CN111909910A - 一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法 - Google Patents

一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法，涉及六种酶法模块，其中一种包括长双歧杆菌N‑乙酰氨基葡萄糖激酶、大肠杆菌糖核苷生成酶以及空肠弯曲杆菌β1‑4‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶。利用空肠弯曲杆菌β1‑4‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶替代人源的β1‑4‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶引入GalNAc，构建Sda糖抗原表位；并利用幽门螺杆菌α1‑2岩藻糖转移酶、幽门螺杆菌α1‑3‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶和人源的α1‑3‑半乳糖转移酶快速、高效的合成Sda糖抗原和ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原。

Description

一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法
技术领域
本发明属于糖抗原制备技术领域，具体涉及一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
早在1967年，科学家们发现了一种新的组织血型抗原—Sda糖抗原。Sda糖抗原广泛分布于人体的红细胞、体液和组织器官中。Sda糖抗原的抗原决定簇是一个三糖结构，即Siaα2,3(GalNAcβ1,4)Gal(如图1所示)。Sda糖抗原在生理和病理方面起到重要的作用。作为一种血型抗原，Sda不仅在血液分型、抗糖抗体筛选中发挥作用，而且在生殖、神经肌肉疾病、癌症以及疟疾感染等过程中扮演着重要的角色。近年来，随着对动物异种器官移植研究的深入，Sda作为一种异种抗原再次进入到人们的视野。在对猪的异种器官移植研究过程中发现来自猪体内的Sda糖抗原可以引起人体的自然免疫从而产生排异反应，也由此证明了Sda糖抗原不只存在于人体，在一些动物体内也会有分布，但是它们的抗原决定簇与人体内的Sda糖抗原决定簇存在差异，究其原因是因为猪体内含有人体中不含有的唾液酸类型N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。Sda血型抗原为非ABO血型抗原，但是两种的抗原决定簇可以同时存在于一个结构中，形成一种杂合型多糖抗原，在人体中发挥作用。Sda血型抗原多糖种类复杂多样，现已明确的Sda类型主要有：tpye1Sda，type2Sda，core1Sda，core2Sda，core3Sda，paragloboside以及ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原。研究表明，在人体内，Sda糖抗原合成的关键酶是β1-4-N-乙酰氨基半乳糖基转移酶B4GalNTII。2018年，有研究者利用从人体卵巢中获得的B4GalNTII酶进行了Sda的体外合成，但是产量极低，很难达到制备级水平。
由于生物体内环境十分复杂，就目前的研究水平而言，以提取的方式从生物体内获得大量结构单一的目标寡糖用于生物学、药学研究的可能性微乎其微。对于化学合成而言，Sda糖链在合成过程中需要反复的保护以及脱保护操作来保证区域、立体选择性，导致其反应步骤多、总体收率低。
以酶法模块化组装策略合成复杂寡糖可以克服化学合成法的不足，但是以哺乳动物来源的酶合成Sda糖抗原面临两方面的困难：1、哺乳动物来源的酶多为跨膜蛋白，在体外重组表达困难，难以获得足量的活性可溶性蛋白；2、哺乳动物来源的酶往往具有较强的底物专一性，底物适用性窄。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法。利用空肠弯曲杆菌β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(CjCgtA)替代人源的β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶引入GalNAc，构建Sda糖抗原表位；并利用幽门螺杆菌α1-2岩藻糖转移酶(Hmα1,2FucT)、幽门螺杆菌α1-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(BgtA)和人源的α1-3-半乳糖转移酶(GTB)快速、高效的合成Sda糖抗原和ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
第一方面，一种酶法模块，包括长双歧杆菌N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、大肠杆菌糖核苷生成酶(GlmU)以及空肠弯曲杆菌β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(CjCgtA)。记为酶法模块C，用于合成Siaα2,3(β1,4GalNAc)Gal表位中的GalNAcβ1,4Gal糖苷键以及其它含有GalNAcβ1,4Gal糖苷键的结构。
本发明提出了用于合成Sda糖抗原的酶法模块，在一个模块中，各种酶相互配合实现Sda糖抗原合成，催化效率高，催化专一性强，酶的来源广泛。在多酶反应的过程中精准的构建目标糖苷键。
一种酶法模块，包括脑膜炎奈瑟菌糖核苷生成酶(NmCSS)、多杀巴斯德菌α2-3唾液酸转移酶。
在本发明的一些实施方式中，多杀巴斯德菌α2-3唾液酸转移酶为PmST1M144D或PmST3。分别记为酶法模块A和酶法模块B。
PmST1M144D和PmST3用于构建Sda糖抗原表位中的Siaα2,3Gal糖苷键。
一种酶法模块，包括脆弱拟杆菌岩藻糖激酶(FKP)、脆弱拟杆菌糖核苷生成酶(FKP)、幽门螺杆菌α1-2岩藻糖转移酶(Hmα1,2FucT)。记为酶法模块D，用于引入Fucα1,2Gal糖苷键，以在Sda糖抗原中引入H抗原，合成H抗原杂合型Sda糖抗原。
一种酶法模块，包括长双歧杆菌N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、大肠杆菌糖核苷生成酶(GlmU)以及幽门螺杆菌α1-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(BgtA)。记为酶法模块E，用于引入GalNAcα1,3Gal糖苷键，构建A抗原表位[Fucα1,2(GalNAcα1,3)Gal]，合成A抗原杂合型Sda糖抗原。
一种酶法模块，包括大肠杆菌半乳糖激酶(EcGalK)、双歧杆菌糖核苷生成酶(BLUSP)以及半乳糖转移酶(GTB)。记为酶法模块F，用于引入Galα1,3Gal糖苷键，构建B抗原表位[Fucα1,2(Galα1,3)Gal]，合成B抗原杂合型Sda糖抗原。
第二方面，上述酶法模块在合成Sda糖抗原中的应用。
第三方面，一种Sda糖抗原的合成方法，所述方法为利用Sda糖抗原核心结构和酶法模块完成Sda糖抗原决定簇的组装得到非杂合型Sda糖抗原；
或，Sda糖抗原核心结构和酶法模块完成ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原的结构合成。
本发明提出了利用酶法模块化组装合成寡糖化合物的方法，在Sda糖抗原核心结构上、利用酶进行组装得到非杂合型和杂合型两种类型的Sda糖抗原。
在本发明的一些实施方式中，Sda糖抗原核心结构为如式I、式II、式III、式IV、式V、式VI所示：
Figure BDA0002573948910000031
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等。
在本发明的一些实施方式中，式IV所示Sda糖抗原核心结构的合成方法为将三糖糖苷[Galβ1,4(GlcNAcα1,3)GalNAcOR1]作为酶反应受体与半乳糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、大肠杆菌半乳糖激酶(EcGalK)、双歧杆菌糖核苷生成酶(BLUSP)以及脑膜炎奈瑟菌β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)混合进行反应得到式(IV)所示的α构型糖苷Galβ1,4(Galβ1,4GlcNAcα1,3)GalNAcOR1。
优选的，三糖糖苷的合成方法为N-乙酰氨基半乳糖通过保护基策略得到了适当的单糖受体，与全乙酰化的半乳糖硫苷供体在N-碘代丁二酰亚胺(NIS)和三氟甲磺酸(TfOH)的催化下进行糖苷化反应，得到全保护的二糖中间体；将此二糖结构经脱保护裸露出羟基后作为糖苷化受体，与端基是三氯乙酰亚胺酯、其余羟基被乙酰基保护的N-乙酰氨基葡萄糖受体反应，得到全保护的三糖，经脱保护操作得到三糖糖苷[Galβ1,4(GlcNAcα1,3)GalNAcOR1]。
在本发明的一些实施方式中，式V所示Sda糖抗原核心结构的合成方法为将二糖糖苷GlcNAcα1,3GalNAcOR1作为酶反应的受体与半乳糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、大肠杆菌半乳糖激酶(EcGalK)、双歧杆菌糖核苷生成酶(BLUSP)以及脑膜炎奈瑟菌β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)混合进行反应得到式(V)所示的α构型糖苷Galβ1,4GlcNAcα1,3GalNAcOR1。
优选的，二糖糖苷的合成方法为：N-乙酰氨基半乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖通过保护基策略得到了适当的单糖受体和供体，在催化剂三氟甲磺酸(TfOH)的催化下，发生糖苷化反应，得到全保护的二糖。再经脱保护过程得到二糖糖苷GlcNAcα1,3GalNAcOR1。
优选的，三糖糖苷或二糖糖苷对应的半乳糖当量为1.2-5.0，糖苷对应的ATP当量为1.2-5.0，糖苷对应的UTP当量为1.2-5.0，MgCl2浓度为5-100mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-500mM，pH 5.0-10.0。不同的酶最适的缓冲液浓度不一样。
在本发明的一些实施方式中，Sda糖抗原核心结构和酶法模块反应的方法为将Sda糖抗原核心结构先后与唾液酸和N-乙酰氨基半乳糖、核苷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、酶法模块混合反应，得到非杂合型Sda糖抗原。优选的，唾液酸为Neu5Ac或Neu5Gc。非杂合型Sda糖抗原将唾液酸和N-乙酰氨基半乳糖分别以α2,3和β1,4糖苷键的形式平行偶联到糖链末端Gal上。
本发明的一些实施方式中，Sda糖抗原核心结构和酶法模块反应的方法为将Sda糖抗原核心结构与唾液酸、核苷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、酶法模块混合反应，得到糖抗原。优选的，唾液酸为Neu5Ac或Neu5Gc；将得到的糖抗原结构与N-乙酰氨基半乳糖、核苷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、酶法模块混合反应，得到非杂合型Sda糖抗原。
在本发明的一些实施方式中，杂合型Sda糖抗原的合成方法为：将非杂合型Sda糖抗原与岩藻糖、N-乙酰氨基半乳糖或半乳糖、核苷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、酶法模块混合反应，所述非杂合型Sda糖抗原为非还原末端连接有半乳糖的结构，得到ABH相关联的杂合型Sda糖抗原。
优选的，核苷酸为胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)中的一到两种。
优选的，Sda糖抗原的合成反应温度为0-37℃，反应时间为0.5-24h或3-72h。
