RO118132B1 - Procedeu de obtinere a carbohidratilor fucozilati intr-un singur amestec de reactie, sistem de reactie in vitro si compus intermediar - Google Patents

Abstract

Inventia se refera la un procedeu de obtinere a carbohidratilor fucozilati intr-un singur amestec de reactie, la un sistem de reactie in vitro, constituit dintr-o fucoziltransferaza si o nucleozid-difosfo-fucoza, si la un compus intermediar in procedeul de obtinere a carbohidratilor fucozilati reprezentat de o monozaharida fosfitil blocata.

Description

Invenția de față se referă la un procedeu de obținere a carbohidratului fucozilat, la un sistem de reacție in vitro, precum și la un compus intermediar.

Procedee de obținere a carbohidraților sunt dezvăluite în brevetele US 5109 126, 4686193, 4563445, 5079353, 4137401, 4925796 și 4770994.

Acestea sunt diferite față de procedeul conform prezentei invenții.

Prezenta invenție se referă la un procedeu de obținere a carbohidraților fucozilați întrun singur amestec de reactive, la un sistem de reactivi in vitro și la un compus intermediar pentru aplicarea procedeului de obținiere a carbohidraților fucozilați.

Procedeul de obținere a carbohidraților fucozilați într-un singur amestec de reacție, conform invenției, cuprinde următoarele faze:

a) Obținerea unui glicosil 1- sau 2-fosfit prin supunerea reacției unui inel glicozidic blocat având un hidroxid în poziția anomerică cu un reactiv trivalent de fosfitilare, reacție în urma căreia rezultă un inel glicozidic blocat 1- sau 2-fosfit substituit;

b) Formarea unei legături O-glicozidice între o nucleozidă 5'-fosfo-fucoză și o grupă hidroxil a unei molecule de carbohidrat acceptoare, cu ajutorul fucoziltransferazei, obținânduse un carbohidrat fucolizat și o nucleozidă 5'-difosfat;

c) Reciclarea, in situ, a nucleozidei 5'-difosfat cu fucoza, obținându-se nucleozidă 5'difosfo-fucoza corespunzătoare.

Sistemul de reacție in vitro .conform invenției, este constituit dintr-o fucoziltransferază și o nucleozită difosfo-fucoză, formând enzima.

Compus intermediar, conform invenției, este o monozaharidă fosfitil blocată cu formula generală structurală:

*2 în care: fiecare R, este același sau diferit și este o grupă arii sau o grupă alchil inferior (C, -C₅); X este independent un atom de oxigen sau azot; R₂ este independent o grupă acil, benzii, silii sau alchil care sunt grupe de blocare, sau X - R₂, ambele sunt grupe absente și sunt înlocuite cu atomi de hidrogen; R₃ este independent un atom de hidrogen, un radical CH₃, - OR₂, - CH₂ - OR₂, CH - (OR₂) - CH (OR₂), sau CH - (OR₂) - CH - (OR₂);R₄ este un atom de hidrogen, carboxil sau alchil (C, - C₅) sau benzii carboxilat; și m este 0 sau 1.

Prezenta invenție se referă deci la procedee perfecționate de producere enzimatică a carbohidraților, în special, a carbohidraților fucozilați. Invenția prezintă pentru sinteza perfecționată a glicozil 1- sau 2-fosfat utilizarea ambilor agenți chimici și enzimatici. Aceste glicozide fosforilate sunt apoi utilizate pentru a produce nucleotide de tip zaharuri, care sunt apoi utilizate ca zaharuri donoare pentru glicozilarea carbohidraților acceptori. în cele de față se preferă, în mod special, dezvăluirea procedeelor utilizate pentru fucozilare.

Prezenta invenție se referă la un procedeu de preparare a carbohidratului fucozilat într-un singur amestec de reacție cuprinzând fazele sau etapele următoare: utilizarea unei fucoziltransferaze pentru a forma o legătură O-glicozidică între o 5'-difosfo-fucoz - nucleozida și o grupare hidroxil disponibilă a moleculei de carbohidrat acceptoare pentru a produce

RO 118132 Β1 un carbohidrat fucozilat și o 5'-difosfat-nucleozida; și reciclizarea in situ a 5'-difosfatnucleozidei cu fucoză pentru a forma nucleozida corespunzătoare 5'-difosfo-fucozei. Proce- 50 deele preferate, conform acestei invenții, constau în utilizarea guaninei ca bază pentru nucleozidă, utilizarea unor cantități catalitice de nucleozide, utilizarea N-acetilglucozamină, galactoză, N-acetilgalactozamină, sau a N-acetilactozamină ca moleculă carbohidrat acceptoare, și utilizarea unei molecule de carbohidrat sialilat ca acceptor.

Această invenție mai prezintă un procedeu de preparare a moleculei de carbohidrat 55 sialilat fucozilat prin formarea enzimatică a legăturilor glicozidice într-un singur amestec de reacție care constă în formarea mai întâi, a legăturii glicozidice între un glicozil activat donor de către o difosfonucleozidă cum este de exemplu, UDP-Gal și o grupă hidroxil disponibilă de la o moleculă de carbohidrat acceptoare cum ar fi, de exemplu, GIcNAc utilizând mai întâi glicoziltransferaza cum ar fi, /3-1,4-galactoziltransferaza în prepararea Ga^1, 4GlcNAc; for- 60 marea unei a doua legături glicozidice între un donor sialil activat cu o monofosfonucleozidă cum ar fi, de exemplu, CMP-NeuAc și o grupă hidroxil disponibilă a moleculei acceptoare de tip zahar cum ar fi, de exemplu, poziția 3-hidroxil din Gal a Gaipi, 4GlcNAc folosind sialiltransferaza cum ar fi, de exemplu, a-2,3-sialiltransferaza; formarea unei a treia legături glicozidice între un donor fucozil activat cu o difosfonucleozidă cum ar fi, GDP-Fuc și o grupă 65 hidroxil disponibilă de la o moleculă acceptoare de tip zahăr cum ar fi, de exemplu, poziția 3-hidroxil din GIcNAc, din Gaipi, 4GlcNAc utilizând o fucoziltransferază cum ar fi, de exemplu, a-1,3/4-fucoziltransferaza în care cel puțin una din fazele (a), (b), sau (c) conțin mai departe formarea in situ a donorului glicozil activat de fosfonucleotidă de la o cantitate catalitică de monofosfat corespunuzător și difosfat nucleozidă. Sunt preferate, în mod 70 special, procedeele acestei invenții în care o parte sau o jumătate din carbohidratul sialilat fucozilat produs, este un ligand Lewis sialilat cum ar fi, de exemplu, sialil Le* (Sie*) sau sialil Le* (Sie*) și în care fucoza este transferată de la un donor fucozil la o grupă hidroxil a Nacetilglucozaminei sau la restul de galactoză al moleculei acceptoare de carbohidrat.

Acest procedeu conține multiple reacții de catalizare a glicoziltransferazei într-un 75 singur amestec de reacție și sunt de preferat acele procedee în care o glicoziltransferază este o sialiltransferază selectată dintr-un grup constând din: a-2,3- sialiltransferază, a-2,4sialiltransferază, a-2,6-sialiltransferază și a-2,8-sialiltransferază. Invenția de față intenționează fucozilarea unei oligozaharide și sunt preferate acele fucoziltransferaze selectate din grupul constând din: a-1,2-fucoziltransferază, a-1,3/4 fucoziltransferază, a-1,3-fucozil- 80 transferază, a-1,6-fucoziltransferază și a-1,4- fucoziltransferază. în mod special ,sunt preferate fucozil transferazele ca, /3-galactozida, a-1,2-transferază, N-acetilglucozamina-a-1,3fucoziltransferază, N-acetilglucozamina- a-1,4-fucozil-transferază și N-acetil-glucozamina-a1,6-fucoziltransferază.

Moleculele acceptorului carbohidrat sunt nelimitate din cauză că glicoziltransferazele 85 nu sunt selective mai presus de pozițiile adiacente zaharurilor. Astfel, poate fi substituită oricare din molecula carbohidratului unde carbohidratul este un Galpl, 4GlcNAc sau analoge acestora, sau terminate în Gaipi, 4GlcNAc-X, pe jumătate, unde X este o moleculă organică. în plus, moleculele acceptoare ale carbohidratului sunt substraturi pentru o fucosilază și pot fi analog Gaipi, 4GlcNAc și Gaipi, 4GlcNAc-X. Ca exemple de astfel de 90 molecule sunt cele de lactoză, NeuAc.al, 6Galp1, 4GlcNAc, Gaipi, 3GlcNAc, GalȘ1, 4Glucal (lactal), NeuAcxa2, 3Gaipi, 4Glucal, produsele reacției 2-halogeno-substituite ai glucalilorde mai sus, GalȘ1, 4(5-tio)Glc, Galpl, 4GlcNAcp-O-alil și cele asemănătoare lor. Este bine cunoscut faptul că molecula acceptoare carbohidrat trebuie să conțină o grupă disponibilă hidroxilică pe zaharida cu care este legat fucozilul donor sau altă grupă de tip 95 zaharuri, hidroxilul fiind determinat de către enzima glicoziltransferazei pentru a fi utilizat în reacție.

RO 118132 Β1

Procedeul, conform invenției, prezintă regenerarea cantității catalitice de nucleotidele utilizate pentru a obține nucleozide de tip zaharuri. O bază preferată pentru nucleotide sunt, citidina, guanina, sau uridina. Monozaharidele donoare sunt nucleotide de tip zaharuri activate cum ar fi, de exemplu, acidul citidin 5'-mono-fosfo-N-acetilneuraminic, guanidin 5'difosfo-fucoză și uridin 5'-difosfo-galactoză.

Prezenta invenție mai are ca obiect și sistemele de reacție in vitro. Fiecare din sisteme se referă la un container inert sau nereactiv sau la un adăpost gen cabină care adăpostește reactanții utilizați pentru a conduce reacțiile descrise mai sus. în mod special, aceste sisteme de reacție au un minimum de fucoziltransferază și o nucleozidă difosfofucoză, formând enzima. Aceste sisteme de reacție pot conține mai departe guanozin difosfofucoză pirofosforilază ca, GDP-fucoză formând enzima, o kinază ca de exemplu, piruvat kinaza sau fructoză-1,6-difosfat kinază, acetil kinază sau fucoz-kinaza. Alți reactanți pot include un NADPH ca sistem de regenerare sau guanozin difosfat manoză și guanozin difosfo manoză pirofosforilază. Dacă un sistem de regenerare NADPH este prezent, acesta poate include o cantitate catalitică din NADP izopropanol, de la 1 până la 10 procente, de preferință, de la 2 până la 4 procente gr./vol. (greutate/volum) în sistemul de reacție, și un alcool dehidrogenază.

Sunt, de asemenea, prezentate în cele de față un număr de procedee chimice pentru sintetizarea oligozaharidelor. Unul se referă la producerea unui glicozil 1- sau 2-fosfat prin reacția unui inel glicozil blocat având o grupă hidroxil în poziția anomerică (1- sau în poziția 2-) cu un reactant trivalent fosforilat pentru a obține un inel glicozil blocat 1- sau 2-fosfit substituit. Fosfitul blocat este oxidat pentru a forma fosfatul corespunzător care este folosit într-o reacție enzimatică. Inelul glicozil poate include un galactozil, glucozil, fucozil, N-acetilglucozil și manozil precum și alte zaharide. Reactivii trivalenți preferați pentru fosfitilare sunt dibenzil Ν,Ν-dialchilfosforoamidit cum ar fi, de exemplu, dibenzil Ν,Ν-dietilfosforoamidit. Ca dialchil sunt alchilii inferiori cu 1 până la 5 atomi de carbon în moleculă, cel mult aceștia pot fi aceeași sau diferiți. Acest procedeu utilizează mai departe reactanți de blocare ca, de exemplu, acetil sau benzii. Inelul glicozil este opțional din grupul constând din D - sau Laldoze având patru, cinci sau șase atomi de carbon, sau din grupul constând din D- sau Lcetoze având patru, cinci sau șase atomi de carbon, precum și zaharidele având până la nouă atomi de carbon în lanțul de zaharidă.

Această invenție își propune să prezinte și noii intermediari pentru producerea unor glicozil 1- sau 2-fosfați. Intermediarul preferat este o monozaharidă fosfitil blocată având formula generală I:

Rg R2 în care: R, este un radical arii sau un alchil inferior; X este independent oxigen sau azot; R₂ este independent un radical acil, un benzii, silii sau o grupă alchil blocată; R₃ este independent -CH₃, -OR,, -CH^OR,, -CHțOF^-CHțORJ, sau -CH(OR₂)-CH(OR₂)-CH(OR₂); R₄ este hidrogen (H), carboxil sau Ο_ΓΟ₅ sau ester benzilic carboxilat și n este 1 sau 2.

RO 118132 Β1

150 într-o grupă preferată a compusului având formula I, R₄ este hidrogen .astfel, încât formula I devine formula II, de mai jos, în care: R_n R₂, R₃, X și n sunt cele definite mai sus.

R2 R2

O-R

O-P_v O-R (II)

155

O grupă special preferată de compuși, este aceea în care monozaharida este al șaselea membru din inel, R₄ este H, și fiecare X este oxigen astfel ca manoza sau fucoza. Sunt preferați compușii în care, R₁ este benzii și R₂ este benzii sau acetil. Ca exemple de 160 intermediari preferați pot fi incluși dibenzilfosfitil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-D-manozidă sau dibenzilfosfitil 2,3,4-tri-O-acetil-L-fucozidă.

O altă grupă special preferată de compuși este aceea în care monozaharida este al șaselea membru din inel, R, și R₂ sunt cei descriși mai sus, un X este azot ceilalți fiind oxigen. Ca exemple de compuși având acea grupă pot fi enumerați GIcNAc, GalNAc și 165 NeuAc. Ilustrativ pentru acești compuși sunt dibenzilfosfitil 2-acetamido-2-deoxi-3,4,6-tri-0acetil-D-glucozida și 2-acetamido-2-deoxi-3,4,6-tri-0-acetil-D-galactozida.

O monozaharidă analoagă este 2,3,4-tri-O-benzoil-alfa-L-fucopiranozil-bromura.

Expresia “grupă hidroxil disponibilă sau utilizabilă se referă la un carbon hidroxisubstituit formând o parte din porțiunea de inel a moleculei acceptoare de carbohidrat, aceea 170 putând forma o legătură glicozidică prin acțiunea unei glicoziltransferaze, transferând un mono- sau difosfonucleozidă-donor glicozil activat la un atom de carbon disponibil. Grupa hidroxil disponibilă este în mod tipic aflată în poziția -3 pentru fucozilare.

Expresia “inel glicozilic blocat” se referă la inelele glicozilice unde substituenții amino sau hidroxi disponibili pot reacționa cu acil, benzii, silii, sau alte grupe de blocare alchil. 175 Fiecare dintre grupe au fost descrise în general de către John Wiley și Sons, în Green, T.W., “Grupe de protecție din sintezele organice”, Inc.,1981.

Expresia “carbohidrat-carbohidrați” înseamnă o parte organică având carbohidrați cu legături covalente la oricare monomeri ai zaharidelor. Aceasta poate include dizaharidele, oligozaharidele, glicollipidele, glicoproteinele și legături nenaturale cum ar fi, de exemplu, 180 legarea zaharidelor de compuși organici nenaturali legați de zaharuri.

Expresia “moleculă acceptoare de carbohidrat” se referă la o moleculă suport având cel puțin o monozaharidă care are una sau mai multe grupe hidroxilice disponibile pentru a forma legături glicozidice cu mono- sau difosfonucleozidă donor glicozilic activat.

Expresia “cantitate catalitică” se referă la concentrațiile reactivilor care sunt prezenți 185 într-o cantitate relativ mică în comparație cu reactivii care sunt în cantitate stoechiometrică și nu sunt reduși ca, concentrație la o cantitate semnificativă în timpul proceselor de desfășurare a reacțiilor. Acești reactivi sunt prezenți în cantitate catalitică fiind reactivi cu o activitate specifică, tipică, și sunt apoi regenerați printr-o reacție în alte reacții.

Expresia “mono sau difosfonucleozidă-donor glicozilic activat” sau “moleculă donor 190 activată” se referă la o nucleotidă de tip zaharuri cum ar fi, de exemplu, 5'-difosfo-galactoz uridina. Acești compuși conțin legături cu energie mare care facilitează formarea unei legături glicozil la molecula acceptoare de carbohidrat. Nucleozida poate fi cuprinsă sau inclusă în oricare din bazele naturale și în zaharide și poate, de asemenea, cuprinde derivați minori ca metil, sau azo substituiți la bază, grupe hidroxi blocate sau dehidroxilate în 195 zaharide și analog tiofosfat dintr-o porțiune a unui difosfat.

RO 118132 Β1

Expresia “legătură glicozidică” se referă la o legătură tipică oxigen/carbon între zaharuri. Aceasta poate fi pe de o parte, a sau β în configurația sa și implică în mod tipic o reacție de sinteză de deshidratare unde o difosfonucleozidă-donor glicozilic activat este transformată într-un carbon disponibil a unei molecule de carbohidrat acceptor utilizând o glicoziltransferază.

Expresia “inel glicozil” se referă la o zaharidă sau aminozaharidă având 5 sau 6 atomi de carbon în inel. El cuprinde aldozele, deoxialdozele și cetozele neprivind orientarea sau configurația legăturilor atomilor de carbon asimetrici. Acesta cuprinde, de exemplu, zaharuri precum este riboza, arabinoza, xiloza, lixoza, aloza, altroza, glucoza, idoza, galactoza, taloza, ribuloza, xiluloza, psicoza, N-acetilglucozamina, N-acetilgalactozamina, N-acetilmanozamina, acidul N-acetilneuraminic, fructoza, sorboza, tagatoza, ramnoza și fucoza.

Expresia “glicoziltransferază” se referă la o familie de enzime care asociază la un mono- sau difosfonucleozidă-donor glicozilic activat, un atom de carbon disponibil al unei molecule de carbohidrat acceptor, printr-o legătură glicozidică. Aceste enzime includ ambele enzime purificate prin surse naturale și sursele au fost modificate genetic pentru a putea fi exprimate astfel de enzime. Familia glicoziltransferazei cuprinde sialiltransferazele, N-acetilglucozaminiltransferazele, N-acetilgalactozaminiltransferazele, fucoziltransferazele, manoziltransferazele, galactogiltransferazele, și KDO transferazele.

Expresia “sistem de regenerare NADPH se referă la un component de enzime care reduce NADP-ul generat dintr-o reacție enzimatică in situ în NADPH. Tipic, un astfel de sistem declanșează la un alcool dehidrogenarea, transformând un alcool, ca (izopropanolul) la o cetonă (acetonă).

Expresia “ligand Lewis sialilat” în termeni funcționali se referă la o moleculă capabilă de a lega la un receptor ELAM un receptor proteic GMP-140. Definit din punct de vedere chimic acești liganzi sunt liganzi ai tetrazaharidelor naturale Sie* și Sle^a, precum și derivații acestora. Astfel de derivați sunt substituenți minori ai grupărilor hidroxi pentru hidrogen, alchil, aciloxi, alcoxi halo, glicozil, molecule de glicali, compuși cu inel glicozilic în care inelul oxigen cu sulf sau NH și radicalul alchil al lor, oxigenat sau derivații acil, atașați la carbonul anomeric al carbohidraților sau moleculelor organice, schimbând orientarea și poziția legăturilor glicozidice sau enantiomerii substituiți ai zaharidelor naturale.

Expresia “proporție stoechiometrică” se referă la cantitatea de materie primă care este prezentă în proporție directă cu produsele reacției. Un reactiv este în proporție stoechiometrică până la finalizarea reacției din cauză că acesta este tipic utilizat în reacțiile de preparare până la sfârșitul reacției și nu este regenerat în timpul acestor procese. Proporțiile stoechiometrice tipice sunt de aproximativ 1:1 sau 2:1 al produsului inițial față de produsul final.

Expresia “reactiv de fosfitilare trivalent” se referă la un reactiv care reacționează cu o grupă hidroxil a unui compus organic pentru a forma un produs conținând fosfit, care poate fi oxidat cu un reactiv de oxidare pentru a se obține un compus fosfat după deprotejare.

în afara unor anumite situații, pe de altă parte, toate informațiile sunt încorporate în cele de față prin raportare.

Abrevieri ADP, adenozin 5'-difosfat; ATP, adenozin 5'-trifosfat; CMP, citidin 5'-monofosfat; CDP, citidin 5'-difosfat; CTP, citidin 5'-trifosfat; CMP-NeuAc, citidin 5'-monofosfo-Nacetilneuraminic acid; Fuc, fucoză; Fk, fucoz kinază; Fuc-1-Ρ, fucoză 1-fosfat; Fuc-T, fucozil transferază; Gal, galactoză; GalNac, N-acetilgalactozamină; GTP, guanozin 5'-trifosfat; GDP-Fuc, guanozin 5'-difosfo fucoză; GDP, guanozin 5’-difosfat; GDP-Man, guanozin 5'difosfo-manoză; GDP-ManPP, GDP-manoză pirofosforilază; GDP-FucPP, GDP-fucoză pirofosforilază; Glc-1-Ρ, glucoză-1-fosfat; GIcNac, N-acetilglucozamină; ManNAc, N-acetilmanozamină; NADP(NADPH), adenin nicotinamid dinucloetid fosfat; NeuAc, acid N

RO 118132 Β1 acetilneuraminic; NMK, nucleozida monofosfat kinazei; MK, miokinază; Ppase, pirofosfatază anorganică; PK, piruvat kinază; PEP, fosfo (enol) piruvat; Pyr, piruvat; PPi, pirofosfat anorganic; Pi, fosfat anorganic; Rha, ramnoză; UDP, uridin 5'-difosfat; UTP.uridin 5'-trifosfat; UDP-GIc, uridin 5'-difosfoglucoză; UDP-Gal, uridin 5'-difosfo-galactoză.

Multe din formulele structurale utilizate în cele de față conțin doar două sau trei grupe 250 legate într-un inel de atomi de carbon. Urmând convenției, grupele necunoscute sunt atomi de hidrogen, și sunt de obicei legături mai puțin descrise ale atomilor de carbon în afară de cazul când este dorită a fi cunoscută structura stereochimică. în alte formule, liniile descrise cu o configurație mai închisă sunt utilizate pentru a descrie legăturile care vin din planul din pagină, în timp ce liniile punctate sunt utilizate pentru a descrie legăturile care revin din 255 planul hârtiei. Liniile ondulate sunt utilizate pentru a indica cele două tipuri de legături (ambele legături alfa și beta).

în invenția de față se prezintă un procedeu de reacție in situ multienzimatic în care o moleculă de carbohidrat acceptor este fucozilat cu o nucleozidă 5'-difosfofucoză utilizând o fucoziltransferază unde nucleozida 5'-difosfofucoză este preferabil a fi generată pe cale 260 enzimatică de la o cantitate catalitică de nucleotide, așa cum se arată în schemele generale 1 și 2, de mai jos.

265

Schema 1

RO 118132 Β1

Schema 2

în mod special, invenția face cunoscută și prevede perfecționarea mijloacelor de obținere a unor nucleotide precursoare zaharidelor care funcționează ca substraturi donoare pentru reacțiile glicoziltransferazei. Aceste metode se realizează prin mijloace chimice și enzimatice. Perfecționarea chimică constă într-o mai bună producere și o mai bună stabilitate a zaharidelor blocate din compușii intermediari utilizați pentru a forma glicozil 1-sau 2fosfații, care sunt transformați prin oxidare la fosfați, și care sunt condensați cu nucleozide monofosfat pentru a se produce zaharidele nucleozidei 5'-difosfo sau nucleotide de tip zaharide.

Un alt aspect al acestei invenții constă în dezvoltarea unui sistem multi-enzimatic cuprinzând mai mult de o reacție a glicoziltransferazei pentru sintetizarea carbohidraților în care o perfecționare rezidă din utilizarea unor cantități catalitice de nucleotidă. Nucleotidele sunt regenerate din mono- sau difosfat de forme tri-fosfat, utilizând in situ simultan reacția enzimatică cu reacțiile glicoziltransferazei. Cantitățile catalitice de nucleotidă sunt utilizate din cauza efectului inhibitor al nucleotidelor asupra glicoziltransferazelor.

RO 118132 Β1

340 în următoarele cereri de brevete este conținută relatarea subiectului de mai sus, US nr. 07/670701 înregistrat în martie 18,1991; US nr. 07/707600 înregistrat în mai 30, 1991; US nr. 07/738211 înregistrat în iulie 30, 1991 intitulate : Substraturi enzimatice de oligozaharide și inhibitori. Metode și compoziții; US nr. 07/852409 înregistrat în martie 16, 1992 și US nr. 07/889652 înregistrat în mai 26, 1992. Fiecare din aceste cinci brevete sunt încorporate în cele de față prin referiri.

A. Fucozilarea

Această invenție se referă la utilizarea fucozelor mai sus descrise și la tehnologia referitoare la fucozilarea carbohidraților. Fucozilarea este o modificare finală obișnuită, pentru mulți carbohidrați activi din punct de vedere biologic cum este, de exemplu, antigenele Lewis ambele sialilate și nesialilate.

(1) Fucoziltransferazele

Fucozilarea oprește din acțiune o fucoziltransferază. Fucoziltransferazele sunt bine cunoscute și au fost verificate și controlate în Adv.Enzymol.,52;44-56(1981). Atomul de carbon din carbohidrat este un membru tipic al inelului unei glucoze, galactoze sau Nacetilglucozamină, sau a altor analogi ai acestora. Legătura glicozidică este mai obișnuită într-o orientare în poziția alfa. Cele mai obișnuite poziții sunt 2-, 3-, sau 6-hidroxil al galactozei, 3-, 4-, sau 6-grupă hidroxil a N-acetilglucozaminei sau 3-, sau 4-hidroxil a glucozei. Glucal- și (5-tio)glucoza conținute în zaharide pot fi, de asemenea, unități acceptând zaharide ale unui carbohidrat acceptor pentru enzimele de fucoziltransferază.

Fucoziltransferazele pot fi izolate din surse naturale sau microorganisme recombinate care au fost genetic alterate pentru a se manifesta fucoziltransferazele. Fucoziltransferazele native purificate au fost descrise de Foster, J.Biol.Chem. 266:3526-3531 (1991); Muramatsu, Eur.J.Biochem., 157:71-75 (1986); și Prieels și colab., J. Biol.Chem., 256:10456-10463 (1981). Genele fucoziltransferazei au fost comunicate ca fiind donate și exprimate concret de Campbell și colab.,J.S/o/.C/)em.,259:11208-11214 (1984); Larsen, și colab., Proc. Natl. Acad.Sci.,OS 87:6674-6678 (1990); și Kulowska-Latallo, și colab., Genes and Devei., 4:1288-1303 (1990); Weston și colab., J.Biol.Chem., 267:4152(1992).

în general, fucoziltransferazele sunt membrane sau diafragme de delimitare. Astfel fucoziltransferazele intacte sunt de obicei tipic insolubile în soluție apoasă. Pentru a ușura utilizarea lor în metode și sisteme de reacție ale acestei invenții, se preferă utilizarea de enzime solubile în care terminația citoplasmatică insolubilă a fost eliminată sau redată mai hidrofilic prin eliminare selectivă sau prin adiția unui acid aminic polar. Câteodată, fucoziltransferazele intacte nativ pot fi utilizate în această invenție prin adiția unei cantități minime dintr-un detergent neionic cum ar fi, de exemplu Triton-X-100.

Fucoziltransferazele sunt un tip specific al glicoziltransferazelor. Molecula donor activată este de tipul unei nucleotide 5'-difosfofucoză. Reacția generează nucleotida ca un rest de grupare, și o fucoză având un ion de carbon reactiv ce formează o legătură glicozidică cu o grupare hidroxil disponibilă a moleculei acceptor.

