CN108251474A - Abh人血型抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种糖类的合成方法,具体涉及ABH血型抗原的合成,包括利用“一锅多酶”体系将岩藻糖以α1‑2糖苷键偶联到式(I)所示的二糖上,合成式(II)所示的三糖的步骤;利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1‑3糖苷键偶联到式(II)所示的三糖上,合成式(III)所示的四糖的步骤;以及利用“一锅多酶”体系将N‑乙酰氨基半乳糖以α1‑3糖苷键偶联到式(II)所示的三糖上,合成式(IV)所示的四糖的步骤。本发明利用酶法模块化组装,充分利用各种酶的高效性与底物专一性,完成了ABH血型抗原的合成。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖类的合成方法,具体涉及ABH血型抗原的合成。
背景技术
ABH血型抗原是人类主要的血型抗原,其抗原表位的决定簇是由寡糖链构成,这些寡糖链可以与多肽或者脂类结合形成糖蛋白或者鞘糖脂。ABH血型抗原不仅存在于红细胞表面,也广泛存在于人体器官的上皮和内皮细胞、母乳、唾液和尿液等,这些寡糖抗原与急性溶血性输血反应以及骨髓和器官移植的免疫反应有关。越来越多的研究表明,这些抗原作为受体在各种细菌、病毒和寄生虫感染以及肿瘤转移中扮演着重要的角色。
ABH血型抗原包括三种抗原表位决定簇,H抗原是由岩藻糖和半乳糖相连形成的二糖[Fucα(1-2)Galβ-OR],A抗原是在H抗原二糖的基础上引入N-乙酰氨基半乳糖[GalNAcα(1-3)[Fucα(1-2)]Galβ-OR],B抗原是在H抗原二糖的基础上引入半乳糖[Galα(1-3)[Fucα(1-2)]Galβ-OR],如图1所示。根据其生物合成途径中二糖前体结构的不同,ABH抗原可以进一步分为5个亚型,分别是I型:Galβ1-3GlcNAcβ1-R,II型:Galβ1-4GlcNAcβ1-R,III型:Galβ1-3GalNAcα1-R,IV型:Galβ1-3GalNAcβ1-R,VI型:Galβ1-4Glcβ1-R。而本发明主要涉及VI型:Galβ1-4Glcβ1-R,再以前体二糖为底物,在糖基转移酶的催化下依次将3种不同的单糖(Fuc,GalNAc,Gal)连接到二糖的非还原末端得到三种A抗原[GalNAcα1,3[Fucα(1-2)]Galβ1,4Glc]、B抗原[Galα1,3[Fucα(1-2)]Galβ1,4Glc]和H抗原[Galβ1,4(Fucα1,2)GlcβProN3]。
ABH血型抗原的重要生物学意义,使其抗原的合成成为近六十年来糖合成领域的热点。目前,对ABH血型抗原的合成方法有化学法、化学酶法、酶法和全细胞发酵。化学法需要复杂的保护,脱保护过程,而且操作条件严格,使最终收率较低;酶法合成中酶的来源和底物专一性限制了酶法的广泛使用,而全细胞发酵只能生成一种寡糖结构而且难以纯化。
发明内容
针对上述不足,本发明提出一种合成ABH抗原的方法。采用“一锅多酶”体系模块化组装合成ABH抗原,为其在生物活性上的研究奠定基础。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种ABH血型抗原的合成方法:包括利用“一锅多酶”体系将岩藻糖以α1-2糖苷键偶联到式(I)所示的二糖上,合成式(II)所示的三糖的步骤;利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1-3糖苷键偶联到式(II)所示的三糖上,合成式(III)所示的四糖的步骤;以及利用“一锅多酶”体系将N-乙酰氨基半乳糖以α1-3糖苷键偶联到式(II)所示的三糖上,合成式(IV)所示的四糖的步骤;
式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)中,R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基。
上述合成方法中,利用“一锅多酶”体系合成式(II)所示的三糖的步骤中,先后用到的酶分别为:岩藻糖焦磷酸化酶和α1-2岩藻糖转移酶。
上述合成方法中,利用“一锅多酶”体系合成式(III)所示的四糖的步骤中,先后用到的酶分别为:半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-3半乳糖转移酶。