在本发明的一些实施方式中，酶法模块A、唾液酸与式I或式III进行反应得到式VII、式VIII、式IX、式X所示的糖抗原，核苷酸为CTP；
Figure BDA0002573948910000041
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等。
上式中，式I对应得到的是式VII、式VIII所示的结构；式III对应得到的式IX、式X所示的结构。
通过合成方法将唾液酸分别以Siaα2,3糖苷键的形式平行偶联到式(I)、式(III)所示的多糖末端Gal上，合成Siaα2,3Gal糖苷键。
在本发明的一些实施方式中，酶法模块B、唾液酸与式II或式IV、V、VI进行反应得到式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、式XVI、式XVII、式XVIII所示的糖抗原，核苷酸为CTP；
Figure BDA0002573948910000051
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等。
上式中，式II对应得到的结构为式XI、式XII；式IV对应得到的结构为式XIII、式XIV；式V对应得到的结构为式XV、式XVI；式VI对应得到的结构为式XVII、式XVIII。
通过合成方法将唾液酸分别以Siaα2,3糖苷键的形式平行偶联到式(II)、式(IV)、式(V)、式(VI)所示的多糖末端Gal上，合成Siaα2,3Gal糖苷键。
在本发明的一些实施方式中，酶法模块C与N-乙酰氨基半乳糖、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、式XVI、式XVII或式XVIII反应得到式(XIX)、式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)、式(XXV)、式(XXVI)、式(XXVII)、式(XXVIII)、式(XXIX)、式(XXX)所示的多糖组装得到的非杂合型Sda糖抗原，核苷酸为ATP和UTP；
Figure BDA0002573948910000061
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等。
将N-乙酰氨基半乳糖分别以β1,4糖苷键的形式平行的偶联到式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)、式(XIV)、式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)所示的非还原末端的连接有唾液酸的Gal上，合成Siaα2,3(GalNAcβ1,4)Gal糖苷键。
在本发明的一些实施方式中，将酶法模块D与岩藻糖、式XXV所示结构组装得到式XXXI所示的杂合型(H抗原)Sda糖抗原，核苷酸为ATP和GTP；
Figure BDA0002573948910000062
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等。
将岩藻糖以α1,2糖苷键的形式偶联到式XXV所示结构的3位分支末端Gal上，合成Fucα1,2Gal糖苷键。
在本发明的一些实施方式中，酶法模块E、N-乙酰氨基半乳糖、式XXXI所示化合物组装得到式XXXII所示的杂合型(A抗原)Sda糖抗原，核苷酸为ATP和UTP；
Figure BDA0002573948910000071
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等。
将N-乙酰氨基半乳糖以α1,3糖苷键的形式偶联到式(XXXI)所示结构的3位分支末端Gal上，合成Fucα1,2(GalNAcα1,3)Gal糖苷键。
在本发明的一些实施方式中，酶法模块F、半乳糖、式XXXI所示化合物组装得到式XXXIII所示的杂合型(B抗原)Sda糖抗原，核苷酸为ATP和UTP；
Figure BDA0002573948910000072
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等。
将半乳糖以α1,3糖苷键的形式偶联到式(XXXI)所示的七糖的3位分支末端Gal上得到八糖。
在本发明的一些实施方式中，反应结束后加入冰乙醇终止反应，然后通过分离纯化得到产物，分离纯化的方法为：离心，将上清液旋干浓缩，通过Bio-Gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化得到产物。
本发明的有益效果：
1、本发明所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点，因而以其为基础的酶法模块化组装效率高，且适于大量制备；而且本发明所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均可以在常规的大肠杆菌系统中方便的表达纯化。
2、本发明将化学法与酶法相结合既避免了目前化学合成策略存在的糖苷化反应选择性低、合成路线冗长、工作量大导致总体收率低，又规避了酶法合成缺乏相关糖苷键的酶等弊端，提供了一种高效、快捷的化学酶法方法合成Sda抗原的糖链结构，而且本发明首次实现的Sda抗原的体外合成，为相关糖结构和生物学功能研究所需的糖链及其缀合物样品的获得提供了可行性极高的途径，还可在分子水平上深入研究这些糖链与受体的相互作用机制及构效关系，为相关疾病病理学机制的阐明和未来的诊断治疗奠定了基础。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：Sda抗原决定簇结构；
图2：酶法模块组装A催化过程图；
图3：酶法模块组装B催化过程图；
图4：酶法模块组装C催化过程图；
图5：酶法模块组装D催化过程图；
图6：酶法模块组装E催化过程图；
图7：酶法模块组装F催化过程图；
图8：化学法合成裸糖3的反应方程式；
图9：酶法合成化合物4的反应方程式；
图10：化学法合成裸糖8的反应方程式；
图11：酶法合成化合物9的反应方程式；
图12：酶法合成化合物11、12、14、15的反应方程式；
图13：酶法合成化合物17-22、24、25的反应方程式；
图14：酶法合成化合物26-37的反应方程式；
图15：酶法合成化合物38的反应方程式；
图16：酶法合成化合物39的反应方程式；
图17：酶法合成化合物40的反应方程式。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明中的“当量”是指物质相互作用时的物质的量的比值，如：唾液酸(1.2-5.0当量)的含义即为：唾液酸与式(I)所示的二糖的物质的量的比为1.2-5.0。
下述具体实施方案中，反应完成后采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程，式(VII)-式(XXX)展开剂为EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2和式(XXXI)-式(XXXIII)的合成展开剂为EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝2:2:1:0.2。
本发明的酶法模块涉及Neisseria meningitidis CMP-sialic acid synthetase(NmCSS),Pasteurella multocidaα2-3-sialyltransferase(PmST1M144D)或者Pasteurella multocida multifunctionalα2-3-sialyltransferase(PmST3)；NahK/GlmU，Bifidobacterium longum N-acetylhexosamine-1-kinase(NahK)和E.coli N-acetylglucosamine uridyltransferase(GlmU),以及Campylobacter jejuniβ1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase(CjCgtA)；Bacteroides fragilis bifunctional L-fucokinase/GDP-fucose pyrophosphorylase(FKP)和Helicobacler mustelaeαl,2-fucosyltransferase(Hmα1,2FucT)；E.coli galactokinase(GalK),Bifidobacteriumlongum UDP-sugar pyrophosphorylase(BLUSP)和Neisseria meningitidesβ1,4-galactosyltransferase(NmLgtB),Helicobacter mustelaeα1,3-N-galactosyltransferase(BgtA),Humanα1,3-galactosyltransferase(GTB)，具有催化效果最佳，合成效率高，纯化简便的优点，而且上述酶可在常规的大肠杆菌表达系统中大量表达纯化。
Sda抗原的抗原决定簇是一个三糖结构，即Siaα2,3(GalNAcβ1,4)Gal(如图1所示)。
下面结合实施例对本发明进一步说明
实施例1
1、化学法合成α-构型的二糖化合物3(GlcNAcβ1,4GalNAcαproN3)
在50mL的双口圆底烧瓶中，将糖基受体(化合物1)(455mg,1.16mmol),糖基供体(化合物a)(1.08g,1.74mmol)以及干燥的
Figure BDA0002573948910000091
分子筛混合于干燥的二氯甲烷中，密封，充入氩气保护并于室温下搅拌30分钟。随后在低温反应器中将反应体系降温至0℃，加入促进剂三氟甲磺酸(TfOH,30μL,0.35mmol)，两小时后，薄层色谱检测(石油醚：乙酸乙酯＝1:3，v/v)受体基本反应完全。反应体系用二氯甲烷稀释后用硅藻土过滤，得到的有机相用饱和碳酸氢钠溶液萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，再通过快速硅胶柱分离纯化得到全保护的二糖化合物2(805mg,81％)。
将二糖化合物2(41mg,0.05mmol)溶解于干燥的四氢呋喃溶液中，加入四丁基氟化铵后在室温下搅拌过夜。不用经过纯化直接将反应体系旋干浓缩后，加入吡啶(5mL)和1.2当量的乙酸酐。薄层色谱检测(二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)反应完全，用1摩尔的盐酸将反应中的吡啶除去，旋蒸浓缩。随即将粗产物溶解在80％的乙酸溶液中，70℃加热直至4,6位苄叉去除完全。向反应液中加入5mL甲苯，旋蒸浓缩，反复进行四次。此步得到的粗产物直接溶解在干燥的甲醇中，加入30％甲醇的甲醇钠溶液，调整pH＝10，薄层色谱检测(乙酸乙酯：甲醇：水：醋酸＝8:3:1:0.2，v/v)反应完全。过Bio-Gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化得到二糖化合物3(19mg,78％)。参数如下1H NMR(600MHz,D2O)δ4.80(d,J＝3.9Hz,1H),4.53(d,J＝8.4Hz,1H),4.21(dd,J＝11.1,3.8Hz,1H),4.19–4.17(m,1H),3.96–3.91(m,2H),3.86(dd,J＝12.4,2.2Hz,1H),3.78–3.68(m,4H),3.66(dd,J＝10.4,8.4Hz,1H),3.53–3.47(m,2H),3.46–3.36(m,4H),2.01(s,3H),1.98(s,3H),1.89–1.84(m,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.30,173.49,102.33,97.01,76.33,75.46,73.26,70.34,69.55,68.66,64.77,61.03,60.25,55.42,48.36,48.07,27.82,22.04,21.89。
化合物3的合成路线如图8所示。
2、化学法合成α-构型的三糖化合物8[Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcαproN3]
