形成壳寡糖将有望成为可能。同时，该类型的多酶催化体系可在全细胞内进行整合，是一种低成本、低污染、低能耗的壳寡糖制备技术。

本发明采用微生物资源及其数据库，挖掘了新型酶分子，开发出了均一分子量壳寡糖的多酶催化的从头合成途径(以乙酰氨基葡萄糖为底物)，实现了该新途径实现在工程菌株中的合理组装，从而为获得了以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为底物从头合成壳寡糖的全细胞催化体系及其生产方法。本发明的目的在于提供一种壳寡糖从头合成的催化途径、多酶催化体系、全细胞转化的工程菌及生产方法。

本发明的首先提供一种具有以乙酰氨基葡萄糖为出发单糖、从头合成均一分子量壳寡糖的多酶催化体系，所述酶催化体系主要包括N-乙酰氨基葡萄糖激酶(AmgK)、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(GlmU)、几丁质合成酶(NodC)、脱乙酰基酶(NodB)。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖激酶AmgK来源于Pseudomonasaeruginosa ATCC 15692；所述UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶GlmU来源于Escherichiacoli MG1655；所述几丁质合成酶NodC和脱乙酰基酶NodB来源于Azorhizobiumcaulinodans ORS 571。

在一种实施方式中，编码所述AmgK的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，编码所述GlmU的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，编码所述NodC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，编码所述NodB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述的多酶催化体系还含有以下任一组合：

(a)腺嘌呤核苷三磷酸和尿苷三磷酸；

(b)来源于Ruegeria pomeroyi的多聚磷酸盐激酶、二磷酸腺苷及尿苷二磷酸。

本发明的第二个目的是提供利用所述多酶催化体系生产壳寡糖的方法，所述方法是以乙酰氨基葡萄糖为底物，转化合成壳寡糖。

在一种实施方式中，将所述N-乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶和脱乙酰基酶按照相同的酶活量加入反应体系中，每种酶按照每毫摩尔底物添加 100～200U；并添加1/2底物浓度的ATP和UTP，在pH6.5～7.5下反应不少于6h。

在一种实施方式中，乙酰氨基葡萄糖浓度为100～500mM，N-乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP- N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶、脱乙酰基酶和多聚磷酸盐激酶的比例为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，且各种酶按照不少于每毫摩尔底物100U的量添加至反应体系中；二磷酸腺苷初始浓度为50～100mM，在30～40℃下反应，多聚磷流加速度为1～100mg/L/min， pH6～8。

优选的，N-乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶、脱乙酰基酶和多聚磷酸盐激酶的比例为1:1:1:1:1、1:1:2:2:1或2:2:1:1:1；所述反应温度为40～50℃，辅因子浓度为50～100mM。

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，是在大肠杆菌中削弱pgm和nagB的表达并敲除murQ，并将编码葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、葡萄糖-1-磷酸N乙酰基转移酶的基因的启动子替换为组成型启动子J23119得到大肠杆菌底盘细胞，在大肠杆菌底盘细胞中表达来源于Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692的N-乙酰氨基葡萄糖激酶、来源于 Escherichia coli MG1655的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、来源于Azorhizobiumcaulinodans ORS 571的几丁质合成酶和脱乙酰基酶、以及来源于Ruegeria pomeroyi的多聚磷酸盐激酶。

在一种实施方式中，以敲除了lacI序列的pTrc99A质粒为所述几丁质合成酶和脱乙酰基酶的表达载体；在质粒pACYC184上整合trc启动子和rrnB T1终止子，用以表达所述N-乙酰氨基葡萄糖激酶和UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，以核苷酸序列如SEQ ID No.7的RBS 序列为N-乙酰氨基葡萄糖激酶和UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的共表达核糖体结合位点；以pACYCDuet-1质粒为表达载体J23119启动子启动磷酸激酶PPK基因的表达。

在一种实施方式中，所述葡萄糖合成酶的NCBI Reference Sequence:NP_418185.1。

在一种实施方式中，所述磷酸葡萄糖胺变位酶的NCBI Reference Sequence:NP_417643.1。

在一种实施方式中，葡萄糖-1-磷酸N乙酰基转移酶的NCBI Reference Sequence:NP_418186.1。

在一种实施方式中，所述的PPK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第四个目的是提供一种具有所述壳寡糖从头合成途径的基因工程菌的构建方法，所述全细胞构建步骤如下：

(1)通过大肠杆菌同源重组策略，替换大肠杆菌自身酶系(氨基葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、葡萄糖-1-磷酸N乙酰基转移酶)的启动子为高强度启动子J23119，获得工程菌底盘细胞；

(2)采用磷酸激酶基因与pBBR1MCS-2质粒进行整合，得到无需诱导的pBBR-ppk表达载体，转化到上述底盘细胞后得到具有辅因子再生系统的基因重组工程菌；

(3)将nodCB基因整合到pTrc99A为骨架的ΔlacI衍生质粒中，将glmU和amgK基因整合到 pACYC184质粒中，分别得到无需诱导的pTrc-nodCB和pACYC-glmU-amgK两个表达载体，将上述两种表达载体导入大肠杆菌底盘细胞，得到含有壳寡糖从头合成途径的全细胞。

本发明的第五个目的是提供基因工程菌的全细胞生产方法，所述所述方法是将上述的全细胞在抗性平板培养获得重组菌单克隆，随后，将上述重组菌单克隆接种至液体种子培养基，培养至一定细胞量来获得重组菌的种子液。收集种子液菌体细胞并生理盐水清洗，稀释到以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为单糖的催化体系中，最终从头合成聚合度可控(DP<10)、分子量均一(～1000Da)、底物转化率高(>70％)的壳寡糖。

在一种实施方式中，所述的抗性平板配方为：15g/L琼脂粉，10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L NaCl，25mg/L四环素，80mg/L氨苄青霉素，25mg/L庆大霉素。

在一种实施方式中，所述的全细胞培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L NaCl，10-100g/L葡萄糖或甘油，25mg/L四环素，80mg/L氨苄青霉素，25mg/L庆大霉素)。

在一种实施方式中，所述的全细胞催化体系配方为：50mM Tris-HCl，20-80OD₆₀₀，10- 100g/L葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖，10-100g/L多聚磷，10mL维生素混合液(每升含有2mgbiotin,2mg folic acid,10mg pyridoxine·HCl，5mg riboflavin,5mg nicotinic acid,5mg calcium D-(+)-pantothenate,0.1mg vitamin B12,5mg p-aminobenzoic acid,5mgthioctic acid)，10mL微量元素混合液(每升含有0.5g MnSO₄·H₂O,0.2g ZnSO₄,0.1gCaCl₂,0.1g CoCl₂·6H₂O,0.1g FeSO₄·7H₂O,20mg CuCl₂·2H₂O,10mg Na₂SeO₃,10mgNiCl₂·6H₂O,10mg Na₂WO₄·2H₂O,)， 25mg/L四环素，80mg/L氨苄青霉素，25mg/L庆大霉素，采用HCl或NaOH调节最终pH 7.2。