上述合成方法中,利用“一锅多酶”体系合成式(IV)所示的四糖的步骤中,先后用到的酶分别为:N-乙酰氨基葡萄糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-3N-乙酰氨基半乳糖转移酶。
在本发明优选的方案中,式(I)所示的β-构型的乳糖化合物的合成方法为:将乳糖与醋酐进行反应后,将其全部裸露羟基用乙酰基保护;然后利用微波反应仪将全乙酰化的乳糖进行β-构型糖苷化反应,然后依次叠氮化和脱保护后即得。可作为下步酶反应受体的乳糖苷,反应的方程式如图6所示。
在本发明优选的方案中,式(II)所示的三糖化合物合成方法为:将式(I)所示的β-构型的乳糖化合物、1.3-3.0当量岩藻糖、1.3-5.0当量腺嘌呤核苷三磷酸、1.3-5.0当量鸟嘌呤核苷三磷酸、5-100mmo MgCl2、10-500mmol、pH 5.0-10.0Tris-HCl缓冲液配制水溶液,然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5,然后添加鸟苷二磷酸岩藻糖焦磷酸化酶和α1-2岩藻糖转移酶,反应时间为3-72小时,待反应完成后,纯化即可直接获得式(II)所示的三糖化合物。可作为下步酶反应受体,反应的方程式如图7所示。
在本发明优选的方案中,式(III)所示的四糖化合物的合成方法为:将式(II)所示的三糖化合物、1.3-3.0当量半乳糖、1.3-5.0当量腺嘌呤核苷三磷酸、1.3-5.0当量尿嘧啶核苷三磷酸、5-100mmol MgCl2、10-500mmol、pH 5.0-10.0Tris-HCl缓冲液配制水溶液,然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5,然后添加半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-3半乳糖转移酶,反应时间为3-72小时,待反应完成后,纯化即可直接获得式(III)所示四糖化合物,反应的方程式如图8所示。
在本发明优选的方案中,式(IV)所示的四糖化合物的合成方法为:将式(II)所示的三糖化合物、1.3-3.0当量N-乙酰氨基半乳糖、1.3-5.0当量腺嘌呤核苷三磷酸、1.3-5.0当量尿嘧啶核苷三磷酸、5-100mmol MgCl2、10-500mmol、pH5.0-10.0Tris-HCl缓冲液配制水溶液,然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5,然后添加N-乙酰氨基半乳糖激酶、UDP-N-乙酰氨基半乳糖合成酶以及α1-3N-乙酰氨基半乳糖转移酶,反应时间为3-72小时,待反应完成后,纯化即可直接获得式(IV)所示的四糖化合物,反应的方程式如图9所示。
上述反应完成后采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程,展开剂为EA:CH3OH:H2O:HOAc=4:2:1:0.2来检测。
式(I)中的叠氮基团,可以进一步通过“点击化学”反应来链接疏水性功能基团。
合成式(II)、式(III)和式(IV)所示的寡糖所采用的“一锅多酶”体系中,反应温度为0-37℃,转速为0-240r/min;所述酶反应的停止方法是向反应中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0-50分钟。
本发明运用糖激酶、糖核苷生成酶和糖基转移酶三种酶重要的催化作用,使其协同合作,构成一个有机的酶反应体系,实现酶的高效利用。本发明在试验中对三类酶进行多次的优化筛选,结果发现:岩藻糖焦磷酸化酶和α1-2岩藻糖转移酶;半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-3半乳糖转移酶;N-乙酰氨基葡萄糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-3N-乙酰氨基半乳糖转移酶;作为本发明的“一锅多酶”体系所采用的酶,其催化效果最为优异,特别适用于ABH血型抗原的酶催化合成,合成效率高,基本无副产物的生成,方便进行纯化。而且上述酶均为细菌来源,均可在常规的大肠杆菌表达系统中方便的表达纯化。
需要说明的是“一锅多酶”体系虽然是合成复杂寡糖的一种非常便捷的方法,但是并不是简单的在不同酶的作用下将不同的单糖连接在一起。
针对ABH血型抗原的合成策略,我们首先分析其单糖的组成、连接的顺序和糖苷键的形式,针对不同构型的糖苷键选用不同的酶,分别建立了合成ABH抗原的三种方法。