在50mL的双口圆底烧瓶中，将糖基受体(化合物1)(700mg,1.78mmol),糖基供体b(968mg,2.14mmol)以及干燥的
Figure BDA0002573948910000101
分子筛混合于干燥的二氯甲烷中，密封，充入氩气保护并于室温下搅拌30分钟。随后在低温反应器中将反应体系降温至-25℃，加入NIS(30μL,0.35mmol)搅拌10分钟后，加入促进剂三氟甲磺酸(TfOH,47μL)，薄层色谱检测(石油醚：乙酸乙酯＝1:3，v/v)受体基本反应完全。反应体系用二氯甲烷稀释后用硅藻土过滤，得到的有机相用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液以及10％的氯化钠溶液依次萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，再通过快速硅胶柱分离纯化得到全保护的二糖化合物5(850mg,66％)。70℃下，在80％的乙酸溶液中将化合物5的4,6位苄叉移除，得到的化合物6再作为受体继续进行糖苷化反应。
化合物6(257mg,0.40mmol)为糖基受体，与糖基供体a(303mg,0.48mmol)，
Figure BDA0002573948910000102
分子筛混合，充分干燥30分钟后，降温至-45℃，加入促进剂三氟甲磺酸(TfOH,11μL,0.12mmol)后升温至室温。薄层色谱检测(二氯甲烷：甲醇＝1:6，v/v)反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液萃取，无水硫酸钠干燥。通过快速硅胶柱分离纯化得到全保护的三糖化合物7(355mg,58％)。与化合物3的脱保护过程类似，化合物7经过三步脱保护的过程得到裸三糖化合物8(150mg,83％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.83(d,J＝3.8Hz,1H),4.49(d,J＝8.5Hz,1H),4.42(d,J＝7.8Hz,1H),4.29(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),4.19(d,J＝3.2Hz,1H),4.03(dd,J＝8.5,3.1Hz,2H),3.99(dd,J＝11.1,3.2Hz,1H),3.90(dd,J＝12.4,2.0Hz,1H),3.87(dd,J＝3.5,0.9Hz,1H),3.75–3.65(m,6H),3.61(dd,J＝7.9,4.4Hz,1H),3.59(dd,J＝9.9,3.4Hz,1H),3.51–3.38(m,7H),1.99(s,6H),1.89–1.84(m,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.42,174.13,104.59,101.41,96.92,76.83,75.72,74.86,73.78,72.34,70.45,69.84,69.79,69.24,68.83,68.44,64.41,60.85,60.57,55.35,48.49,48.08,27.80,22.07,21.84。
化合物8的合成路线如图10所示。
3、酶法合成半乳糖基化产物4和9的一般操作方法
向50mL的离心管中加入化学合成得到的化合物3或8(1.0当量)、半乳糖(1.1当量)、腺苷三磷酸(ATP，1.2当量)、尿苷三磷酸(UTP，1.2当量)、Tris-HCl缓冲液(100mM，pH＝7.5)和氯化镁(20mM)，加双蒸水调节体积到10mL，振动混匀后加入酶EcGalK、BLUSP、NmLgtB。在37℃、110rpm下反应12小时。薄层色谱检测(乙酸乙酯：甲醇：水：醋酸＝8:3:1:0.2，v/v)反应完成后，加入等体积的冰乙醇10ml终止反应，4℃下静置30分钟。将反应体系在4℃，10000rpm条件下离心10分钟，将上清液旋干浓缩，过Bio-Gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化得到产物。
以下为酶法模块化组装获得半乳糖基化产物9和4的收率及结构信息：
化合物9[Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαproN3,78％]。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.84(d,J＝3.8Hz,1H),4.53(d,J＝8.3Hz,1H),4.45(d,J＝7,8Hz,1H),4.43(d,J＝9Hz,1H),4.30(dd,J＝11.1,3.8Hz,1H),4.20(d,J＝3.1Hz,1H),4.05(dd,J＝8.8,2.7Hz,2H),3.99(ddd,J＝15.4,11.7,2.7Hz,2H),3.89(dd,J＝10.4,3.4Hz,2H),3.81(dd,J＝12.3,5.2Hz,1H),3.78–3.56(m,14H),3.54–3.39(m,5H),2.00(d,J＝1.5Hz,6H),1.91–1.85(m,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.45,174.12,104.61,102.76,101.34,96.95,78.34,76.85,75.24,74.89,74.64,72.41,72.37,70.84,70.49,69.84,69.26,68.85,68.47,68.43,64.47,60.91,60.89,59.93,54.90,48.51,48.12,27.83,22.12,21.88。
化合物4(Galβ1,4GlcNAcβ1,3GalNAcαproN3,91％)。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.81(d,J＝3.9Hz,1H),4.55(d,J＝7.9Hz,1H),4.44(d,J＝7.8Hz,1H),4.22(dd,J＝11.1,3.8Hz,1H),4.18(d,J＝2.5Hz,1H),3.96–3.87(m,4H),3.83–3.61(m,12H),3.54–3.47(m,2H),3.47–3.38(m,2H),2.01(s,3H),1.98(s,3H),1.86(p,J＝6.4Hz,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.27,173.48,102.73,102.21,97.01,78.10,76.39,75.22,74.37,72.35,71.90,70.82,70.33,68.64,68.39,64.79,61.03,60.88,59.65,54.96,48.35,48.08,27.82,22.06,21.89。
化合物9的合成路线如图11所示。
实施例2
酶法模块A合成唾液酸化产物11、12、14、15的方法：
向50mL的离心管中加入受体化合物(化合物10或化合物13)(1.0当量)、唾液酸(Neu5Ac或Neu5Gc,1.1当量)、胞苷三磷酸(CTP，1.2当量)、Tris-HCl缓冲液(100mM，pH＝8.0)和氯化镁(20mM)，加双蒸水调节体积到10mL，振动混匀后加入酶NmCSS、PmST1M144D。在37℃、110rpm下反应12小时。薄层色谱检测(乙酸乙酯：甲醇：水：醋酸＝4:2:1:0.2，v/v)反应完成后，加入等体积的冰乙醇10mL终止反应，4℃下静置30分钟。将反应体系在4℃，10000rpm条件下离心10分钟，将上清液旋干浓缩，过Bio-Gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化得到产物。
化合物11、12、14、15的合成路线如图12所示。
化合物10和化合物13分别为式I和式III所示化合物，其中R1为叠氮取代烷基。
酶法模块A的催化过程如图2所示，唾液酸在酶NmCSS催化下合成CMP-Sia，在糖基转移酶PmST1M144D作用下以α2,3糖苷键的形式连接到末端Gal的3位。
以下为酶法模块组装A获得的代表性化合物：
Figure BDA0002573948910000111
以下为酶法模块组装A获得的化合物11、12、14、15的具体结构和收率信息：
化合物11(Neu5Acα2,3Galβ1,3GlcNAcβproN3，63％)。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.56(d,J＝8.3Hz,1H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.09(dd,J＝9.8,3.2Hz,1H),3.98(dt,J＝10.9,5.6Hz,1H),3.95–3.91(m,2H),3.89–3.81(m,4H),3.80–3.71(m,4H),3.70–3.59(m,6H),3.54(td,J＝9.0,7.8,2.7Hz,2H),3.49(ddd,J＝10.1,5.7,2.2Hz,1H),3.38(td,J＝6.6,2.4Hz,2H),2.76(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),2.03(d,J＝6.2Hz,6H),1.85(p,J＝6.4Hz,2H),1.78(t,J＝12.2Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.93,174.54,173.86,103.41,100.87,99.60,82.48,75.58,75.34,75.06,72.76,71.80,69.04,68.70,68.35,68.00,67.20,67.11,62.41,60.98,60.70,54.40,51.61,47.75,39.73,28.06,22.27,22.00。
化合物12(Neu5Gcα2,3Galβ1,3GlcNAcβproN3，76％)。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.54(d,J＝8.4Hz,1H),4.48(d,J＝7.8Hz,1H),4.10(s,2H),4.08(dd,J＝9.9,3.2Hz,1H),3.96(dt,J＝10.9,5.6Hz,1H),3.93–3.90(m,2H),3.86(ddd,J＝8.9,6.1,2.5Hz,1H),3.84–3.61(m,12H),3.58(dd,J＝9.1,2.0Hz,1H),3.55–3.51(m,2H),3.48(dd,J＝5.6,2.2Hz,1H),3.37(td,J＝6.6,2.4Hz,2H),2.76(dd,J＝12.4,4.7Hz,1H),2.02(s,3H),1.83(p,J＝7.2,6.8Hz,2H),1.78(t,J＝12.2Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.63,174.47,173.83,103.35,100.81,99.54,82.40,75.51,75.28,74.99,72.41,71.81,68.98,68.63,68.02,67.85,67.13,67.05,62.31,60.92,60.87,60.63,54.35,51.26,47.69,39.74,28.00,22.21。
化合物14(Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAcαproN3，76％)。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.91(d,J＝3.7Hz,1H),4.54(d,J＝7.8Hz,1H),4.32(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),4.25(d,J＝3Hz,1H),4.08(dd,J＝9.8,3.2Hz,1H),4.05(dd,J＝11.1,3.1Hz,1H),3.99(dd,J＝7.3,5.9Hz,1H),3.93(d,J＝3.2Hz,1H),3.90–3.58(m,13H),3.55(ddd,J＝9.8,7.0,2.9Hz,2H),3.52–3.42(m,2H),2.75(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),2.03(d,J＝1.4Hz,6H),1.93–1.88(m,2H),1.79(t,J＝12.1Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.95,174.54,173.87,104.42,99.68,97.15,77.36,75.62,74.75,72.77,71.80,70.60,69.06,68.54,68.35,68.02,67.36,64.89,62.47,61.19,60.95,51.62,48.66,48.15,39.69,27.94,22.02,22.01。