本发明的第六个目的是提供一种全细胞转化生产壳寡糖的方法，所述方法是所述的基因工程菌以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为底物生产壳寡糖。

将所述基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1～5，按照体积比2～10％的量接种至含有5～100g/L葡萄糖的发酵体系中，在30℃和200rpm恒温摇床中培养不少于96h；

或者，将所述基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1～5，按照体积比2～10％的量接种至含有5～100g/L 葡萄糖的发酵体系中，控制通风量为1.0～2.0v/v、搅拌转速500～800rpm，发酵不少于60h。

在一种实施方式中，在发酵第24小时开始持续12h加入流加培养基，在发酵第60小时开始持续24h加入流加培养基，所述葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖的浓度比为(1～3):1，当比例为 3:1时，葡萄糖的流加速度为15g/L/h，对应的乙酰氨基酸葡萄糖的流加速度为5g/L/h；当比例为2:1时，葡萄糖的流加速度为10g/L/h，对应的乙酰氨基酸葡萄糖的流加速度为5g/L/h；当比例为1:1时，葡萄糖的流加速度为5g/L/h，对应的乙酰氨基酸葡萄糖的流加速度为5g/L/h。

在一种实施方式中，所述多聚磷酸盐的浓度为100～300mM，在发酵第24小时开始按照 1mL/h速度进行流加。

在一种实施方式中，在发酵前期(OD600＜10)溶氧维持在10％以上，发酵中期维持溶氧在10％～30％，发酵后期(OD600＞50)溶氧维持在30％±10％。

优选的，所述基因工程菌的接种量为5％～10％。

优选的，初始发酵培养基中葡萄糖的浓度为10～100g/L。

优选的，所述葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖的浓度比为1:1。

优选的，所述多聚磷酸盐浓度为200～300mM。

本发明还提供所述多酶催化体系及基因工程菌在生物化工、制药或食品领域中实现壳寡糖的高效从头合成的应用。

本发明的有益效果：

本发明以4种关键酶分子为催化单元和乙酰氨基葡萄糖为底物，构建体外从头合成壳寡糖的多酶催化途径。整条途径简单(只需4步，为目前已报导的最多路径)、底转化效率高(>70％)，合成的壳寡糖聚合度可控(DP<10)、分子量均一(～1000Da)。因此，采用该新型途径在其最近催化体系下进行壳寡糖的从头合成，应用潜力巨大。

在上述的多酶催化途径的基础上，本发明以大肠杆菌为底盘菌，通过自身相关基因的强启动子替换、重组质粒的快速构建与导入，获得拥有完整的壳寡糖从头合成途径的重组大肠杆菌。通过后期细胞扩增和收集，获得具有从头合成壳寡糖途径的全细胞。该全细胞拥有辅因子再生系统，可在优化后的催化体系中高效聚合葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为聚合度可控 (DP<10)、分子量均一(～1000Da)的壳寡糖，在5L发酵罐体系中壳聚糖产量可达23.2g/L，在 1000L发酵罐体系中壳聚糖产量达到20g/L以上，展现了巨大的工业生产价值。

附图说明

图1是以乙酰氨基葡萄糖为底物从头合成壳寡糖的体外途径。

图2是以五单位壳寡糖合成为代表的产物HPLC图谱特征峰。

图3是全细胞法从头合成五单位壳寡糖的代谢途径。

图4是大肠杆菌从头合成5单位壳寡糖的产量结果。

具体实施方式

以下实施例中以大肠杆菌JM109为质粒克隆扩增的主要载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为酶表达宿主；所使用的骨架型质粒pETDuet-1和pACYCDuet-1均为Novagen公司的商业化产品，所采用质粒提取试剂盒为上海生工公司商业化产品；基因与引物的合成都由上海生工公司完成；大肠杆菌生物量即为细胞浓度，采用分光光度计于1cm光程测定600nm处的吸光度差值。

下述实施例中，没有多作说明的都是采用常规分子生物学实验方法完成，所采用酶相关试剂盒均在大连宝生物公司购买。

酶活测定：

N-乙酰氨基葡萄糖激酶(AmgK)酶活测定：该酶主要依靠ATP来催化GlcNAc到GlcNAc- 6-P，可以通过磷酸化速度来测定AmgK的酶催化活性，其中磷酸化速度可以通过酶级联反应来测定。首先，在1mL反应液(100mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl₂，5mM ATP，1mM磷酸烯醇丙酮酸，0.2mM NADH，10U丙酮酸激酶，7U乳酸脱氢酶)中，分别加入不同浓度(0.01-2.5mM)的GlcNAc，通过加入0.5μg的AmgK酶液在30℃启动反应；然后，通过紫外分光光度计在340nm实时监测吸光度变化，通过绘制的米氏方程曲线可以比较不同来源的 AmgK酶活性。

UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(GlmU)酶活测定：GlmU属于双功能酶，拥有尿苷酰转移酶活性和乙酰基转移酶活性，我们主要针对尿苷酰转移酶活性进行酶活测定。首先，配置 25mM HEPES缓冲液(pH 7.6)，加入终浓度分别是5mM MgCl₂,1mM DTT,1mM GlcNAc-1-P,2mM UTP,0.04U热温度无机焦磷酸酶(TIPP)以及不同浓度的GlmU，在30℃下反应半小时后加热到65℃终止反应；然后，采用商业化试剂盒(Malachite Green Phosphate AssayKit, Sigma-Aldrich)进行磷酸盐含量分析，从而测定GlmU的尿苷酰转移酶活性。

几丁质合成酶(NodC)酶活测定：以50mM的Tris-HCl(pH 7.0)为缓冲液，5mM的UDP-GlcNAc为供体，0.5mM的GlcNAc为受体，加入0.5-2.5μg的NodC，在37℃下反应24h 后加入10％三氯乙酸终止反应；随后，采用Asahipak NH2P-50 4E色谱柱(250×4.6mm；ShodexChina Co.,Ltd.,Shanghai,China)和蒸发光散射检测器的液相色谱(流动相57％乙腈)进行寡糖产物检测，根据产物浓度对NodC酶活进行标定和比较。

脱乙酰基酶(NodB)酶活测定：以50mM的Tris-HCl(pH 7.0)为缓冲液，以5mM乙酰基化的壳寡糖作为底物，加入0.5-2.5μg的NodB，在37℃下反应24h后加入10％三氯乙酸终止反应；随后，采用Aminex HPX-8H柱的液相色谱对产物中的乙酸含量进行分析，从而标定NodB的酶催化活性。