(2) Condițiile reacției de fucozilare și substraturile

Fucoziltransferazele sunt glicozilaze tipice, și sunt enzime relativ dure. Condițiile de reacție convenabile pentru cele mai multe glicoziltransferaze sunt convenabile și pentru fucoziltransferaze. De exemplu, condițiile de reacție convenabile sunt, o temperatură de la 10 la 40°C, circuitele tampon sunt substanțe tampon organice și anorganice cu pH-ul cuprins în intervalul pH -ului fiziologic. Un interval de pH acceptabil este cuprins între 4 până la 9. Concentrația sării este între 0 până la 200 mM, și de la 0,1 până la 1,0% pentru detergentul neionic (de exemplu, Triton X 100) care este utilizat când enzimele nu sunt solubile în mediul apos de fucozilare. Cationii bivalenți precum este Mn²⁺ sunt adesea necesari.

345

350

355

360

365

370

375

380

385

RO 118132 Β1

Moleculele acceptoare ale carbohidratului sunt nelimitate. Pozițiile legăturilor cunoscute sunt prevăzute ca mai sus; câteodată, restul de moleculă carbohidrat acceptoare nu este hotărâtor sau decisiv. Fucoziltransferazele sunt în întregime substraturi tolerante și mai presus de zaharida acceptoare după care este fucoza atașată și zaharida imediat adiacentă la acceptorul de tip zaharidă, structura rămânând a substratului care este de mică importanță. Moleculele carbohidratului acceptor pot fi făcute exclusiv la restul de zaharidă incluzând monozaharidele glicoproteinelor, ale glicolipidelor, sau un compus nenatural unde zaharida acceptând fucoza este legată la compuși cum ar fi, de exemplu, arii, heterocicluri, cicloalchene și hidrocarburi aciclice.

O moleculă de carbohidrat acceptor preferată e terminată în Gal314GlcNAc-X, în care X este o moleculă organică. Grupări exemplificatoare pentru X sunt notate mai jos în text. Molecule de carbohidrat acceptor pot fi Galpl, 4GlcNAc, lactoză, NeuAc.a2, 6Galp1, 4GlcNAc, GalȘ1, 3GlcNAc, Galpl, 4Glucal, (lactal), NeuAcxa2, 3GalȘ1, 4Glucal, produsele reacției de substituție 2-halogen ai glucalilor, Galpl, 4(5-tio)Glc, Galpl, 4GlcNAcp-O-alil.

Un Sle^x sau Sle^a analog poate astfel include un atom de halogen în locul unui hidroxil din inel. O nouă metodă a fost găsită pentru prepararea 2- sau 3-halo-mono- și oligozaharide pornind de la glicalii lor corespunzători prin utilizarea cloroperoxidazei. Rezultă 2(3)-deoxi2(3)-halozaharide care pot fi apoi utilizate în sintezele discutate mai jos.

Conform acestei metode, un glical este amestecat cu apă oxigenată, un ion de halogen (clor, brom, sau iod) și o cantitate catalitică dintr-o clorperoxidază (EC 1.11.10) întro soluție tampon apoasă având o valoare a pH-ului cuprinsă, între 2,5 până la 3,5 pentru a forma amestecul de reacție. Rezultatul amestecului de reacție este apoi menținut până se formează produsul dorit. Concentrația diferiților reactanți poate fi variată și este binecunoscută în practică. Exemple de concentrații și sinteze sunt prevăzute mai jos. Produsul halohidrat astfel format este apoi de preferat să fie recuperat.

La temperatura obișnuită a camerei, timpii de reacție tipici sunt de la 15 min până la

2- 4 zile. Iodurile reacționează cel mai rapid și clorurile reacționează cel mai lent, încet.

Produsele termodinamice formate sunt obținute în mod tipic, excepție făcând interacțiunile 1,3-diaxial, care previne formarea produsului substituit 2-axial. Când interacțiunile 1,3diaxiale sunt prezente în glicalul care reacționează, stereospecificitatea în produsul halohidrat este observată ca o orientare a sau β a grupei halogen, cu ambii anomeri al grupei 1sau 2-hidroxil, grupele, de asemenea, fiind formate. Exemple de sinteze de molecule 2- sau

3- halo carbohidrat acceptor și precursorii lor sunt ilustrate în schemele 3, 4 și 4a de mai jos.

Bromhidrarea unei molecule de sialil Le^x având un glical terminal (compusul 36 al schemei 4a) are conformația soluției similară cu a produselor sialil Le^x prevăzute (compușii 37a și 37b). Aceste produse participă având aceeași conformație cu compusul 36 și sialil Le* în legăturile din aria sau domeniul constând din NeuAc-Gal-Fuc conform cu studiile NOE.

Zaharidele bromurate pot fi, de asemenea, preparate utilizând N-bromsuccinimida (NBS) într-un solvent de apă-acetonitril. Acest procedeu poate fi utilizat pentru a produce schimbarea procentuală a produselor formate cum este compusul 32 și 33 care sunt produse în mod egal în reacția enzimatică și în proporția de 1.2,5 (32.33) utilizând NBS. Compusul 35,3-halogenat și izomerul său halogenat compusul 35a sunt realizate în proporția de 2:3 (35:35a) utilizând reacția NBS și comparat cu un singur izomer, compusul 35, când este utilizată reacția enzimatică.

RO 118132 Β1

435

Schema 3

440

445

450

455

50%. β/α-0.4 ( 83% toul yield)

460

COOH

465

470

Schema 3 ilustrează bromhidrarea D-glucal, D-galactal, și

D-fucal și formarea corespunzătoare a 2-deoxi-2-brommonozaharide, compușii 20, 21, 22, și 23. Bromhidrarea compusului sialil, compusul 34, cu cloroperoxidază (CPO), pentru a forma acidul 3-deoxi-3 bromosialic corespunzător, compusul 35, este, de asemenea, cunoscut din schema 3.

Schema 4 ilustrează cloro- și iodohidrarea la galactal, pentru a forma compușii 25, 26 și 27. De asemenea, este descris în schema 4 bromhidrarea Gali, 3Glucal, (compusul 28) și Gali, 4Glucal (compusul 31) pentru a se forma compușii a și /3-2-deoxi-2-bromo, corespunzător compușii 29 și 30, și respectiv, compușii 32 și 33.

475

RO 118132 Β1

Schema 4

15%yield,p/a = 3

major product, 57% yicid

CPOJI₂0₂. KI. pH3

63% yield β/α = 3 min. ’>ith or without chloropcroxidasc

(32/33=1)

Donorul de fucoză acționat, 5’-difosfofucoz-nucleozida este mai ușor să fie sau să includă guanozina; câteodată există donori alternativi cum ar fi, o nucleotidă care este o oarecare L-zaharidă, cum ar fi, de exemplu, L-ramnoza, și L-idoza.

A lega reacția fucoziltransferazei cu o reacție secundară a glicoziltransferazei, este un simplu avantaj datorat faptului că, condițiile de reacție optime pentru cele mai multe glicoziltransferaze sunt avantajate. Condițiile de reacție date pentru oricare glicoziltransferază permite funcționarea fucoziltransferazelor cunoscute.

RO 118132 Β1

Utilizând condițiile de reacție de mai sus pentru fucoziltransferaze și utilizând rutina experimentală de titrare, se pot obține condițiile de reacție adecvate pentru sintezele oligozaharidelor fucozilate utilizând doar monozaharide.

în general, pentru condițiile de reacție selectate pentru reacțiile unor glicoziltransferaze multiple într-un singur amestec de reacție, se ia în considerare temperatura, pH-ul, osmopolaritatea solventului, și compoziția ionică a reacțiilor de mai sus. Când una din glicoziltransferaze este o fucoziltransferază, condițiile acceptabile de reacție au un domeniu al pH-ului cuprins ,între 6,0 până la 8,5, cel mai preferat fiind între aproximativ 7,0 până la 7,5. Sunt utilizați cationii bivalenți precum este Mn²⁺, ionii chelați bivalenți nu sunt doriți.

Soluțiile tampon nu sunt hotărâtoare sau decisive. Soluțiile tampon apoase ca, de exemplu, HEPES sunt adecvate. Capacitatea osmotică inclusiv a soluțiilor tampon este cuprinsă, între 100 până, la aproximativ, 300 mOsm.

Condițiile de mai sus la care funcționează enzimele sunt prezentate în cele de față ca fiind condițiile biologice de reacție.

Timpii de reacție variază cu substraturile, enzimele și cu temperaturile. De obicei, timpii de reacție sunt cuprinși, de la 24 până la 96 h.

Sub anumite circumstanțe, când se utilizează o galactoziltransferază și monozaharida acceptoare are un aglicom într-o poziție a glucozei, într-o α-orientare, condițiile de reacție cuprind și lactalbumină, de preferință, a-lactalbumină.

De exemplu, reacția sialiltransferazei descrisă în Ichikawa și colab., J. Amer. Chem. Soc., 113:4698-4700 (1991) poate fi legată chimic cu un recombinant uman Lewis alfa (1,3/4) fucoziltransferază așa cum descrie și Kukowska-Latallo și colab., Genes and Bevel., 4:1288 (1990). Ca simplă urmare, amestecul de reacție bazic al sistemului tampon (HEPES) având un pH cuprins, între 7,0 și 7,5, are o concentrație a sării cuprinsă, între 50 și 200 mM. Reacția demarează la aproximativ 37°C.

B. Substratul specific și studiul inhibiției glicoziltransferazelor alfa 1,3/4 FucT Fucoziltransferază

Este capabilă de a transfera o parte sau jumătate din Fuc al GDP-Fuc la grupele 3și 4-OH al GIcNAc, pentru a produce Le^x sau Le^a care este un a 1,3/4 FucT. (KukowskaLatallo și colab., Lett., 1:425 (1990). Așa după cum se indică în tabelul 1, de mai jos, enzima catalizează fucozilarea lui Gal-beta, 1,3G1c Nac mai aproape (Vrel580) decât Gal-beta 1,4GlcNAc(LacNac) (Vre,100) (între 1 și 4) la 10 mM concentrație a acceptorului carbohidrat. Sialilarea LacNac(intrarea 7) este, de asemenea, un substrat pentru această enzimă, permițând sinteza (Dumas și colab.,Bioorg. & Med.Chem.Lett., 1:425(1991) lui sialil Le^x. Interesant este că, Galbeta 1,4(5-tio)Glc(Gautheron-Le Narvorși colab., J.Chem. Soc. Chem. Commun., 1130(1991) Wong și colab., J. Am.Chem.Soc., 113:8137-8245(1991) este un substrat mai bun decât dizaharida corespunzătoare, lactoza (intrările 2 și 3) sub aceste condiții. Fiecare din substraturile din tabelul 1 constituie un carbohidrat acceptor pentru fucoză, de la donorul fucozil utilizând această enzimă. Galbeta 1,4 deoxinojirimicin (Gautheron-Le Narvor și colab.., J. Chem. Soc. Chem.Commun., 1130 (1991); Wong și colab., 3.Am.Chem,Soc., 113:8137-8245(1991) (Intrarea 11), este un inhibitor (IC50 40 mM). A face o alimentare limitată cu alfa-1,3/4Fuc, fără o investigare mai departe nu poate fi un suport.

530

535

540

545

550

555

560

565

RO 118132 Β1

Schema 4a

Tabelul 1

Dizaharide și trizaharide ca substraturi sau inhibitori pentru a-1,3/4 fucoziltransferaza

Nr. crt.	Substratul	V ,a vrel
1.	Galp1,4G1cNAc	100
2.	GalȘ1,4G1c	120
3.	Galp1,45-tioG1c)c	130
4.	Galp1,3G1cNAc	580
5.	GlcNAcpi,4G1cNAc	23
6.	Galp1,4GalNAc	27
7.	NeuAca2,3Gaipi ,4G1 cNAcd	60
8.	Fuca1,2 Galp1,4G1ce	250
9.	GlcNAcpi,6Galp1,4G1ce	13
	Inhibitori	IC5n(mM)
10.	Galpl ,4(3-deoxi)G1 cNAcȘOaliP	> 125
11.	Gaipi ,4deoxinojirimicinc	40
12.	4Galp1,4Gucalcf	> 125

^aViteza relativă cu 0,20 mM GDP-Fuc, 20 Mm MnCI₂, și 10 mM acceptor. Activitatea specifică = 2 U/mg (1 U=Azmol de GDP-Fuc consumat pe oră).

“Ooncentrația inhibitorului necesar pentru a da 50% inhibiție cu 0:2 mM GDP-Fuc.

^cGautheron-Le Narvor, și colab., J.Chem. Soc. Chem.Commun.î99'î, 1130; Wong C.H. și colab., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113-137;

^dPurchased form Oxford GlycoSystem., Inc.Rosedale New York;

'Purchased from Sigma, St.Louis, Mo.-Haworth, W.N și colab., J.Chem.soc.1930, 2644.

RO 118132 Β1

615 a-1,3 FucT

Enzima responsabilă pentru producerea sialil Le^x este plasma umană tipul a-1,3 FucT, care a fost recent donată, [WESTON și colab., J.Biol. Chem., 267:4152(1992)] și utilizată în sinteze. Substratul specific indică (tabelul 2 de mai jos), după cum se presupune, aceea că enzima este mai specifică pentru LacNac) (V/K_m 2,9 intrare 1) decât pentru Galbetal, 3G1cNAc(V/K_m 0,22 intrare 5). Similar la rezultatul pentru a-1,3/4 FucT (intrare 3 în tabelul 1), Galbeta 1,4 (5-tio) Glc este, de asemenea, un substrat pentru aFucT (intrare 3 în tabelul 2). Spre deosebire a-1,3/4 enzima, lactal (intrare 6) este un substrat pentru a-1,3 enzimă.

Trizaharidele NeuAca2,3Galbetal, 4G1cNAc (intrare 7), un precursor al sialil Le^x, este cel mai bun substrat cu o viteză maximă relativă de 620 procente față de LacNac. Legătura a-2,6-sialozidă (intrare 10) este cu aproximativ 50 la sută din timp mai puțin activă ca substrat decât izomerul a-2,3. Nu are valoare faptul că enzima poate, de asemenea, transfera sau transporta Fuc la glucal-conținând trizaharide sialilate (V_re, 330 procente, intrare 9).

Cu privire la legătură, enzima are o mare afinitate pentru dizaharide (intrările 1,3,4,6,) decât pentru trizaharide. O creștere a afinității este observată când o parte din GIcNAc al LacNAc este înlocuit cu 5-tio-Glc, glucal [Haworth și colab., J.Chem. Soc., 2664 (1990)] sau GIcNacaOalil. Lactoza are, câteodată, o foarte mică afinitate, cu toate că, coeficientul relativ la V_max este cât se poate de mare (150 procente). Fiecare din substraturile din tabelul 2 este un carbohidrat acceptor pentru fucoză de la donorul fucozil utilizând această enzimă.

în studiul inhibiției enzimei a-1,3 FucT (tabelul 3, de mai jos), observația că 3'-deoxiLacNAc-ȘOalil[Gautheron-Le Narvorși colab., J.Chem.Soc.Chem.Commun., 1130 (1991); Wong și colab., J.Am. Chem.Soc.,113: 8137-8245(1991)] este un inhibitor slab (intrare 5), este compatibil cu raportul anterior al oligozaharidelor deoxigenate față de glicoziltransferaze. (Hindsgaul și colab., J.Biol. Chem., 266:17858(1991). Dintre carbohidrații acceptori, substratul analog examinat, Galp1,4 deoxinojirimicin este cel mai potent inhibitor (intrare 4, IC₅₀=8 mM).

Tabelul 2

620

625

630

635

640

Dizaharide și trizaharide ca substraturi pentru a-1,3 fucozil transferaze

Nr. crt.	Substraturi	Km(rnM)	vrel a
1.	GalȘ1,4G1cNAc	35	100
2.	Gaipi,4G1c	500	150
3.	Galp1,4(5-tioG1c)b	12	51
4.	GalȘ1,4G1cNAcpOalilc	16	64
5.	Galp1,3G1cNAc	600	130
6.	Galp1,4G1ucalbd	34	10
7.	NeuAca2,3 Galp1,4G1cNAce	100	620
8.	NeuAca2,3 Gaipi,4G1cNAcpOalilf	280	380
9.	NeuAca2,3 Galp1,4Glucalf	64	330
10.	NeuAca2,6 Gaipi,4G1cNAc9	70	13

“Viteza maximă relativă cu 0,1 mM GDP-Fuc, 10 mM MnCI₂ și 10 mM Gal β-1,4 GIcNac. Activitatea specifică = 2,6 U/mg (1 U = 1 μηιοΙ de GDP-Fuc consumat pe oră;

^bGautheron-Le Narvor C și colab., J.Chem. Soc.Chem.Commun. 1991, 1130; Wong, C.H. et al. J.Am. Chem. Soc. 1991, 113, 8137;

Hawarth, W,N. șl colab., J. Chem. Soc. 1930, 2644. Furnizată de Oxford Glycosyntese, Inc. Rosedale, New York. Preparată enzimatic folosind o a-2,3 sialil transferaza de la Cytel Co., în acest studiu;

’lchichawa Y, și colab., J.Am.Chem. Soc. 1881, 113, 4698.

645

650

655

660

RO 118132 Β1

Două aza-zaharide (Kajimito și colab., J.Am.Chem.Soc., 113:6679 (1991) cunoscute a fi puternic inhibitori α-fucozidaze sunt probate ca acceptori analogi (intrare 8 și 9), și ele sunt fundamentate de a fi inhibitori moderați pentru LacNAc pentru FucT (IC⁵⁰ de la aproximativ 34 până la aproximativ 52 mM). Deoxinojirimicina este câteodată, un substrat pentru a-1,4 GalT [Wong și colab., J.Am.Chem. Soc., 113: 8137-8145 (1991)]. GDP-Man este, de asemenea, un potențial puternic inhibitor pentru a-1,3 FucT (IC₅₀ 2 mM).

Pentru studiul de producere al inhibiției, atenția noastră a fost focalizată pe realizarea de nucleozide difosfat. GDP este un produs de fucozilare enzimatică și este un foarte puternic inhibitor necompetitiv pentru LacNAc (Κ_Η = 0,13 mM, K_is = 0,16 mM, intrare 10). O altă difosfat nucleozidă, UDP obținută prin galactozilare enzimatică este, de asemenea, un inhibitor puternic al GalT (Kj = 0,46 mM). GDP-Fuc este un inhibitor puternic al 1,3FucT la o concentrație de aproximativ 0,2 mM, și nu este inhibitor pentru a-1,3/4 FucT.

în plus,la o aza-zaharidă de la nr. 8 și 9 din tabelul 3, o altă aza-zaharidă precum sunt compușii 51, 52, și 53 de mai jos, de asemenea, inhibă activitatea α-fucozidazei precum compusul 50 (intrare 9 în tabelul 3). Compușii 50 - 53 prezintă valorile K, cu care enzimele acestea se prezintă și anume de 4, 22, 8 și Med.Chem.Lett., 2:33 (1992)].

1,4 μΜ-ÎDumas și colab.,Bioorg &

în plus, la compusul 50, a fost mai nou stabilit că acel compus 53 este, de asemenea, un inhibitor competitiv din plasmă umană de tipul a-1,3-fucoziltransferază. Valoarea lui IC₅₀ pentru LacNAc este de 80 mM. în plus, GDP, care s-a format în timpul reacției de fucozilare din GDP-Fuc și este un inhibitor necompetitiv, când prezența a IC₅₀ de 0,05 mM determină o profundă inhibiție sinergetică în prezența unui alt compus 50 sau 53. Datele privind exemple de inhibiție studiate utilizând compusul 50 sunt descrise în fig.3. Acest efect sinergetic poate fi dat de o interacțiune între GDP și aza-zaharidă în poziția activă a enzimei pentru a forma un complex care imită sau mimează structura stării de tranziție a reacției de fucoziltransfer.

Rezultatele de mai sus, prevăd un procedeu de inhibare a reacției glicoziltransferazei precum și al reacției fucoziltransferazei. Conform cu acel procedeu, o glicoziltransferază cum este plasma umană de tip a-1,3-fucoziltransferază, o moleculă de carbohidrat acceptoare cum este LacNAc, un donor glicozilic activat cum este GDP-Fuc și o cantitate inhibitoare dintr-o aza-zaharidă cum sunt compușii 50 sau 53 sunt amestecați într-un mediu apos și sunt menținuți în condiții biologice de reacție o perioadă de timp suficientă pentru ca reacția glicoziltransferazei să fie inhibată.

RO 118132 Β1

710

Mai preferat, este ca o cantitate de inhibitor a produsului nucleozid difosfat să fie prezentă în reacția de glicozilare cum ar fi, UDP sau GDP unde GDP-Fuc este un donor glicozilic. Cantitățile inhibatoare pentru aza-zaharidă și difosfat nucleozidă, când sunt prezente, sunt de preferat a fi de cel puțin 10 procente pentru valoarea individuală a IC₅₀, și mai preferat este ca aceste cantități să fie de cel puțin 50 procente la o valoare a indicelui individual IC₅₀, valoare măsurată in vitro așa cum s-a discutat mai sus pentru reacția particulară de glicozilare, pentru a fi inhibată. Concentrațiile în exces ale valorilor IC₅₀ pot fi, de asemenea, utilizate. Acea reacție de glicozilare este tipic inhibată de cel puțin 25 procente, și mai preferat, de cel puțin 50 procente.

Inhibarea glicozilării se poate face in vitro sau poate avea loc in vivo. Un exemplu de studiu de inhibare in vitro va fi ilustrat mai jos. Pentru reacția in vivo, enzima, donorul glicozil și moleculele acceptoare și GDP sunt prezente într-un corp de animal, care poate fi un animal de laborator cum ar fi, de exemplu, șoarece, șobolan sau iepure. Aza-zaharida este administrată acestui organism printr-o tehnică uzuală de administrare a medicamentelor, bine cunoscută în practică. Se adaugă cantități de GDP, dacă acestea sunt, de asemenea, dorite. Condițiile de reacție biologice sunt produse de corpul animalului gazdă. Adăugarea de aza-zaharidă este menținută în corpul animal până când este excretat sau catabolizat.

Tabelul 3

715

720

725

Inhibare a-1,3 FucT

Nr. crt.	Inhibitori	IC50 a(mM)
1.	GalȘ1,4Glucalb	Nlc
2.	Galpl ,3GlcNAc	NI
3.	Galp1,3GalNAc	>100
4.	Gaipi ,4Deoxinojirimicinb	8
5.	Gaipi ,4(3-deoxi)GlcNAcȘOalilb	710
6.	GIcNAcȘI ,4GlcNAc	NI
7.	GDP-Man	2
8.	HO HO	52
Intrare	Inhibitorii	IC50 a(mM)
9.	h3c HO	34
10.	GDP	0,05®

^aConcentrația de inhibitor pentru a da o inhibiție 50% cu 0,1 mM GDP-Fuc.

mM Mn²⁺ și 1m Mm LacNAc la un pH=6,2, la 37°C; ^bGautheron-Le Narvor, et al.,J.Chem.Soc.Chem.Commun.1991, 1130; ^cNu se observă o inhibiție până la 50 mM de concentrație a inhibitorului; ^dKajimoto et al., J.Am.Chem.Soc.1991, 113, 6679;

^eK,=19±3 mM; ^eK_n=0,13±0,05 mM, K =0,16±0,06 mM.

730

735

740

745

RO 118132 Β1

C. Mijloace chimice și enzimatice de obținere a GDP-fucozei

Ciclul reacției fucoziltransferazei poate fi condusă prin oricare adiție de cantități stoechiometrice de nucleotide potrivite de tip zahar, cum este, de exemplu, GDP-fucoza sau preferabil, nucleotida de tip zahar poate fi generată dintr-o cantitate catalitică de nucleotide corespunzătoare și cantități stoechiometice de PEP și Man-1-Ρ sau Fuc-1-Ρ.

GDP-fucoza este donorul de tip zaharat activat preferat pentru fucoziltransferazele cunoscute. Este dificil și costisitor de fabricat și pentru alte reacții ciclice descrise în această invenție este de preferat ca aceste sinteze să fie realizate la regenerarea in situ a precusorilor acestor nucleotide. O schemă generală este schema 1 ce prezintă ciclul fucozei.

(1) Sintezele chimice ale 1-fosfat fucozei și a GDP-fucozei

Sintezele chimice ale GDP-fucozei se realizează cuplând 1-fosfat fucoză și un GMP activat cum este, de exemplu, GMP-morfolidat. Generalități în, (a) Kochetkov și colab., Adv.Carbohydr.Chem, Biochem., 28:307(1973); (b) Moffat, Methods Enzimol., 8:136(1966); și (c) Roseman și colab., Am.Chem.Soc.,83:659(1961). Pentru labilitatea relativ înaltă a 1fosfat-fucozei și GDP-Fuc, procentul chimic raportat pentru sintezele Fuc-1-Ρ și reacția de cuplare a Fuc-1-Ρ și derivatul GMP trebuie să fie mic. Au fost prezentate diferite sinteze de 1- fosfat fucoză. Numai de la Fuc-1-Ρ nucleotidele de tip zaharuri au o termodinamică instabilă a părții β-fosfat pe centrul anomeric al fucozei, și aceasta face dificil controlul stereochimiei centrului anomeric. în această descriere sunt prezentate două căi eficiente pentru GDP-Fuc: una prin metodă chimică și cealaltă prin metodă enzimatică.

Prima sinteză chimică a GDP-Fuc a fost făcută de grupul Barker. [Nunez și colab., Can.J.Chem., 59:2086(1981)]. Pentru prepararea 1-fosfat fucozei, ei utilizează 2,3,4-tri-Oacetil-beta-L-fucoză care este preparată din derivatul bromurat corespunzător, urmată de cristalizare fracționată, și fosforilare a anomerului β rezultat. Grupul Hindsgaul [Gokhale, Can.J.Chem., 68:1063(1990)] utilizează o reacție de glicozilare a bromurii acetofucozilice și a dibenzilfosfat tetrabutilamoniu ca sare, pentru a produce un fosfat glicozil relativ instabil (mai puțin de 10 min în cromatografie pe silicagel). Schmidt și colab., [Schmidt și colab., LiebigsAnn. Chem., 191:121 (1991)] utilizează imid fucozil și obțin un produs glicozidic, fără o cantitate mai mare de catalizator acid Lewis, în Grupul van Boom [Westerduinn și colab, Tetrahedron Lett., 27:1211(1968)] utilizează un agent de fosfitilare trivalent la 2,3,4-tri-Obenzil-fucoza și o transformă într-o alfa-fucozil fosfat.

Se descriu mai departe două sinteze chimice îmbunătățite și apropiate pentru GDPfucoză (a se vedea schemele 5-7 de mai ios). Una este redată în schema 5, și utilizează o reacție de glicozilare a brom fucozil benzoatului (Bz) (compusul 3) și dibenzilfosfatului. Utilizând ca grupă de protecție o grupă benzoil în loc de acetil, crește și se îmbunătățește stabilitatea derivatului fucozil precum și stereoselectivitatea reacției de glicozilare. Glicozilarea compusului 3 și a dibenzilfosfatului [Linshorst și colab., Carbohydr.Res.,209:119 (1991)] se desfășoară foarte lin și rezultă produsul de cuplare în proporție de 95% ca produs unic. Ca exemplu, compusul 4 a fost suficient de stabil pentru a fi purificat prin cromatografie pe silicagel (mai mult de 3 h); câteodată, materialul purificat era instabil. Când compusul purificat 4 era lăsat întreaga noapte la temperatura camerei, se observa o anumită descompunere și anomerizare a compusului 4. Trebuie de menționat că, compusul 4 purificat era utilizat în faza imediat următoare. Deprotejarea grupelor benzii (Bn) de fosfat, pentru o parte din grupele benzii au fost făcute în modul descris anterior. [Gokhale și colab, Can.J.Chem, 68:1063(1990)].