化合物15(Neu5Gcα2,3Galβ1,3GalNAcαproN3，76％)。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.90(d,J＝3.7Hz,1H),4.53(d,J＝7.9Hz,1H),4.31(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),4.24(d,J＝3.0Hz,1H),4.12–4.01(m,4H),4.00–3.90(m,3H),3.90–3.69(m,9H),3.66–3.40(m,7H),2.76(dd,J＝12.4,4.7Hz,1H),2.02(s,3H),1.89(p,J＝6.4Hz,2H),1.79(t,J＝12.1Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.65,174.47,173.84,104.36,99.62,97.08,77.28,75.53,74.68,72.41,71.80,70.53,68.98,68.47,68.02,67.86,67.27,64.81,62.35,61.12,60.88,59.22,51.25,48.59,48.07,39.68,27.87,21.95。
实施例3
酶法模块B唾液酸化产物17–22、24、25的方法：
向50mL的离心管中加入受体化合物(化合物4、化合物9、化合物16或化合物22)(1.0当量)、唾液酸(Neu5Ac或Neu5Gc,1.1当量)、胞苷三磷酸(CTP，1.2当量)、Tris-HCl缓冲液(100mM，pH＝8.0)和氯化镁(20mM)，加双蒸水调节体积到10mL，振动混匀后加入酶NmCSS、PmST3。在37℃、110rpm下反应12小时。薄层色谱检测(乙酸乙酯：甲醇：水：醋酸＝4:2:1:0.2,v/v)。反应完成后，加入等体积的冰乙醇10mL终止反应，4℃下静置30分钟。将反应体系在4℃，10000rpm条件下离心10分钟，将上清液旋干浓缩，过Bio-Gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化得到产物。
化合物17–22、24、25的合成路线如图13所示。
化合物16和化合物23分别为式II、式VI所示结构的化合物，其中R1为叠氮取代烷基。
酶法模块B的催化过程如图3所示，唾液酸在酶NmCSS催化下合成CMP-Sia，在糖基转移酶PmST3作用下以α2,3糖苷键的形式连接到末端β1,4Gal的3位。
以下为酶法模块组装B获得的代表性化合物：
Figure BDA0002573948910000131
以下为酶法模块组装B获得唾液酸化化合物17–22、24、25的具体结构和收率信息：
化合物17(Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAcβproN3，91％)。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.53(d,J＝7.9Hz,1H),4.51(d,J＝8.1Hz,1H),4.10(dd,J＝9.9,3.1Hz,1H),4.00–3.92(m,3H),3.89–3.81(m,4H),3.76–3.52(m,13H),3.36(td,J＝6.5,3.8Hz,2H),2.74(dd,J＝12.5,4.7Hz,1H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),1.83(q,J＝6.4Hz,2H),1.78(t,J＝12.2Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.97,174.45,173.85,102.54,101.12,99.78,78.27,75.44,75.14,74.72,72.85,72.31,71.74,69.35,68.32,68.06,67.44,67.10,62.55,61.00,60.00,55.05,51.65,47.75,39.60,28.08,22.14,22.02。
化合物18(Neu5Gcα2,3Galβ1,4GlcNAcβproN3，93％)。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.54(d,J＝7.9Hz,1H),4.51(d,J＝8.1Hz,1H),4.13–4.09(m,3H),4.01–3.61(m,17H),3.59–3.54(m,3H),3.36(td,J＝6.5,3.7Hz,2H),2.76(dd,J＝12.4,4.7Hz,1H),2.03(s,3H),1.85–1.77(m,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.67,174.38,173.82,102.47,101.05,99.72,78.19,75.36,75.07,74.65,72.50,72.24,71.72,69.29,68.00,67.91,67.36,67.03,62.43,60.94,60.87,59.94,54.98,51.28,47.67,39.59,28.01,22.07。
化合物19[Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαproN3，96％]。结构参数：：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.84(d,J＝3.8Hz,1H),4.53(d,J＝7.2Hz,1H),4.53(d,J＝9Hz,1H)4.43(d,J＝7.8Hz,1H),4.30(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),4.20(d,J＝3.2Hz,1H),4.09(dd,J＝9.9,3.1Hz,1H),4.07–4.03(m,2H),4.00(ddd,J＝11.9,8.3,2.7Hz,2H),3.93(d,J＝3.2Hz,1H),3.89–3.81(m,4H),3.77–3.53(m,16H),3.51–3.40(m,4H),2.74(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),2.01(d,J＝0.8Hz,3H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.91–1.85(m,2H),1.78(t,J＝12.1Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.88,174.43,174.11,173.76,104.60,102.45,101.39,99.67,96.95,78.19,76.86,75.34,75.06,74.88,74.64,72.76,72.37,71.65,70.48,69.86,69.28,69.26,68.83,68.47,68.25,67.96,67.34,64.48,62.45,60.92,60.87,59.91,54.90,51.55,48.51,48.12,39.51,27.82,22.11,21.92,21.8。
化合物20[Neu5Gcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαproN3，89％]。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.86(d,J＝3.8Hz,1H),4.55(d,J＝7.8Hz,1H),4.54(d,J＝8.4Hz,1H)4.45(d,J＝7.8Hz,1H),4.31(dd,J＝11.0,3.7Hz,1H),4.22(d,J＝3.1Hz,1H),4.13–4.10(m,3H),4.06(dq,J＝7.9,3.1Hz,2H),4.01(ddd,J＝11.0,7.4,2.6Hz,2H),3.96–3.41(m,28H),2.77(dd,J＝12.5,4.7Hz,1H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),1.94–1.86(m,2H),1.81(t,J＝12.1Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.68,174.46,174.13,173.81,104.62,102.49,101.42,99.72,96.98,78.26,76.89,75.37,75.09,74.91,74.67,72.51,72.40,71.73,70.52,69.87,69.30,69.29,68.85,68.50,68.01,67.93,67.37,64.53,62.45,60.94,60.90,59.96,59.59,54.93,51.29,48.54,48.15,39.61,27.85,22.15,21.91。
化合物21(Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3GalNAcαproN3，87％)。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.53(d,J＝7.9Hz,1H),4.51(d,J＝7.8Hz,1H),4.20(dd,J＝11.1,3.8Hz,1H),4.17(d,J＝3Hz,1H)4.07(dd,J＝9.9,3.1Hz,1H),3.92(ddd,J＝13.0,7.4,3.9Hz,4H),3.86–3.37(m,23H),2.71(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),2.00(s,3H),1.98(s,3H),1.96(s,3H),1.85(p,J＝6.5Hz,2H),1.75(t,J＝12.1Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.63,174.27,173.75,173.47,102.36,102.27,99.66,96.99,77.86,76.29,75.31,75.03,74.36,72.44,71.85,71.67,70.34,69.24,68.65,67.94,67.82,67.28,64.74,62.36,61.04,60.88,60.80,59.60,54.93,51.21,48.36,48.04,39.53,27.81,22.03,21.86。
化合物22(Neu5Gcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3GalNAcαproN3，92％)。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.53(d,J＝8.0Hz,1H),4.51(d,J＝7.9Hz,1H),4.20(dd,J＝11.1,3.8Hz,1H),4.18(d,J＝3Hz,1H),4.09–4.06(m,3H),3.95–3.80(m,9H),3.77–3.64(m,11H),3.60(dd,J＝11.9,6.3Hz,1H),3.56–3.45(m,4H),3.41(tq,J＝12.6,6.1Hz,2H),2.73(dd,J＝12.4,4.7Hz,1H),2.00(s,3H),1.96(s,3H),1.85(p,J＝6.5Hz,2H),1.77(t,J＝12.1Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.85,174.27,173.72,173.48,102.36,102.27,99.65,97.00,77.87,76.30,75.33,75.03,74.37,72.73,71.85,71.62,70.35,69.24,68.66,68.21,67.91,67.30,64.75,62.40,61.05,60.88,59.60,54.94,51.51,48.37,48.05,39.47,27.82,22.04,21.87。