多聚磷酸盐激酶(PPK)酶活测定：根据多聚磷酸盐在550nm处存在较强的吸收峰，可通过监测反应体系中多聚磷酸盐吸光度变化来标定PPK酶催化速率。在50mM的HEPES缓冲液(pH7.5)中，加入5mM的ADP和MgSO₄，加入0.5-2.5μg的PPK酶，在37℃反应条件下监测反应体系550nm处的吸光度变化并绘制时间曲线。根据不同酶浓度标定的反应曲线，从而计算PPK酶活性。

实施例中所涉及PCR、酶切、连接过程都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。

实施例1：从头合成壳寡糖的多酶催化体系的构建

(1)4种关键酶的异源表达和酶纯化

本专利基于酶催化方案，设计五单位壳寡糖的体外从头合成途径(见图1)，以下体外合成体系都基于此途径开展。

选择来自Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692的amgK基因、Escherichia coliMG1655的glmU基因、Azorhizobium caulinodans ORS 571的nodB和nodC基因，以大肠杆菌为表达宿主进行密码子优化，优化后的amgK基因、glmU基因、nodB基因、nodC基因的序列分别如SEQ ID NO.1～4所示，以NdeI/XhoI作为双酶切位点、以6×His-tag作为蛋白C端融合短肽，直接进行基因合成。将上述3种基因和质粒pETDuet-1分别进行双酶切，通过T4 DNA连接酶16℃连接上述酶切后的基因和线性化质粒片段1小时，即可转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态。最后，通过含有氨苄抗性的LB培养基固体平板筛选和基因测序，分别获得含有目标表达载体 (pET-amgK、pET-glmU、pET-nodC和pET-nodB)的正确菌株，将其用甘油保存后备用。

采用LB培养基，接种上述四种含有正确表达载体的菌株，在对数生长前期(OD₆₀₀＝0.5)加入200μM终浓度的IPTG，在30℃下诱导24小时后离心收集菌体，进行超声破碎和高速离心后取上清，初步获得酶溶液。采用填充镍柱10mL，对上述四种酶溶液进行酶纯化，测定纯化后酶溶液的蛋白浓度、酶活以及分子量大小，后续采用甘油溶液混合，在-80℃下保存备用。

(2)壳寡糖体外从头合成途径的多酶体系构建

根据上述四种酶(N-乙酰氨基葡萄糖激酶(AmgK)、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(GlmU)、几丁质合成酶(NodC)、脱乙酰基酶(NodB))的蛋白浓度和酶活高低，计算比酶活。初步按照四种酶的比酶活(50U/μl、20U/μl、10U/μl、20U/μl)，调节酶溶液添加体积(2μl、5μl、10μl、 5μl)，使得最终活性比例1:1:1:1，以50mM Tris-HCl为缓冲液(pH 7.0)，继续添加100mM乙酰氨基葡萄糖、50mM ATP和50mM UTP，得到由四种酶组成的壳寡糖体外从头合成多酶催化体系，在40℃下反应6h。通过HPLC液相分析，体外酶催化得到48mg/L五单位壳寡糖(见图2)。

(3)辅酶再生体系的构建

选择Ruegeria pomeroyi来源的多聚磷酸盐激酶PPK基因，以大肠杆菌为表达宿主进行密码子优化，得到优化后的序列如SEQ ID NO.5所示，以NdeI/XhoI作为双酶切位点、以6×His- tag作为蛋白C端融合短肽，直接进行基因合成。采用pACYCDuet-1为表达载体，通过 NdeI/XhoI双酶切位点进行连接得到pACYC-PPK质粒。化学法转化质粒到大肠杆菌 BL21(DE3)得到表达PPK酶的重组菌。在经过IPTG诱导表达24h后，收集菌体进行超声破碎后取上清酶液，在蛋白纯化后进行酶活测定、蛋白浓度分析，计算出比酶活，-80℃下保存备用。

在壳寡糖体外从头合成途径的多酶体系中添加1mg/L的多聚磷酸激酶PPK，以多聚磷酸为底物进行恒速流加(1-100mg/L/min)，通过酶催化循环再生ATP和UTP。测定壳寡糖合成前体乙酰氨基葡萄糖的消耗速率(10-100mg/L/min)以及壳寡糖合成速率(1-10mg/L/min)，计算辅因子ATP/UTP最大需求速率(～5mM/min)，从而调节ADP添加浓度在25-50mM之间，增加 UDP浓度到50-100mM之间，从而获得辅因子再生速率和壳寡糖合成速率相匹配的多酶催化体系。

实施例2：从头合成壳寡糖的催化体系的优化

基于N-乙酰氨基葡萄糖激酶(AmgK)、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(GlmU)、几丁质合成酶(NodC)、脱乙酰基酶(NodB)以及多聚磷酸盐激酶(PPK)，按照四种酶的比酶活(50U/μl、 20U/μl、10U/μl、20U/μl、50U/μl)，调节酶溶液添加体积(2:5:10:5:2、2:5:20:10:2、4:10:10:5:2) μl，从而得到不同种酶分子比例(1:1:1:1:1、1:1:2:2:1、2:2:1:1:1)；另外设置辅因子ADP初始浓度(25，50，75，100mM)、pH6-8、温度30-50℃、乙酰氨基葡萄糖浓度(100-500mM)以及多聚磷流加速度(1-100mg/L/min)为优化因子，总共反应6h，进行响应面优化实验(表1)。

表1.多酶催化体系合成壳寡糖的响应面优化组合

优化结果显示，在酶分子比例(1:1:2:2:1)、辅因子初始浓度(100mM)、pH7、乙酰氨基葡萄糖浓度(100-500mM)以及多聚磷流加速度(1-100mg/L/min)条件下，获得壳寡糖聚合度可控 (DP<10)、分子量均一(～1000Da)、底物转化率高(>70％)的从头合成多酶催化体系，五单位壳寡糖最高产量为20g/L。

实施例3：具有壳寡糖从头合成途径的全细胞构建方法

(1)大肠杆菌中壳寡糖从头合成途径设计与竞争途径的削弱

基于壳寡糖体外从头合成的多酶催化体系，以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖中的一种或两种为底物，设计出两条途径共存的壳寡糖从头合成途径(如图3所示)。根据存在的三条竞争途径(Glc-6P→Glc-1P，GlcN-6P→Fru-6P，GlcNAc-6P→MurNAc-6P)的关键酶基因pgm、nagB和murQ，削弱pgm和nagB的表达，并敲除murQ。