RO 118132 Β1

795

(BnO),P<O}OM AgjCOj

CHjCij-EljOCHjCN n Hj/pd-c îNNaHCO,

ElOH

BzO

Γ OBx

800

805

ZjaqJUOH 3) Dowai 1-X8 [HCO/j

HjC

O- PfOXOHh

810

O altă utilizare accesibilă a reactivului de fosfitilare este, de exemplu, a dibenzil N,Ndietilfosforamidit(DDP) care a fost utilizat pentru prepararea dihidroxi acetilfosfatului (DHAP) (A se vedea și schema 6 de mai jos). [Pederson și colab., Tetrahedron,47:2643(1991)]. Astfel, 2,3,4-tri-O-acetilfucoza, compusul 7, preparat prin oricare diacetilare chimică și enzimatică [Hennen și colab., J.Org.Chem., 53:4943 (1988)], este fosfinat cu DDP în prezență de tetrazol. Reacția se desfășoară lent pentru a da un randament de 79% din compusul 8, un compus cu formula I și II care a fost oxidat la fosfatul corespunzător compusului 9. Deprotejarea compusului 9 a fost efectuată similar cu prepararea compusului 5 din compusul 4.

Schema 6

815

820

HO OH

AcjO

NaOAc

	yvOAe	BnNH/THF
>OAc	orPPL
1 / AcO OAc

825

OP(OBn)j ^{30% H}2°î (BnOhPNEt,

l)Hj/Pd-C EtOH-N NaHCOj

2) NaOH/HjO

OPOfONa)₂

830

835

840

RO 118132 Β1

Reacția de fosfitilare utilizând (BnO₂)PNEt₂ (DDP) ilustrată în schema 6 este destul de folosită pentru formarea unor defosfiți diferiți și a fosfaților corespunzători, cu un randament mare. Următoarele exemple de produse și detaliile sunt discutate în secțiunea H.

Fuc-1-Ρ este activat eficient prin conversia sării trialchilamoniu prin reacția cu guanozin-5'-monofosfo morfolidat (1:2) într-un solvent ca piridina. Produsul, GDP-Fuc, compusul 12, este purificat utilizând cromatografia pe coloană convențională. Aceste reacții sunt descrise în schema 7 de mai jos.

Schema 7

O

(2) Producerea enzimatică a GDP-fucozei

Este preferată producerea enzimatică a GDP-fucozei din fucoză. Prepararea enzimatică a GDP-fucozei a fost raportată de Schacter și colab.,Methods of Enzymol.,28:285 (1972) utilizând fucoz kinaza și GDP-fucoz pirofosforilaza din ficatul de porc.

Așa după cum se poate ușor vedea, această reacție multienzimatică poate fi realizată utilizând diferite combinații de enzime și substraturi de energie înaltă. Ciclul de reacție al fucozei descris în schemele 1 și 8 prezintă exemple cu aceste sisteme multienzimatice. Fucoza este adăugată în cantitate stoechiometrică în paralel cu PEP. Cantitățile catalitice de PK, FK și GDP-FucPP sunt adăugate în paralel cu ADP și GDP. Reacțiile sunt asemănătoare celor prevăzute pentru transferaze.

RO 118132 Β1

885

Schema 8

890

895

900 (3) Manoza ca materie primă 905

Alternativ, GDP-Fuc poate fi obținută eficient din prepararea GDP-manozei și după aceea prin conversie enzimatică la GDP-Fuc. Precursorul GDP-Man este Man-1-Ρ, compusul 18. Man-1-Ρ se prepară în același mod ca fucoza-1-Ρ. De preferat este utilizarea grupărilor de blocaj acetil pentru a forma manoza per O-acetat așa după cum s-a descris în schema 9 de mai jos. Alternativ, Man-1-Ρ poate fi produsă enzimatic într-o manieră asemă- 910 nătoare ca Glc-1-Ρ.

Schema 9

915

920

(BnOJiPNEij THF

AcO-Λ O Ac

30% HjOj

THF

OPiOBn),

925

OPOfOBnJj

1) Hj/Pd-C EtOH-NNaHCOj

2) NaOH/HjO

930

RO 118132 Β1

Sintezele enzimatice ale GDP-fucozei, din 1-fosfat manoză cu generarea in situ a GDP-manozei este realizată prin combinarea a două sisteme enzimatice: GDP-manoză pirofosforilază și GDP-fucoză din enzime sintetice. Regenerarea NADPH este necesară pentru formarea GDP-fucozei. O astfel de regenerare poate fi realizată prin utilizarea NADPH în funcție de alcool dehidrogenaza Thermoanaerobacteriul brokiiîn prezență de izopropanol sau glucoză fosfat dehidrogenază în prezența glucozei. GDP-manoza pirofosforilază poate fi obținută din drojdia de bere așa cum se descrie mai jos : se cunosc și alte surse ca, Arthrobacter [Preiss și colab., J.Biol.chem., 239:3119(1964], Escherichia coli [Liberman și colab, J.Bact., 101:965(1970)], precum și din sursă animală [Smoot și colab., Eur.J. Biochem., 148:83(1995)].

Conversia GDP-fucozei la GDP-manoză a fost raportată mai întâi de Ginsburg și Kirkman [Ginsburg și colab.,J.Am.Chem.Soc., 80:3481(1958)]. Enzima a fost parțial purificată și utilizată pentru a demonstra conversia GDP-fucoză din A.aerogenes (ATCC 12658), denumite în mod curent Klebsiella pneumoniae [Ginsburg, J.Biol.Chem. 235:2196 (1960)]. Reacția depinde de NADPH. Yamamoto și colab., de asemenea, raportează sinteze GDP-fucozei din GDP-manoză prin utilizarea enzimei obținute din Agrobacterium radiobacter [Yamamoto și colab., Agric.Biol.Chem.,48:823(1984)].

Mai departe, este descrisă conversia 1-fosfat manozei la GDP-fucoză cu generare in situ a GDP-manozei. Manoza-1-fosfat este transformată la GDP-fucoză prin combinarea a două sisteme enzimatice, GDP manoză pirofosforilază și GDP-fucoză enzimă sintetică cu regenerarea NADPH. Cu toate că rezultatul inițial dă o producție scăzută, câteodată, se așteaptă ca la obținerea unei enzime cu o activitate înaltă, să poată rezulta o producție semnificativă. Aceste reacții sunt prezentate în schema 10 și 11.

Schema 10

OH

GTP

O

H

GDP-Min pyrophosphocyhse

PPaxe PPi » 2Pi

NADP

NADPH isopropanol acetone

RO 118132 Β1

975

Schema 11

GDP-D-Min HO OH

NADPH

Q*GDP Intermediatei

980

985

990

Pentru sinteza oligozaharidelor fucozilate, este utilizat un sistem de regenerare cofactor în care GDP-ul transferat este convertit la GTP cu ajutorul unui fosfoenolpiruvat (PEP) și a piruvat kinazei (PK), și NADP este convertit la NADPH cu 2-propanol în prezența alcool dehidrogenazei. Utilizând a-1,3/4 fucoziltransferaza, Gal β 1,3 GIcNAc este convertit la Gaipi,3(Fuca1,4)GlcNAc. [Dumas și colab., Biomed.Chem.Lett, 1:425(1991)].

D. Nucleotide reciclate

Din cauză că glicoziltransferazele sunt adesea inhibate de nucleotide, se preferă ca, concentrația nucleotidelor să fie menținută la minimum. Regenerarea trifosfaților nucleozidici din zaharide donoare de nucleotide permite utilizarea unei cantități catalitice de nucleotide, care elimină efectiv inhibiția activității glicoziltransferazei. Regenerarea nucleotidelor capabile de a servi la lianți de înaltă energie a fucozil nucleotidei donoare necesită ca reacția și condițiile suportului de reacție să depindă de ambele și anume, de piruvat kinoză și guanozin 5'-difosfofucoză pirofosforilază, din reacțiile enzimatice. Un exemplu de sistem de reciclare este descris în schema 12 de mai jos.

Schema 12

995

1000

1005

1010

1015

1020

RO 118132 Β1

Această monozaharidă donoare activată conține suportul sistemelor regenerate de reacția glicoziltransferazei. Sistemele regenerate conțin monozaharida donoare activată, și enzimele pentru regenerarea nucleotidelor activate ale zaharidei donoare, de la respectivul fosfat donor, nucleotidă și zaharida donoare. Enzimele în sistemul regenerat conțin kinazele ca, de exemplu, piruvat kinaza, acetilkinaza, și 1,6-difosfofructokinaza respectiv și nucleotida-zaharidei-pirofosforilazei cum este, de exemplu, GDP-Fuc-PP. Donorii fosfat cuprind PEP, acetilfosfat, și D-fructoză 1,6-difosfat.

Unii donori fosfat pot inhiba activitatea altor enzime în sistem, motiv pentru care donorii trebuie să fie selectați cu grijă. Nucleotidă care este fosforilată prin kinază poate fi selectată să funcționeze ca substrat adecvat pentru nucleotida-zaharidei-pirofosforilază.

Sistemul regenerat de reacție, descris mai sus poate fi inhibat printr-un anume mecanism de reacție dacă concentrația pirofosfatului anorganic este excesivă. Utilizarea unei cantități catalitice de pirofosfatază anorganică corectează această problemă.

E. Liganzii sialil Lewis

Produsul final preferat prin procedeele descrise în prezenta invenție sunt carbohidrații activi din punct de vedere farmaceutic. Astfel de produse sunt liganzii sialil Lewis. (De văzut schemele de reacție 1 și 23 prezentate mai sus. Grupa R din schema 13 poate fi hidrogen sau o grupă organică X, după cum s-a notat mai sus). Liganzii sialil Lewis sunt definiți ca orice compus care se leagă la un receptor selecționat, așa cum descrie Polley și colab., în Proc.Natl.Acad.Sci,US, 88:6224(1991). Acești liganzi sunt cunoscuți prin acidul lor sialilic și fucoză conținând structuri terminale bazate pe glicoproteine și glicolipide. Liganzii aceștia sunt liganzi sialil Le^x(SLe^x) și sialil Le^a(SLe^a) răspândiți natural. Acești liganzi sunt mai departe analogi nenaturali care leagă într-o manieră similară receptorul natural la liganzi. De exemplu, ligandul analog poate fi preparat cu un acceptor analog al oligozaharidei pentru glicoziltransferază. Diferiți acceptori analaogi sunt bine cunoscuți și sunt oligozaharide deoxigenate descrise în Hindsgaul și colab.,J.Biol.Chem.,266:17858-17862(1991).

Schema 13

Liganzi analogi sunt ușor de preparat utilizând metodele de reacție de mai jos și sunt ușor de testat utilizând exemplul descris mai jos. De exemplu, receptorii recunosc un ligand care a fost modificat din starea naturală printr-o caracteristică a reacției de epimerizare (de la GIcNAc la GalNac), sau o schimbare în orientarea uneia din legăturile glicozidice (o legătură a-2,6 la o legătură β-2,6). Procedurile exemplificatoare sunt prezentate mai jos.

RO 118132 Β1

1075

Galactozilarea

Două sisteme multienzime pentru sinteza LacNAc au fost realizate in situ cu cofactor de regenerare. Unul începe cu Glc-1-Ρ- și utilizează UDP-GIc pirofosforilază (EC 2.7.7.9, UDPGP) și UDP-Gal 4-epimerază (EC 5.1.3.2. UDPGE) [Wong și colab., J.Org.Chem., 47:5416(1982); Auge și colab., Carbohydr.Res., 151:147(1986); Thiem și colab.,Angew. Chem. Int.Ed.Engl.,30:1163(1991); Thiem și colab., Synthesis, 141(1991)]. Acesta este prezentat în schema 14, de mai jos, unde NacGIcpOalil compusul 40; X este O-alil) este utilizat ca un acceptor ilustrativ pentru GalT. UDP-galactoza este generată din UDP-GIc; câteodată, acest echilibru favorizează formarea de UDP-GIc și Glp-1-Ρ poate fi preparat separat. Glc-1-Ρ poate fi preparat utilizând reacția de fosfitilare discutată în cele de față.

1080

Schema 14

1085

1090

1095

1100

1105

2Pi

O altă utilizare pentru Gal în locul Glc-1-Ρ, ca donor precursor, și UDPGP, galactokinază (GK; EC 2.7.1.6) și Gal-1-Ρ uridiltransferază (Gal-1-Ρ UT; EC 2.7.7.12) este descrisă în schema 15 de mai jos utilizând 1-¹³C-Gal care este ilustrat în schemă printr-un cerc cu liniuță, hașurat, la poziția 1). GK este specific pentru galactoză, permițând o producție directă a Gal-1-Ρ, care este transformat la UDP-Gal cu Gal-1-Ρ UT și UDP-GIc. Ultimul sistem a dovedit de a fi convenabil pentru prepararea [Gal-1-¹³C]-LacNAc.

1110

1115

RO 118132 Β1

Schema 15

pyrophosphorylast

PPast

IR PEP Gal-l-rUT rtr

S-PYR

NHAc

NHAc

Nj

Sistemul multi-enzimatic (schema 15) pornește cu 1-¹³C-Gal, (99 procent atomic, procurat de la Isotec Inc., Miamisburg, OH), GIcNAc pOalil (compusul 40), [Lee și colab., Carbohydr.Res.,37:î93 (1974] fosfoenolpiruvat (PEP), și o cantitate catalitică de Glc-1-Ρ, ATP și UDP. UDP s-a transformat în UTP cu piruvat kinază (PK;EC 2.7.1.40) și PEP, și UTP a reacționat cu Glc-1-Ρ catalizat de UDPGD pentru a produce UDP-G1c. Produsul secundar pirofosfat anorganic (PPi) s-a descompus prin pirofosfatază anorganică (Ppase; 3.6.1.1). Cu Gal-1-Ρ UT, UDP-GIc care reacționează cu ¹³C-Gal-1-P, generat de ¹³C-Gal și ATP în prezența GK, duce la obținerea de UDP-¹³C-Gal și Glc-1-Ρ. ¹³C-Gal al UDP-¹³C-Gal este transferat pe acceptorul (GIcNACpOalil) prin GalT pentru a se obține (Gal-1-¹³C)-conținând LacNAcȘOalil (compusul 41). Obținerea UDP este urmată din nou de conversia la UTP printr-o reacție a PK și PEP, care reacționează cu cedarea Glc-1-Ρ pentru a regenera UDPGIc. Utilizând acest sistem multienzimatic, (Gal-1-¹³C)-LacNAc60alil s-a obținut la un randament de 54 procente. Același procedeu este, de asemenea, utilizat la prepararea unor LacNAc nespecifici, și analogi. Exemple de analogi 41a-c sunt ilustrate în schemă.

Sialilarea

Un sistem multienzimatic pentru sialilare pornește cu NeuAc, (Gal-1-¹³C)LacNAcȘOalil, PEP, și cantități catalitice de ATP și CMP, așa după cum descrie schema 16 de mai jos. CMP s-a transformat CDP prin nucleozida monofosfat kinază. (EC 2.7.4.4.,NMK), în prezența lui ATP, care este regenerat din produsul său secundar ADP catalizat de PK în prezența PEP, apoi de la CTP cu PEP prin PK. CTP se supune reacției NeuAc cu CMPNeuAc sintetază (EC 2.7.7. 43) pentru a produce CMP-NeuAc. Produsul secundar, PPi este hidrolizat la Pi prin PPare. Sialilarea LacNAc6Oalil este realizată cu CMP-NeuAc și a-2,3 sialiltransferază (a2,3SiaT;.(Ec 2.4.99.6)]. CMP emis sau degajat este din nou convertit la CDP, CTP, și în final la CMP-NeuAc. Utilizând acest sistem, a fost preparată (Gal-1-¹³C)NeuAca2,3Gaipi, 4GlcNAcȘOalil (compusul 42) precum și trizaharida necaracteristică.

RO 118132 Β1

1165

Schema 16

1170

1175

1180

Interesant că lactal (Gaipi,4Glucal) a fost un substrat bun pentru a-2,3 SiaT, permițând ia NeuAca2,3Gaipi,4Glucal (compusul 43, din schema 16) să fie sintetizat în proporție de 21 procente lactal a fost preparat fie pe cale chimică [Haworth și colab.,J.Chem.Soc., 2644 (1930)] fie enzimatic utilizând GalT și glucal. [Gautheron-Le Narvor și colab., J.Chem.Soc.Chem.Commun., 1130 (1991); Wong și colab., J.Am.Chem.Soc., 113:8137-8245(1991)]. Oligozaharida conținând glical cum este compusul 43 poate fi convertit la alți derivați sialil Le^x utilizând procedeul lui Danishefsky și a altora. [Griffith și colab., J.Am.Chem.Soc., 112:5811 (1990); Halcomb și colab.,J.Am .Chem.Soc., 112:5811 (1990); Halcomb și colab.,J.Am.Chem.Soc., 111:6661(1989); Kessler, și colab., Angew.Chem.Int.Ed.Engl., 29:425(1990); Thiem și colab., Synthesis, 696 (1978)]. Compusul 43 poate fi, de asemenea, halogenat după cum s-a discutat aici pentru a obține derivați 2halo-2-deoxi-Glc.

Un procedeu similar celui descris în schema 16 utilizând a-2,6 sialiltransferaza (EC 2.4.99.1) cu Gaipi ,4GlcNAc ca acceptor carbohidrat este produs într-un procent de 22% din NeuAca2,6Galp1,4Glc) NAc după o reacție de două zile la temperatura camerei.

Fucozilarea

Enzima umană donată este utilizată pentru fucozilare utilizat într-o cantitate stoechiometrică GDP-Fu (procent atomic 99, furnizat de Isotec Inc.Miamisburg, OH) așa cum este descris în Schema 17 de mai jos.

1185

1190

1195

1200

RO 118132 Β1

Schema 17

Astfel, fucozilarea lui sialil LacNacpOalil (compusul 42) conduce la obținerea sialil Le^x(compusul 44 după purificare pe silicagel și o purificare pe BioGel P-2. LacNAcȘOalil (compusul 41) și sialil glical, compusul 43, au fost, de asemenea, fucozilați pentru a da Le^x triazaharidă, compusul 45, și sialil Le^x glical respectiv, compusul 46, din care doi compuși sunt descriși în schema 16. Interesant este că, a-1,3 FucT și a-1,3/4 FucT acceptă Gaipi ,4(5-tio)Glc pentru a se obține un (5-tio)-Glc-Le^x analog, GalȘ1,4(Fuca 1,3)-(5-tio)Glc ca cel prezentat în Schema 18, de mai jos.

Schema 18

rel v = 70%

HO al ,3-FucT rel v«51%

OH -O

OH

HO

RO 118132 Β1

Astfel pentru regenerarea in situ a GDP-Fuc, conversia Man-1-Pla GDP-Fuc prin GDP-Man pe o cale biosintetică a GDP-Fuc în microorganisme a fost mai întâi examinată așa cum se prezintă în Schema 19. “Acceptor-OH” din Schema 19 și 20 (de mai jos) este o grupă hidroxil a substratului de carbohidrat acceptor așa cum este listat în tabelul 2, de mai sus.

1255

Schema 19

1260

— - » 2P1

1265

1270

1275

Enzimele microbiene au fost utilizate deoarece erau mai ușor accesibile. Mai mult, acest sistem permite regenerarea GDP-Man. GDP-Man pirofosforilază (GDP-Man PP) a fost descoperită în drojdia de bere [Munch-Peterson, Methods in Enzymol., 5:171(1962); Simon și colab., J.Org.Chem. 55:1834 (1990] și enzimele generând GDP-Fuc sunt cunoscute de a exista în bacterii [Ginsburg, J.8/o/.Chem.235:2196 (1960); Ginsburg, Methods in Enzymol., 8:293 (1966)] ca Klebsiella Pneumonia. în această regenerare, GTP a fost regenerat din GDP în prezența PEP și PK. Man-1-Ρ supus reacției cu GTP conduce la GDP-Man prin GDP-Man PP de la celulele de drojdie de bere uscată. GDP-Man este transformată în GDPFuc în prezența NADPH și GDP-Fuc generând enzime parțial purificate din bacterie. NADP oxidat este reciclat înapoi la NADPH prin Thermo anaerobium brokii alcool dehidrogenază (TADH) (EC 1.1.1.1) și izopropanol. Producerea de GDP-Man și GDP-Fuc a fost confirmată prin HPLC, și fucozilarea LacNAc pOalil și compusul 42 pentru a se obține compusul 45 și 44, fiind realizate în 5-10 mg. O preparare sintetică al sialil Le^x cu regenerare in situ a GDPFuc este în curs de desfășurare utilizând enzime purificate.

O metodă alternativă a fost pornită de la Fuc-1-Ρ, care a fost convertit la GDP-Fuc catalizat prin GDP-Fuc pirofosforilază (GDP-Fuc-P) așa cum se prezintă în schema 20, de mai jos). [Ishihara și colab.J.8/o/.Chem.243:1103 (1968); Ishihara și colab., J.Biol.Chem., 243: 1110 (1968); Schachter și colab., Methods in enzymol., 28:285 (1972); Richards și colab., Biochim. Biophis. Acta., 484:353(1977); Kilkerși colab., Biochim. Biophys. Acta., 570: 271 (1979)]; GDP-Fuc a fost parțial purificat din ficatul de porc [Ishihara și colab., J.Biol.Chem., 243:1110 (1968)] și a fost demonstrat faptul că regenerarea sistemului descris în Schema 20 este funcțional pe o scară analitică pentru sinteze Le^x și sialil Le^x.

1280

1285

1290

1295

RO 118132 Β1

Schema 20

PEP PYR

în plus, la antigenele sialil Lewis, SLe^x, SLe^a, și respectiv analogii lor, antigenele grupei de sânge ABH sunt, de asemenea, oligozaharide importante. Această invenție tratează mijloace rapide și economice de a obține toți acești compuși. De exemplu, pentru obținerea lui Sle^a, care are o structură ca și NeuAc a-2,3 Gal β-1,3 (Fuc a 1,4)GlcNAc, se combină următoarele trei galactoziltransferaze: β-1,3 galactoziltransferaza; a-2,3 sialiltransferaza și a-1,4 fucoziltransferaza. Condițiile de reacție și substraturile enzimatice ancilare pentru regenerarea nucleotidelor de zaharuri sunt de primă importanță.

Pentru oligozaharidele H-active, antigena grupării de sânge 0, care are o structură ca a Fuca1,2Gal β-R, unde R poate fi β-1,3 GlcNAc-R₁ sau β1,3 GalNAc-R! și unde Ri este o oligozaharidă restrânsă, se pot combina următoarele glicoziltransferaze: β-1,3 galactoziltransferaza și a-1,2 fucoziltransferaza cu componenți de reacție ancilari proprii, și condițiile sunt cele de mai sus pentru oricare SLe^x sau SLe^a, pentru a se produce Fucal ,2 Ga^,3 Glc NAc-Rv Grupa R, a unei grupe de sânge 0 constituie astfel un alt grup X discutat mai sus, astfel cum sunt grupele R, pentru grupele de sânge A- și B-.

Pentru olgozaharidele A-active, antigena grupei de sânge-A, care are o structură ca a GalNAca-1,3 (Fucal ,2)Ga^-R, unde R poate fi βΙ^ΟΙοΝΑο-Ρ, sau β-1 .SGalNAc-R! și unde R! este o oligozaharidă restrânsă, se pot combina următoarele glicoziltransferaze: β1,3 galactoziltransferaza; a-1,2 fucoziltransferaza și a-1,3 N-acetilgalactozaminiltransferaza cu componenți de reacție auxiliari specifici și condițiile spuse mai sus pentru obținerea GalNAc a-1,3(Fuc a1,2) Gal β-1,3 GlcNAc-R_v

Pentru oligozaharidele B-active, antigena grupei de sânge-B care are o structură ca a Gal a-1,3(Fuc a1,2) Ga^-R, unde R poate fi β-1,3 GIcNAc-R, sau β-1,3 GalNAc^ și unde R, este o oligozaharidă restrânsă, se pot combina următoarele glicoziltransferaze: β-1,3 galactoziltransferaza; a-1,2 fucoziltransferaza; a-1,3 galactoziltransferaza cu componenți de reacție ancilari specifici, așa cum sunt arătate mai sus pentru a prepara Gala-1,3 (Fucal,2) Gal3-1,3 GIcNAc-R,.

Astfel, enzima catalizează sintezele oligozaharidelor care au molecule de carbohidrat sialilat fucozilat ce sunt prevăzute a se obține, în care produsele fiecărei reacții de glicozilare sunt izolate anterior fazei următoare de glicozilare. Aceste reacții de glicozilare pot, și fac de preferință, utilizarea (fazelor) reciclării fazelor discutate mai sus.

De asemenea, sunt prevăzute multiple glicozilări într-un singur amestec de reacție pentru a obține aceleași molecule de carbohidrat sialilat fucozilat prin aceeași reacție de fucozilare. De asemenea, sunt utilizate reacțiile de reciclare discutate mai sus. în plus, valorile K_m și V_rel sunt arătate în tabelul 1 și 2 și sunt utilizate pentru ajustarea concentrațiilor speciilor de reactanți pentru a reduce la minimum partea de reactanți. Inhibitorii astfel prezentați în tabelul 3 pot fi, de asemenea, utilizați în controlul formării produsului. Mai departe sunt prevăzute reacții de glicozilare în multe faze sau trepte aduse într-un singur amestec de

RO 118132 Β1

1350 reacție pentru a obține produsele de mai sus, dar în care o enzimă sau reactantul necesar glicozilării este adăugat după alte reacții ce sunt substanțial complet terminate, astfel, încât o reacție de glicozilare începe după cel puțin una sau, de preferat, două alte glicozilări substanțial complet terminate. într-un exemplu de sinteză, toți reactivii și enzimele prezentate în Schema 1 cu excepția fucoziltransferazei (FucT) sunt adăugați la amestecul de reacție și NeuAc a-2,3Gal β- 1,4GlcNAc-OR se formează, care este, de asemenea, prezentat în schema 16 de formare a compusului 42 unde R este alil. Odată ce un compus ca, compusul 42 din schema 16, a fost obținut, se adaugă FucT ca ,de exemplu, a-1,3 fucoziltransferaza sau a-1,3/4 fucoziltransferaza și se formează carbohidratul sialilat fucozilat ca, de exemplu, compusul 44 din schema 17. Alternativ, enzima FucT poate fi prezentă și donorul fucozil precursor cum arfi fucoza poate fi omis. Similar, fucoza poate fi prezentă în afara enzimei sale de fosforilare, fucoz-kinaza.

F. Descompunerea produselor fucozilate pentru a forma liganzii

Produsele fucozilate descrise mai sus sunt folosite să funcționeze cel mai bine ca liganzi, când leagă cele mai multe părți. Astfel de părți pot fi proteinele, glicoproteinele, glicolipidele și analogii non-biologici al acestor molecule. Caracteristic, este aceea că reducerea finală a zaharidei se face prin legarea chimică la o amină liberă sau mercaptan printr-o legătură glicozidică. Sunt utilizați lipozomi pentru a prepara macromolecule multivalente. O varietate de metode sunt utilizate pentru prepararea lipozomilor, așa după cum se descrie în de exemplu, Szoka și colab., Ann.Rev. Biophys. Bioeng., 9:467(1980), brevete US 4235871, 4501728 și 4837028, ce sunt încorporate aici prin referiri.