化合物24(Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3Galβ1,4GlcβproN3，91％)。结构参数：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.70(d,J＝8.3Hz,1H),4.56(d,J＝7.9Hz,1H),4.49(d,J＝8.0Hz,1H),4.44(d,J＝7.9Hz,1H),4.16(d,J＝3.3Hz,1H),4.12(dd,J＝9.9,3.1Hz,1H),4.02–3.94(m,5H),3.91–3.55(m,25H),3.46(t,J＝6.7Hz,2H),3.33–3.29(m,1H),2.76(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),2.03(s,6H),1.91(p,J＝6.6Hz,2H),1.80(t,J＝12.1Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.98,174.86,173.83,102.91,102.77,102.50,102.07,99.77,82.01,78.32,77.94,75.45,75.14,74.86,74.74,74.52,74.32,72.85,72.75,72.11,71.73,69.92,69.35,68.32,68.28,68.04,67.43,67.33,62.54,61.00,60.93,60.01,59.80,55.14,51.64,47.83,39.60,28.19,22.13,22.00。
化合物25(Neu5Gcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3Galβ1,4GlcβproN3，92％)。结构参数：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.68(d,J＝8.4Hz,1H),4.55(d,J＝7.9Hz,1H),4.47(d,J＝8.0Hz,1H),4.42(d,J＝7.9Hz,1H),4.14(d,J＝3.3Hz,1H),4.10(m,3H),4.01–3.84(m,9H),3.81–3.69(m,12H),3.65–3.54(m,9H),3.44(t,J＝6.7Hz,2H),3.31–3.28(m,1H),2.76(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),2.02(s,3H),1.90(p,J＝6.6Hz,2H),1.80(t,J＝12.1Hz,1H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.68,174.80,173.80,102.84,102.71,102.44,102.01,99.72,81.95,78.25,77.87,75.38,75.08,74.80,74.68,74.46,74.26,72.68,72.51,72.05,71.73,69.86,69.29,68.23,68.00,67.91,67.36,67.27,62.43,60.94,60.87,59.95,59.74,55.08,51.28,47.77,39.60,28.13,22.07。
实施例4
酶法模块C合成化合物26-37的方法：
向50mL的离心管中加入受体化合物(1.0当量)、N-乙酰氨基半乳糖(1.2当量)、腺苷三磷酸(ATP，1.2当量)、尿苷三磷酸(UTP，1.2当量)、Tris-HCl缓冲液(100mM，pH＝7.0)和氯化镁(20mM)，加双蒸水调节体积到10mL，振动混匀后加入酶NahK/GlmU、CjCgtA。在37℃、110rpm下反应12小时。薄层色谱检测(乙酸乙酯：甲醇：水：醋酸＝4:2:1:0.2，v/v)反应完成后，加入等体积的冰乙醇10毫升终止反应，4℃下静置30分钟，将反应体系在4℃，10000rpm条件下离心10分钟，将上清液旋干浓缩，过Bio-Gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化得到产物。
受体化合物为化合物11、化合物12、化合物14、化合物15、化合物17、化合物18、化合物19、化合物20、化合物21、化合物22、化合物24、化合物25。化合物26-37的合成路线如图14所示。
酶法模块C的催化过程如图4所示，GalNAc在酶NahK/GlmU催化下合成UDP-GalNAc，在糖基转移酶CjCgtA作用下以β1,4糖苷键的形式连接到末端Gal的4位。
以下为酶法模块组装C获得的代表性化合物：
Figure BDA0002573948910000151
以下为一酶法模块组装C获得化合物26-37的具体结构和收率信息：
化合物26[Neu5Acα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,3GlcNAcβproN3，91％]。结构参数：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.72(d,J＝8.5Hz,1H),4.55(d,J＝8.4Hz,1H),4.52(d,J＝7.9Hz,1H),4.13(dd,J＝9.8,3.1Hz,1H),4.10(d,J＝3.1Hz,1H),3.98(dt,J＝11.0,5.6Hz,1H),3.95–3.46(m,23H),3.40–3.33(m,3H),2.67(dd,J＝12.6,4.7Hz,1H),2.04(s,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),1.91(t,J＝12.1Hz,1H),1.85(p,J＝6.4Hz,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.97,174.82,174.51,174.03,103.00,102.68,101.38,100.91,82.38,76.77,75.30,74.65,74.44,73.99,72.97,72.23,71.17,69.59,68.64,68.62,67.95,67.73,67.10,62.72,61.11,60.72,60.48,54.38,52.30,51.53,47.75,37.16,28.07,22.55,22.27,22.01。
化合物27[Neu5Gcα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,3GlcNAcβproN3，89％]。结构参数：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.70(d,J＝8.5Hz,1H),4.52(d,J＝8.4Hz,1H),4.49(d,J＝7.9Hz,1H),4.12(dd,J＝9.7,3.1Hz,1H),4.09(d,J＝8.1Hz,3H),3.95(dt,J＝10.9,5.6Hz,1H),3.92–3.56(m,21H),3.52(dd,J＝9.9,8.4Hz,1H),3.45(ddd,J＝9.9,5.7,2.3Hz,1H),3.37–3.31(m,3H),2.66(dd,J＝12.6,4.7Hz,1H),2.02(s,3H),2.00(s,3H),1.90(t,J＝12.1Hz,1H),1.82(p,J＝6.4Hz,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.64,174.76,174.44,173.99,102.94,102.62,101.31,100.85,82.30,76.67,75.24,74.59,74.38,73.93,72.62,72.24,71.09,69.53,68.58,68.30,67.80,67.67,67.03,62.61,61.05,60.88,60.66,60.42,54.32,52.24,51.17,47.68,37.18,28.01,22.49,22.21。
化合物28[Neu5Acα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,3GalNAcαproN3，93％]。结构参数：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.86(d,J＝3.8Hz,1H),4.70(d,J＝8.5Hz,1H),4.52(d,J＝7.9Hz,1H),4.30(dd,J＝11.0,3.7Hz,1H),4.17(d,J＝3.1Hz,1H),4.10–4.06(m,2H),3.99(dd,J＝11.1,3.1Hz,1H),3.96(dd,J＝7.0,5.5Hz,1H),3.91–3.86(m,2H),3.84(dd,J＝12.0,2.3Hz,1H),3.81–3.64(m,13H),3.59(dd,J＝12.0,6.7Hz,1H),3.56(dd,J＝9.2,2.2Hz,1H),3.51(dt,J＝10.2,6.0Hz,1H),3.48–3.40(m,3H),3.31(dd,J＝9.6,7.9Hz,1H),2.63(dd,J＝12.7,4.7Hz,1H),2.00(s,3H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.91–1.85(m,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.93,174.86,174.50,174.04,104.30,102.65,101.43,97.19,77.29,76.83,74.62,74.29,73.56,72.93,72.22,71.08,70.53,69.57,68.62,68.61,67.93,67.68,64.82,62.74,61.15,61.09,60.33,52.27,51.49,48.55,48.10,37.00,27.92,22.53,21.98,21.96。
化合物29[Neu5Gcα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,3GalNAcαproN3，87％]。结构参数：1HNMR(500MHz,D2O)δ4.90(d,J＝3.8Hz,1H),4.74(d,J＝8.5Hz,1H),4.56(d,J＝7.9Hz,1H),4.33(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),4.20(d,J＝3.0Hz,1H),4.15–4.10(m,4H),4.02(dd,J＝11.1,3.1Hz,1H),3.99(t,J＝6.3Hz,1H),3.94–3.68(m,16H),3.65–3.58(m,3H),3.55(dt,J＝10.3,6.1Hz,1H),3.52–3.42(m,2H),3.35(dd,J＝9.6,7.9Hz,1H),2.68(dd,J＝12.6,4.5Hz,1H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),1.96–1.88(m,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.68,174.87,174.50,174.07,104.31,102.65,101.43,97.19,77.29,76.80,74.63,74.30,73.57,72.65,72.30,71.07,70.53,69.58,68.63,68.36,67.85,67.69,64.83,62.70,61.15,61.09,60.91,60.33,52.27,51.19,48.55,48.11,37.09,27.92,22.54,21.97。