①设计削弱表达强度的2对引物：

pgm正向引物(5’-3’)：

ACACCGTAAAGATACTCACGCCTGTTTTTTAGGCTAGAATAGGCAAGTTAAAAGGC TAGTCCGTT，

反向引物(5’-3’)：

AACGGACTAGCCTTTTAACTTGCCTATTCTAGCCTAAAAAACAGGCGTGAGTATCTT TACGGTGT-3’，

使pgm的RBS由aacgttgcagacaaaggacaaagca缩短为aacgttgcagacaagacaaagca，从而降低 pgm的表达量；

murQ正向引物(5’-3’)：

ACA CCGCTGAATTGACCGGTATGTTAGGTAGGAAATAGCGTAAGATAGGTCCGTT，

反向引物(5’-3’)：

AACGGACCTATCTTACGCTATTTCCTACCTAACATACCGGTCAATTCAGCGGTGT，

使murQ的RBS由gatcgtaaatagtaaggtcaccaccg缩短为gatcgtatagtagtcaccaccg，从而降低 murQ的表达量；

②敲除nagB的引物：

正向引物(5’-3’)

ACACCGCCTGCTTTATGCATGGTTTTAGGCTAGAATAGGCAAGTTAAAATAGGCTAG TCCGTT-3’，

反向引物(5’-3’)：

AACGGACTAGCTATTTTAACTTGCTATTCTAGTAGCTAAACCGAATGCATAAGCAGG CGGTGT)。

以大肠杆菌K-12基因组为模板，通过PCR对上述3种引物扩增(50μl体系：100μM正向和反向引物各5μl、100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.4)；条件：90℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min)，随后采用PAGE纯化片段进行融合PCR，扩增后得到用于CRISPR-Cas9敲除的sgRNA片段，确保浓度大于400ng/μl。用EcoRV酶切 2μgpCas9/gRNA载体，采用琼脂糖凝胶回收线性化载体(50～100ng/μl)，再采用含有PEG4000的体系中进行T4 DNA连接酶连接。将连接好的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞，在30℃条件下，卡那抗性琼脂平板上挑取单克隆进行测序验证，获得壳寡糖竞争途径被削弱的大肠杆菌。最后采用37℃的LB液体培养条件，消除pCas9的质粒，得到无抗性的大肠杆菌突变株。

(2)UDP-GlcNAc合成强化的大肠杆菌底盘细胞构建

基于上述得到大肠杆菌，将大肠杆菌突变株基因组上的编码氨基葡萄糖合成酶(GlmS， NCBI Reference Sequence:NP_418185.1)、磷酸葡萄糖胺变位酶(GlmM，NCBIReference Sequence:NP_417643.1)、葡萄糖-1-磷酸N乙酰基转移酶(GlmU，NCBIReference Sequence: NP_418186.1)的基因进行启动子替换，分别以启动子上游～50bp序列作为5’端同源臂，下游～50bp序列作为3’端同源臂，同时以高强度组成型启动子J23119序列 (TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC，SEQ ID No.6)作为大肠杆菌自身启动子的替换模块，设计出三对引物：

glmS上游引物(5’-3’)：

ACATCACGTTGCGCGATCGCGCCAACAATTCCACACATAGTTTTTGATTCCGATTTATGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGC，

下游引物(5’-3’)：

TTCTGGCCGGCTAACCCGGTCACATGGGATGAGGAGATAACATAATCTCCCTCCCACTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATG；

glmM上游引物(5’-3’)：

CATCGGTACCGAAATATTTACGATTACTCATAGCGTTTGTTTTCCTTTGCGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGC，

下游引物(5’-3’)：

GTCAAAGAAACCGTAGAAGCGATGCGGGTGGTGGAAGCCACTCTGTCTTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATG；

glmU：上游

引物(5’-3’)：

GTGCCTTTGCCTGCGGCAAGGATCACTACGCTCATAGCATTATTCAACATGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGC，

下游引物(5’-3’)：

AACCCCCCTGTTTTCCTGTTTATTCATTGATCGAAATAAGAGCAAAAACATCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATG。

以大肠杆菌基因组为模板，通过PCR对上述3种酶基因进行上下游同源臂扩增，随后纯化片段进行融合PCR，扩增后得到可以同源重组的DNA片段，确保浓度大于200ng/μl。

以携带red同源重组系统的商业化质粒pKD46为对象，转入大肠杆菌BL21(DE3)的化学感受态细胞中，在30℃平板培养条件和氨苄青霉素抗性选择性压力(100μg/L)下得到重组菌。随后，挑取重组菌单克隆到氨苄青霉素抗性(100μg/L)的LB液体培养基中，培养细胞浓度到0.2OD₆₀₀，加入0.5％的L-阿拉伯糖，诱导2h左右，等细胞浓度约为0.4OD₆₀₀再收集菌体，用10％甘油洗涤制备电转感受态，于-80℃保存备用。

取上述纯化的第一种DNA片段2μl，加到含有100μl重组菌电转感受态的冰浴电击转化杯中，孵育混合15分钟后进行电击转化(电转仪参数：电压2500V、电阻200Ω、电容25 μF)，迅速加入含有0.5％L-阿拉伯糖的LB液体培养1ml，转移到15ml离心管中，置于30°培养箱中复苏1h。随后，取100μl、200μl、500μl分别进行均匀涂板(含有100μg/L氨苄青霉素抗性的LB培养基)，置于30℃培养箱中过夜生长。第二天，采用验证引物(上游5’-TATACCTAGGACTGAGCTAGC-3’，下游5’-GTCAAAGAAACCGTAGAAGCG-3’)进行单克隆验证，挑取阳性克隆测序验证，甘油管正确的突变体，即为大肠杆菌BL21(DE3)中氨基葡萄糖合成酶基因启动子序列替换成强启动子J23119序列的突变株。基于上述突变株和操作步骤，分别进行磷酸葡萄糖胺变位酶和葡萄糖-1-磷酸N乙酰基转移酶两种基因启动子的替换操作，后续采用37℃的LB液体培养条件，消除pKD46质粒，得到无抗性的大肠杆菌突变株，最终得到大肠杆菌合成壳寡糖重要前体物质UDP-GlcNAc过量积累的底盘菌E.coli CHO1。

(3)含有辅因子再生系统的重组菌构建

采用限制性内切酶NdeI和XhoI对实施例1中构建得到的pACYC-PPK质粒进行双酶切，获得粘性末端的磷酸激酶PPK基因。同时，设计含有J23119启动子序列和NdeI/XhoI内切酶识别序列的pBBR1MCS-2质粒扩增引物：

pBBR引物(5’-3’)：

ATCCATATGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGTTATCCGCTC ACAATTCCAC，