G. încercarea activității funcționale a ligandului sialil Lewis

O prezentare a acestei invenții relatează producerea antigeni Lewis sialilați în ambele forme naturală și mimetică sau analoge. Aceste antigene joacă un rol în adeziunea intercelulară și joacă un rol în bolile inflamatorii precum și în alte boli umane și animale în diferite condiții. în legătură cu facilitarea producerii acestor antigene se folosește prezenta invenție descrisă în cele de față, pentru a proba produsele rezultate în privința abilității lor de a lega la un antigen sialilat Lewis natural receptori ca ELAM și GMP 140. Aceste probe au fost descrise în detaliu în Polley și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 88:6224-6228(1991) și Phillips și colab., Science., 250:1130-1132 (1990) fiecare dintre acestea sunt încorporate în cele de față prin referințe.

Cu toate că un număr de diferite probe sunt disponibile, o probă preferată măsoară abilitatea antigenelor de a bloca sau inhiba legarea celuleleor purtând acceptori de legare specifici și celule exprimând antigene corespunzând antigenelor sialitate Lewis. Legătura este evaluată vizual sub un microscop. Acceptorul sau receptorul preferat de pe celule reprezentative sunt hematiile activate și celulele endoteliale. Receptorii sunt o parte dintr-o familie cunoscută ca fiind selectinele sau LEC-CAM_S și include LEC-CAM-1, ELAM-1, GMP140, și CD 62. Liganzii sunt bazați pe neutrofile, monocite, și celule tumorale.

într-o probă tipică, neutrofilele sunt izolate prin așezarea unui strat de sânge heparinizat peste un mediu mono-poli rezolutiv (Ficoll-Hypaque-Flow Laboratories), urmată de centrifugare timp de 25 min, la 2000 rpm (rotații pe minut) și apoi, mai departe 25 min, la 2500 rpm.

Hematiile pot fi izolate urmând procedeul descris. Sângele este extras de la un donor uman normal într-o seringă conținând ACD anticoagulant (dextroză, 2,0 g; citrat de sodiu 2,49 g; și acid citric 1,25 g; la 100 ml apă), într-o proporție de 6 procente sânge la o parte de anticoagulant. Sângele este centrifugat la 800 rpm (aproximativ 90 X g), timp de 15 min, la temperatura camerei. Supernatantul (partea limpede rămasă de la centrifugare) este colectat și centrifugat la 1200 rpm (aproximativ 400 x g), timp de 6 min. Supernatantul este scos și centrifugat, la 2000 rpm (1200 x g), timp de 10 min pentru a tableta hematiile.

1355

1360

1365

1370

1375

1380

1385

1390

1395

RO 118132 Β1

Acestea sunt spălate de două ori cu Tyrode-HEPES soluție tamponată având un pH de 6,5 (NaCI 8,0 g; KCI 0,2 g; NaH₂PO₄. H₂O 0,057 g; MgCI₂.6 H£ 0,184 g; NaHCO₃ 0,1 g; dextroză 1,0 g; și HEPES 2,383 g, puse într-un litru de apă distilată, și aduse la un pH de 6,5 cu 1N NaOH) urmată de o spălare în PBS. Hematiile sunt suspendate la o concentrație de 10⁸/ml în PBS și sunt activate prin incubare, timp de 20 min, la temperatura camerei cu trombină și în final, concentrația este 0,25 U/ml.

Pentru probă, 20μΙ de suspensie de hematii (2 x 10⁸/ml) este plasată într-un tub al centrifugei Eppendorf. Un volum egal de oligozaharide preparate la o concentrație cuprinsă, între 200 și 0,3 ^g/ml, sau de glicolipid-lipozomi preparați (prepararea a fost descrisă mai sus) la o concentrație cuprinsă, între 2 și 0,25 pg/ml, se adaugă, și tuburile sunt menținute la temperatura camerei, timp de 20 min. După aceea, 20 μΙ de preparat neutrofil (2 x 10⁶/ml) este adăugat și tuburile sunt ținute, timp de 20 min, la temperatura camerei.

Legarea hematiilor activate la neutrofile este determinată pe microscop. Tipic, o sută de neutrofile sunt evaluate. Ele sunt marcate ca pozitive dacă sunt atașate două sau mai multe hematii și negative, dacă sunt legate mai puțin de două hematii.

H. Mijloace perfecționate pentru producerea 1- sau 2-glicozil

Zaharidele fosforilate având fosfatul pe atomul de carbon anomeric (în poziția 1- sau 2-) sunt valorificate ca intermediari în reacțiile descrise în cele de față și multe sunt comercializate. Această invenție prevede un mijloc perfecționat de fosforilare selectivă al acestui atom de carbon al unei monozaharide. Perfecționarea implică utilizarea unui reactiv trivalent de fosfitilare pentru a transforma o parte fosfitil la atomul de carbon dorit. Fosfitul rezultat este apoi utilizat pentru a prepara fosfatul corespunzător care el însuși este utilizat într-o reacție enzimatică descrisă în cele de față.

O monozaharidă fosfitil blocată corespunde structurii cu formula I, de mai jos:

f I

Rg R2 (i) în care: fiecare R, este același sau diferit și este o grupă arii, ca fenil sau benzii sau o grupă alchil inferioară; X este independent, fie oxigen, fie azot; R₂ este independent, un acil, benzii, silii, sau grupă alchil blocată, sau X-R₂ împreună sunt absente și sunt înlocuite cu hidrogen; R₃ este independent, hidrogen (-H), -CH₃, OR₂, CH₂OR₂, -CH(OR₂)-CH(OR₂), CH(OR₂)-CH(OR₂)-CH(OR₂), -NH₂, sau -NHR₂; R₄ este hidrogen (H), carboxil sau un alchil C,-C₅ sau benzii carboxilat și n este 1 sau 2, de preferință, 2. Monozaharida fosfitil blocată astfel, include derivați ai acidului alialic, KDO, KDN și compușii lor similari, unde R₄ este carboxil sau o grupă ester carboxilat. într-o grupă preferată a compusului cu formula I, R₄ este hidrogen. în acest caz, formula I devine formula II, de mai jos, în care R_v R₂, R₃, X și n sunt cele definite mai sus.

(IIJ

RO 118132 Β1

1450

Este cunoscut faptul că fiecare grupă FȚ poate fi diferită de alta. De fapt, tema este aceea că reactivul de fosfililare poate fi preparat prin reacția PCI₃ cu o amină secundară cum este, de exemplu, diizopropilamina și 2 mol de alcool. Astfel, prin amestecarea porțiunii alcoolice a amestecului de reacție, se poate prepara un reactiv de fosfitilare și fosfit care poate avea două grupe R, diferite cum este, de exemplu, benzii și etil. Preferabil, ambele grupe R₁ sunt aceleași, și mai preferabil, ambele grupe fenil sau grupe benzii, astfel ca aceste grupe să poată fi îndepărtate prin hidrogenoliză.

Este, de asemenea, cunoscut că fiecare X poate fi oxigen sau azot, și compușii având ambele grupe prezente sunt prevăzute să fie sialil, dibenzil fosfat blocat, compusul 97. Grupele de blocare R₂ sunt grupe acil cum este grupa acil C^Cg ,ca, de exemplu, formil, acetil, pivaloil și pentanoil, benzoil și ftaloil, grupe de blocare alchil și grupe silii. Ca exemple de grupe alchil C^Cg, sunt grupe metil, etil, izopropil, t-butil, ciclopentil, și pentil. Acetalii și cetalii formați de la C^Cg alchil cetone sau aldehide, de preferat fiind acetona și formaldehida, pot, de asemenea, forma o grupă alchil de blocare. Benzaldehida este, de asemenea, prevăzută pentru a forma grupe de blocare la formare a acefalului. Ca cetali sau acetali sunt bine cunoscute grupe de blocare în chimia zaharidelor. Exemplu de grupe de blocare silii sunt tri-C^Cg alchilsilil, ca, de exemplu, trimetilsilil, t-butildimetilsilil și cele asemenea lor, grupă de blocare C^Cg alchildifenilsilil ca, de exemplu, grupa difenilmetilsilil, grupe de blocare di-C^Cgalchilfenil silii ca, grupa fenildimetilsilil și grupa de blocare trifenilsilil.

Se preferă în mod uzual ca toate grupele de blocare să fie aceleași, sau dacă sunt diferite, ele vor fi selectiv îndepărtate prin diferite reacții. De exemplu, grupa benzii poate fi îndepărtată în prezența unei grupe acetil prin hidrogenoliză, pe când o grupă acetil poate fi îndepărtată în prezența unei grupe benzii prin tratare cu o amină primară, ca benzii amina. Acetil este mai ales o grupă de blocare preferată față de o grupă C-acetil în poziția anomerică (1- sau în poziția 2-) ce poate fi ușor îndepărtată în prezența unei alte grupe Oacetil la o altă poziție din inel, prin tratare cu o amină primară.

Trebuie, de menționat, aceea că X-R₂ poate fi absent și înlocuit cu hidrogen. Ca monozaharidă blocată este o deoxi monozaharidă care este prezentată de compușii 97 și 101 până la 113.

Trebuie, de asemenea, de știut că atunci când n=2 în formula generală I, sunt preferate zaharurile având șase inele, dar ambele grupe (R₃-CH) nu necesită să fie aceleași, și sunt de obicei și în mod uzual diferite. De exemplu, pentru fosfit fucozil blocat, compusul 8, discutat anterior și prezentat în Schema 6, o grupă R₃ este CH₃, pe când cealaltă este Oacetil (Oac). Similar, pentru fosfit manozil blocat, compusul 16, discutat în schema 9, un R₃ este o grupă CH₂OAc, și cealaltă este OAc.

Formula generală I poate fi alternativ expresia formulei IA de mai jos, când: fiecare R, este același sau diferit și este o grupă arii ca fenil, sau benzii sau o grupă alchil C₁-C₅ inferior; X este independent oxigen sau azot; R₂ este independent o grupă blocată acil, benzii, silii, sau alchil sau X-R₂ împreună sunt absente și sunt înlocuite de hidrogen; R₃ este independent hidrogen, (-H), -CH₂, -OR₂, -CH₂OR₂, -CH(OR₂), sau -CH(OR₂)-CH(OR₂), CH(OR₂)-CH(OR₂)-CH(OR₂); R₄ este hidrogen (H), carboxil sau alchil C_rC₅ sau benzii carboxilat; m este 0 sau 1, astfel ca atunci când m este 0, grupa (CH-X-R₂) este absentă și este format un inel cu 5 membri, și când m este 1 grupa (CH-X-R₂) este prezentă și monozaharida are șase membri în inel, ceea ce este de preferat.

1455

1460

1465

1470

1475

1480

1485

1490

1495

RO 118132 Β1

Urmând preferința pentru 6 membri în inel în monozaharida blocată, de tip fosfit, formula IA poate fi exprimată ca formula IB, unde R₁-R₄ și X sunt cele din formula IA.

Urmând preferința pentru compușii în care, R₄ este hidrogen, formula II poate fi exprimată ca formula IIA, de mai jos. Urmând preferința pentru 6 membri în inelul monozaharidei blocate (unde m=1), formula IIA poate fi exprimată ca formula IIB, de mai jos. R^, m, și X sunt ca cele din formula IA.

Excepția astfel notată pentru diferențele din grupa R definite printre formulele I, II, IA, IB, și IIA, identitățile lui X, acil, silii, alchil, și a grupelor asemănătoare printre aceste formule sunt aceleași.

Reactivii de fosfililare trivalenți au fost anterior definiți. Reactivii fosfitil trivalenți convenabili sunt, dibenzil Ν,Ν-dietilfosforamidit, 2-cianoetil Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetraizopropilfosforoamidit sau 2-cianoetil N,N-diizopropilclorofosfoamidit.

Procesul de preparare a monozaharidei fosfit blocată de la o monozaharidă nesubstituită (neblocată) este un proces cu multe faze începând cu oricare monozaharidă (aldoză sau cetoză fără restricție de confirmare sau orientare). Monozaharida este mai întâi, blocată la fiecare hidroxil liber (sau amină) utilizând un reactiv standard de blocare cum ar fi, o grupă acil, benzii, silii, sau grupe alchil astfel discutate, mai sus. Grupa de blocare, tipică un acil 0,-05 sau o grupă benzii, în poziția 1- sau 2- este apoi selectiv îndepărtată utilizând, fie o lipază din pancreasul porcin, fie un alchil-sau benzii amină într-un solvent polar neapos cum ar fi, tetrahidrofuran sau diclormetan. Reactivul de fosfitilare trivalent este apoi adăugat la poziția 1- sau 2- în condiții anaerobe utilizând o amină aromatică secundară sau terțiară, agent de condensare ca, de exemplu ,1,2,4-triazol, imidazol, tetrazol sau piridină-p-toluensulfonată. Triazolul sau tetrazolul sunt agenții de condensare preferați. Produsul este apoi oxidat, utilizând un oxidant cum ar fi, apa oxigenată sau f-butil hidroperoxid. Grupa fosforil rezultată este neprotejată de sarea fosfat (de exemplu, sodiu) utilizând reacția de reducere hidrogen/paladiu pentru derivații benzii și tratament alcalin pentru derivații 2-cianoetil.

Astfel, utilizând reacția de mai sus au fost preparați un număr de monoglicozilfosfiți și fosfații corespunzători. Exemple de compuși, precum fosfații, au fost preparați din 2-acetamido-2-deoxi-D-galactoză (GalNAc; compusul 89), 2-acetamido-2-deoxi-D-glucoză (GIcNAc; compusul 90), D-galactoza (Gal, compusul 91), D-glucoza (Glc; compusul 92), D-manoză (Man; compușii 18 și 93), L-ramnoză (Rha; compusul 94), L-fucoză (Fuc; compusul 5), și N-acetil-acid neuraminic (NeuAC; compusul 99). Schemele 21 - 23 de mai jos, prezintă ecuația acestor reacții. Fosfitul de la 2-ftalimidoil-2-deoxi-D-glucoză-3,4,6triacetat (compusul 100), este de asemenea, preparat prin procesul ilustrat în Schema 23 în proporție de aproximativ 90 procente.

RO 118132 Β1

1545

Schema 21

1550

1555

30% H2O2

THF

OPO(OBn)₂

1560

1565

1570

Schema 23

1575

1580

Tabelul 4 de mai jos, arată identitățile a variatelor grupe “R” (R¹*⁴) utilizând schemele următoare. Tabelul 5 arată producția și raportul sau proporția anomerică pentru diferiți compuși ai schemelor 21-23 și tabelul 4.

Solvenții sunt cei potriviți pentru a influența raportul anomeric al produselor fosfitilate. Astfel, când compusul 70 este fosfitilat în THF, raportul α:β este 1:6, pe când în cloroform, raportul se schimbă la 1:2.

1585

RO 118132 Β1

Tabelul 4

Pentru schemele 21 și 22 fCP = compus)

CP*	R1	R2	R3	R4
61	H	NHAc	OAc	H
62	H	NHAc	H	OAc
63	H	OAc	OAc	H
64	H	OAc	H	OAc
65	OAc	H	H	OAc
66	H	OAc	OAc	H
67	OAc	H	H	OAc
68	H	NHAc	OAc	H
69	H	NHAc	H	OAc
70	H	OAc	OAc	H
71	H	OAc	H	OAc
72	OAc	H	H	OAc
73	H	OAC	OAc	H
74	OAc	H	H	OAc
75	H	NHAc	OAc	H
76	H	NHAc	H	OAc
77	H	OAc	OAc	H
78	H	OAc	H	OAc
79	OAc	H	H	OAc
80	H	OAc	OAc	H
81	OAc	H	H	OAc
82	H	NHAc	OAc	H
83	H	NHAc	H	OAc
84	H	OAc	OAc	H
85	H	OAc	H	OAc
86	OAc	H	H	OAc
87	H	OAc	OAc	H
88	OAc	H	H	OAc
89	H	NHAc	OH	H
90	H	NHAc	H	OH
91	H	OH	OH	H
92	H	OH	H	OH
93	OH	H	H	OH
94	H	OH	OH	H
95	OH	H	H	OH

*CP = compus

RO 118132 Β1

1630

Tabelul 5

CP*	α:β	Randament (%)
68	numai a	71
69	numai a	83
70	2 : 1	81
71	3 : 1	85
72	numai a	87
73	18 : 1	88
75	7,4: 1	47
76	numai a	93
77	1 : 2	88
78	1 :4	97
79	3: 1	80
80	6:1	97
82	numai a	93
83	numai a	97
84	1 : 2	94
85	1 :4	98
86	3 : 1	98
87	6: 1	98
99	numai a	64
90	numai a	39
91	1 : 2	42
92	1 : 4	59
93	3 : 1	72
94	6 : 1	76
97	numai β	68
98	numai β	95
99	numai β	99

*CP = compus

1635

1640

1645

1650

1655

Este de notat aceea că, compușii din schemele de mai sus și din tabele sunt derivați de manoză și fucoză derivați dați de numere diferite în discuțiile mai recente. Acești compuși sunt renumerotați aici pentru ușurarea prezentării datelor. Ambele numere sunt prevăzute în exemplele ce urmează.

1660

RO 118132 Β1

Urmând reacțiile subliniate în Schema 23, sintezele, sunt prevăzute mai jos, a diferitelor monozaharide carboxilate specifice cu formula generală I . Acești compuși sunt raportați la acidul D-sialic (compusul 101), D și L-KDN și L-KDO. Structurile pentru exemplele de membri metilester (Me) ai acestor compuși unde R este acetil și R, este benzii sunt descrise mai jos în compușii 101-113. Monozaharidele de bază carboxilate se pot prepara utilizând acid sialic în reacția aldoză-catalizată, după Gautheron-Le Narvor și colab., J.Am.Chem.Soc. 113:7816 (1991) și Sugai și colab., J.Am.Chem.Soc.

RO 118132 Β1

Invenția de față prezintă avantajul obținerii carbohidratului fucozilat într-un singur amestec de reacție.

Se dau, în continuare, exemple de realizare a invenției în legătură și cu fig. 1 ... 3, care reprezintă :

- fig.1, prezintă o cursă tipică în timp a conversiei GDP-manozei la GDP-fucoză prin oxidarea NADPH utilizând măsurători de densitate optică (Abs). Graficul A: controlul cuvetei fără GDP-manoză. Graficul B: același control cu excepția faptului că se adaugă 1 μίτιοΙ de GDP-manoză. Pe ordonată este tresată absorbția unităților la 340 nm, pe când pe abscisă sunt trecute minutele;

- fig.2, în trei panouri precum sunt fig.2-A, 2-B și 2-C, indică schemele eluției HPLC pentru conversia GDP-manozei (a) la GDP-fucoză (b) la timpul 0 (2-A), după 3 h (2-B) și după 6 h (2-C), respectiv, după inițierea reacției. Ordonata conține unitățile de absorbție relativă la 254 nm, pe când abscisa este în minute;

- fig.3, este un grafic ce ilustrează inhibiția sinergistică a a-1,3 fucoziltransferazei cu guanidin 5'-difosfat (GDP) la compusul 50 în prezența 0,2 mM ¹⁴C-GDP-fucoză, și 20 mMMnCI₂ ,la un pH de 6,2. Simbolurile sunt după cum urmează : triunghiuri deschise = 0,05 mM GDP; cercuri deschise = 34 mM compusul 50; și cercuri închise = 0,05 mM GDP plus 34 mM de compus 50. Ordonata este în unități de inversie a vitezei inițiale de formare a produsului (l/v), pe când abscisa este inversul concentrației de N-acetillactozamină (LacNAc).

Exemplul 1. Sinteza chimică a 1-fosfat fucozei (Schemele 5 și 6) (a) 1,2,3,4-tetra-O-benzoil-L-fucoza (Compusul 2)

Clorură de benzoil (21,4 g, 152,3 mmol; 17,7 ml) este adăugată prin picurare la o soluție răcită de L-fucoză (5,0 g, 30,5 mmol) în piridină (100 ml), la 0-5°C, și amestecul este agitat, timp de 3 h, la temperatura camerei. Amestecul este turnat în apă cu gheață și extras cu acetat de etil (EtOAc). Extractul este succesiv spălat cu acid clorhidric diluat rece, soluție apoasă de NaHCO₃, și saramură sau soluție de sare, uscat peste MgSO₄ anhidru, și concentrat. Produsul este utilizat pentru faza următoare fără o purificare ulterioară.

(b) Dibenzilfosforil 2,3,4-tri-O-benzoil-beta-1-fucozidă. (Compusul 4)

La o soluție răcită a compusului 2 (2,0 g, 3,44 mmol) în CH₂CI₂ (20 ml) și Αο,Ο(2 ml) se adaugă prin picurare 30% HBr-AcOH, timp de 8 min, la temperatură cu 0-5°C, și amestecul se agită, timp de 2 h ,la temperatura camerei. Apoi, este turnat în apă cu gheață și extras cu EtOAc. Extractul este spălat succesiv cu apă, soluție apoasă de NaHCO₃ și saramură, uscat peste MgSO₄ anhidru, și concentrat pentru a se obține compusul 3. Compusul 3 este utilizat pentru faza următoare fără o purificare ulterioară. ¹H RMN (CDCI3) δ: 1,36 (3H, d, J 6,51 Hz, 6-CH3), 4,69 (1 H,br q, J 6,56 Hz, H-5), 5,62 (1H, dd, J 3,91, 10,5 Hz, H-2), 5,84 (1H, dd, J 0,97, 3,33 Hz, H-4), 6,01 (1H, dd, J 3,36, 10,50 Hz, H-3), 6,94 (1H, d, J 3,92 Hz, H-1); ¹³C RMN (CDCI3) δ: 15,8, 68,6, 69,2, 70,4, 89,4, 165,4, 165,6, 165,7.

Ag₂CO₃ (1,90 g, 6,89 mmol) este adăugat într-o soluție răcită (0-5°C) a compusului 3 de mai sus, dibenzilfosfat (2,88 g, 10,3 mmol); și MS 3Â (6 g) în CH₂CI₂-Et₂O-CH₃CN (20 ml fiecare) într-un balon rotund la fund învelit cu folie de aluminiu pentru a îndepărta lumina. Amestecul este agitat, timp de 10 h, la temperatura camerei și filtrat prin filtru Celite, și filtratul este concentrat. Reziduul este cromatografiat pe silicagel, cu toluen-EtOAc (2,5 :1), pentru a se obține compusul 4 (2,4 g, 95%) ca un singur produs. ¹H RMN (CDCI3) δ: 1,35 (¹H, d, J 6,35 Hz, 6-CH3), 4,225 (1H, br dt, J 5,71,6,70 Hz, H-5), 4,77 (1H, dd, J 7,07, 11,65 Hz, benzilic), 4,86 (1H, dd, J 6,50, 1,63 Hz, benzilic), 5,11 (1H, dd, J 7,51, 11,71 Hz, benzilic), 5,14 (1H, dd, J 7,27, 11,70 Hz, benzilic), 5,58 (1H, dd, J 3,48, 10,44 Hz, H-3), 5,69 (1H, dd, J 7,37, 7,89 Hz, H-1), 5,76 (1H, dd, J 8,03, 3,44 Hz, H-4), 5,90 (1H, dd, J 8,03, 10,45, H-2); ¹³C RMN (CDCI₃) δ: 16,12, 69,31, 69,35, 69,54, 69,58, 69,63, 69,70, 70,57,

1710

1715

1720

1725

1730

1735

1740

1745

1750

1755

RO 118132 Β1

70,83, 71,70, 96,97, 97,00, 127,28, 127,40, 127,89, 128,06, 128,13, 128,26, 128,31, 128,43, 128,58, 128,66, 128,83, 129,06, 129,67, 129,72, 129,77, 129,93, 133,27, 133,41, 133,51, 165,24, 165,45, 165,79. HRMS, calculat pentru C₄₁H₃₇PCs (M+Cs⁺) 869,1128; găsit: 869,1138.

(c) beta-L-fucoză 1-fosfat (compusul 5)

Compusul 4 (2,32 g, 3,15 mmol) este hidrogenat pe Pd/C 5% (400 mg) în EtOH (60 ml) și 1N NaHCO₃ (15 ml), timp de 10 h. Catalizatorul este filtrat printr-un filtru Celite™. La o soluție răcită a reziduului în apă (20 ml) se adaugă prin picurare 1N NaOH (20 ml), la 0-5°C, și amestecul este agitat, timp de 3 h, la temperatura camerei. Amestecul este neutralizat cu grijă prin adăugarea a 1N AcOH rece la pH=7,5 și materialul insolubil este filtrat prin filtrul Celite™. Filtratul este diluat la 250 ml și transferat într-o coloană Dowex 1-X8 (HCO₂) (2x15 cm) și apoi ,eluat cu gradient de NH₄OAc₂; apă (200 ml), 0,1 M NH₄OAc₂ (200 ml), 0,1 M NH₄OAc₂ (200 ml), și 0,3 M NH₄OAc₂ (200 ml). Fucoza este eluată cu apă și compusul 5 dorit este eluat între 0,2 - 0,3 M NH₄OAc2- După îndepărtarea sării, se obține compusul 5 (700 mg, 82%). Datele ¹H și ¹³C-RMN sunt în concordanță cu cele raportate de grupul Baker. [Nunez și colab., Can.J.Chem., 59:2086(1981)].

(d) 1,2,3,4-tetra-O-acetil-L-fucoza (compusul 6)

Un amestec de L-fucoză (3,0 g, 18,2 mmol) și NaOAc anhidră (50 mg, 0,61 mmol) în anhidridă acetică (20 ml) este agitat, timp de 2 h, la temperatura camerei și apoi, încălzit la 100°C, timp de 2 h. După răcire, amestecul este turnat în apă cu gheață, agitat, timp de 2 h, și extras cu cloroform. Extractele sunt succesiv spălate cu o soluție apoasă de carbonat de sodiu și apă, uscat pe MgSO₄ anhidru, și concentrat. Siropul rezidual este cromatografiat pe silicagel, toluen, acetat de etil (10:1), pentru a se obține compusul 6 (5,92 g, 98%) sub forma unui amestec de a și β (1:7 după ¹N RMN spectru).

(e) 2,3,4-tri-O-acetil-L-fucoză (compusul 7 sau 74

i. Metoda chimică: o soluție din compusul 6 sau 67 (3,0 g, 9,0 mmol) și benzii amină (1,45 g, 13,5 mmol; 1,47 ml) în THF (35 ml) este agitată, timp de o zi ,la temperatura camerei. Amestecul este diluat cu cloroform și spălat succesiv cu acid clorhidric diluat răcit cu gheață, soluție apoasă de NaHCO₃ și apă, uscat pe MgSO₄ anhidru, și concentrat. Siropul rezidual este cromatografiat pe silicagel, toluen-acetat de etil (1:1), pentru a se obține compusul 7 sau 74 (2,40 g, 92%). Spectrul ¹H RMN este în bună concordanță cu cele raportate. (Hennen și colab., J.Org.Chem. 53:4743 (1988)).

ii. Procedeul enzimatic: o suspensie din compusul 6 sau 67 (2,5 g 7,5 mmol) și lipază pancreatică porcină (5,6 g) în 13% (v/v) DMF/soluție tampon fosfat (50 mM, pH=7) este agitată, timp de 5 zile, la temperatura camerei, timp în care pH-ul este ajustat cu soluție N de NaOH. Amestecul este filtrat, și filtratul este extras cu acetat de etil. Extractul este spălat cu apă, uscat apoi pe MgSO₄ anhidru. Purificarea produsului este făcută ca cea dată compusului 7 sau 74 (1,1 g, 48,4%), sub forma unui amestec de a și β (1:1).