化合物30[Neu5Acα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβproN3，94％]。结构参数：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.73(d,J＝8.5Hz,1H),4.55(d,J＝7.9Hz,1H),4.52(d,J＝7.9Hz,1H),4.15(dd,J＝9.8,3.1Hz,1H),4.12(d,J＝3.1Hz,1H),4.01–3.95(m,2H),3.93–3.56(m,21H),3.48(dd,J＝10.1,2.1Hz,1H),3.39–3.34(m,3H),2.66(dd,J＝12.6,4.6Hz,1H),2.05(s,3H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),1.93(t,J＝12.1Hz,1H),1.84(p,J＝6.4Hz,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.96,174.79,174.45,174.04,102.72,102.56,101.60,101.13,78.84,77.14,74.66,74.26,73.96,73.03,72.34,72.24,71.22,69.99,68.67,67.96,67.72,67.08,62.79,61.11,60.48,60.06,54.92,52.29,51.55,47.74,36.88,28.07,22.56,22.13,22.01。
化合物31[Neu5Gcα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβproN3，87％]。结构参数：1HNMR(500MHz,D2O)δ4.74(d,J＝8.5Hz,1H),4.56(d,J＝8.0Hz,1H),4.53(d,J＝8.1Hz,1H),4.17(dd,J＝9.8,3.0Hz,1H),4.12(s,3H),4.03–3.57(m,24H),3.41–3.35(m,3H),2.68(dd,J＝12.6,4.4Hz,1H),2.05(s,3H),2.02(s,3H),1.95(t,J＝11.8Hz,1H),1.85(p,J＝6.5Hz,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.68,174.76,174.43,174.06,102.69,102.53,101.58,101.10,78.78,77.09,74.64,74.23,73.93,72.71,72.31,72.28,71.17,69.97,68.39,67.84,67.69,67.05,62.72,61.09,60.90,60.45,60.02,54.90,52.26,51.22,47.70,36.91,28.05,22.54,22.10。
化合物32[Neu5Acα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαproN3，92％]。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.84(d,J＝3.8Hz,1H),4.70(d,J＝8.5Hz,1H),4.52(d,J＝7.8Hz,1H),4.52(d,J＝9Hz,1H),4.43(d,J＝7.8Hz,1H),4.30(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),4.20(d,J＝3.2Hz,1H),4.13(dd,J＝9.8,3.0Hz,1H),4.09(d,J＝3.1Hz,1H),4.06–4.03(m,2H),3.99(td,J＝12.7,12.0,2.7Hz,2H),3.90–3.55(m,26H),3.50–3.40(m,6H),3.33(dd,J＝9.7,7.9Hz,1H),2.63(dd,J＝12.6,4.6Hz,1H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.99(s,3H),1.93–1.84(m,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.92,174.76,174.49,174.17,174.03,104.66,102.69,102.53,101.56,101.44,97.00,78.79,77.10,76.91,74.93,74.64,74.22,73.93,72.99,72.42,72.22,71.17,70.54,69.95,69.85,69.32,68.88,68.64,68.53,67.92,67.69,64.52,62.76,61.09,60.93,60.45,60.02,54.84,52.26,51.51,48.56,48.17,36.84,27.88,22.53,22.17,21.98,21.93。
化合物33[Neu5Gcα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcαproN3，88％]。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.88(d,J＝3.8Hz,1H),4.75(d,J＝8.5Hz,1H),4.56(d,J＝7.8Hz,1H),4.55(d,J＝8.4Hz,1H)4.46(d,J＝7.8Hz,1H),4.33(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),4.23(d,J＝3.2Hz,1H),4.17(dd,J＝9.8,3.1Hz,1H),4.13(s,2H),4.09–4.00(m,5H),3.95–3.58(m,27H),3.54–3.43(m,5H),3.37(dd,J＝9.6,7.8Hz,1H),2.69(dd,J＝12.5,4.5Hz,1H),2.03(d,J＝2.6Hz,9H),1.95(t,J＝12.0Hz,1H),1.92–1.86(m,2H)；13CNMR(150MHz,D2O)δ175.72,174.80,174.52,174.20,174.07,104.68,102.72,102.58,101.61,101.47,97.04,78.87,77.11,76.95,74.97,74.68,74.28,73.98,72.75,72.47,72.31,71.23,70.59,69.99,69.87,69.36,68.91,68.57,68.42,67.89,67.74,64.60,62.76,61.12,60.96,60.49,60.08,54.88,52.30,51.27,48.61,48.22,36.98,27.91,22.58,22.21,21.97。
化合物34[Neu5Acα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβ1,3GalNAcαproN3，92％]。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.85(d,J＝3.8Hz,1H),4.73(d,J＝8.5Hz,1H),4.59(d,J＝7.8Hz,1H),4.56(d,J＝7.9Hz,1H),4.26(dd,J＝11.1,3.8Hz,1H),4.22(d,J＝3.1Hz,1H),4.16(dd,J＝9.8,3.1Hz,1H),4.12(d,J＝3.1Hz,1H),4.00–3.67(m,23H),3.63(dd,J＝12.1,6.7Hz,1H),3.60(dd,J＝9.1,2.1Hz,1H),3.57–3.43(m,5H),3.36(dd,J＝9.8,7.9Hz,1H),2.67(dd,J＝12.6,4.6Hz,1H),2.05(s,3H),2.04(s,3H),2.02(s,3H),2.02(s,3H),1.94–1.88(m,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.97,174.79,174.39,174.03,173.60,102.73,102.55,102.39,101.58,97.13,78.65,77.12,76.45,74.66,74.45,74.28,73.99,73.04,72.24,72.03,71.20,70.47,70.00,68.77,68.66,67.96,67.72,64.91,62.79,61.16,61.12,60.50,59.83,54.94,52.30,51.57,48.49,48.20,36.91,27.94,22.58,22.18,22.02,22.00。
化合物35[Neu5Gcα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβ1,3GalNAcαproN3，92％]。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.85(d,J＝3.8Hz,1H),4.74(d,J＝8.6Hz,1H),4.59(d,J＝7.7Hz,1H),4.57(d,J＝7.9Hz,1H),4.26(dd,J＝11.1,3.8Hz,1H),4.22(d,J＝3.1Hz,1H),4.17(dd,J＝9.8,3.1Hz,1H),4.13(s,3H),4.00–3.67(m,23H),3.65–3.60(m,3H),3.58–3.51(m,2H),3.50–3.43(m,2H),3.37(dd,J＝9.8,7.9Hz,1H),2.69(dd,J＝12.6,4.5Hz,1H),2.06(s,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),1.97–1.93(m,1H),1.93–1.89(m,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.72,174.80,174.40,174.06,173.60,102.73,102.56,102.40,101.60,97.13,78.66,77.10,76.45,74.67,74.45,74.29,74.00,72.76,72.31,72.04,71.20,70.47,70.01,68.78,68.41,67.88,67.73,64.91,62.76,61.17,61.12,60.96,60.50,59.84,54.94,52.30,51.27,48.49,48.20,36.98,27.94,22.59,22.18,22.01。
化合物36[Neu5Acα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβ1,3Galβ1,4GlcβproN3，90％]。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.70(d,J＝8.5Hz,1H),4.67(d,J＝8.3Hz,1H),4.53(d,J＝8.0Hz,1H),4.46(d,J＝8.0Hz,1H),4.41(d,J＝7.9Hz,1H),4.13(q,J＝4.6Hz,2H),4.09(d,J＝3.1Hz,1H),4.00–3.53(m,32H),3.47–3.45(m,1H),3.43(t,J＝6.8Hz,3H),3.33(dd,J＝9.8,7.9Hz,1H),3.30–3.26(m,1H),2.63(dd,J＝12.6,4.6Hz,1H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.93–1.86(m,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.92,174.84,174.76,174.02,102.88,102.76,102.69,102.49,102.04,101.56,81.97,78.45,78.26,77.10,74.83,74.71,74.64,74.44,74.29,74.23,73.93,73.00,72.71,72.22,72.11,71.17,69.96,69.90,68.65,68.26,67.92,67.69,67.30,62.75,61.09,60.91,60.46,59.97,59.81,54.98,52.26,51.51,47.79,36.84,28.17,22.53,22.10,21.97。