下游引物(5’-3’)：

ATCCTCGAGCTGAATGGCGAATGGAAATTG；

通过PCR法扩增质粒片段并在胶回收后采用NdeI/XhoI内切酶进行消化，从而获得携带粘性末端的线性化质粒pBBR-J23119。将具有互补粘性末端的PPK基因和线性化质粒pBBR- J23119进行T4 DNA ligase的连接反应，通过热激法转入化学感受态的大肠杆菌底盘菌。经过卡那抗性平板的阳性克隆验证，得到质粒pBBR-J23119-ppk，其磷酸激酶PPK受到组成型启动子J23119的启动，该重组菌胞内的ATP和UTP水平可以通过胞外添加多聚磷酸盐进行调节，即获得具有辅因子再生系统的重组菌。

(4)具有壳寡糖从头合成途径的重组大肠杆菌构建

为实现壳寡糖从头合成途径多个关键酶在无外源诱导条件下的高效表达，需要联合三种兼容性质粒(pTrc99A、pACYC184、pBBR1MCS-2)共同转化大肠杆菌底盘细胞，同时采用高强度杂合启动子trc作为主要启动子。其中，pTrc99A质粒中含有trc启动子，虽然可以直接作为nodCB基因的表达载体，但是仍需通半乳糖类似物IPTG进行诱导表达；pACYC184质粒缺乏启动子序列，也需要进一步修饰改造。因此，本专利基于pTrc99A质粒进行lacI序列的缺失，基于pACYC184质粒进行启动子序列和终止子序列的添加，最终获得无需诱导的高强度表达质粒系统pTrc100和pACtrc。

具体操作如下：基于lacI基因序列，设计末端同源臂引物：

ΔlacI上游：5’-CGACAA GGTGCTGATGCACTCTGCGACATCGTATAAC-3’，

ΔlacI下游：5’-GCATCAGCACCTTGTCGATTAATGCAG CTGGCACG-3’，

以pTrc99A质粒为模板进行PCR扩增，采用限制性内切酶DpnI对PCR扩增液体中的环状质粒模板进行消化，DNA片段纯化回收后转化到化学感受态大肠杆菌JM109中，在氨苄青霉素抗性平板上进行阳性单克隆筛选和验证，即获得无需诱导的高强度表达质粒系统pTrc100。

另外，以pTrc99A质粒为模板，设计引物：

trc上游：5’-ATCGAATTCGCCGACATCATAACGGTTC-3’，

trc下游：5’-ATCCCATGGCTTCGCAACGTTCAAATCCG-3’，

来PCR扩增trc启动子和rrnB T1终止子的全长trc-T1序列，通过限制性内切酶NcoI/EcoRI 消化trc-T1序列和pACYC184质粒后产生相同粘性末端，采用T4 DNA连接酶进行连接后转化到化学感受态大肠杆菌JM109中，在四环素抗性平板上进行阳性单克隆筛选和验证，即获得无需诱导的高强度表达质粒系统pACtrc。

优先以Azorhizobium caulinodans ORS 571来源的壳寡糖合成酶为表达对象，设计nodCB 基因的引物：

nodCB上游引物：5’-ATCCCATGGCTATGAGTGTCCTTGGGCAAG-3’，

nodCB下游引物：5’-ATCGGATCCTT AGGAACTCTCGCGTGATAG-3’，

以nodCB基因簇序列(核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)为模板，PCR扩增得到DNA片段并回收。采用两种限制性内切酶NcoI和BamHI分别对上述nodCB基因片段和提取好的环状pTrc100质粒进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收具有相同粘性末端的nodCB基因和线性化质粒pTrc100。酶切产物回收后进行T4 DNA ligase酶连接和化学感受态细胞转化，氨苄青霉素抗性平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，15g/L琼脂粉，80mg/L氨苄青霉素)筛选得到含有正确质粒pTrc-nodCB的单克隆。

以RBS序列(TGCAAAGGAAAACAAACGCT，SEQ ID No.5)为glmU和amgK基因的共表达核糖体结合位点，设计融合PCR引物：

上游5’-AGCGTTTGTTTTCCTTTGCATCAAGCTTCAGCACCCTG-3’，

下游5’-TGCAAAGGAAAACAAACGCTATGTTGAATAATGCTATGAGCGT-3’，以glmU 和amgK基因为模板，扩增得到amgK-RBS-glmU序列。再通过两种限制性内切酶NcoI和 BamHI分别对上述序列片段和提取好的环状pACtrc质粒进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收具有相同粘性末端的amgK-RBS-glmU基因序列和线性化质粒pACtrc。酶切产物回收后进行T4 DNAligase酶连接和化学感受态细胞转化，四环素抗性平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，15g/L琼脂粉，25mg/L四环素)筛选得到含有正确质粒pACtrc-amgK- glmU的单克隆。

提取三种质粒(pTrc-nodCB、pACtrc-amgK-glmU、pBBR-J23119-ppk)，采用1-10ng的浓度均匀混合到100μl电击转化感受态细胞E.coli CHO1，将含有大肠杆菌和质粒的预冷电击杯(间距1cm)擦干，迅速放入Bio-Rad公司生产的高压电击仪的电击槽；电击完成后，迅速取出电击杯并加入1mL无抗生素LB液体培养基，并全部转移到2mL无菌试管中；在30℃和150rpm摇床培养1小时后，4000rpm离心30s收集菌泥，全部涂布抗性平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，15g/L琼脂粉，25mg/L四环素，80mg/L氨苄青霉素，25mg/L庆大霉素)，30℃培养18-22小时后筛选阳性单克隆，即具有壳寡糖从头合成途径的重组大肠杆菌。

实施例4：从头合成壳寡糖途径工程菌的培养条件和发酵优化

具有壳寡糖从头合成途径的重组大肠杆菌利用人工导入的壳寡糖体外合成途径，以葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖为底物前体，以大肠杆菌自身氧化磷酸化系统或基于多聚磷酸盐的辅酶再生系统来再生辅因子ATP和UTP，从头合成五单元壳寡糖。该工程菌经过竞争途径敲除或削弱，同时经过寡糖前体UDP-GlcNAc合成途径的强化，不需要额外添加诱导剂，可以高效积累五单元壳寡糖。

(1)从头合成壳寡糖途径工程菌的培养条件

利用实施例3构建得到的重组大肠杆菌发酵生产壳寡糖，具体步骤如下：

首先，在三抗性LB平板(15g/L琼脂粉，10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L NaCl，25mg/L四环素，80mg/L氨苄青霉素，25mg/L庆大霉素)上挑取重组菌单克隆，接种至含有5 mL种子培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L NaCl，25mg/L四环素，80mg/L氨苄青霉素，25mg/L庆大霉素)的试管中，在30℃和200rpm恒温摇床中培养8小时，获得重组大肠杆菌初步活化的种子液；

取上述OD₆₀₀＝1的重组大肠杆菌细胞100μL，接种至含有100mL LB发酵培养基(每升 LB培养基中含有5g/L葡萄糖)，在30℃和200rpm恒温摇床中培养4天，壳寡糖产量为100mg/L。