(f) Dibenzilfosforil 2,3,4-tri-O-acetil-L-fucozidă (compusul 9 sau 88)

Dibenzil Ν,Ν-dietilfosforamidă (Pederson și colab., Tetrahedron, 47:2643 (1991) (2,7 g, 8,5 mmol) este adăugată prin picurare la o soluție din compusul 7 sau 74 (1,0 g, 3,4 mmol) și tetrazol (1,0 g 14,5 mmol) în THF (50 ml) sub azot, la temperatura camerei, și amestecul este agitat, timp de o oră la temperatura camerei. Se adaugă la amestec eter (50 ml), și faza organică este spălată cu HCI diluat răcit cu gheață, soluție apoasă de NaHCO₃, și apă, și uscată pe MgSO₄ anhidru și apoi concentrată. Siropul rezidual este cromatografiat pe silicagel cu hexan:acetat de etil (4:1), dând compusul 8 sau 81 (1,43 g, 79%) sub forma unui amestec de a și β (1:10). Anomerul β :¹H RMN (CDCI₃) a : 1,22 (3H, d, J 6,50 Hz, 6-CH₃), 1,91 (1,99, 2,19(3H fiecare, s, 3xOAc), 3,85 (1H, dq, J 1,00, 6,50 Hz, H5), 4,82-4,96 (4H, m, protoni benzilici), 5,02-5,08 (2H, m, H-2,3), 5,25 (1H, dd, J, 0,50, 3,50 Hz, H-4), 5,32 (1H, dd, J 8,00, 10,50 Hz, H-1).

RO 118132 Β1

1810

La o soluție din compusul 8 sau 81, răcită, (500 mg, 0,9 mol; 500 mg, 0,9 mmol) în THF (50 ml) se adaugă 34% apă oxigenată, (7 ml) într-o singură porțiune, și amestecul este menținut la cald mai mică sau egală cu temperatura camerei și agitat, timp de 90 min. Amestecul este diluat cu eter și spălat cu o soluție de tiosulfat apoasă răcită cu gheață, o soluție apoasă de NaHCO₃, și apă, apoi uscat pe MgSO₄ și concentrat pentru a se obține compusul 9 sau 88 (420 mg, 81%). Acesta este utilizat pentru faza următoare fără a fi purificat. Spectrul ¹H RMN este în bună concordanță cu acea raportare. [Schmidt și colab., LiebigsAnn.Chem., 191:121 (1991)]. ¹H RMN (CDCI₃) δ : 1,22 (3H, J 10,0 Hz, 6-CH₃), 1,9, 1,91, 1,99, 2,19 (3H fiecare, s, 3 x OAc), 3,90 (1H, dq, J 6,50, 7,50 Hz, H-5), 5,00-5,03 (m, H-3, protoni benzilici), 5,03-5,12 (m, protoni benzilici), 5,26 (1H, dd, J 1,00, 3,50 Hz, H-4), 5,27-5,33 (2H, m, H-1,2). HRMS calculat pentru C₂₆H₃₁O_nPCs (M+Cs) + 683,0658, găsit=683,0658.

(g) L-fucoză-1 -fosfat (compusul 5 sau 95)

Compusul 9 sau 88 (5,0 g, 9,1 mmol) este hidrogenat pe Pd/C 5% (400 mg) în EtOH (70 ml) și NaHCO₃ N (30 ml) sub atmosferă de hidrogen, timp de 3 h, la temperatura camerei, și catalizatorul este apoi filtrat. La filtratul răcit se adaugă soluție normală de NaOH N, la 0-5°C în timp ce soluția devine puternic alcalină (pH mai mic de 13). Amestecul este agitat, timp de 4 h, la temperatura camerei și neutralizat prin adiție de acid acetic rece N, la pH=7,5. Amestecul este filtrat, diluat cu 500 ml și aplicat pe o coloană cu rășină Dowex 1-XB (HCOO ) și eluat cu un gradient liniar de bicarbonat de amoniu (0-0,5). Fracțiile sau fracțiunile specifice sunt colectate și liofilizate. Excesul de bicarbonat de amoniu este îndepărtat prin adăugarea unei rășini Dowey 50 XB(H⁺) la o soluție de pudră liofilizată în apă. Rășina este filtrată, și filtratul este liofilizat. O soluție din produs este trecută printr-o coloană de Dowex 50-W-XB(Na⁺) cu apă și se obține compusul 5 sau 95 (2,61 g, 99%) sub forma unui amestec de a și β (1:10 din date ¹H RMN). ¹H- și ¹³C-RMN sunt spectrele în bună concordanță cu cele raportate. [Nunez și colab., Can.J.Chem.,59:2086 (1981)].

Exemplul 2. Sinteza chimică a GDP-fucozei (compusul 12), (Schema 7)

Compusul 5 este mai întâi transformat în sarea sa de trietilamoniu prin trecere printro coloană cu Dowex 50 W-X8 formă (Et₃NH⁺) cu apă și liofilizat. Sarea liofilizată de L-fucoză1-fosfat trietilamoniu (compusul 10) (300 mg, 0,83 mmol) și guanozin-5'-monofosfat morfolida (compusul 11) (600 mg, 0,83 mmol) sunt separat uscate prin co-evaporare folosind de două ori piridina. Ele sunt apoi combinate cu piridină uscată (20 ml) și amestecul se agită 5 zile la temperatura camerei, și apoi este concentrat. Produsul este purificat pe o coloană de Sephadex 0-25 (superfină) (3 x 65 cm) de două ori cu apă. Fracțiunile specifice sunt trecute printr-o coloană Dowex 50 W-Xg (Na⁺) cu apă. Fracțiunile sunt comasate și liofilizate obținându-se compusul 12 (-300 mg) concomitent cu o mică cantitate de GMP (judecat după ¹H RMN). Spectrul ¹H RMN este în bună concordanță cu valoarea raportată. [Gokhale și colab.,Can.J. Chem.,68:1063 (1990)].

Exemplul 3. Procedeele enzimatice și probele pentru transformarea manozei-1-Ρ în GDP-fucoză (Schemele 9-11) (a) Prepararea GDP-manoză pirofosforilază prin conversia Man-1-Ρ la GDP-manoză Enzima pentru producerea GDP-manozei este GDP-manoză pirofosforilază (GDPManPP), care se obține din drojdie de bere. GDP-ManPP din drojdia de bere este recuperată prin precipitare cu sulfat de amoniu (aproximativ 80% în comparație cu extractul de celule libere brute) cu activitate specifică de circa 0,1 unități pe ml soluție de enzimă.

1815

1820

1825

1830

1835

1840

1845

1850

RO 118132 Β1

Drojdia de bere Saccharomyces cerevisiae este cultivată pe mediu: 5 g/l, extract de drojdie de bere; 10 peptonă; pH=6,0. Cultura este cultivată, la temperatura de 30°C prin agitare în timpul nopții. Celulele care sunt recoltate prin centrifugare și spălate cu 50 mM soluție tris-tampon (pH =7,5) conținând 2 mM MgCI₂ și 0,5 mM DTT. Celulele (circa 10 g) sunt sparte prin folosirea unei mașini de tabletare Bead-beater (Bioseptic Products, OK) prin impulsuri la interval de 1 min, timp de 5 min. Soluția este apoi centrifugată, la 4°C și 23,00 g timp de o oră. Supernatantul (extractul de celule libere) este apoi colectat și utilizat pentru purificarea enzimei. La enzimă parțial purificată, 40-80% (la 0°C) precipitatul este colectat ușor prin adăugare de sulfat de amoniu pudră la extractul de celule libere la 40 % saturate și centrifugat ,la 4°C, la 15,00 g, timp de 30 min și apoi, supernatantul este mai departe adăugat la sulfat de amoniu saturat 80%. După centrifugare, precipitatul este colectat și redizolvat în 20 ml de 50 mM tris- (pH=7,5) soluție tampon conținând 2 mM MgCI₂ și 0,05 mM DTT și dializat în 4I din aceeași soluție tampon întreaga noapte (circa 18 h), la 4°C. Activitatea acestui preparat este estimată la circa 0,1 U/ml bazat pe proba activității HPLC.

(b) Prepararea enzimelor sintetice de GDP-fucoză pentru conversia GDP-manozei la GDP-fucoză

Prima încercare de a utiliza enzimă sintetică de GDP-fucoză parțial purificată (colectată după precipitare cu sulfat de amoniu) pentru conversia GDP-manoză la GDP-fucoză nu a fost un succes dat de puternica oxidare internă a NADPH. După purificarea enzimei prin trecere peste DEAD-Sepharose CL-6B în coloană, rezultă o enzimă cu o activitate înaltă precum și descreșterea activității oxidative a NADPH. Soluția de enzimă la acest stadiu este estimată la circa 0,05 U/ml bazat pe proba de oxidare a NADPH.

Creșterea GDP-fucoză este observată utilizând proba HPLC. După 6 h de reacție, producția de GDP-fucoză este estimată la cca 9% bazat pe adiția manozei 1-fosfat. Se aștepta ca o producție mare să fie obținută dacă soluția de enzimă cu mare activitate poate fi preparată. în timpul reacției, se observă degradarea GDP-manozei. Această degradare poate fi prevenită prin adiția potasiului fluorid. Aceasta este dată de contaminarea altor enzime din prepararea enzimei. Dacă este utilizată enzimă pură, nu mai este necesară adiția sării fluorid.

Bacteria Klebsiella pneumonia ATCC 12658 este cultivată pe 2 I de mediu care conține 10 g de acid casamino (Difco), 5 g extract de drojdie de bere, 3 g de K₂HPO₄, 1 g de KH₂PO₄ și 5 g D-glucoză per litru (pH=7,0). După incubare la 37°C, timp de 18 h, celulele sunt recoltate prin centrifugare (10,000 x g, 50 min, 4°C) și resuspendate în 50 mM trissoluție tampon conținând 0,5 mM DTT (pH=7,5). Apoi, celulele sunt sporite printr-o presă celulară French la 16000 1b/in. Celula sfărâmată, rămășițele, sunt îndepărtate prin centrifugare la 23,000 x g, timp de 60 min și supernatantul (extractul de celulă liberă) este utilizat pentru purificarea enzimei. Extractul de celulă liberă (50 ml) de la 2 I de cultură este tratat cu 60 mg de sulfat de protamină și precipitatul rezultat este îndepărtat după centrifugare. Apoi, se adaugă sulfatul de amoniu solid sub agitare ușoară la o saturație de 70% (0,436 g per ml, la 0°C). După centrifugare, precipitatul este colectat și resuspendat în 20 ml de soluție tampon (50 mM tris conținând 0,5 mM DTT, pH=7,5), și dializat pe timpul nopții (cca 18 h), la 4°C în 4 I din aceeași soluție tampon. Soluția rezultată (20 ml) este apoi trecută printr-o coloană de DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) (3 x 30 cm) care este în prealabil echilibrat cu această soluție tampon. Enzimă este eluată cu un gradient liniar din 0 -1 mM NaCI în aceeași soluție tampon (total 400 ml). Fracțiunea activă este comasată și dializată în 2 I de 50 mM tris- soluție tampon conținând 0,5 mM DTT (pH=7,5). Această enzimă preparată este utilizată direct în sinteză. Activitatea este estimată la circa 0,5 U/ml bazat pe IPLC și proba de oxidare a NADH.

RO 118132 Β1

1905 (c) Test pentru activitatea enzimei

Se utilizează un sistem HPLC pentru a determina formarea GDP-Man și GDP-fucozei și coloana partisil 5 SAX (Whatman Co.) 4,6 x 12,5 cm, cu particula de dimensiunea 5 μιτιοΙ. Soluția tampon mobilă este 0,1 M soluție tampon fosfat (pH = 3,5) cu un raport de curgere de 0,5 ml/min (presiune 42 kgf/cm²,600 psi). Compușii sunt detectați cu un detector UV la 254 nm. Timpul de retenție pentru GDP-manoză este de circa 8,9 min și GDP-fucoză este de circa 13 min. Activitatea GDP-manoză pirofosforilază este probată prin următoarea formare a GDP-manozei de la a-manoză-1-fosfat și GTP prin analiza HPLC. Amestecul de reacție conține 10 μιτιοΙ de tris-HCI, 1 μιτιοΙ α-manoză, 1-fosfat, 1 μιτιοΙ GTP și enzimă parțial purificată în volum total de 0,5 ml. Amestecul de reacție stă la incubare la 30°C o perioadă de timp depinzând de activitatea enzimei. Reactantul (100 μΙ) este retras și centrifugat prin filtru element Ultrafree (10,000 MW, Millipore). Filtratul (5 μΙ) este apoi injectat într-un HPLC pentru a măsura formarea GDP-manozei. Cuantificarea GDP-manozei este estimată printr-o soluție standard de GDP-manoză preparată din GDP-manoză purificată (sigma). O unitate este egală cu 1 μιτιοΙ de GDP-manoză formată într-un minut în condițiile probei.

Activitatea măsurată pentru conversia GDP-D-manoză la GDP-L-fucoză poate fi următoarea, fie prin determinarea spectrofotometrică a oxidării NAHPH, fie măsurând direct formarea GDP-L-fucozei prin metoda HPLC. Prepararea enzimei conținând oxidaza NADPH activă, este necesar de a determina simultan proporția de NADPH oxidat în absența substratului. în două cuvete, 1 ml de 50 mM tris- soluție tampon (pH = 7,5) conținând 0,2 μιτιοΙ de NADPH și soluție de enzimă, în altă cuvetă 0,1 μιτιοΙ de GDP-manoză. Se determină procentul de descreștere a densității optice în cele două cuvete la 340 nm. Diferența în proporție de NADPH oxidat este măsura procesului de conversie. Fig.1 prezintă proba tipică în care linia de absorbție A este cuveta fără GDP-manoză și linia B este aceeași soluție după adăugarea a 1 μιτιοΙ de GDP-manoză. O unitate este egală cu 1 μιτιοΙ de NADPH oxidat per minut în condițiile probei.

Pentru proba HPLC, mediul de reacție este 1 ml de tris- soluție tampon (pH = 7,5) conținând 1 μιτιοΙ de GDP-D-manoză, 0,2 μιτιοΙ KF, 2 U T.brokii alcool dehidrogenază, 10 μΙ izopropanol și soluție de enzimă originală. După incubare pentru o anumită perioadă de timp (o oră), 100 μΙ din reactant este centrifugat prin filtrul unit Ultrafree (10,000 MW, Millipore). Filtratul (5 μΙ) este apoi injectat la HPLC pentru măsurarea formării GDP-fucozei. Cuantificarea GDP-fucozei este estimată de un preparat standard de GDP-fucoză obținut din GDPfucoză purificată (sigma). O uniate este egală cu 1 μιτιοΙ GDP-fucoză formată per minut în condițiile probei sau a încercării. Fig.2 prezintă trei exemplare de HPLC, grafic, la timpul 0 (A), după 3 h (B), și după 6 h (C), după ce a fost inițiată reacția. Așa cum s-a notat mai sus GDP-manoza eluează la circa 8-9 min, pe când GDP-fucoza eluează la circa 13 min.

Exemplul 4. Sintezele enzimatice ale GDP-fucozei pornind de la 1-fosfat manoză

La 5 ml de soluție de reacție, se adaugă 5 μιτιοΙ Man-1-fosfat, 1 μιτιοΙ NADPH, 5 μιτιοΙ GTP. 5 μιτιοΙ PEP, 100 U piruvat kinază, 50 μΙ izopropanol 5 U T.brokii alcool dehidrogenază, 1 μιτιοΙ MgCI₂, 100 U fosfatază anorganică, 5 μιτιοΙ KF, 0,1 U GDP-manoză soluție de pirofosfatază și 0,05 U GDP-fucoză, enzimă sintetică, după care sunt incubate la 30°C, timp de 6 h, formarea GDP-fucozei este determinată prin proba sau încercarea cu HPLC.

Exemplul 5. Prepararea Gal β 1,3 (Fuc a 1,4) GIcNAc utilizând generarea in situ a GDP-tuc

Un amestec de sare de sodiu a GTP (6,0 mg, 10 μπιοΙ), sare de Ka Man-1-P (3,5 mg, 10 μιτιοΙ), Gal β 1,3 GICNAc (3,8 mg, 10 μιτιοΙ), NaF (0,42 mg, 10 μιτιοΙ), NADPH (9,4 mg, 10 μιτιοΙ), sare de Ka PEP (4,1 mg, 20 μιτιοΙ), MgCI₂-6 H₂O (2,6 mg. 10 μιτιοΙ),

1910

1915

1920

1925

1930

1935

1940

1945

RO 118132 Β1

MnCI₂-4 H₂O (2 mg, 10 _Mmol), 2-propanol (50 μΙ), ADH (12 U), PK (200 U), Ppase (100 U), enzimă impurificată preparată din GDP-manoză pirofosforilază (1,0 ml) și enzimă impură preparată din GDP-fuc, produc enzimă (1,0 ml) în 100 mM de tris- soluție tampon (pH = 7,5) și se diluează până la 3 ml. Se adaugă la amestec a- 3/4 fucoziltransferază (0,01 U) și amestecul rezultat este agitat sub Ar, timp de 3 zile, la temperatura camerei. Amestecul este filtrat și aplicat pe o coloană cu Dowex 50W-X8 (H⁺) cu apă. Fracțiunea este colectată și liofilizată. Reziduul material este purificat pe o coloană de Saphadex G-25 (superfină) cu apă. Fracțiunile specifice sunt comasate și liofilizate dând în final Gaipi,3(Fuca 1,4)GlcNAc. Spectrul lor ¹H-RMN este în bună concordanță cu cel raportat. [Dumas și colab., Biomed. Chem. Lett., 1:425 (1991)].

Exemplul 6. Sintezele chimice ale 1-fosfat manozei (compusul 18 sau 93: schema 9) (a) 1,2,3,4,6-penta-O-acetil-D-manoza-(compusul 14 sau 65)

D-manoza (compusul 13; 5,0 g, 27,8 mmol) este dizolvat în piridină anhidră (30 ml) și răcită la 0-5°C pe baie de gheață. Anhidrida acetică (20 ml) este adăugată încet la soluție și amestecul se agită la temperatura camerei, timp de 8 h. Amestecul este pus în apă cu gheață și extras cu acetat de etil. Extractele sunt apoi spălate cu HCI rece, apă, soluție saturată de bicarbonat de sodiu rece, apă, soluție saturată de NaCI, apă și uscate pe sulfat de sodiu anhidru. Stratul organic este concentrat în vacuum și utilizat pentru faza următoare fără a fi purificat. Se obține compusul 14 sau 65; 10,6 g, 98% procent în greutate a produsului, izomer-α pur.

(b) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-D-manoză (compusul 15 sau 72)

Pentaacetatul (compusul 14 sau 65; 10,0 g, 25,6 mmol) este dizolvat în THF și se adaugă 1,5 echivalenți de benzilamină (4,6 ml). Amestecul este agitat la temperatura camerei, timp de o zi. Apoi acesta este extras cu acetat de etil, și spălat substanțial cu acid clorhidric rece, apă, soluție rece saturată de bicarbonat de sodiu, apă, NaCI soluție saturată rece, apă, și uscat peste sulfat de sodiu anhidru. Solventul este îndepărtat în vacuum și reziduul sub formă de sirop este cromatografiat pe silicagel cu acetat de etil:hexan (2:3, v/v) pentru a da compusul 15 sau 72 (7,8 g, 87 % produs, izomer a pur). ¹H RMN (CDCI₃) δ 2,00, 2,05, 2,11, 2,17 (3H, s, 4 x CH₃CO), 4,01-4,15, (1H, m, 5-H), 4,21-4-4,29 (2H, m, 6-H), 5,24 (1H, d,1-H), 5,26-5,27 (1H,m,2-H), 5,30-5,34 (1H,d, J=12,03 Hz, 4=H), 5,41-5,45 (1 H.dd.J 3,36, 9,99 Hz, 3-H).

(c) dibenzilfosfitil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-D-manozidă (compusul16 sau 79)

Tetraacetat-manoza (compusul 15 sau 72) (1,5 g, 4,31 mmol) este dizolvat în THF anhidru (30 ml) și agitat sub atmosferă de azot la temperatura camerei. Se adaugă 1,2,4triazol (1,5 g, 21,7 mmol) la soluție și se agită până la dizolvarea acestuia. Soluția este adăugată la dibenzil-N,N-dietil-fosforiamidit (10,0 g, 31 mmol), și amestecul este agitat timp de o oră. Se adaugă 50 ml eter la soluție și amestecul de reacție este în continuare extras cu soluție rece saturată de bicarbonat de sodiu, apă, soluție rece saturată de NaCI și apă, și se usucă peste sulfat de sodiu anhidru. Extractul organic este apoi concentrat în vacuum și siropul rezidual este purificat prin silicagel folosind o coloană de silicagel, cu EtOAc-hexan (1:4, v/v) ca sistem de solvent pur (a - izomer pur) pentru a da compusul 15 sau 79.

¹H RMN (CDCI₃) δ: 2,0-2,3 (12H, 4s, 4 x CH₃CO), 3,92-3,98 (1H, dd, 6-Ha), 4,05-4,1 (1H, m, 5-H), 4,18-4,24 (1H, dd, 6-Hb), 4,85-5,12 (4H, m, CH₂Ph), 5,22-5,24 (11H, m, 2-H), 5,28-5,32 (1H, t, 4-H), 5,38-5,42 (1H, dd, 3-H), 5,48-5,52 (1H, dd, 1-H).

(d) dibenzil fosforil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-D-manozidă (compusul 17 sau 86)

Compusul 16 sau 79 dizolvat în THF anhidru și răcit la - 76°C cu o baie uscată de gheață: acetonă și 30% apă oxigenată (7 ml) care se adaugă la o soluție într-o singură porție. Soluția a fost încălzită până la temperatura camerei și agitată, timp de 90 min.

RO 118132 Β1

Excesul de apă oxigenată este atenuat prin adăugare de tiosulfat de sodiu răcit cu gheață. Se adaugă 100 ml de eter și extractul este scos cu grijă așa cum s-a descris mai sus pentru a se obține compusul 17 sau 86 care este utilizat în faza următoare fără purificare.

(e) D-manoză-1-fosfat (compusul 18 sau 93)

Compusul 17 sau 86 este hidrogenat pe Pd/C 5% (400 mg) în etanol (30 ml) și în bicarbonat de sodiu (10 ml) sub atmosferă de hidrogen, timp de 2 h. Catalizatorul este filtrat apoi și filtratul este concentrat. Se adaugă NaOH prin picurare la rezidiu la 0-5°C, la un pH ca cel al amestecului de reacție, de circa 12. Amestecul este agitat 3 h, la 4°C și apoi neutralizat prin adiție de acid acetic N rece la un pH = 7,2, este filtrat, diluat la 400 ml, aplicat într-o coloană cu Dowex 1-X8(HCOO', 2 x 28 cm), și eluat cu un gradient liniar de bicarbonat de amoniu (0-0,6 M). Fracțiunile conținând D-manoză-1-fosfat sunt comasate și liofilizate. Excesul de bicarbonat de amoniu este îndepărtat prin spălarea pudrei liofilizate cu Dowex 50W-X8 (forma hidrogen) pentru a se obține compusul 18 sau 93 sub formă de sare de sodiu.

Exemplul 7.

A. Procedeul general pentru halohidrarea cloroperoxidazei catalizate (schemele 3,4, și 4a)

Un amestec de reacție conținând 20 ml soluție tampon de fosfat citric (pH = 3), 1mmol de glical, 5 mmol halogenură de potasiu și 1170 unități de enzimă sunt adăugate la 600 μ\ de H₂O₂ (30%). Reacția este continuată 30 min pentru iodohidrare, 3 h pentru bromhidrare sau 3 zile pentru clorhidrare la temperatura camerei. Solventul este îndepărtat la presiune redusă, și se adaugă metanol la reziduu. Materialul insolubil este filtrat, și solventul este îndepărtat la presiune redusă. Reziduul este purificat cu C8 fază inversă în coloană prin cromatografie pe silicagel pentru a se obține 2-deoxi-2 halozaharidă. Produsele sunt convertite la peracetați printr-o metodă standard (piridină, cantitate catalitică de 4dimetilaminopiridină, anhidridă acetică, o zi) și purificate prin coloană cromatografică cu silicagel pentru caracterizare.

(1) Peracetatul compusului 20 ¹H-RMN (CDCIg) δ: α-izomer: 2,04 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,10 (3H, s), 2,21 (3H, s), 4,05 (1H, dd, J = 2,5, 12,5 Hz, H-6) 4,08 (1H, dd, J = 3,5, 11 Hz, H-2), ,4,28 (1H, ddd, J = 2,4, 10 Hz, H-5), 4,31 (1H, dd, J = 4, 12,5 Hz, H-6), 5,09 (1H, dd, J = 9, 10 Hz, H-3), 5,52 (1H, dd, J = 0, 11 Hz, H-4), 6,36 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-1) ppm.

Izomerul β : 2,03 (3H, s), 2,09 (3H, s), 2,11 (3H, s), 2,18 (3H, s), 3,88 (1H, ddd, J = 2,4, 4,5, 10,5 Hz, H-59) 3,90 (1H, dd, J = 9, 10,5 Hz, H-2), 4,11 (1H, dd, J = 2,5, 12,5 Hz, H-6), 4,32 (1H, dd, J = 4,5, 12,5 Hz, H6), 5,03 (1H, dd, J = 9, 10 Hz H-3), 5,34 (1H, dd, J = 9, 10,5 Hz), 5,81 (1H, d, J = 9 Hz, H-1), ppm. ¹³C-RMN (CDCI₃) d: 20,52-20,67 (4 x C), 47,50, 62,10, 68,46, 72,85, 74,36, 93,11, 167,91-172,10, (4 x C) ppm. HRMS (M⁺Na⁺): calculat 433,0110/435, găsit 433,0112/435.

(2) Peracetatul compusului 21 ¹H-RMN (CDCI3) δ : izomerul a: 2,07 (3H, s), 2,10 (3H, s), 2,11 (3H,s), 2,17 (3H, s), 4,19 (1H, ddd, J = 2,5, 4,5, 10,5 Hz, H-5), 4,17 (1H, dd, J = 2,5, 10,5 Hz, H-6), 4,23 (1H, dd, J = 4,5, 12,5 Hz, H-6), ,4,43 (1H, dd, J = 2, 4Hz, H-2), 5,21 (1H, dd, J = 4, 9,5 Hz, H-4), 5,45 (1H, t, J = 10 Hz, H-4), 6,32 (1H, d, J = 2 Hz, H-1), ppm. ¹³C-RMN (CDCI3) δ: 20,60, 20,66, 20,75, 20,86, 47,77, 61,82, 65,54, 68,75, 71,25, 93,11, 167,20-171,90 (4 x C) ppm.

Izomerul β : 2,07 (3H, s), 2,10 (3H, s), 2,12 (3H, s), 2,18 (3H, s), 3,82 (1H, ddd, J = 2,5, 5, 9,5 Hz, H-5), 4,13 (1H, dd, J = 2,5, 12,5 Hz, H-6), 4,27 (1H, dd, J = 5, 10,5 Hz, H-6), 4,60 (1H, dd, J = 3,5, 1,5 Hz, H-2), 5,00 (1H, dd, J = 4, 9,5 Hz, H-3), 5,43 (1H, T, J-9,5 Hz, H-4), 5,74 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1), ppm. ¹³C-RMN (CDCI₃) δ: 20,60-20,85 (4 x C), 51,05, 61,82, 65,27, 71,01, 73,04, 90,01, 167,20-171,90, (4 x C) ppm, HRMS (M+Na⁺): calculat: 433,0110/435, găsit :433,0115/435.

2000

2005

2010

2015

2020

2025

2030

2035

2040

2045

RO 118132 Β1 (3) Peracetatul compusului 22 ¹H-RMN (CDCI3) δ : izomerul β: 2,04 (3H, s), 2,07 (3H, s), 2,16 (3H,s), 2,19 (3H, s), 4,08 (1H, dd, J = 9,11,5 Hz, H-2), 4,10-4,15 (3H, m, 2 x H-6 & H-5), 5,15 (1H, dd, J = 3, 11,5 Hz, H-3), 5,35 (1H, d, J = 3,Hz, H-4), 5,84 (1H, d, J = 9, Hz, H-1),ppm. ¹³C-RMN (CDCI3) δ : 20,42, 20,52, 20,61, 20,66, 46,35, 60,89, 67,03, 71,94, 72,78, 93,43, 168,31-170,90 (4 X C) ppm. Izomerul a : ¹³C-RMN (CDCI₃) δ: 20,42-20,66 (4 x C), 44,39, 67,04, 67,09, 68,64, 69,39, 91,05, 167,01-170,86 (4 x C) ppm, HRMS (M+Na⁺): calculat:433,0110/435, găsit: 433,0119/435.