化合物37[Neu5Gcα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβ1,3Galβ1,4GlcβproN3，90％]。结构参数：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.71(d,J＝8.5Hz,1H),4.67(d,J＝8.3Hz,1H),4.54(d,J＝7.9Hz,1H),4.46(d,J＝8.0Hz,1H),4.41(d,J＝7.9Hz,1H),4.16–4.12(m,3H),4.10(d,J＝5.4Hz,2H),4.00–3.53(m,34H),3.44(t,J＝6.7Hz,2H),3.34(dd,J＝9.7,7.9Hz,1H),3.31–3.27(m,1H),2.65(dd,J＝12.6,4.7Hz,1H),2.01(s,3H),1.99(s,3H),1.94–1.86(m,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ175.64,174.80,174.72,174.00,102.84,102.71,102.65,102.47,102.00,101.53,81.94,78.45,78.26,77.04,74.79,74.68,74.60,74.41,74.26,74.21,73.91,72.68,72.24,72.08,71.14,69.93,69.87,68.35,68.22,67.81,67.66,67.27,62.68,61.05,60.87,60.43,59.95,59.79,54.96,52.23,51.19,47.77,36.90,28.13,22.51,22.07。
实施例5
酶法模块D合成H抗原相关联的杂合型Sda抗原化合物38[Neu5Gcα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Fucα1,2Galβ1,3)GalNAcαproN3，81％]，合成步骤如下：
向50mL的离心管中加入受体化合物32(1.0当量)、岩藻糖(1.1当量)、腺苷三磷酸(ATP，1.2当量)、鸟苷三磷酸(GTP，1.2当量)、Tris-HCl缓冲液(100mM，pH＝7.5)和氯化镁(20mM)，加双蒸水调节体积到10mL，振动混匀后加入酶FKP，Hmα1,2FucT。在37℃、110rpm下反应2小时。薄层色谱检测(乙酸乙酯：甲醇：水：醋酸＝2:2:1:0.2，v/v)。反应完成后，加入等体积的冰乙醇10毫升终止反应，4℃下静置30分钟。将反应体系在4℃，10000rpm条件下离心10分钟，将上清液旋干浓缩，过Bio-Gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化得到产物。具体参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ5.24(d,J＝4.1Hz,1H),4.86(d,J＝3.5Hz,1H),4.74(d,J＝8.5Hz,1H),4.63(d,J＝7.7Hz,1H),4.56(d,J＝7.8Hz,2H),4.23(q,J＝6.6Hz,1H),4.19–4.07(m,7H),4.01(dd,J＝12.3,2.2Hz,1H),3.94–3.59(m,30H),3.51–3.42(m,5H),3.36(dd,J＝9.8,7.9Hz,1H),2.67(dd,J＝12.6,4.6Hz,1H),2.05(s,3H),2.04(s,3H),2.02(d,J＝1.0Hz,6H),1.96–1.92(m,1H),1.89(q,J＝6.3Hz,2H),1.20(d,J＝6.5Hz,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.97,174.79,174.23,174.04,173.60,102.72,102.58,101.99,101.60,101.53,99.21,96.57,78.85,77.14,76.19,75.00,74.67,74.27,73.98,73.84,73.50,73.04,72.48,72.25,71.80,71.23,70.07,69.99,69.55,69.35,69.27,69.07,68.67,68.04,67.97,67.73,66.77,64.41,62.80,61.12,60.92,60.49,60.07,59.42,54.89,52.30,51.56,49.42,48.15,36.91,27.98,22.57,22.21,22.01,21.87,15.35。
酶法模块D的催化过程如图5所示，Fucose在双功能酶FKP催化下合成GDP-Fucose，在糖基转移酶Hmα1,2FucT作用下以α1,2糖苷键的形式连接到3位分支的Gal上。
化合物38的具体合成路线如图15所示。
实施例6
酶法模块E合成A抗原相关联的杂合型Sda抗原化合物39{Neu5Gcα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβ1,6[Fucα1,2(GalNAcα1,3)Galβ1,3]GalNAcαproN3，72％}，合成步骤如下：
向50mL的离心管中加入受体化合物38(1.0当量)、N-乙酰氨基半乳糖(1.2当量)、腺苷三磷酸(ATP，1.2当量)、尿苷三磷酸(UTP，1.2当量)、Tris-HCl缓冲液(100mM，pH＝7.5)和氯化镁(20mM)，加双蒸水调节体积到10mL，振动混匀后加入酶NahK/GlmU、BgtA。在37℃、110rpm下反应12小时。薄层色谱检测(乙酸乙酯：甲醇：水：醋酸＝2:2:1:0.2，v/v)反应完成后，加入等体积的冰乙醇10毫升终止反应，4℃下静置30分钟。将反应体系在4℃，10000rpm条件下离心10分钟，将上清液旋干浓缩，过Bio-Gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化得到产物。具体参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ5.25(d,J＝4.2Hz,1H),5.14(d,J＝3.9Hz,1H),4.70(d,J＝8.5Hz,1H),4.64(d,J＝7.6Hz,1H),4.43(d,J＝7.2Hz,1H),4.42(d,J＝8.4Hz,1H),4.26(td,J＝8.3,7.8,5.5Hz,2H),4.22–3.52(m,45H),3.49–3.39(m,4H),3.33(dd,J＝9.7,7.9Hz,1H),2.63(dd,J＝12.6,4.6Hz,1H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.99(d,J＝1.0Hz,6H),1.93–1.83(m,3H),1.17(d,J＝6.5Hz,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.92,174.75,174.20,174.02,173.56,102.69,102.52,102.05,101.56,101.48,98.68,96.44,91.15,78.77,77.10,75.31,74.77,74.63,74.21,73.93,72.99,72.74,72.43,72.22,71.73,71.17,70.88,70.06,69.95,69.88,69.51,69.34,69.27,68.64,68.46,67.91,67.68,67.65,67.57,66.83,64.27,62.91,62.75,61.33,61.08,60.93,60.45,60.00,54.84,52.25,51.51,49.50,49.30,48.06,36.83,27.95,22.53,22.17,21.97,21.88,15.27。
酶法模块E的催化过程如图6所示，GalNAc在酶NahK/GlmU催化下合成UDP-GalNAc，在糖基转移酶BgtA作用下以α1,3糖苷键的形式连接到3位分支的Gal上。
化合物39的具体合成路线如图16所示。
实施例7
酶法模块F合成B抗原相关联的杂合型Sda抗原化合物40{Neu5Gcα2,3(GalNAcβ1,4)Galβ1,4GlcNAcβ1,6[Fucα1,2(Galα1,3)Galβ1,3]GalNAcαproN3，50％}，合成步骤如下：向50mL的离心管中加入受体化合物38(1.0当量)、半乳糖(1.2当量)、腺苷三磷酸(ATP，1.2当量)、尿苷三磷酸(UTP，1.2当量)、Tris-HCl缓冲液(100mM，pH＝7.5)和氯化镁(20mM)，加双蒸水调节体积到10mL，振动混匀后加入酶GalK、BLUSP、GTB。在37℃℃、110rpm下反应24小时。薄层色谱检测(乙酸乙酯：甲醇：水：醋酸＝2:2:1:0.2，v/v)反应完成后，加入等体积的冰乙醇10毫升终止反应，4℃下静置30分钟。将反应体系在4℃，10000rpm条件下离心10分钟，将上清液旋干浓缩，过Bio-Gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化得到产物。具体参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ5.23(d,J＝4.3Hz,1H),5.21(d,J＝3.7Hz,1H),4.70(d,J＝8.5Hz,1H),4.66(d,J＝7.6Hz,1H),4.39(d,J＝7.8Hz,1H),4.38(d,J＝9Hz,1H),4.27–4.04(m,9H),3.99–3.52(m,38H),3.47–3.39(m,4H),3.33(dd,J＝9.7,7.9Hz,1H),2.63(dd,J＝12.6,4.6Hz,1H),2.02(s,3H),2.00(s,3H),1.99(s,6H),1.93–1.83(m,3H),1.16(d,J＝6.5Hz,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.92,174.75,174.19,174.02,173.55,102.69,102.52,102.14,101.56,101.49,98.75,96.42,92.82,78.76,77.10,75.84,74.63,74.57,74.27,74.21,73.93,72.99,72.74,72.43,72.22,71.73,71.17,70.96,70.16,69.95,69.52,69.39,69.29,69.22,68.64,68.03,67.91,67.69,67.58,66.80,64.25,63.33,62.75,61.29,61.09,60.90,60.45,60.00,54.85,52.25,51.51,49.29,48.06,36.83,27.96,22.53,22.17,21.98,21.88,15.27。
酶法模块F的催化过程如图7所示，Galactose在酶GalK和BLUSP催化下生成UDP-Gal，在糖基转移酶GTB作用下以α1,3糖苷键的形式连接到3位分支的Gal上。
化合物40的具体合成路线如图17所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酶法模块，其特征在于：包括长双歧杆菌N-乙酰氨基葡萄糖激酶、大肠杆菌糖核苷生成酶以及空肠弯曲杆菌β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。
2.一种酶法模块，其特征在于：包括脑膜炎奈瑟菌糖核苷生成酶、多杀巴斯德菌α2-3唾液酸转移酶；
优选的，多杀巴斯德菌α2-3唾液酸转移酶为PmST1M144D或PmST3。
3.一种酶法模块，其特征在于：包括脆弱拟杆菌岩藻糖激酶、脆弱拟杆菌糖核苷生成酶、幽门螺杆菌α1-2岩藻糖转移酶。
4.一种酶法模块，其特征在于：包括长双歧杆菌N-乙酰氨基葡萄糖激酶、大肠杆菌糖核苷生成酶以及幽门螺杆菌α1-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。
5.一种酶法模块，其特征在于：包括大肠杆菌半乳糖激酶、双歧杆菌糖核苷生成酶以及半乳糖转移酶。
6.权利要求1-5任一所述的酶法模块在合成Sda糖抗原中的应用。