取上述OD₆₀₀＝1的重组大肠杆菌细胞100μL，接种至含有100mL发酵培养基(每升含有 5-50g葡萄糖，0.8g NaHCO₃，0.68g Na₂HPO₄·7H₂O，0.3g KH₂PO₄，0.05g NaCl，0.1gNH₄Cl， 0.08g MgSO₄·7H₂O，0.005g乙二胺四乙酸，0.2mg硫胺素，1mL维生素混合液，1mL微量元素混合液，25mg/L四环素，80mg/L氨苄青霉素，25mg/L庆大霉素)的摇瓶中，在30℃和200rpm恒温摇床中培养4天，期间间隔8～12小时取样测定细胞浓度和五单元壳寡糖积累量。当葡萄糖浓度为5g/L时，发酵4天壳寡糖产量为1.2g/L。

(2)从头合成壳寡糖途径工程菌的发酵优化

以上述构建的重组大肠杆菌(竞争途径敲除或削弱，UDP-GlcNAc合成途径强化，外源壳寡糖合成途径导入)为发酵生产菌株，首先通过的培养(上述培养条件(1))获得各级发酵罐的种子液。通过对发酵条件及工艺的优化，实现发酵罐的逐级扩大培养(5L，50L，500L，1000L)。

在前期5L发酵培养过程中，分别设定不同的参数及工艺，

(1)种子液接种量(2％、5％、10％)；

(2)底物葡萄糖初始浓度(10g/L，50g/L，100g/L)；

(3)在发酵第24小时开始持续12h加入流加培养基，在发酵第60小时开始持续24h加入流加培养基，流加培养基中葡萄糖及乙酰氨基葡萄糖浓度及比例(3：1，2：1，1：1)；当比例为3:1时，葡萄糖的流加速度为15g/L/h，对应的乙酰氨基酸葡萄糖的流加速度为5g/L/h；当比例为2:1时，葡萄糖的流加速度为10g/L/h，对应的乙酰氨基酸葡萄糖的流加速度为5g/L/h；当比例为1:1时，葡萄糖的流加速度为5g/L/h，对应的乙酰氨基酸葡萄糖的流加速度为5g/L/h；

(4)在发酵第24小时开始恒速流加多聚磷酸溶液(多聚磷溶液的浓度100mM，200mM， 300mM)，按照1mL/h速度进行流加；

从而实现细胞积累及产物大量合成，反应过程中控制通风量为1.5v/v、搅拌转速800rpm，在发酵前期(OD600＜10)溶氧维持在10％以上，发酵中期维持溶氧在10％～30％，发酵后期 (OD600＞50)溶氧维持在30％±10％，共反应96h。

优化上述因子，进行正交实验(结果见表2)，获得最优发酵体系：接种量5％，葡萄糖初始浓度50g/L，葡萄糖及乙酰氨基葡萄糖浓度及比例1:1，多聚磷酸盐200mM进行恒速流加，通风量1.5v/v，搅拌转速800rpm。

表2. 5L发酵罐水平的产壳寡糖发酵条件多因子正交试验结果

后期在1000L发酵罐中放大生产壳寡糖，按照上述最优的条件，在发酵60h时，胞外壳寡糖产量为17g/L，继续进行发酵，胞外产量达20g/L以上(如图4所示)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏海飞生物科技有限公司

<120> 一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法

<130> BAA220507A

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcgacg atgcccgttt tcagcaactg aactgttggc tggatagctg tctgccggag 60

ctgttcgttg cagaaggttg gggtgaagta cctccggccg aactgatccc agcatcttcc 120

gatgcgagct tccgtcgcta ttttcgttgg cagggtggtg accgctctct ggttgttatg 180

gatgctccgc cgccacagga agattgtcgt ccgttcgtta aagttgcagg cctgctggct 240

ggtgcaggtg tgcatgtacc tcgtatcctg gctcaggacc tggaaaacgg cttcctgctg 300

ctgtctgatc tgggccgcca aacctatctg gacgtactgc atccgggcaa cgcggacgaa 360

ctgttcgaac cggcactgga cgcgctgatt gctttccaga aggttgacgt ggctggtgtt 420

ctgccagcgt acgacgaagc tgttctgcgt cgcgaactgc aactgttccc ggattggtat 480

ctggcgcgtc acctgggtgt agaactggaa ggcgaaaccc tggcccgttg gaagcgcatt 540

tgtgacctgc tggttcgttc tgcgctggaa cagccgcgtg ttttcgtaca ccgtgactat 600

atgcctcgca acctgatgct gtctgaaccg aacccgggcg tgctggattt ccaggacgca 660

ctgcacggcc cggttactta cgatgttact tgtctgtata aagatgcgtt cgtatcttgg 720

ccggaaccgc gtgttcacgc agctctgaac cgttactgga aaaaggcaac ttgggctggt 780

attccgctgc cgccgtcctt tgaagatttc ctgcgtgctt ccgatctgat gggcgtgcag 840

cgtcacctga aagttatcgg tatcttcgcc cgtatctgcc atcgtgatgg taaaccgcgt 900

tatctgggtg atgtaccgcg cttcttccgc tatctggaaa cggcggttgc acgtcgtccg 960

gaactggctg aactgggtga actgctggct tctctgccgc agggtgctga agcttga 1017

<210> 2

<211> 1427

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttagccgg ccagaatcac tttttcttta ccggacgacg ccagccttct ttctgagtct 60