(4) Compusul 23 ¹H-RMN (CDCI₃), izomerul δ : 1,12 (3H, d, J = 6,5, CH₃) 3,45 (1H, dd, J = 1, 3Hz, H4), 3,52 (1H, dd, J = 3, 10,5 Hz, H-3), 3,58 (1H, Qd, J =1,6,5 Hz, H-5), 3,69 (1H, dd, J = 8,5,

10.5 Hz, H-2), 4,45 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-1). ¹³C-RMN (CDCI₃), izomerul β: 16,71, 58,04, 72,13, 73,56, 76,03, 98,78 ppm; izomerul β: 16,71, 58,04, 72,13, 73,56, 76,03, 98,78 ppm. Izomerul β : 16,71, 54,71, 67,25, 71,13, 74,55, 94,20 ppm, HRMS (M+Na⁺) : calculat: 248,9738/251, găsit: 248,9730/251.

(5) Peracetatul compusului 25

Ή-RMN (CDCI₃) δ : izomerul β: 2,05 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,16 (3H,s), 2,18 (3H, s), 4,06 (1H, dd, J = 9, 11,5 Hz, H-2), 4,07-4,15 (3H, m, 2 x H-6 & H-5), 5,09 (1H, dd, J = 3,

11.5 Hz), 5,39 (1H, d, J = 3,Hz, H-4), 5,75 (1H, d, J = 9, Hz, H-1)ppm. ¹³C-RMN (CDCI₃) izomerul β: 20,21-22,55,(4 x C) 55,30, 60,87, 66,84, 71,86, 72,74 93,53, 168,20-180,21 (4 x C) ppm;izomerul a : 20,1-22,55, (4 x C), 53,46, 61,04, 67,44, 68,67, 69,51, 90,94, 168,20180,21 (4 x C) ppm. HRMS (M+Na⁺): calculat: 389,0615/391, găsit: 389,0610/391.

(6) Peracetatul compusului 27 ¹H-RMN (CDCI3), δ izomerul β : 2,04 (3H, s) 2,07 (3H, s), 2,12 (3H,s), 2,17 (3H, s), 4,06-4,17 (4H, m, H-2,2 x H-6 & H-5), 5,13(1 H, dd, J = 3,5, 10 Hz, H-3), 5,25 1H, d, J = 3,5 Hz, H-4), 5,91 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-1), ppm. ¹³C-RMN (CDCI3), izomerul β: 20,5, 22,50, (4 x C), 24,98, 60,94, 67,10, 72,16 74,10, 94,15,168,20-179,36 (4 x C), ppm; izomerul a: 20,522,50 (4 x C), 29,87, 60,63, 67,68, 68,31, 69,42, 92,16, 168,20-179,36 (4 x C) ppm, HRMS (M+Na⁺): calculat: 480,9972/,găsit: 480,9999.

β. Halohidrarea clorperoxidazei-catalizate a dizaharidelor glicali și sialal (1) Halohidrarea compusului 28 (schema 4)

Se adaugă 40 ml 30% H₂O₂ la un amestec din compusul 28 (20 mg, 0,065 mmol), KBr (38,6 mg, 0,32 mmol) și clorperoxidază (76 unități) în soluție tampon de citrat (1,4 ml, pH = 3), și amestecul de reacție este ușor agitat, timp de 3 h, la temperatura camerei. Solventul este îndepărtat la presiune redusă, și se adaugă MeOH la reziduu. Materialul insolubil este filtrat, și filtratul este concentrat la presiune redusă. Reziduul este purificat cu C₈fază inversă pe o coloană cromatografică cu silicagel pentru a se obține un amestec de Dgalactopiranozil-β (1,3)-2-brom-2-deoxi-D-glucopiranoză, compusul 29, (10 mg) și Dgalactopiranozil-β (1,3)-2-brom-2-deoxi-D-manopiranoză,compusul 30 (10 mg) în 76% produs. Produsele sunt acetilate cu Ac₂O și piridină în prezența unei cantități catalitice de DMAP pentru caracterizare.

(2) Halohidrarea cloroperoxidazei-catalizate a 2,3-dehidro- N-acetil acid neuraminic (compusul 35), (Schema 3)

Se adaugă 100 ml de H₂O₂ 30% la un amestec din compusul 34 [Meindl, HoppeSeyler’sZ.Physiol.Chem., 1350:1088 (1969); 50 mg, 0,17 mmol], KBr (102 mg, 0,857 mmol), și cloroperoxidază (200 unități) în soluție tampon de citrat (3,5 ml; pH=3), și amestecul de reacție este ușor agitat, timp de 30 min, la temperatura camerei. Solventul este îndepărtat

RO 118132 Β1

2095 la presiune redusă, și se adaugă MeOH la reziduu. Materialul insolubil este filtrat, și filtratul este concentrat la presiune redusă. Reziduul este purificat cu BioGel P-2 pe coloană și apoi purificat cu C₈- faza reversă, pe o coloană cromatografică cu silicagel, prin cromatografiere CH₃CN/H₂O (5:1) pentru a se obține acidul 2-brom-2-deoxi-N-acetilneuraminic (compusul 35, 43 mg, 65%). Produsul este paracetilat cu Ac₂O și piridină în prezența unei cantități catalitice de DMAP urmată de metilare cu Mei și Cs₂CO₃ pentru caracterizare.

¹H-RMN (CDCI₃) δ : 1,95, 2,04, 2,05, 2,10, 2,19, 2,20, (3H, s, fiecare, OAc și NHAc), 3,83 (3H, s, COOCH₃), 4,11 (1H, ddd, J = 8,7, 10,6, 10,7, Hz, H-5), 4,22 (1H, dd, J = 6,4, 12,5 Hz, H-9), 4,32 91H, dd, J-1,8, 10,6 Hz, H-6), 4,57 (1H, dd, J = 5,15 (1H, ddd, J = 2,4, 5,5, 6,4 Hz, H-8), 5,31 (1H, dd, J = 1,8, 5,5 Hz, H-7), 5,43 (1H, d, J = 8,7 Hz, NH), 5,67 (1H, dd, J = 3,8, 10,7 Hz, H-4), HRMS: calculat pentru C₂₂H₃₀NO₁₄BrCs (M + Cs⁺): 743,9904/746, găsit: 743,9900/746.

(3) 1,3,6,2',3',4',6'-heptaacetil-D-galactopiranozil-beta( 1,4)-2-brom-2-deoxiglicopiranoză (compusul 32) și -2-deoximano- piranoză (compusul 33)

Conform cu procedeul general, un amestec de 1:1 compus 32 și compus 33 (155 mg, 71%) este obținut din Gal β (1,4) Glucal (compusul 31) (96,5 mg). Raportul dintre compușii 32 și 33 a fost determinat de raportul integral al protonilor anomerici ai compușilor 32 și 33. Compușii 32 și 33 sunt obținuți ca un amestec anomeric α : β și anume compusul 32 (α:β=1:3), compusul 33 (α:β=2:1).

HRMS al compusului 32 și al compusului 33: calculat pentru C₂₆H₃₅O₁₇BrCs (M+Cs⁺): 831,0112/833, găsit: 831,0112/833.

¹H-RMN al amestecului de compuși 32 și 33:¹H-MNR (CDCI₃) δ : 1,96, 1,97, 1,98, 1,981,2,03, 2,04, 2,05, 2,06, 2,070, 2,074, 2,075, 2,08, 2,12, 2,13, 2,132, 2,15, 2,16, ,2,166, (-OCH₃), 3,84 (dd, J = 1,6, 9,0 Hz, H-2 al Glu al anomerului β al compusului 32), 3,73-4,22 (m), 4,40 (dd, J = 2,2, 3,8 Hz, H-2 al anomerului a, compusul 33), 4,43-4,47 (m), 4,46 (dd, J = 1,0, 7,6 Hz), 4,55 (d, J = 8,0 Hz), 4,57 (dd, J = 1,6, 4,0 Hz, H-2 al anomerului a al compusului 33), 4,59 (d, J = 8,0 Hz), 4,93 (dd, J = 3,5, 5,1 Hz), 4,96 (dd, J = 3,5, 4,96 Hz), 4,99 (dd, J = 3,5, 10,5 Hz, H-3' al anomerului β al compusului 32), 5,03 (dd, J = 3,8, 8,8 Hz), 4,07-5,12 (m), 5,16 (dd, J = 8,0,10,5 Hz), 5,20-5,26 (m), 5,35-5,38 (m), 5,70 (d, J = 1,6, H-1 al anomerului β al compusului 33), 5,76 (d, j = 9,0 Hz, H-1) al anomerului β al compusului 32), 6,26 (d, J = 2,2 Hz, H-1 al anomerului a al compusului 33), 6,30 (d, J = 3,4 Hz, H-1 al anomerului a al compusului 32).

¹³C-RMN (CDCI₃) 20,52, 20,61, 20,65, 20,75, 20,80, 20,84, 20,88, 20,93, 46,27,

47,95, 48,13, 51,26, 60,77, 60,91, 61,08, 61,49, 61,67, 61,79, 62,04, 66,56, 66,62, 66,71,

66,75, 68,97, 69,03, 69,09, 69,14, 69,30, 70,68, 70,72, 70,75, 70,78, 70,82, 70,86, 70,91,

70,94, 70,98, 71,16, 71,73, 73,44, 73,68, 73,80, 74,13, 74,29, 76,32, 76,61, 89,77, 90,34,

92,98, 93,13, 100,84, 101,19, 101,45, 168,42, 168,45, 168,53, 168,92, 169,14, 169,22, 169,36, 169,59, 169,65, 170,08, 170,13, 170,16, 170,29, 170,36, 170,46.

(4) 1,3,6,2',3',4', 6'-heptaacetil-D-galactopiranozil-p( 1,3)-2-brom-2-deoxiglucopiranozăfcompusul 29) și -2- deoximano- piranoză (compusul 30)

Conform procedeului general, un amestec 1:1 (compușii 29 și 30) (66 mg, 76%) sunt obținuți din Gal β (1,3) Glucal (compusul 28) (38,6 mg). Compușii 29 și 30 sunt izolați prin cromatografie pe coloană prin silicagel (AcOEt/n-hexan, 5/2), ca amestec anomeric α:β; compusul 29 (α:β = 1:10), compusul 30 (α:β = 12:5.

Anomerul β al compusului 29 :¹H RMN (CDCI₃) δ : 1,98, 2,04, 2,07, 2,08, 2,09, 2,15, 2,17 (3H, fiecare, s, OAc x 7), 3,78 (1H, ddd, J = 1,8, 4,6, 9,7 Hz, H-5 al Glu), 3,85 (1H, t, J = 9,5 Hz, H-2 al Glu), 3,89 (1H, t, J = 7 Hz, H-5 al Gal), 3,96 (1H, t, J = 10,0 Hz, H-3 al

2100

2105

2110

2115

2120

2125

2130

2135

2140

RO 118132 Β1

Glu), 4,07 (1H, m, H-6 al Gal), 4,09 (1H, dd, J = 1,8, 12,4 Hz, H-6 al Glu), 4,13 (1H, dd, J = 7,0,11,1 Hz, H-6 al Gal), 4,25 (1H, dd, J = 4,6,12,4 Hz, H-6 al Glu), 4,89 (1H, d, J = 7,7 Hz, H-1 al Gal), 4,97 (1H, t, J = 9,6 Hz, H-4 al Glu), 5,03 (1H, dd, J = 3,4, 10,0 Hz, H-3 al Gal), 5,13 (1H, dd, J = 7,7, 10,0 Hz, H-2 al Gal), 5,36 (1H, d, J = 3,4 Hz H-4 al Gal), 5,75 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-1 al Glu).

HRMS: calculat pentru C₂₆H₃₅O₁₇BrCs (M+Cs⁺): 831,0112/833, găsit: 831,0112/833.

¹³C-RMN (CDCI₃) δ : 20,55, 20,64, 20,68, 20,71, 20,75, 20,96, 50,11, 60,93, 61,62, 66,73, 68,53, 68,96, 70,62, 70,82, 72,87, 77,21, 81,30, 92,86, 101,61, 168,03, 169,35, 170,13, 170,20, 170,36, 170,67.

Anomerul a al compusului 30 :¹H RMN (CDCI₃) δ: 4,24 (1H, bd, J = 3,0 Hz, H-2 al Man), 4,55 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1 al Gal), 5,01 (1H, dd, J = 3,4, 10,5 Hz, H-3 al Gal), 5,18 (1H, dd, J = 7,8, 10,5 Hz, H-2 al Gal), 5,32 (1H, t, J = 8,7, H-4 al Man), 5,39 (1H, dd, J = 1,0, 3,4 Hz, H-4 al Gal), 6,30 (1H, d, J = 3,0, Hz, H-1 al Man).

Anomerul β al compusului 30 :¹H RMN (CDCI₃) δ 4,45 (1H, dd, J = 2,0, 3,5 Hz, H-2al Man), 4,55 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1 al Gal), 5,01 (1H, dd, J = 3,4, 10,5 Hz, H-3 al Gal), 5,20 (1H, dd, J = 7,8, 10,5 Hz, H-2 al Gal), 5,30 (1H, t, J = 7,4 Hz, H-4 al Man), 5,39 (1H, dd, J = 1,0, 3,4 Hz, H-4 al Gal), 5,80 (1H, d, J = 2,0, Hz, H-1 al Man).

HRMS : calculat pentru C₂₆H₃₅O₁₇BrCs (M+C_s ⁺): 831,0112/833, găsit: 831,0110/833.

¹³C-RMN 20,57, 20,65, 20,76, 20,87, 20,95, 21,01,21,04, 48,21,60,98, 61,19, 62,01, 62,61, 66,75, 66,82, 68,43, 68,52, 70,71,70,88, 71,05, 72,03, 73,36, 74,74, 75,93, 77,23, 90,08, 92,80, 100,10, 100,24, 168,23, 169,13, 169,22, 169,73, 170,40.

(5) Sialil a (1,3) Gal β (1,4) [(Fuc a 1,3)]-2-brom-2- deoxiglucopiranoză (compusul 37a) și -2-brom-2-deoximanopiranoză (compusul 37b)

Conform procedeului general, un amestec de 1:1 compuși 37a și 37b (3,5 mg, 56%) este obținut din NeuAc (2,3) Gal β (1,4) [Fuc a (1,3)] glucal compusul 36 (5,5 mg). Raportul dintre compușii 37a și 37b este determinat de raportul integrat al protonilor metil, ai fucozei.

¹H-RMN al amestecului de compuși 37 a și 37 b : ¹H-RMN (D₂O) δ 1,17 (d, J = 6,0 Hz, CH₃ al Fuc), 1,18 (d, J = 6,0 Hz, CH₃ al Fuc) 1,80 (t, J = 12,7 Hz, H-3ax al NeuAc), 2,02 (s, NHAc), 2,75 (dd, J = 5,0, 12,7 Hz, H-3 eq al NeuAc), 3,45-4,13 (m), 4,48 (d, J = 8,0 Hz, H-1 al Gal), 4,49 (d. J = 8,0 Hz, H-1 al Gal), 5,0-5,04 (m), 5,18-5,22 (m), 5,38-4,42 (m).

Exemplul 8. Procedeul general de bromhidrare cu NBS

La o soluție de 1 mmol glucal într-un amestec de 3,6 ml CH₃ CN-1,5 ml H₂O se adaugă 1 mmol de N-bromsuccinimidă (NBS) la temperatura camerei. Reacția este continuată 3 h, la aceeași temperatură. Solventul este îndepărtat sub presiune redusă, și reziduul este cromatografiat pe silicagel în coloana de cromatografie. Produsele sunt transformate la peracetați cu piridină și anhidridă acetică în prezența unei cantități catalitice de 4-dimetilaminopiridină și purificate prin silicagel în coloana cromatografică pentru caracterizare.

(a) 1,3,6,2',3',4',6 '-heptaacetil-D-galactopiranozil-β (1,4)-2-brom-2-deoxiglucopiranoză (compusul 32) și -2-deoximanopiranoză (compusul 33)

Conform cu procedeul general, un amestec de compuși 32 și 33 1:2,5 (30 mg, 78 %) este obținut din Gal β (1,4) Glucal (compusul 31) (17 mg). Raportul compușilor 32 și 33 este determinat din raportul integrat al protonilor anomerici. Compușii 32 și 33 se obțin ca amestec anomeric α :β : compusul 32 (a : β = 3:5, compusul 33 (a : β = 5:2).

(b) Metil(5-acetamido-2,4,7,8,9-penta-O-acetil-3-brom-3,5-dideoxi-beta-D-eritro-Lmano-2-nonulopiranozonat (metil peracetil compus 35, compus 35a) și metil 5acetamido- 2,4,7,8,9-penta-O-acetil-3-brom-3,5-dideoxi a-D-eritro-L-gluco-2-nonulopiranozonat (compusul 35b)

Bromhidrarea chimică este susținută conform cu procedeul general și produsele sunt convertite la peracetați, urmată de esterificare cu iodură de metil în prezența unei cantități

RO 118132 Β1 echimolare de carbonat de cesiu pentru a se obține un amestec de compuși 35a și 35b (155 mg, 74%). Raportul de producere al compușilor 35a și 35b este determinat de raportul integral al protonilor de metilester.

¹H-RMN al compușilor 35a și 35b sunt în bună concordanță cu indicațiile prealabile.

Compusul 35b : ¹H-RMN (CDCI₃),0:1,90, 2,03, 2,08, 2,10, 2,12, 2,15, (3H, s, fiecare OAc și NHAc), 3,78 (3H, s, COOCH₃), 4,04 (1H, dd, J = 6,0, 12,4 Hz, H-9), 4,09 (1H, D, J = 10,0 Hz, H-3ax), 4,33 (1H, ddd, J = 10,0, 10,6, 10,7 Hz, H-5), 4,36 (1H, dd, J = 2,4, 12,4 Hz, H-9'), 5,10 (1H, ddd, J = 2,4, 6,0, Hz, H-8), 5,25 (1H, dd, J 0= 2,5, 10,7, Hz, H-6), 5,30 (1H, dd, J = 10,0, 10,6 Hz), H-4), 5,38 (1H, dd, J = 2,5, 6,1 Hz, H-7), 5,90 (1H, d, J = 10,0 Hz, NH).

Exemplul 9. Exprimarea Gal β 1,3/4 GIcNAc a 2,3 sialiltransferază

O exprimare de înaltă eficiență a Gal β 1,3/4 GIcNAc a 2,3 sialiltransferazei solubile este realizată în sistemul de exprimare virotic utilizând cDNA codificând fuzionarea proteinei dintre peptidă pre-insulinei ca semnal și domeniul catalitic al sialiltransferazei. cDNA codificând fuziunea proteinei a fost construită de Wen și colab., în vectorul plasmidă pGIRI99. [Huseh și colab., J. Biol.Chem. 261:4940(1986)]. Pentru a izola un fragment de ADN conținând întreaga secvență codificată, partea poziției unice a Eco-RI la capătul 3' și a himerei a fost mai întâi descompusă, legătura a fost modelată și astfel agenții de legătură sintetici conținând un Nhe în poziția 1 au fost fixați. Plasmida rezultată este extrasă cu Nhe 1 pentru a realiza fuziunea proteinei cDNA, și acest fragment este donat în unica poziție 1 a Nhe în pBlueBac, și vectorul în sistemul de transfer din expresia baculovirotică, sub controlul promotorului polipolihedrin baculovirotic (Invitrogen; San Diego, CA). Toate manipulările DNA recombinate sunt efectuate în condițiile recomandate de instrucțiunile fabricanților de enzime utilizând protocoale standard. [Sambrook și colab., Molecular Cloning-, A.Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (1989)].

Crearea baculovirusurilor recombinate este dată utilizând sistemul de exprimare MaxBac (Invitrogen) urmând exact protocoalele recomandate de fabricant. Mai pe scurt, plasmida și tipul de virus ADN sunt amestecate și utilizate pentru a transfecta celulele Sf-9 prin metoda fosfat de calciu. Virusul recombinant este produs prin transferul celulelor și difuzate (într-o cultură) într-un mediu de cultură, și se purifică repetat placa la limita de diluție. Diferite plăci donate izolate sunt analizate pentru abilitatea de a cauza secretarea a 2,3 NeuT într-un mediu de celule infectate prin testarea unei părți a mediului direct pentru a 2,3 NeuT privind activitatea acestuia, într-o probă de sialiltransferază. Substanța direct izolată care are cel mai înalt nivel al secreției a 2,3 NeuT, este desemnată a fi rBv2, 3ST, și este expandată la 500 ml prin infectarea unor celule Sf-9 proaspete; a2,3 NeuT ca activitate este probată utilizând o modificare a probei publicate cu 0,9 mM. Aceste manipulări sunt ilustrate schematic în schema 24 de mai jos.

2190

2195

2200

2205

2210

2215

2220

2225

RO 118132 Β1

Schema 24

2230

2235

2240

I

2245

SP6 PLS α-2,3 NeuT

PLS: proinsulin leader sequence

2250

IBIunt end and ligated with Nhe I linker

Nhe I Nhe I “ί-L-t-i----------------P

SP6 PLS a-2,3 NeuT

2255

Nhel pBlueBac vector

Nhel Nhel u j ~~ TJ

PLS a-23NeuT

Digested with Nhel

Ugation

2260

2265

NheI Nhe I u·^---—r—li

Exemplul 10. Gal β 1,3 GIcNAc β 1,3 Gal β 1,4 Glc ca acceptor

Pentru a produce o mare cantitate de a2,3 NeuT, rBv2, 3ST, se utilizează celule Sf-9 infectate în cultură monostrat, și producția în general, de 2-3 unități de a 2,3 NeuT activ

2270

RO 118132 Β1

2275 secretat de 10® celule infectate când crește în medii de Excell-400 (JRH Bioscience, Lenexa, KS). Unitățile de activitate (mmol/min) sunt definite prin multiplicarea probelor rezultate cu un factor 1,6 pentru a se obține activitatea V_max. Mediile condiționate de la rBv 2,3 ST- celule infectate sunt colectate la 72 h de la infectare și recombinatul a 2,3 NeuT este parțial purificat într-o singură treaptă prin cromatografiere. Trei litri de mediu conținând a 2,3 NeuT sunt filtrate și concentrate la aproximativ 250 ml în Amicon CH₂PRS sistem spiral echipat cu un S1Y10. Unitatea este apoi transmisă într-un procedeu de diafiltrare pentru a desăra supernatantul concentrat cu 3 vol.de 10 mM acid cacodilic, 25 mM NaCI, 25% glicerină, pH = 5,3 (soluția tampon A). Eșantionul este apoi aplicat la o coloană (2,5 x 17 cm) de SSepharose Fast Flow (Pharmacia) echilibrat cu soluția tampon A la un raport de curgere de 2 ml/min. După ce tot eșantionul a fost încărcat, coloana este spălată cu soluție tampon A până când OD₂₈₀ al efluentului coloanei redevine sau se reîntoarce la linia de bază (1,6 voi. coloană).

a 2,3 NeuT este apoi eluat din coloană cu 50 mM acid cacodilic, 1M NaCI, 25% glicerină pH= 6,5. Fracțiunile conținând a 2,3 NeuT sunt comasate și dializate pe timpul nopții (18 h) în contrast cu 1 I 50 mM acid cacodilic, 0,5 M NaCI, 50% glicerol, pH = 6,0 și apoi stocat la - 20°C.

Exemplul 11. Galactozilarea (a) LacNAc β Oalil (compusul 41; Schema 14)

Un amestec din compusul 40 [Lee și colab., Carbohydr.Res., 37:193(1974] (2,0 g, 7,65 mmol), Glc-1-P(2,74 g, 7,65 mmol), PEP (sare de K, 1,6 g, 7,65 μηιοΙ), NAD⁺(193 mg, 0,25 mmol), MnCI2.4H2O (79,2 mg, 0,4 mmol), MgCI2x6H2O (162,6 mg, 0,8 mmol), DTT (306 mg, 2 mmol), KCI (1,04 g, 15 mmol), NaN3 (20 mg, 0,31 mmol) și UDP (90 mg, 0,19 mmol) în soluție tampon HEPES (100 mM, pH = 7,5; 200 ml) este ajustat cu 10N și N NaOH, la pH=7,5 și enzimele, UDPGE (10 U), UDPGP (20 U), PK (100 U), GalT (5 U) și PPază (100 U) sunt adăugate la soluție. Amestecul este agitat ușor în atmosferă de Ar ,la temperatura camerei (25°C), timp de 5 zile. Amestecul este concentrat și cromatografiat pe silicagel, cu CHCI3-EtOAc-MeOH (5:2:2 la 5:2:3) pentru a se obține dizaharida, care este apoi purificată cu Sephadex G-25, cu apă, pentru a se obține LacNAc β Oalil (compusul 41) (1,7 g, 50%); ¹H RMN (D2O)5: 2,00 (3H, s, NHAc), 3,49 (1H, dd, J 7,84, 9,97 Hz, H-2 al Gal), 3,52-3,57 (1H, m, H-5 al GIcNAc), 3,63 (1H, dd, J 3,31, 10,04 Hz, H-3 al Gal), 3,65-3,75 (8H, m), 3,79 (1H, dd, J 5,10, 12,27 Hz, H-6a al GIcNAc), 3,88(1 H, br, d, J 3,32 Hz, H-4 al Gal), 3,95 (1H, dd, J 2,14, 12,27 Hz, H-6b al GIcNAc), 4,43 (1H, d, J 7,81 Hz, H-1 al Gal), 4,55 (1H, d, J 8,28 Hz, H-1 al GIcNAc), 5,21-5,29 (2H, m, alilic), 5,83-5,90 (1H, m, alilic), ¹³C RMN (D₂O) δ : 22,6, 55,5, 60,5, 61,5, 69,0, 70,9, 71,4, 72,9, 75,2, 75,8, 78,8, 100,4, 103,3, 118,6, 133,7.

(b) De la schema 15, compusul 1 - ¹³C-41

O soluție din compusul 40 (1,15 g, 4,4 mmol), 1 - ¹³C-Gal (99% procent atomic, produsă de Isotec Inc. Miamisburg, OH; 800 mg, 4,4 mmol) sare de potasiu a PEP (1,82 g, 8,8 mmol; 95 procente), UDP (90 mg, 0,19 mmol), ATP (100 mg, 0,18 mmol), cisteină (116 mg, 0,96 mmol), DTT (183 mg, 1,2 mmol), MgCI2 6H2O (244 mg, 1,2 mmol), MnCI2.4 H2O (118 mg, 0,6 mmol), KCI (179 mg, 2,4 mmol) și Glc-1-P-(77 mg, 0,22 mmol) în HEPES soluție tampon (100 mM, pH=7,5; 120 ml) este ajustată cu 10 N și N NaOH la un pH = 7,5 și enzimele, GK (10 U), PK (200 U), PPaze (10 U), Gal-1-Ρ UT (10 U), UDPGP (10 U) și GalT (10 U) sunt adăugate soluției. Amestecul este ușor agitat în atmosferă de argon, la temperatura camerei, circa 25°C, timp de 3 zile. Amestecul este concentrat în vacuum și reziduul este cromatografiat pe silicagel, cu EtOAc-MeOH (2:1), pentru a se obține o dizaharidă, care este mai departe purificată cu o coloană de Sephadex G-25, cu apă, pentru a se obține compusul 1-¹³C-41 (106 g, 57%). ¹H RMN (D2O) δ : 2,00 (3H, s, NHAc), 3,482280

2285

2290

2295

2300

2305

2310

2315

2320

RO 118132 Β1

3,52 (1H, m, H-2 al Gal), 4,43 (1H, dd, J^, h.₂,₈,₃₂, 162,33 Hz, H-1, al Gal), 4,54 (1H, d, J 8,32, Hz„ H-1 al CIcNAc). HRMS: calculat pentru ^C^’CH^NO^NaiM+Na*): 447,1672, găsit: 447,1681.