7.一种Sda糖抗原的合成方法，其特征在于：利用Sda糖抗原核心结构和酶法模块完成Sda糖抗原决定簇的组装得到非杂合型Sda糖抗原；
或，Sda糖抗原结构和酶法模块完成ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原的结构合成。
8.如权利要求7所述的Sda糖抗原的合成方法，其特征在于：Sda糖抗原核心结构为如式I、式II、式III、式IV、式V、式VI所示：
Figure FDA0002573948900000011
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等；
优选的，式IV所示Sda糖抗原核心结构的合成方法为将三糖糖苷[Galβ1,4(GlcNAcα1,3)GalNAcOR1]作为酶反应受体与半乳糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、大肠杆菌半乳糖激酶(EcGalK)、双歧杆菌糖核苷生成酶(BLUSP)以及脑膜炎奈瑟菌β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)混合进行反应得到式(IV)所示的α构型糖苷Galβ1,4(Galβ1,4GlcNAcα1,3)GalNAcOR1；
优选的，式V所示Sda糖抗原核心结构的合成方法为将二糖糖苷GlcNAcα1,3GalNAcOR1作为酶反应的受体与半乳糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、大肠杆菌半乳糖激酶(EcGalK)、双歧杆菌糖核苷生成酶(BLUSP)以及脑膜炎奈瑟菌β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)混合进行反应得到式(V)所示的α构型糖苷Galβ1,4GlcNAcα1,3GalNAcOR1；
优选的，三糖糖苷或二糖糖苷对应的半乳糖当量为1.2-5.0，糖苷对应的ATP当量为1.2-5.0，糖苷对应的UTP当量为1.2-5.0，MgCl2浓度为5-100mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-500mM，pH 5.0-10.0。
9.如权利要求7所述的Sda糖抗原的合成方法，其特征在于：Sda糖抗原核心结构和酶法模块反应的方法为将Sda糖抗原核心结构先后与唾液酸和N-乙酰氨基半乳糖、核苷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、酶法模块混合反应，得到Sda糖抗原；
优选的，Sda糖抗原核心结构和酶法模块反应的方法为将Sda糖抗原核心结构与唾液酸、核苷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、酶法模块混合反应，得到糖抗原；将得到的糖抗原结构与N-乙酰氨基半乳糖、核苷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、酶法模块混合反应，得到非杂合型Sda糖抗原。
或，杂合型Sda糖抗原的合成方法为：将非杂合型Sda糖抗原与岩藻糖、N-乙酰氨基半乳糖或半乳糖、核苷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、酶法模块混合反应，得到ABH相关联的杂合型Sda糖抗原；
优选的，唾液酸为Neu5Ac或Neu5Gc；
优选的，核苷酸为胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)中的一到两种；
优选的，Sda糖抗原的合成反应温度为0-37℃，反应时间为0.5-24h或3-72h。
10.如权利要求7所述的Sda糖抗原的合成方法，其特征在于：酶法模块A、唾液酸与式I或式III进行反应得到式VII、式VIII、式IX、式X所示的糖抗原，核苷酸为CTP；
Figure FDA0002573948900000021
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类；
或，酶法模块B、唾液酸与式II或式IV、V、VI进行反应得到式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、式XVI、式XVII、式XVIII所示糖抗原，核苷酸为CTP；
Figure FDA0002573948900000022
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类；
或，酶法模块C与N-乙酰氨基半乳糖、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、式XVI、式XVII或式XVIII反应得到(XIX)、式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)、式(XXV)、式(XXVI)、式(XXVII)、式(XXVIII)、式(XXIX)、式(XXX)所示的多糖组装得到的非杂合型Sda糖抗原，核苷酸为ATP和UTP；
Figure FDA0002573948900000031
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类；
或，将酶法模块D与岩藻糖、式XXV所示结构组装得到式XXXI所示的杂合型Sda糖抗原，核苷酸为ATP和GTP；
Figure FDA0002573948900000032
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类；
或，酶法模块E、N-乙酰氨基半乳糖、式XXXI所示化合物组装得到式XXXII所示的杂合型Sda糖抗原，核苷酸为ATP和UTP；
Figure FDA0002573948900000041
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类；
或，酶法模块F、半乳糖、式XXXI所示化合物组装得到式XXXIII所示的杂合型Sda糖抗原，核苷酸为ATP和UTP；
Figure FDA0002573948900000042
R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410705A (zh) * 2022-01-24 2022-04-29 武汉糖智药业有限公司 一种新型血型抗原及其酶法合成方法
CN114736944A (zh) * 2022-04-14 2022-07-12 山东大学深圳研究院 一种化学酶法合成α-肌营养不良蛋白聚糖相关糖肽的方法
CN114990174A (zh) * 2022-05-19 2022-09-02 江苏海飞生物科技有限公司 一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102443597A (zh) * 2010-10-15 2012-05-09 天津赛科瑞德生物科技有限公司 糖核苷酸的酶法制备
CN102796144A (zh) * 2012-08-22 2012-11-28 山东大学 Tf抗原及其类似物、和其化学酶法合成方法及其应用
CN103555796A (zh) * 2013-10-24 2014-02-05 山东大学 双唾液酸化四糖的合成方法
US20170016040A1 (en) * 2011-07-21 2017-01-19 The Regents Of The University Of California Chemoenzymatic synthesis of heparin and heparan sulfate analogs
CN108130349A (zh) * 2018-01-19 2018-06-08 山东大学 一种Lewis x单聚体、二聚体及其唾液酸化衍生物的寡糖的合成方法
CN108251474A (zh) * 2018-01-15 2018-07-06 山东大学 Abh人血型抗原的合成方法
CN111235128A (zh) * 2020-01-17 2020-06-05 山东大学 一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102443597A (zh) * 2010-10-15 2012-05-09 天津赛科瑞德生物科技有限公司 糖核苷酸的酶法制备
US20170016040A1 (en) * 2011-07-21 2017-01-19 The Regents Of The University Of California Chemoenzymatic synthesis of heparin and heparan sulfate analogs
CN102796144A (zh) * 2012-08-22 2012-11-28 山东大学 Tf抗原及其类似物、和其化学酶法合成方法及其应用
CN103555796A (zh) * 2013-10-24 2014-02-05 山东大学 双唾液酸化四糖的合成方法
CN108251474A (zh) * 2018-01-15 2018-07-06 山东大学 Abh人血型抗原的合成方法
CN108130349A (zh) * 2018-01-19 2018-06-08 山东大学 一种Lewis x单聚体、二聚体及其唾液酸化衍生物的寡糖的合成方法
CN111235128A (zh) * 2020-01-17 2020-06-05 山东大学 一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENGJIANG ZHAO ET AL.: "The Sda and Cad glycan antigens and their glycosyltransferase, beta 1,4GalNAcT-II, in xenotransplantation", 《XENOTRANSPLANTATION》 *
FABIODALL"OLIO ET AL.: "The expanding roles of the Sd(a)/Cad carbohydrate antigen and its cognate glycosyltransferase B4GALNT2", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-GENERAL SUBJECTS》 *
HAI YU ET AL.: "Streamlined chemoenzymatic total synthesis of prioritized ganglioside cancer antigens", 《ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY》 *
KAN ZHONG ET AL.: "Highly efficient biocatalytic cascade for the diversity-oriented synthesis of complex blood group Sda antigens", 《GREEN CHEMISTRY》 *
张娇等: "Sda抗原研究进展", 《临床血液学杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410705A (zh) * 2022-01-24 2022-04-29 武汉糖智药业有限公司 一种新型血型抗原及其酶法合成方法
CN114736944A (zh) * 2022-04-14 2022-07-12 山东大学深圳研究院 一种化学酶法合成α-肌营养不良蛋白聚糖相关糖肽的方法
CN114990174A (zh) * 2022-05-19 2022-09-02 江苏海飞生物科技有限公司 一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法
CN114990174B (zh) * 2022-05-19 2023-10-20 江苏海飞生物科技有限公司 一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法

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