gcggcacacg gctgatagct aatgcatttt cgccgacatt acgcgtcaca gttgtacccg 120

cagcaatggt cgcgcctttg cctactgtta ccggggccac cagctgagtg tcggaaccaa 180

caaacacatc gtcgccgata atggtcttaa atttattcgc accatcgtag ttgcaggtaa 240

tggttcccgc gccgatgtta acgttatcgc caatttccgc atcgcccagg taagtcagat 300

gaccagcttt cgagccttta cccagacgcg cttttttcat ctcaacgaag ttaccgacgt 360

gagcaccttc cagcaactca gcaccaggac gcaaacgggc aaacgggcca atggtacagg 420

ccgctgccag attcgcatct tccacaacgg tatacggact gatttcgcaa tcatcgccaa 480

tcacgctgtt tttaatcacg caaccggtgc caattttcac gcgatgaccg agagtcacgt 540

tgccctcgat gataacgtta gtatcaattt caacatcgcg cccgtgagtt agcgtaccac 600

gcagatcaaa acgcgctgga tcgcgcagca taacgcctgc taacagcagt ttttcagcct 660

gttcggactg ataaacacgc tccagacggg agagttgcag gcggttattc acgccttcta 720

cttcgcttaa acgttgcgga tgaacggcga cgatttcacg cccttcctga tacgccagcg 780

caataatgtc ggtgatgtag tattcgccct gagcattatt gttggtcagc ttcgccagcc 840

agcgtttcat atctgcgccg ttggcaatca gaatgccggt gttgatctcc tgaatctgac 900

gctgctcgtc ggtggcatct ttgtgctcaa caatgccggt aactttgccg ttttcacggg 960

tgatacgtcc ataaccggtc ggatcatcca gtttcaccgt cagcagacca atgccaccct 1020

gcggtttagc atcacgcaga cgctggagtg tttcgacaga gatcagcggc acgtcgccgt 1080

agagcattaa aatgtcttca tcatcggcaa agaaaggtgc ggcctgctgc attgcatgac 1140

ccgtacccag ctgctctgcc tgaagcaccc agttaaggtt gtcgtctttc agcgcctgtt 1200

ttagcagatc gccgccgtga ccgtacacca ggtgaacgtg cgctgcgcct aattcattcg 1260

cagcatcaat gacatgctga accatcgctt tcccggcaag ggtatgcagc actttcggaa 1320

gatcggaata catgcgcgtg cctttgcctg cggcaaggat cactacgctc atagcattat 1380

tcaacatacg cgtcctgact gtaatttgag aacgaattta aaccgct 1427

<210> 3

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgagtgtcc ttgggcaagc tgcacgaatc acgcagaatc agagttcaat atacatcacg 60

ttcgatgatg ggccgcaccc gagcgtgacg ccagcagtat gcgaaatact gagagagcac 120

tcggctctta cggcattttt tcaaataggc cggtttacga aagaataccc tagtatatca 180

cgacagtgcc aattggacgg tcacgctatt ggaaatcata cgttcgacca tcccaatcta 240

caagaccggg ccggcgagga agtagagtat caaatatcgt ctgcgcaaaa atgcctcgag 300

catatctgtg gtcgcggatt tgttcggcac ttccgtgccc catacggcgc gtggagcacc 360

cagatattaa acgttgtgaa taaaatcggc ttgcggcctg tctcgtggcc tgtcgacccg 420

agagattggg aggcgccgag aatagaaaat ctcatcaatg agatattaga taacgctcga 480

cctagctcga taattcttct gcacgacggg tgccctccag atgaagctgc gatgtgggac 540

gtgcgtggtg gccgagctca gacattagcg gcgctccggt acgtcgttcc agctcttcag 600

gcgcgcggat ttgcgcttca gccgttgcca tga 633

<210> 4

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgagtgtcg tagatgtgat cggtttgctt gcgactgcag cctacgtgac gttggcgagc 60

gcatacaagg tggtccagtt cattaacgtg tcgagcgtaa cggatgtcgc tggtctcgaa 120

agtgatgctt tgccgctcac tccaagggtt gacgttatcg tgccgacatt caatgagaac 180

tccagcacat tgctcgagtg cgtcgcttct atatgcgcac aagactaccg cggaccaata 240

acgattgtcg tggtagacga tgggtcgacc aacaaaacat catttcacgc agtatgcgac 300

aagtacgcga gcgacgaaag gttcatattt gtcgaacttg atcaaaacaa ggggacggcc 360

gcgcaaatgg aggccatcag gagaacagac ggagacctga tactaaacgt agactcggac 420

acggttatag ataaggatgt tgttacaaag cttgcgtcgt ccatgagagc cccgaatgtc 480

ggtggtgtca tggggcagct cgttgcaaag aatcgagaaa gatcttggct taccagatta 540

atcgatatgg agtactggct tgcgtgtaac gaggagcgca ttgcgcagtc gaggtttggc 600

tccgtgatgt gttgttgtgg gccgtgcgcc atgtatagaa gatctgcaat tacgccacta 660

ttggcagaat atgagcacca gacattccta gggcgtccga gcaactttgg tgaggatcgc 720

catctcacaa tcctgatgct gaaggcggga tttcggaccg ggtacgtccc aagtgccgta 780

gcgaggacgt tggttccgga tggctcgccg tacctgcgcc agcaactccg ctgggcccgc 840

agcacttatc gcgacaccgc cctcgcctta cgtataaaga aaaatctaag caaatatatc 900

acctttgaga tatgcgcaca gaatttgggt acggctctct tacttgtgat gaccatgatt 960

tcgctttcgc tgactacatc agggtcgcaa acgcccgtta tcattctggg tgtcgttgtg 1020

gggatgtcta taataagatg ttgttctgtc gcccttatag cgaaagattt tcggtttcta 1080

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ctgttaacca ttcgggatag tcggtggcta tcacgcgaga gttcctaa 1188

<210> 5

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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accgatccgg tggtaaaagt ggccagcccg caggatcctg cgggtgacgc gaaagtcgaa 120

gacgcgactg ctccggttgc ggaagtggaa ccgcgcaccc cgcgtaaccg ccgtctgcca 180

accccagaaa acgttcgcca cgcattcgaa agcggtaagt acccttactc ccgtaaaatg 240

agccgtcgtc cttacgaagc ggaaaaagcg atgctgcagg cagagctgct gaaagtacag 300

ctgtgggcgc aggaaaccgg tgaacgtttc gttctgctgt ttgaaggccg cgacgcggcg 360

ggtaaaggcg gtacgattaa acgttttatg gaacatctga acccacgcca ggctcgcgtg 420

gttgcactga ataaaccgac ttgggaagaa aaaggtcagt ggtactacca acgttacgtt 480

caggaactgc caactgtggg tgagatggtg ttctacgacc gttcttggta caatcgtgcg 540

ggcgttgaac gcgttatggg tttttgcact ccgaacgaat atctggaatt tatgcgtcag 600

accccggatc tggaacgcat gctggttcgt tctggcattc gcctgtataa gtactggttc 660

tccgttaccc aggaagagca gcagcgtcgc ttcaaatctc gcgaaacgga ccctctgaaa 720

cagtggaaac tgtccccgat cgacaaggcg tctctggata aatgggatga ctacaccgaa 780

gcaaaagaag caatgttctt ttataccgac actgcagacg cgccgtggac tattattaag 840

tctaacgaca aaaaacgtgc gcgcctgaac tgtatgcgtc acttcctgag caccatcgac 900

tatccgggca aagacaaaca tgttgttggt gaaccggacc cgctgatcgt tggtcgtgcg 960

catcacgtaa tccagaaaag cgaacacatc ctgggcaccg ctctgcaccc ggatcagcgc 1020

gcccgtcagg attaa 1035

<210> 6

<211> 1862

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgagtgtcc ttgggcaagc tgcacgaatc acgcagaatc agagttcaat atacatcacg 60