(c) 2-deoxi-D-galactopiranozil-b(1,4)-2-acetamido-2-deoxi-glicopiranoză (compusul 41b) (36 procente): ambele spectre ¹H RMN al heptaacetatului și spectrul ¹³C RMN al compusului 41a sunt în bună concordanță cu cele raportate [Thiem și colab., Angew. Chem. Int. Ed.Engl., 30:1163(1991)].

(d) 2-amino-2-deoxi-D-galactopiranozil-b( 1,4)-2-acetamido-2-deoxi-glucopiranoză (compusul 41b) (12 procente): ¹H RMN pentru sarea HCI (D₂O) δ: 2,02, 2,024 (sNHAc al anomerului a și β al GIcNAc), 3,17-3,23 (1H, m, H-2 al GaIN), 4,67 (d, J 7,53, Hz, H-1b, al GIcNAc), 5,13 (d, J 1,54 Hz, H-lb al GIcNAc), HRMS: calculat pentru C₁₄H₂₆N₂O₁₀Na (M+Na⁺): 405,1485, găsit: 405,1489. ¹H RMN al acetatului său este în bună concordanță cu cele raportate. [Palcicși colab., Glycobiology, 1:205 (1991)].

(e) Etil D-galactopiranozil-b(1,4)-2-azido-2-deoxi-D- glucopiranozidă (compusul 41c) în acest caz DTT este eliminat deoarece grupa 2-azidă este redusă la amina corespunzătoare cu DTT. (15 procente): ¹H RMN anomerul β (D₂O) δ: 1,22 (1H, t, J 7,80 Hz, OCH₂CH₃), 3,27 (1H, J 8,33, 9,64 Hz, H-2 al Glc N₃), 4,40 (1H, d, J 7,81 Hz, H-1 al Gal),

4.55 (1H, H, 8,24 Hz, H-1 al GlcN₃), HRMS: calculat pentru C₁₄H₂₅N₃O_1QNa (M+Na⁺): 418,1438, găsit: 418,1438.

Acceptorul, etil 2-azido-2-deoxi-D-glucopiranozidă este preparat după cum urmează: triacetil-D-glucal este azidonitrat [Lemieux și colab., Can.J.Chem.57:1244(1979)] [NaN₃ și Ce(NH₄)₂(NO₃)₆ în CHjCN] și acetolizat (NaOAc în AcOH) pentru a da 2-azido-1,3,4,6-tetraO-acetil-2-deoxi-D-glucopiranoză, care este tratată cu TiBr₄ în CH₂CI₂ și EtOAc, dând un brom glicozil, care glicozilat cu EtOH în prezența AgOTf și MS 4Â în CH₂CI₂ pentru a da după O-deacetilare cu NaOMe în MeOH, etil-2-azido-2-deoxi-D-glucopiranozidă (22 procente întreaga producție) sub forma unui amestec de a și β 1:1,5.¹H RMN (D₂O) δ : 1,21 (t, J 7,80 Hz, OCH₂CH₃ al anomerului β), 1,22 (t, J 7,80 Hz, OCH₂CH₃), 2,99 (DD, J 7,43, 9,83 Hz, H-2 al anomerului β), 5,11 (d, J 3,58, Hz, H-1 al anomerului a), HRMS: calculat pentru C₈H₁₅N₃O₅Cs(M+Cs⁺): 366,0066, găsit: 366,0666.

Exemplul 12. Sialilarea. (Schema 16, compusul 42) (a) Compusul 42

O soluție a compusului 1-¹³C-41 (210 mg, 0,50μΠΊθΙ) NeuAc (160 mg, 0,52 ^mol), PEP Na3 sare (120 mg, 0,51 mmol), MgCI2.6H2O (20 mg, 0,10 mmol), MnCI2.4H2O (4,9 mg, 0,025 mmol), KCI (7,5 mg, 0,10 mmol), CMP (16 mg, 0,05 mmol), ATP (2,7 mg, 0,005 /zmol) și mercaptoetanol (0,34 ml) în soluție tampon HEPES (200 mM, pH=7,5; 3,5 ml) este ajustată cu NaOH, la pH=7,5 și apoi se adaugă la soluție enzimele, NMK (5 U), PK (100 U), PPază (10 U), CMP-NeuAc sintetază (0,4 U) și a 2,3 SiaT (0,1 U). Amestecul este agitat ușor sub atmosferă de Ar, la temperatura camerei (25°C) ,timp de 3 zile. Amestecul este concentrat și reziduul este cromatografiat pe silicagel, cu EtOAc-iPrOH-H2O (2:2:1), pentru a da o trizaharidă, care este apoi purificată cu BioGel P-2, cu apă, pentru a se obține compusul 42 (88 mg, 24 procente) ¹H RMN (D2O) d 1,81 (1H, br t, J 12,02 Hz, H-3ax al NeuAC), 2,04 (6H, s, NHAc al GIcNAc și NeuAc), 2,76 (1H, dd, J 4,57, 12,33 Hz, H-3eq al Neu Ac), 3,96 (1H, br, d, J 3,10 Hz, H-4 al Gal), 4,13 (1H, dd, J, 3,09, 9,94 Hz, H-3 al Gal),

4.56 (1H, dd, J_H.., _H.₂ 7,83, _13c 162,78 Hz H-1 al Gal), 4,58 (1H, d, J 8,32 Hz, H-1 al

GIcNAc), HRMS: calculat pentru C₂₇H₄₄N₂O₁₉CS2 (M-H⁺ + 2Cs⁺): 980,0759, găsit: 980,0720.

RO 118132 Β1 (b) NeuAc a 2,3'Lactal (compusul 43, 82 mg) ¹H RMN (D₂O, 320°K) δ : 1,84 (1H, br, t, J 12,18, Hz, H-3eq al NeuAC), 2,08 (3H, s, NHAc, al NeuAc), 2,82 (1H, dd, J 4,46, 12,32 Hz, H-3eq al NeuAc), 4,01 (1H, br, d, J 2,50 Hz, H-4 al Gal), 4,16 (1H, dd, J 2,50, 9,50 Hz, H-3 al Gal), 4,43 (1H, dt, J 1,18, 6,46 Hz, H-3 al Glucal), 4,65 (1H, d, J 7,86 Hz, H-1 al Gal), 4,88 (1H dd, J 2,63, 6,07 Hz, H-2 al GlucAI), și 6,51 (1H, dd, J 1,45, 6,08 Hz H-1 al Glucal). HRMS: calculat pentru C₂3H₃₅NO₁₇NaCs2 (MH⁺+2Cs⁺): 864,0092, găsit: 864,0066.

Exemplul 13.

(a) Fucozilarea (Schema 17). Compușii 44, 45 și 46

O soluție de FucT (0,02 U; 2 ml) este adăugată la o soluție a compusului 42 (23 mg, 0,031 mmol) și GDP-Fuc (ichikawa și colab., J.Org.Chem.,) (24 mg, 0,036 mmol) în soluție tampon HEPES (3 ml; 200 mM, pH = 7,5) conținând 5 mM ATP, 20 mM Mn²⁺. Amestecul este agitat ușor sub atmosferă de argon, timp de 5 zile, la temperatura camerei (25°C). Un rezultat similar s-a obținut utilizând o soluție conținând compusul 42 (23 mg, 0,031 mmol) și GDP-Fuc (70 mg, 0,105 mmol) în soluție tampon HEPES (1 ml, 200 mM, pH = 7,4) conținând Mn²⁺ (20 mM și un a 1,3FucT soluție (0,01 U) care este manipulată similar. Amestecul este concentrat și cromatografiat pe silicagel, cu EtOAc-iPrOH-H₂O (2:2:1), pentru a se obține o tetrazaharidă, care este mai departe purificată cu BioGel P-2, cu apă. Eluantul este trecut printr-o coloană cu Dowex 50W-X8[H⁺], eluat cu apă, pentru a îndepărta cationul Mn²⁺, este neutralizat cu NaOH soluție normală, și liofilizat pentru a se obține compusul 44 (18 mg); similar, sunt preparați compusul 45 (42 mg) și compusul 46 (51 mg).

Compusul 44:¹H RMN (D₂O) δ : 1,11 (3H, d, J 6,61 Hz, 6-CH₃ al Fuc), 1,73 (1H, br t, J 12,04 Hz, H-3ax al NeuAc), 1,96 (3H, s, NHAc al GIcNAc), 1,97 (3H, s, NHAc al NeuAc), 2,69 (1H, dd, J 4,52, 12,38 Hz, H-3eq al NeuAc), 3,46 (1H, dt, J 7,00, 9,68 Hz, H-2 al Gal), 3,71 (1H, br d, J 3,00, Hz, H-4 al Fuc), 4,02 (1H, dd, J 2,94, 9,78 Hz, H-3 al Gal), 4,46 (1H, dd, J₁₂ 7,90, J_13cH 162,13 Hz, H-1 al Gal) 4,52 (1H, d, J 8,41, Hz, H-1 alGIcNAc), 5,04 (1H, d, J 3,98 Hz, H-1 al Fuc).

Compusul 45:¹H RMN (D₂O) δ : 1,17 (3H, d, J 6,61 Hz, 6-CH₃ al Fuc), 2,03 (3H, s, NHAc al GIcNAc), 3,50 (1 H,ddd, J 6,47, 7,86, 9,86 Hz, H-2 al Gal), 3,80 (1H, br d, J 2,88 Hz, H-4 al Fuc), 4,46 (1H, dd, J₁₂7,79, J_13C._H H₁₆₁₄₅ Hz, H-1 al Gal), 4,59 (1H, d, J 8,44 Hz, H-1 al GIcNAc), 4,84 (1H, brq, J 7,50 Hz, H-5 al Fuc), 5,11 (1H, d, J 3,90 Hz, H-1 al Fuc).

Compusul 46:Ή RMN (D₂O la 320°K) δ : 1,11 (3H, d, J 6,61 Hz, 6-CH₃ ai Fuc), 1,84 (1H, brt, 12,00 Hz, H-3ax al NeuAc), 2,08 (1H, dd, J 4,52, 12,38 Hz, H-3eq al NeuAc), 4,49 (1H, br q, J 7,50 Hz, H-5 al Fuc), 4,64 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1 al Gal), 5,02 (1H, dd, J 2,5, 6,0 Hz, H-2 al Glucal), 5,09 (1H, d, J 3,98 Hz, H-1 al Fuc), 6,51 (1H, dd, J 1,5, 6,0 Hz, H-1 al Glucal).

(b) Gal β 1,4 (Fuc a1,3)-(5-tio)Glc

O soluție de Gal β 1,4(5-tio)Glc (30 mg, 84 mmol), GDP-Fuc (60 mg, 84 mmol) și a 1,3/4 FucT (0,5 U) în soluție tampon de cacodilat de sodiu (5,4 ml 50 mM, pH=6,2) conținând 5 mM ATP și 20 mM MnCI₂ este agitată 2 zile, la temperatura camerei. Valoarea R, a materiei prime și a produsului este 0,39 și respectiv 0,31 în EtOAc/AcOH/H₂O 3:2:1 pe silice TLC. Amestecul de reacție este aplicat direct la o coloană Sephadex G-25 Superfine (1,5 x 30 cm), și eluat cu apă. Fracțiunile conținând produsul sunt comasate și trecute succesiv prin coloanele de QAE-Shepadex și Dowex 50-XB (H⁺) cu apă. Efluentul este comasat și liofilizat (21 mg).¹H RMN (D₂O, 20°C δ : 1,13 (3H, d, J=6,7 Hz, 6-CH₃ al Fuc), 3,40 (1H, dd, J=6,4 și 11,7 Hz), 3,60 (1H, dd, J=3,6 și 11,7 Hz), 4,52 (1H, d, J = 7,9 Hz), 4,95 (1H, J = 2,6 Hz), 5,34, (1H, d, J = 3,8 Hz).

2370

2375

2380

2385

2390

2395

2400

2405

2410

2415

RO 118132 Β1

Exemplu! 14. Studiul cinetic al enzimelor (a) Pentru FucT

Procedeele de verificare sau de probe sunt esențial aceleași cu cele descrise anterior [Fukowska-Latallo și colab., Gene & Development, 4: 1288 (1990] cu aceleași modificări. Un amestec conținând 0,25 mM GDP-¹⁴C-Fuc (5000 cpm/ml), 6,25 mM ATP, 25 mM MnCI₂ și 62,5 mM soluție tampon de cacodilat de sodiu, pH = 6,2 este amestecat cu gheață proaspătă și menținut în gheață. La această soluție, se adaugă FucT imediat înainte de utilizare, și reacția este inițiată prin combinarea a 16 μ\ din acest amestec și 4 μΙ din 100 mM din acceptor (soluția total incubată este 20 μ\). Incubare este menținută la 37°C, timp de 30 240 min depinzând de acceptorul aflat în studiu. Probele separate din absența acceptorului sunt utilizate pentru a corecta hidroliza GDP-Fuc. După completa incubare, se adaugă 400 μ\ dintr-o suspensie 25% (v/v) QAE-Shephadex. Această suspensie este amestecată ușor la temperaura camerei, timp de 10 min înainte de centrifugare la 13,00 rpm, timp de 1 min. Din fluidul supernatant, 200 μ\ sunt extrase și amestecate cu 10 ml amestec de scintilație. Radioactivitatea este măsurată cu un numărător de particule. Sunt introduse cu grije mai puțin de 10 procente din amestecul de reacție enzimatică care au loc peste perioada de incubare. Aceste probe se pot desfășura în absența ATP.

(b) Pentru GalT

Viteza inițială a reacției enzimei este determinată prin măsurarea cantității de LacNAc formată cu o ușoară modificare a probei de către Pierce și colab. [Pierce și colab., Anal. Biochem., 102:441 (1980]. Toate reacțiile sunt realizate în 100 mM de soluție tampon de cacodilat (pH = 7,5) cu fixarea concentrației Mn²⁺ (9,2 mM) și UDP-Gal (0,1 mM; 58,5 cpm/pmol al UDP-¹⁴C-Gal), în loc ml de soluție. Reacția este inițiată prin adiția GalT (0,05 U, 120 mg proteină; de la Sigma), și permite să stea la 20°C, timp de 30 min. Hidroliza nespecifică a UDP-Gal este măsurată prin reacția de control în absența GalT. Reacția este oprită prin trecerea printr-ο coloană de QAE-Sephadex (700 ml), și eluție prin presiunea slabă a aerului pentru a îndepărta UGP-Gal nereacționat. Amestecul de reacție este clătit de două ori cu 400 ml apă de fiecare dată, și se trece printr-o coloană cu rășină. Filtratul este colectat și transformat direct într-o scintilație vial. Fluidul scintilat este adăugat la vial, și apoi radioactivitatea este măsurată printr-un contor de măsurare a scintilației lichidului. Datele sunt analizate de un plot dublu recioproc pentru a obține K_m (1,5 mM pentru GIcNAc) [o valoare de 1,3 ± 1 mM este raportată de Palcic și colab., Carbohydr.Res., 159:315(1987)] și Kj (0,46 ± 0,06 mM pentru UDP. Similar, IC₅₀ ca valoare a UDP pentru GalT este determinată utilizând concentrații diferite ale UDP.

Exemplul 15. CDP-Fuc generând enzima utilizată în Schema 19 (a) Prepararea enzimei (GDP-Fuc S)

Bacteria, Klebsiella pneumonia, ATCC 12658 este introdusă în 2 I mediu conținând 10 g de acid casamino (Difco), 5 g extract de drojdie 3 g K₂HPO₄, 1 g KH₂PO₄ și 5 g Dglucoză la litru (pH = 7,0). După incubare la 37°C, timp de 18 h, celule sunt adunate prin centrifugare (10,000 x g, 50 min, 4°C) și resuspendate în 5 mM soluție tris tampon conținând 0,5 mM DTT. Celulele sunt rupte, sfărâmate într-o presă French la 16,000 1 b/in. Detritusurile celulare sunt îndepărtate prin centrifugare la 23,00 x g, timp de 60 min și supernatantul (celula extrasă liber) este utilizat pentru purificarea enzimei. Extractul de celulă liberă (50 ml) pentru 2 I de cultură este tratat cu 60 mg sulfat de protamină și precipitatul rezultat este îndepărtat după centrifugare. Apoi, se adaugă sulfat de amoniu solid cu agitare ușoară la 70 procente când saturarea este atinsă (0,436 g/ml la 0°C. După centrifugare, precipitatul este colectat și resuspendat în 20 ml soluție tampon (50 mM tris conținând 0,5 mM DTT, pH=7,5) și apoi dializat întreaga noapte la 4°C în 4 I din aceeași soluție tampon.

RO 118132 Β1

2470

Restul de soluție (20 ml) este trecută printr-o coloană DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) (3 x 30 cm) preechilibrată cu aceeași soluție tampon. Enzima este eluată cu un gradient liniar de NaCI de la 0-1 mM în aceeași soluție tampon (total 400 ml). Fracțiunile active sunt comasate și dializate în 2 I de 50 mM tris soluție tampon conținând 0,5 mM de DTT (pH = 7,5). Aceste preparate de GDP-Fuc S enzimă este utilizat pentru prepararea GDP-Fuc. Activitatea este estimată la cca. 0,05 U/ml bazat pe IPLC și probele de oxidare a NADH.

(b) Prepararea enzimatică și regenerarea GDP-Fuc din Man-1-Ρ

Schema 19

O soluție de imidazol (10 mM), Man-1-Ρ (10 mM), GDP (10 mM), PEP (10 Mm), KF (5 mM), Mg²⁺ (10 mM ), KCI (20 mM), NADP (2 mM), EDTA (6 mM), iPrOH (2%), PK (80 U), TBDH (32 U), celule de drojdie de bere (S.cerevisiae, 52 mg, înghețat-uscate în 50 mM tris soluție tampon, pH = 7,5) GDP-Fuc S enzime generată (400 ml) în HEPES soluție tampon (pH = 7,5) (volumul total al soluției 2 ml) este incubată la 37°C sub atmosferă de argon, timp de 18 h.

Se utilizează o coloană partisil HPLC 5 SAX (Whatman Co.), 0,46 x 12,5 cm, cu particula de 5 mm dimensiune. Faza mobilă este 0,1 M soluție tampon fosfat (pH = 3,5) cu o viteză de curgere de 0,5 ml/minut. (Presiune 42 kgf/cm² 600 psi). Compușii sunt detectați cu un detector UV la 254 nm. Timpii de retenție pentru GDP-Man și GDP-Fuc sunt 9,92 și 13,4 min, GDP-Fuc (5 procente) și GDP-Man (30 procente) sunt formați pe baza analizelor HPLC.

O soluție din compusul 41 sau 42 (10 mM în 2 ml HEPES soluție tampon pH = 7,5, conținând 5 mM ATP și 20 mM MnCI₂) se adaugă apoi și amestecul este agitat 5 zile. TLC pe placă cu silicagel: R, = 0,28 pentru compusul 45 și 0,50 pentru compusul 41 cu EtOAc: AcOH:H₂O = 4:2:1 (v/v) și 0,56 pentru compusul 44 și 0,63 pentru compusul 42 cu 1M NH₄OH : iPrOH = 1:2,4 (v/v). Compușii 45 și 44 (8 și 4 fiecare) sunt izolați și purificați așa după cum se descrie mai sus.

Exemplul 16. Purificarea GDP-fucozei pirofosforilază pentru a se utiliza în schema 20 (a) Prepararea enzimei

Ficat de porc (4 kg) este omogenizat în gheață 10 mM MOPS, la pH = 7,5, cu 1 mg/ml antipatin, aprotinin, chimosatin, leupeptin și pepstatin, din fiecare câte 1 mg/ml, întrun amestecător Waring (15 s). Rămășițele de celule sunt îndepărtate prin centrifugare la 8,000 x g, timp de 20 min, la 4°C. La fracțiunea de supernatant de 1 I se adaugă 2% soluție sulfat de protamină. Amestecul este agitat 5 min, și precipitatul îndepărtat prin centrifugare ca mai sus. Se adaugă ușor sulfat de amoniu solid la fracțiunea supernatantului la o saturație de 50% (0,291 g/ml la 0°C). După centrifugarea descrisă ca mai sus, precipitatul este colectat și resuspendat în 1600 ml 1,2 M sulfat de amoniu.

Proba este amestecată cu fenil Sepharose (250 ml) care a fost echilibrată în 1,2 M sulfat de amoniu. Rășina cu enzima legată este spălată cu 1,2 M sulfat de amoniu (1,5 I) și enzima activă eluată cu 0,4 M sulfat de amoniu (750 ml). Procesul este repetat până când majoritatea enzimei active este îndepărtată din probă. O porțiune din fenil Sepharose eluată este (200 ml) dializată din nou cu 10 mM MOPS, pH = 7,5 și trecută printr-o coloană cu DEAE 5PW (15 cm x 21,5 mm) echilibrată în aceeași soluție tampon. Enzima activă este observată în materialul care curge din coloană, și este concentrată de exemplu printr-un filtru Amicon.

Proba este aporsupusă filtrării printr-o coloană cu TSK Gel 3000 SW9 (30 cm x 21,5 mm) echilibrată în 50 mM MOPS, pH=7,5 cu 150 mM KCI. Fracțiunile active sunt colectate și stocate împreună cu 50% sulfat de amoniu. După purificare, GDP-Fuc pirofosforilază este

2475

2480

2485

2490

2495

2500

2505

2510

RO 118132 Β1 supusă probei conform metodei lui Ishihara and Health Ishihara și colab., J.Biol.Chem., 243:1110(1968)]. O unitate de acțiune sau activă este definită prin încorporarea a 1 mmol de ³²P-pirofosfat anorganic în GTP per minut.

(b) Regenerarea GDP-fucozei, folosirea GDP-fucozei pirofosforilază, schema 20. Sintezele Sialyl-Lewis-X

O soluție de MOPS, pH = 7,5 (50 mM), Fuc-1-Ρ (10 mM), GDP (1 mM), PEP (10 mM), KF (5 mM), Mg²⁺(10 mM), Mn²⁺ (10 mM), PK (5 U), sialil-(3H)-LacNAcȘ-O(CH₂)₆CO₂Me (10 mM), a 1,3 FucT (0,1 U), pirofosfatază anorganică (5 U), și GDP-Fuc pirofosforilază (0,1 U) sunt amestecate într-un volum de 100 ml. Amestecul de reacție este incubat pe un tub ce se rotește, la temperatura camerei, timp de 60 h. Producția este colectată pe o coloană cu Sep-Pac C18 și eluată cu 50% metanol. Proba este uscată și evaporată sub presiune redusă, resuspendată în apă și analizată în strat subțire prin cromatografie în strat subțire pe placa de silicagel cu izopropanol/1 M acetat de amoniu (6:1) ca solvent. Sialil Lewis -x este format cu un randament de 30% cum s-a determinat prin măsurarea scintilației.

Exemplul 17. (2R)-metil-(5S)-hidroximetil-(3R, 4R)-dihidroxipirolidonă; (compusul50)

A. Cis-2,3-epoxi-1,4-butan-diol

C/s-2,3-epoxi-1,4-butan-diol este preparat din 1,4-dihidroxi-2-butenă, conform cu procedeul raportat [Nelson și colab., J.Med.Chem. 10:153(1976)] cu excepția că reacția este menținută la temperatura camerei, timp de 36 h.

B. 2-azido-2-deoxi-threitol

O soluție conținând c/s-2,3-epoxi-1,4-butan-diol (1,82 g, 17,50 mM), sodiu azidă (NaN₃) 5,68 g, 5 echivalenți), și NH₄CI (4,68 g 5 echivalenți) în 100 ml metanol și 12 ml H₂O este încălzită la reflux 24 h. Solventul este îndepărtat sub presiune, apoi etanolul este adăugat și precipitatul este filtrat. Procedeul de precipitare este repetat de câteva ori pentru a îndepărta excesul de NaN₃ și NH₄CI, obținându-se 2-azido-2-deoxi-treitol sub formă de lichid galben (90%, R₁ = 0,28, EtOAc 100 procente); infraroșu 2109 cm’¹ (-N3); ¹H RMN (CD3COCD₃) δ: 3,49 (1H, m), 3,59 (3H, m), 3,79 (5H, m), 4,03 (1H, t, J = 5,5 Hz), 4,19 (1H, d, J = 5,5), 4,30 (1H, t, J = 5,5 Hz) ppm. HRMS (M+H⁺) calculat: 148,0722, găsit: 148,072.

C. 5-azido-5-deoxi-L-xilo-hexuloză-1-fosfat

O soluție conținând 2-azido-2-deoxi-treitol preparată mai sus (476 mg, 3,24 mM) în 10 ml H₂O este răcită la 0°C și se adaugă NaO₄ (762 mg, 1,1 echivalent). După 10 min, materia primă se dispersează complet și dispare apărând o pată ca un strat subțire cromatografie (R₁ = 0,5, acetat de etil). Se adaugă apoi BaCI₂x2H₂O (870 mg, 1,1 echivalent) la soluție și precipitatul este filtrat. Soluția este acidulată la pH = 1 cu Dowex 50 (H⁺). 2azido-3-hidroxipropionaldehida racemică, astfel preparată nu este izolată.

După filtrare, soluția conținând amestecul racemicul este ajustată la un pH = 7 cu hidroxid de sodiu (NaOH 10 N). Apoi, a fost adăugată dihidroxi aceton fosfat (1,5 milioane) și soluția a fost reajustată la pH =7 cu NaOH 10 normal. Se adaugă apoi dihidroxiacetonăfosfat (1,5 mmol) și soluția este adusă la pH = 7 cu NaOH 10 N. La această soluție, FDP aldolaza din mușchiul de șobolan este adăugată (500 U) și soluția este agitată ușor, timp de 2 zile. Proba enzimatică indică aceea că întregul DHAP a fost consumat.

Compusul din litiu este mai întâi izolat ca sare de bariu prin adiția a doi echivalenți de BaCI₂.2H₂O la amestecul de reacție. Soluția este menținută la - 20°C pe timpul nopții (circa 18 h). Precipitatul este recuperat, și tratat cu Dowex 50 (H⁺) în apă distilată pentru a îndepărta cationii de bariu. După filtrare, soluția este adusă la un pH = 7 și liofilizată pentru a obține compusul purificat din titlu (75 %).¹H RMN (D₂O) δ : 3,13 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3), 3,14 (1H, ddd, J = 9,5, 5,11 Hz, H-5), 3,20 (1H, t, J = 11 Hz, H-6a), 3,31 (1H, t, J = 9,5 Hz,

RO 118132 Β1

H-4), 3,37 (1H, dd, J = 6,11 Hz, H-6e), 3,40-3,44 (2H, m, 2 x H-1) ppm. ¹³C-RMN (D₂O) δ : 61,78, 63,36, 67,35, 70,95, 97,67, (d, J = 9,5 Hz) ppm, HRMS (M-4H⁺ + 5 Na⁺): calculat: 395,9540, găsit: 395,9538.