ttcgatgatg ggccgcaccc gagcgtgacg ccagcagtat gcgaaatact gagagagcac 120

tcggctctta cggcattttt tcaaataggc cggtttacga aagaataccc tagtatatca 180

cgacagtgcc aattggacgg tcacgctatt ggaaatcata cgttcgacca tcccaatcta 240

caagaccggg ccggcgagga agtagagtat caaatatcgt ctgcgcaaaa atgcctcgag 300

catatctgtg gtcgcggatt tgttcggcac ttccgtgccc catacggcgc gtggagcacc 360

cagatattaa acgttgtgaa taaaatcggc ttgcggcctg tctcgtggcc tgtcgacccg 420

agagattggg aggcgccgag aatagaaaat ctcatcaatg agatattaga taacgctcga 480

cctagctcga taattcttct gcacgacggg tgccctccag atgaagctgc gatgtgggac 540

gtgcgtggtg gccgagctca gacattagcg gcgctccggt acgtcgttcc agctcttcag 600

gcgcgcggat ttgcgcttca gccgttgcca tgaggcgagt cgacaagaaa agagatgcca 660

gatgagtgtc gtagatgtga tcggtttgct tgcgactgca gcctacgtga cgttggcgag 720

cgcatacaag gtggtccagt tcattaacgt gtcgagcgta acggatgtcg ctggtctcga 780

aagtgatgct ttgccgctca ctccaagggt tgacgttatc gtgccgacat tcaatgagaa 840

ctccagcaca ttgctcgagt gcgtcgcttc tatatgcgca caagactacc gcggaccaat 900

aacgattgtc gtggtagacg atgggtcgac caacaaaaca tcatttcacg cagtatgcga 960

caagtacgcg agcgacgaaa ggttcatatt tgtcgaactt gatcaaaaca aggggacggc 1020

cgcgcaaatg gaggccatca ggagaacaga cggagacctg atactaaacg tagactcgga 1080

cacggttata gataaggatg ttgttacaaa gcttgcgtcg tccatgagag ccccgaatgt 1140

cggtggtgtc atggggcagc tcgttgcaaa gaatcgagaa agatcttggc ttaccagatt 1200

aatcgatatg gagtactggc ttgcgtgtaa cgaggagcgc attgcgcagt cgaggtttgg 1260

ctccgtgatg tgttgttgtg ggccgtgcgc catgtataga agatctgcaa ttacgccact 1320

attggcagaa tatgagcacc agacattcct agggcgtccg agcaactttg gtgaggatcg 1380

ccatctcaca atcctgatgc tgaaggcggg atttcggacc gggtacgtcc caagtgccgt 1440

agcgaggacg ttggttccgg atggctcgcc gtacctgcgc cagcaactcc gctgggcccg 1500

cagcacttat cgcgacaccg ccctcgcctt acgtataaag aaaaatctaa gcaaatatat 1560

cacctttgag atatgcgcac agaatttggg tacggctctc ttacttgtga tgaccatgat 1620

ttcgctttcg ctgactacat cagggtcgca aacgcccgtt atcattctgg gtgtcgttgt 1680

ggggatgtct ataataagat gttgttctgt cgcccttata gcgaaagatt ttcggtttct 1740

atacttcatc gttcactcag cgttgaatgt tctaatttta acgccgttaa aactctatgc 1800

cctgttaacc attcgggata gtcggtggct atcacgcgag agttcctaaa acatcagtta 1860

at 1862

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgcaaaggaa aacaaacgct 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacgttgcag acaaaggaca aagca 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aacgttgcag acaagacaaa gca 23

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gatcgtaaat agtaaggtca ccaccg 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gatcgtatag tagtcaccac cg 22

Claims

1.一种可从头合成壳寡糖的多酶催化体系，其特征在于，所述催化体系包含来源于Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692的N-乙酰氨基葡萄糖激酶、来源于Escherichiacoli MG1655的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、来源于Azorhizobium caulinodans ORS571的几丁质合成酶和脱乙酰基酶催化底物合成壳寡糖。

2.根据权利要求1所述的多酶催化体系，其特征在于，所述体系还含有以下任一组合：

(a)腺嘌呤核苷三磷酸和尿苷三磷酸；

3.利用权利要求1或2所述的多酶催化体系生产壳寡糖的方法，其特征在于，以乙酰氨基葡萄糖为底物，转化合成壳寡糖。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述N-乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶和脱乙酰基酶按照相同的酶活量加入反应体系中，每种酶按照每毫摩尔底物添加100～200U；并添加1/2底物浓度的ATP和UTP，在pH6.5～7.5下反应不少于6h；

或者，乙酰氨基葡萄糖浓度为100～500mM，N-乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶、脱乙酰基酶和多聚磷酸盐激酶的比例为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，且各种酶按照不少于每毫摩尔底物100U的量添加至反应体系中；二磷酸腺苷初始浓度为50～100mM，在30～40℃下反应，多聚磷流加速度为1～100mg/L/min，pH6～8。

5.一种基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌中削弱pgm和nagB的表达并敲除murQ，并将编码葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、葡萄糖-1-磷酸N乙酰基转移酶的基因的启动子替换为组成型启动子J23119得到大肠杆菌底盘细胞，在大肠杆菌底盘细胞中表达来源于Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692的N-乙酰氨基葡萄糖激酶、来源于Escherichiacoli MG1655的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、来源于Azorhizobium caulinodans ORS571的几丁质合成酶和脱乙酰基酶、以及来源于Ruegeria pomeroyi的多聚磷酸盐激酶。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以敲除了lacI序列的pTrc99A质粒为所述几丁质合成酶和脱乙酰基酶的表达载体；在质粒pACYC184上整合trc启动子和rrnBT1终止子，用以表达所述N-乙酰氨基葡萄糖激酶和UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，以核苷酸序列如SEQ ID No.7的RBS序列为N-乙酰氨基葡萄糖激酶和UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的共表达核糖体结合位点；以pACYCDuet-1质粒为表达载体J23119启动子启动磷酸激酶PPK基因的表达。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述葡萄糖合成酶的NCBIReference Sequence:NP_418185.1；磷酸葡萄糖胺变位酶的NCBI Reference Sequence:NP_417643.1；葡萄糖-1-磷酸N乙酰基转移酶的NCBI Reference Sequence:NP_418186.1。

8.一种全细胞转化生产壳寡糖的方法，其特征在于，利用权利要求5～7任一所述的基因工程菌以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为底物生产壳寡糖。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1～5，按照体积比2～10％的量接种至含有5～100g/L葡萄糖的发酵体系中，在28～35℃下培养不少于96h；

或者，将所述基因工程菌培养至OD₆₀₀＝1～5，按照体积比2～10％的量接种至含有5～100g/L葡萄糖的发酵体系中，控制通风量为1.0～2.0v/v、搅拌转速500～800rpm，发酵时间不少于60h。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在发酵过程中补加葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖和多聚磷酸盐。