D. O soluție de 5-azidă-5-deoxi-L-xilo-hexuloză-1-fosfat (100 mg, 0,35 mmol) în 5 ml apă este hidrogenată cu 20 mg 10% Pd/C sub presiune de hidrogen de 2,8 kgf/cm²(40 psi), timp de o zi. Catalizatorul este recuperat prin filtrare și filtratul este concentrat în vacuum. Reziduul este cromatografiat în coloană cu silicagel (metanol: cloroform: apă = 6:4:2). Pentru a se obține compusul 50 (40 mg, 78% produs), 2R:2S = 6:1).¹H RMN (D2O) δ : 1,31 (3H, d, J = 7 Hz, 2R - CH3), 1,27 (3H, d, J - 6,5 Hz, 2S-CH3), 3,36 (1H, m, H-2), 3,66 (1H, m, H-5), 3,74 - 3,81 (2H, m, 2 x H-5), 3,85 (1H, m, H-3), 4,08 (1H, dd, J=2,5,4,5 Hz, H-4), ppm; ¹³CRMN (D2O) δ 16,58 (C-2'), 57,90 (C-5*), 61,50, 63,44, 75,62, 87,09 ppm, HRMS (M + H⁺): calculat: 148,0974, găsit: 148,0974.

Exemplul 18. Prepararea FucT ca inhibitor (compușii 51 - 53)

Compușii inhibitori 51 - 53 au fost preparați în general așa cum se descrie în schema 25 de mai jos :

2565

2570

2575

2580

Schema 25 <S)-M \

OHO (RJ-M

2585

2590

2595

Pentru sintezele compușilor 51-53 sunt alese azido-aldehidele (S)-54 și (R)-54 ca acceptori pentru reacțiile de aldolază catalizată cu dihidroxiacetonă fosfat (faza a: fuculoză 1-fosfat aldolază; faza b: fructoză 1,6-difosfat aldolază din mușchiul de șobolan, pentru a forma fosfații intermediari care sunt mai întâi tratați cu fosfatază acidă și apoi aminare reductivă (faza c:H₂/Pd-C, 3,5 kgf/cm², 50 psi) pentru a forma produsul final care conține două centre adiționale chiral în pozițiile 3- și 4-,

Compușii (S)-54 și (R)-54 sunt preparați din 2-butin-1 -ol prin reacție cu Lindlar drept catalizator, urmată de epoxidare și deschizând azida pentru a prevedea pozițiile respective de azidodioli 2- și 3-ena enantiomeri, în raportul 6:1. Descompunerea 2-azidodiol este susținută utilizând o lipază din Pseudomonas sp_L și vinii acetat ca agent de acilare (Wang și colab., J.Org.Chem.,53:3127 (1988); Wang și colab., J.Am.Chem Soc., 110:7200 (1980)), pentru a se obține (2R, 3S)-2-azido-3-hidroxi-4-acetat și (2S, 3R)-2-azido-3,4-diacetat de mare puritate optică determinată prin ¹H RMN în prezența Eu (hfc)₃. Azidohidroxiacetatul purificat și azidodiacetatul sunt separat hidrolizați pentru a forma diolii respectivi care apoi sunt desfăcuți prin oxidare cu periodat de sodiu pentru a forma compușii cu formulele (S)-54 și (R)-54.

2600

2605

2610

RO 118132 Β1

Datele fizice pentru compușii 51 - 53 sunt prevăzute mai jos.

53: (a)_D ²⁵ + 21,8° (c = 1,0, CH₃OH); Rf = 0,20 (CHCI₃/CH₃OH/H₂O/NH₄OH = 5/4/1/0,08); Ή RMN (500 Mhz, CD₃OD/TMS): δ 1,140 (3H, d, J = 6 Hz, CH₃), 2,34 - 2,45 (1H, m, CHN), 2,47 - 2,55 (1 H, m, CHN), 3,656 (1Hm, dd J = 4 Hz, și 11 Hz, Ch_aO), 3,744 (1H, dd, J = 5 Hz și 11 Hz, Ch_bO), 3,876 (1H, dd, J = 5 Hz, și 5 Hz, CHO), 4,268 (1H, dd, J = 5 Hz și 8 Hz, CHO). ¹³C RMN (125 Mhz, CD₃OD): δ 12,98, 60,56, 65,24, 70,95, 72,14, 73,88, HRMS (M + H⁺), calculat: 148,0974, găsit: 148,0968.

: (a)_D ²⁵ + 22,7° (c = 1,2, CH₃OH); Rf = 0,19 (CHCI₃/CH₃OH/H₂O/NH₄OH = 5/4/1/0,08); Ή RMN (500 Mhz, CD₃OD/TMS): δ 1,162 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH₃), 2,915 (1H, dt, J = 4 și 4,5 Hz CHN), 3,213 (1H, dq, J = 4 și 6,5 Hz,

CHN) , 3,650 (1H, dd, J = 5 Hz și 11 Hz, Ch_aO), 3,658 (1H, dd, J = 5 Hz și 11 Hz, Ch_bO), 3,741 (1H, dd, J = 1,5 Hz și 4 Hz CHO), 3,835 (1H, dd, J = 1,5 Hz și 4 Hz, CHO). ¹³C RMN (125 MHz, CD₃OD) δ : 13,72, 57,85, 63,07, 68,60, 80,60, 81,54, HRMS (M + H⁺), calculat : 148,0974, găsit: 148,0964.

: (a)_D ²⁵ + 39,1° (c = 0,8, CH3OH); Rf = 0,19 (CHCI3/CH3OH/H2O/NH4OH = 5/4/1/0,08); ¹H RMN (500 Mhz, CD3OD/TMS): δ 1,193 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH₃), 2,920 (1H, dt, J = 6,5 și 7,5 Hz, CHN), 2,982 (1H, ddd, J = 4,5, 6,5 și 6,5 Hz, CHN), 3,500 (1H, dd, J = 6,5 Hz și 7,5 Hz, CHO), 3,572 (1H, dd, J = 6Hz, și 11 Hz,CH_aO), 3,644 (1H, dd, J = 4,5 Hz și 11 Hz,CH_bO), 3,751 (1H, dd, J = 6,5 Hz și 6,5 Hz,

CHO) . ¹³C RMN (125 Mhz, CD₃OD) : δ 18,83, 58,07, 63,61, 64,36, 79,88, 84,88, HRMS (M+H⁺), calculat: 148,0974, găsit: 148,0971.

Exemplul 19. Sintezele și datele pentru compușii din schemele 21-23

Compușii 61 - 99 și sintezele lor au fost discutate în relație cu schemele 21 - 23. Datele selectate pentru ¹H RMN și HRMS ale compușilor din aceste scheme sunt prezentate în tabelele 6-8. Detaliile sintetice specifice pentru exemplele de compuși conform celor discutate sunt prevăzute mai jos.

Proceduri descrise mai jos sunt, de asemenea, aplicate și altor glicozil-1 -fosfați, compușii 89-95. O singură modificare apare la faza de purificare a compușilor 68, 69, 75 și 76. EtOAc este utilizat ca eluent pentru compușii 68 și 69, EtOAc : hexan (2:3) pentru compusul 75 și CHCI₃: EtOAc: MeOH (15:0,5:0,2) pentru compusul 76.

A. 2,3,4,6-tetra-O-acetil-D-glucoză (compusul 71)

O soluție de pentaacetat, compusul 64 (5,0 g, 12,8 mmol) și BnNH₂ (19,2 mmol) în THF (30 ml) este menținută la temperatura camerei pe timpul nopții (circa 18 h). Amestecul este diluat cu apă rece și extras cu CHCI₃ (3 x 50 ml). Combinația organică este succesiv spălată cu HCI diluat răcit cu gheață, NaHCO₃ saturat, NaCI saturat și apă, apoi uscat peste Na₂SO₄ anhidru și concentrat în vacuum. Siropul rezidual este purificat prin cromatografie pe gel cu EtOAc/hexan (2:3) pentru a se obține compusul 71 (3,80 g, 85%) sub forma unui amestec de anomeri α : β (3:1) după ¹H RMN (CDCI₃).

B. Dibenzilfosfinil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-D-glucoză fosfit (compusul 78)

Dibenzil N,N-dietilfosforamidit (0,86 g, 7,3 mmol) este adăugat la o soluție de compus 71 (1 g, 2,9 mmol) și 1,2,4-triazol (0,8 g, 11,5 mmol) în CH₂CI₂ anhidru, în atmosferă de azot la temperatura camerei. Amestecul este supus agitării la temperatura camerei 1 - 2 h după diluție cu eter. Amestecul este succesiv spălat cu NaHCO₃ saturat răcit cu gheață, NaCI saturată, și apă, uscat pe Na₂SO₃ anhidru și concentrat în vacuum. Siropul rezidual este cromatografiat pe silicagel cu EtOAc/hexan (1:4) pentru a se obține compusul 78 (1,73 g, 97%) sub forma unui amestec de (α:β) 1:4 prin ¹H RMN (CDCI₃).

RO 118132 Β1

2660

C. Dibenzilfosforil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-D-glucoză (compusul 25)

La o soluție din compusul 78 (1,2 g, 2,2 mmol) în THF (50 ml) răcită la - 78°C cu baie de acetonă-gheață uscată, se adaugă prin picurare 30% H₂O₂ (10 ml), și amestecul este menținut la temperatura camerei pentru a se încălzi, apoi este agitat 1,5 h, la temperatura camerei. Amestecul este diluat cu eter și spălat succesiv cu Na₂S₂O₃ saturat răcit cu gheață, NaHCO₃ saturat, NaCI saturat, și apă. Faza organică este uscată pe Na₂SO₄ anhidru și concentrată pentru a se obține un amestec α: β (1:4) de compus 85 (1,36 g, 98%) după ¹H RMN (CDCI₃). Acest produs este utilizat pentru faza următoare fără a fi purificat.

D. 1-fosfat glucoza (compusul 92)

Compusul 85 (1 g, 1,8 mmol) este hidrogenat (1,029 kgf/cm² 14,7 psi) peste 5% Pd/C (200 mg) în EtOH (30 ml) și 10% NaHCO₃ (20 ml) ,10 h, la temperatura camerei. Amestecul este filtrat și filtratul este concentrat. Reziduul este tratat cu 1N NaOH (10 ml), la temperatura camerei 10 h. Amestecul este neutralizat cu 1N AcOH răcit cu gheață la un pH = 7,5 și materialul insolubil este recuperat prin filtrare. Alternativ, o soluție de MeOH: H₂O (1:1, v/v) în 10% Et₃N este utilizată în loc de NaOH, astfel, încât neutralizarea următoare este eliminată. Filtratul este concentrat, diluat cu apă, și trecut printr-o coloană cu Dowex 50 W-X8 (Na⁺) (1x15 cm) cu apă ca eluent. Fracțiunile asemănătoare sunt colectate, și liofilizate pentru a se obține compusul 92.

Este posibil să se observe o mică cantitate de produs defosforilat. Aceasta poate fi îndepărtată prin trecerea filtratului diluat printr-o coloană cu Dowex 1W-X8 (HCO‘₂) (1 x 30 cm). Coloana este mai întâi eluată cu apă pentru a îndepărta produsul neutru, apoi se aplică un gradient liniar de NH₄HCO₃ (0,1 M-0,3 M) pentru a elua produsul dorit. Fracțiunile apropiate sunt colectate și liofilizate. Pudra liofilizată este dizolvată în apă (10 ml), răcită la 0°C și neutralizată la pH = 7,0 cu rășină Dowex 50W - X8 (H⁺). Rășina este filtrată și filtratul este din nou liofilizat pentru a se produce compusul 92 (0,30 g, 59%) sub forma unui amestec α;β (1:4) după ¹H RMN (D₂O).

E. Metil-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3, S-dideoxi-β- D-glicero-D-galacto-2nonulopiranozonat (compusul 96)

Acest compus este preparat prin procedeul Marra și colab.,Carbohydr. Res., 190: 317 (1989). Alternativ, un amestec de metil 2-cloro-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5dideoxi-0-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranozonat [Kuhn și colab., Chem. Ber., ‘99:611 (1966)] (0,67 g, 1,3 mol) și carbonat de argint (0,363 g, 1,3 mmol) în acetonă (5 ml), H₂O (0,5 ml) este agitat timp de 10 h, la temperatura camerei. Suspensia este filtrată prin trecerea printr-un pat de Celite™ 545, și filtratul este evaporat la sec. Reziduul este diluat cu cloroform, spălat cu apă și saramură, și apoi uscat pe sulfat de sodiu. Soluția este evaporată în vacuum pentru a da un material proaspăt, care este cromatografiat pe silicagel în coloană (cloroform: metanol, 25:1) pentru a se obține compusul 96. (0,568 g, 88%) sub formă de cristale albe aciculare.

Ή RMN (CDCI₃) δ : 1,90, 2,02, 2,03, 2,10, 2,14, (3H fiecare, s, 4 x OAc și NAc), 2,17 (1H, dd, J 5,04, 12,72 Hz, H-3eq), 2,29 (1H, dd, J 11,52, 12,72 Hz, H-3ax), 3,87 (3H, s, COO Me), 4,02 (1H, dd, J 7,04 12,4 Hz, H-9), 4,12 (1H, dd, J = 2,1, 7,8 Hz, H-6), 4,13 (1H, d, J 7,8 Hz, NH), 4,17 (1H, DDD, 7,8, 9,8, 10,28, Hz, H-5), 4,42 (1H, dd, J 1,92, 12,4 Hz, H-9'), 5,20-5,26 (2H, m, H-4 și H-8), 5,32 (1H, dd, J 2,1,6,50 Hz, H-7), 5,37 (1H, bs, OH).

F. Metil 5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-(dibenzilfosfitil)-3,5-dideoxi-p-Dglicero-D-galacto-2-nonulopiranozonat (compusul 97)

Dibenzil N,N-dietilfosfoamidat (0,25 g, 0,78 mmol) este adăugat prin picurare la o soluție de compus 96 (0,166 g, 0,34 mmol) și 1H-tetrazol (0,10 g, 1,43 mmol), în THF (5 ml)

2665

2670

2675

2680

2685

2690

2695

2700

RO 118132 Β1 sub atmosferă de azot. Amestecul este menținut 4 h, la temperatura camerei. Diclormetanul (10 ml) este adăugat la acest amestec, și faza organică este spălată cu HCI diluat răcit cu gheață, NaHCO₃ apoasă, și apă cu gheață, apoi este uscată peste NaSO₄ anhidru. Soluția este evaporată în vacuum pentru a se obține materialul proaspăt, care este cromatografiat într-o coloană cu silicagel cu EtOAc/hexan (5:1) pentru a se obține compusul 97 (0,17 g, 68%) sub formă de sirop incolor. ¹³C-RMN (CDCI₃) δ : 20,7, 20,8, 20,9, 21,0, 23,1, 36,0, 49,5, 53,5, 62,6, 67,3, 67,4, 67,8, 69,3, 70,8, 94,8, 128,0, 128,7, 135,5, 141,8, 153,0, 169,1, 170,2, 170,4, 170,8, 171,0 HRMS: calculat pentru C₃₄H₄₂NO₁₅PCs (M + Cs⁺): 868,1346, găsit: 868,1346.

G. Metil-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-2-(dibenzilfosforil)-3,5-dideoxi-0-D-gliceroD-galacto-2-nonulopiranozonat (Compusul 98)

La o soluție răcită a compusului 97 (0,13 g, 0,17 mmol) în THF (2 ml) se adaugă tBuO₂H (0,4 ml) la - 10°C, și amestecul este menținut la cald până la temperatura camerei, și agitat timp de 1 h, la temperatura camerei. Amestecul este apoi diluat cu CH₂CI₂ și spălat cu NaHCO₃ apoasă răcită cu gheață și apă, apoi uscat peste Na₂SO₄ anhidru. Faza organică este evaporată în vacuum pentru a se obține materialul proaspăt, care este cromatografiat pe silicagel cu CHCI₃/MeOH (25:1) obținându-se compusul 98 (0,126 g, 95%) sub formă de sirop incolor. HRMS: calculat pentru C₃₄H₄₂NO₁₆PCs (M + Cs⁺): 884,1396; găsit: 884,1305.

H. Acidul metil 5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-dideoxi-(3-D-glicero-D-galacto2-nonu/opiranozonat 2-fosforic (compusul 99, forma hidrogenată)

Compusul 98 (0,22 g, 0,25 mmol) este hidrogenat (1,029 kgf/cm²14,7 psi) peste 5 procente de Pd/C (10 mg) în atmosferă de hidrogen, timp de 7 h, la temperatura camerei. Catalizatorul este filtrat printr-un pat de Celite™ 545 și filtratul este concentrat în vacuum. Materialul proaspăt este cromatografiat pe o coloană cu silicagel cu fază reversă, folosind CH₃CN/H₂O (5:1) pentru a se obține compusul 99, forma hidrogen (0,164 g, 99%) sub formă de sirop incolor. HRMS: calculat pentru C₂₀H₃₀NO₁₆PCs (M+C_s ⁺): 704,0356, găsit: 704,0356.

Claims (48)

1. 2850

   Revendicări

   1. Procedeu de obținere a carbohidraților fucozilați într-un singur amestec de reacție, caracterizat prin aceea că, cuprinde următoarele faze:

   a) obținerea unui glicosil 1 - sau 2 fosfit prin supunerea reacției unui inel glicozidic blocat având un hidroxid în poziția anomerică cu un reactiv trivalent de fosfitilare, reacție în urma căreia rezultă un inel glicozidic blocat 1 sau 2 fosfit substituit;

   b) formarea unei legături O-glicozidice între o nucleozidă 5' fosfo - fucoză și o grupă hidroxil a unei molecule de carbohidrat acceptoare, cu ajutorul fucoziltransferazei, obținânduse un carbohidrat fucolizat și o nucleozidă 5' - difosfat;

   c) reciclarea, in situ, a nucleozidei 5' - difosfat cu fucoza, obținându-se nucleozidă 5' - difosofucoza corespunzătoare.
2. 2. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, în scopul sintezei unei molecule halo carbonhidrat acceptor, se halohidrează clorperoxidaza prin formarea mai întâi, a unei amestec de reacție din glical cu apă oxigenată și un ion de halogen, selectat dintre clor, brom, iod și o cantitate catalitică de clorperoxidază, într-o soluție tampon având valoarea pH - ului, între 2,5 și 3,5 și apoi, menținerea acestui amestec de reacție pe o perioadă suficientă pentru obținerea produsului halohidrat, care în final se recuperează.
3. 3. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, inelul glicozidic din faza a) este selectat dintr-un grup constând din galactozil, glucozil, fucozil, N - acetilglucoaminil, manozil și zaharide cu 8 sau 9 atomi de carbon având o grupă carboxil sau alil (C₄ - C_s) sau un ester benzii carboxilat în poziția 1.
4. 4. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, inelul glicozil din faza a) este fucozil.
5. 5. Procedeu, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, inelul glicozil este blocat cu acetil sau grupări benzii de blocare.
6. 6. Procedeu, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, reactivul de fosfitilare din faza a) este un dibenzil N,N - dialchilfosoroamidit.
7. 7. Procedeu, conform revendicării 6, caracterizat prin aceea că, reactivul de fosfitilare din faza a) este un dibenzil N,N - dietilfosoroamidit.
8. 8. Procedeu, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, inelul glicozidic este selectat dintr-un grup constând din L - sau D - aldoze având 4, 5 sau 6 atomi de carbon.
9. 9. Procedeu, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, inelul glicozidic este selectat dintr-un grup constând din L - sau D - cetoze având 4, 5 sau 6 atomi de carbon.
10. 10. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, inelul glicozidic din faza a) este selectat dintr-un grup constând din L - sau D - aldoze și cetoze având 4 până la 9 atomi de carbon.
11. 11. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, baza nucleozidei din faza b) este guanina.
12. 12. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, nucleozidă 5' difosfat din faza b) este prezentată dintr-o cantitate catalitică.
13. 13. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, gruparea hidroxil a moleculei de carbonhidrant acceptoare este o porțiune dintr-o N - acetilglucozamină, galactoză sau N-acetilgactozamină.
14. 14. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, molecula carbonhidrat acceptoare este sialilată.

    2855

    2860

    2865

    2870

    2875

    2880

    2885

    2890

    2895

    RO 118132 Β1
15. 15. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, pentru obținerea unei molecule de carbohidrat sialilat fucolizat prin formare enzimică de legături glicozidice într-un singur amestec de reacție, se realizează următoarele faze:

    i) se formează mai întâi o legătură glicozidică între un glicozil difosfonucleozid activat donor și o grupă hidroxil convenabilă a moleculei de carbonhidrat acceptoare utilizând o primă glicoziltransferază; apoi ii) se formează o a doua legătură glicozidică între un donor sialil al monofosonucleozidei active și o grupă convenabilă a moleculei de carbonhidrat acceptoare utilizând o silaliltransferază ; și în final iii) se formează o a treia legătură glicozidică între un donor fucozil al difosonucleozidei active și o grupă hidroxil convenabilă a moleculei de carbonhidrat acceptoare prin procedeul din faza b), legăturile glicozidice din fazele i), ii) și iii) fiind formate într-un singur amestec de reacție.
16. 16. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, o parte din carbonhidratul sialilat fucolizat este un ligand sialilat Lewis.
17. 17. Procedeu .conform revendicării 16, caracterizat prin aceea că, ligandul sialilat Lewis este SLe^x sau SLe^a.
18. 18. Procedeu .conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, fucoza este transferată de la un fucozil donor la o grupă hidroxil a unei porțiuni dintr-o N-acetilglucozamină a moleculei de carbonhidrant acceptoare.
19. 19. Procedeu, conform revendicării 18, caracterizat prin aceea că, donorul fucozil transferă fucoza la o grupă hidroxil a carbonului din poziția 3 din N-acetilglucozamină.
20. 20. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, donorul fucozil transferă fucoza la o grupă hidroxil a unei porțiuni de galactoză din molecula de carbonhidrat acceptoare.
21. 21. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, sialiltransferază este selectată dintr-un grup constând din a - 2, 3-sialiltransferaza,

    2,6 sialiltransferază și a - 8-sialiltransferaza
22. 22. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, fucoziltransferaza este selectată dintr-un grup cunoscând din a-1,2,-fucoziltransferază, a- 1,3 fucoziltransferază, a - 1,6 - fucoziltransferază, a - 1,4 fucoziltransferază șu a - 1,3/4 fucoziltransferază.
23. 23. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, fucoziltransferaza este selectată dintr-un grup constând din β - galactozidază - a-1, 2 - fucoziltransferaza, N - acetilglucozamina - a-1,3 - fucoziltransferază,N-acetilglucozamina-a -1,6fucoziltransferaza,N-acetilglucozamina-a-1,4 fucoziltransferază și N-acetilglucoz-amina- a1,3/4 fucoziltransferază.
24. 24. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, molecula carbonhidrat acceptoare este o moleculă de carbohidrat susținut în care terminațiile carbonhidrat sunt Ga^1,4GlcNac - X, în care X este o moleculă organică.
25. 25. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, baza a cel puțin unei nucleozide este citidina sau uridina.
26. 26. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, donorul sialil al monofosonucleozidei activate este citidina acidului 5'-monofoso-N-acetilneuraminic.
27. 27. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, donorul fucozil al difosfonucleozidei activate este guanizin - 5' - difosfo-fucoza.
28. 28. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, donorul glicozil din faza i) este un donor galactozil al difosfonucleozidei active care este uridin 5' - difosfo galactoza.
29. 29. Procedeu, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, fazele i) și ii) sunt complet realizate înaintea începerii fazei iii).

    RO 118132 Β1

    2950
30. 30. Sistem de reacție in vitro, caracterizat prin aceea că este constituit dintr-o fucoziltransferază și o nucleozidă - difosfo - fucoză, formând enzima.
31. 31. Sistem de reacție, conform revendicării 30, caracterizat prin aceea că, nucleozidă - difosfo - fucozei, formând enzima, este guanozin - difosfo - fucoza pirofosforilaza.
32. 32. Sistem de reacție, conform revendicării 30, caracterizat prin aceea că, mai poate conține o kinază.
33. 33. Sistem de reacție, conform revendicării 32, caracterizat prin aceea că, mai poate conține o piruvat - kinază.
34. 34. Sistem de reacție, conform revendicării 31, caracterizat prin aceea că, kinaza este o fucoz-kinaza.
35. 35. Sistem de reacție, conform revendicării 31, caracterizat prin aceea că, conține un sistem de regenerare NADPH.
36. 36. Sistem de reacție, conform revendicării 35, caracterizat prin aceea că, nucleozidă difoso fucozei formează un sistem care conține guanozindifosfomanoza.
37. 37. Sistem de reacție, conform revendicării 36, caracterizat prin aceea că, guanozin-difosfo-manoza este generată in situ din guanozin trifosfat și 1- fosfat manoză.
38. 38. Sistem de reacție, conform revendicării 37, caracterizat prin aceea că, conține piruvat kinaza și guanozin-difosfo-manoza-pirofosorilază.
39. 39. Compus intermediar, caracterizat prin aceea că este o monozaharidă fosfitil blocată cu formula generală structurală:

    2955

    2960

    2965

    Ra

    2970

    2975 în care: fiecare R, este același sau diferit și este o grupă arii sau o grupă alchil inferior (Ct -C₅); X este independent un atom de oxigen sau azot; R₂ este independent o grupă acil, benzii, silii sau alchil care sunt grupe de blocare, sau X - R₂, ambele sunt grupe absente și sunt înlocuite cu atomi de hidrogen; R₃ este independent un atom de hidrogen, un radical CH₃, - OR₂, - CH₂ - OR₂, CH - (OR₂) - CH (OR₂), sau CH - (OR₂) - CH - (OR₂);R₄ este un atom de hidrogen, carboxil sau alchil - C₅) sau benzii carboxilat; și m este 0 sau 1.
40. 40. Compus intermediar, conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că, m în forma generală este 1 și fiecare X este oxigen.
41. 41. Compus intermediar, conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că este o monozaharidă selectată dintr-un grup constând din manoză, frucoză, galactoză, glucoză și ramnoză.
42. 42. Compus intermediar, conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că, în formula generală m este 1, un X este azot și alt X’ este oxigen.
43. 43. Compus intermediar, conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că este monozaharidă selectată dintr-un grup constând din 2 - acetamido - 2- deoxi-galactoză, 2acetamido - 2- deoxi - glucoză, acid acetil-neuraminic și 2 - ftalilimidoil - 2- deoxil - glucoză.
44. 44. Compus intermediar, conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că, în formula generală R₁ este benzii.
45. 45. Compus intermediar, conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că, R₂ este benzii sau acetil.

    2980

    2985

    2990

    2995

    RO 118132 Β1
46. 46. Compus intermediar .conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că este monozaharidă selectată dintr-un grup constând din:

    dibenzilfosfinil 2,3,4,6 - tetra - O - acetil - a - D - manozidă, dibenzilfosfinil 2,3,4,6 - tri - O - acetil - β - L - fucozidă, dibenzilfosfinil - 2 acetamină - 2 - deoxi - 3,4,6 tri - O - acetil - D - galactozidă, dibenzilfosfinil - 2 acetamido - 2 - deoxi - 3,4,6 tri - O - acetil - glucoză, dibenzilfosfinil 2,3,4,6 - tetra - O - acetil - D - galactozidă, dibenzilfosfinil 2,3,4,6 - tetra - O - acetil - G - glucozidă, dibenzilfosfinil 2,3,4,6 - tri - O - acetil - L- ramnozidă, dibenzilfosfinil 2 - ftalmidoil - 2 - deoxi - 3,4,6 tri - O acetil - D - glucozidă, metil 5 - acetamido - 4,7,8,9 - tetra - O - acetil - 2 - (dibenzilfosfitil) - 3,5 - dideoxi- β - D - glicero - D - galacto - 2 - nonulopiranozonat.
47. 47. Compus intermediar, conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că este o bromură de 2, 3, 4, - tri - O - benzoil - a - L - fucopiranzil.
48. 48. Compus intermediar, conform revendicării 39, caracterizat prin aceea că este o glicozilhalohidrină avand una din formulele structurale,