另外,酶属于蛋白质,其活性会受到温度、pH、金属离子、底物浓度、反应体系的温度以及时间等因素的影响,结合这些因素,再综合各种酶的活性条件,我们选用了最合适的条件,是各种酶在同一条件下发挥其作用,达到高效合成的目的。
本发明的有益效果:
本发明提供了一种模块化组装体系,巧妙地结合了化学法和酶法,高效、快捷的实现了ABH抗原的化学酶法合成。从简单的原料出发,避免了使用价格昂贵的糖核苷供体,降低了成本;所用的酶都来自于细菌,在大肠杆菌中重组表达,解决的酶的来源问题,为高效的合成寡糖提供了基础;避免了化学合成中复杂的保护、脱保护过程,再加上酶的高效性、专一性,大大提高了寡糖合成的收率;而且酶法合成的副产物很少,降低了纯化的难度,能更容易的得到单一的寡糖。
附图说明
图1:ABH抗原的结构。
图2:通式I所示化合物。
图3:通式II所示化合物,H抗原。
图4:通式III所示化合物,B抗原。
图5:通式IV所示化合物,A抗原。
图6:化学法合成β-构型的乳糖化合物1的反应方程式。
图7:“一锅多酶”体系合成三糖化合物2的反应方程式。
图8:“一锅多酶”体系合成四糖化合物3的反应方程式。
图9:“一锅多酶”体系合成四糖化合物4的反应方程式。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明,应该说明的是,下述说明仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。
下述实施例中所涉及的反应原料、溶剂等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规产品,所涉及的合成方法、工艺,若无特别说明,均为所属领域的常规技术手段。
下述实施例中所提及的化合物1、2、3、4分别对应于R1为叠氮取代烷基的通式I、II、III、IV的化合物。
实施例:ABH抗原的合成
步骤如下具体如下:
(1)化学法合成β-构型的乳糖化合物1(Galβ1,4GlcβProN3)
向500mL圆底烧瓶中加入乳糖(10g,29.23mmol)、醋酐(55mL)和醋酸钠(9.6g),在160℃反应条件下回流搅拌6小时。薄层色谱检测(PE:EA=1:1)反应完全后,旋蒸浓缩。所得固体复溶于300mL二氯甲烷中,用半饱和食盐水萃取一次,饱和碳酸氢钠溶液萃取三次,双蒸水溶液萃取三次,之后分离有机相,再用无水硫酸钠干燥有机相,旋蒸浓缩,获得淡黄色固体化合物5(18.6g,94%)。
向容积为10mL的微波专用反应管中加入化合物5(1.0g,1.47mmol)、二氯甲烷(5.0mL)、三氟化硼乙醚(0.36mL)和3-氯-1-丙醇(0.25mL),磁力搅拌,预搅拌2分钟,反应温度为50℃,反应时间为15分钟。按照相同的反应条件,平行开5组相同的反应。之后收集反应液,旋蒸浓缩,快速硅胶柱分离纯化,获得淡黄色固体化合物6(2.78g,53%)。
向250mL圆底烧瓶中加入化合物6(2.40g,3.37mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(40mL)、叠氮钠(1.1g)和四丁基碘化铵(0.12g),110℃搅拌回流12小时。薄层色谱检测(PE:EA=1:1)反应完全后,使用硅藻土过滤,二氯甲烷冲洗,半饱和食盐水萃取,反复三次,再用无水硫酸钠干燥有机相,旋蒸浓缩,快速硅胶柱分离纯化,获得淡黄色固体化合物7(1.93g,90%)。
向50mL圆底烧瓶中加入化合物7(1.50g,2.36mmol)、甲醇(10mL)、甲醇钠,直至溶液体系pH值到9.5左右,室温搅拌4小时,薄层色谱检测(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=4:2:1:0.2)反应完全后,用酸性离子交换树脂将反应液的PH值调节到中性,旋蒸浓缩,快速硅胶柱分离纯化,得到白色固体化合物1(0.90g,90%)。
化合物1的合成路线如图6所示。
(2)“一锅多酶”体系合成H抗原三糖化合物2[Galβ1,4(Fucα1,2)GlcβProN3]。
本发明的化合物2[Galβ1,4(Fucα1,2)GlcβProN3]的合成步骤如下:
向50ml离心管中加入受体化合物1(Galβ1-4GlcβproN3)(100mg,0.24mmol)、岩藻糖(59mg,0.36mmol)、腺苷三磷酸(ATP,182mg,0.36mmol)、鸟苷三磷酸(GTP,217mg,0.36mmol);Tris-HCl(121.14mmol,pH 7.5)和氯化锰(20mmol),溶于少许三蒸水,震荡至完全溶解,用1MHCl或1MNaOH将pH调至7.5,之后加入鸟苷二磷酸岩藻糖焦磷酸化酶(酶FKP(2mg)和α1-2岩藻糖转移酶(HMα1,2FucT(3mg),最后用三蒸水将反应液总体积补至10ml,在27℃,100rpm/min条件下反应36h,反应进程用薄层色谱(乙酸乙酯:甲醇:水:醋酸=8:3:1:0.2,v/v)检测,茴香醛染色液显色。反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃,12000rpm/min条件下离心30min,收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化,获得化合物2(150mg,92%)。参数如下:1HNMR(600MHz,D2O)δ5.30(d,J=2.2Hz,1H),4.51(d,J=7.7Hz,1H),4.44(d,J=8.0Hz,1H),4.22(q,J=6.5Hz,1H),4.00–3.64(m,14H),3.58(t,J=9.2Hz,1H),3.45(t,J=6.7Hz,3H),3.32(t,J=8.6Hz,1H),1.90(p,J=6.4Hz,2H),1.22(d,J=6.5Hz,3H),13CNMR(151MHz,D2O)δ102.20,100.18,99.27,76.23,75.80,75.25,75.13,74.20,73.49,72.83,71.59,69.53,69.05,68.08,67.33,66.82,61.02,60.10,47.79,28.15,15.21。
化合物2的合成路线如图7所示。
(3)“一锅多酶”体系合成B抗原四糖化合物3[Galα1,3Galβ1,4(Fucα1,2)GlcβProN3]。
向50ml离心管中加入受体化合物2[Galβ1,4(Fucα1,2)GlcβProN3](50mg,0.09mmol)、半乳糖(Gal,24mg,0.13mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,68mg,0.13mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,79mg,0.13mmol),Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化镁(20mmol),溶于少许三蒸水,震荡至完全溶解,用1MHCl或1MNaOH将pH调至7.5,之后加入酶EcGalK(2mg),BLUSP(1.5mg)和GTB(2.0mg),最后用三蒸水将反应液总体积补至5.0ml,在37℃,100rpm/min条件下反应36h,反应进程用薄层色谱(乙酸乙酯:甲醇:水:醋酸=8:3:1:0.2,v/v)检测,茴香醛染色液显色。反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃,12000rpm/min条件下离心30min,收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化,获得化合物3(71mg,90%)。参数如下:1HNMR(600MHz,D2O)δ5.30(d,J=4.1Hz,1H),5.22(d,J=2.8Hz,1H),4.57(d,J=7.6Hz,1H),4.41(d,J=8.0Hz,1H),4.29(q,J=6.5Hz,1H),4.26(d,J=2.5Hz,1H),4.18(t,J=6.1Hz,1H),3.99–3.66(m,18H),3.55(t,J=9.3Hz,1H),3.45–3.41(m,3H),3.31(t,J=8.5Hz,1H),1.89(p,J=6.5Hz,2H),1.21(d,J=6.6Hz,3H);13CNMR(151MHz,D2O)δ102.24,100.04,98.65,92.90,76.09,75.85,75.26,74.79,74.26,72.79,72.40,71.58,71.02,69.88,69.38,69.15,67.95,67.56,67.31,66.71,63.36,61.16,61.02,60.06,47.75,28.12,15.02。
化合物3的合成路线如图8所示。
(4)“一锅多酶”体系合成A抗原四糖化合物4[GalNAcα1,3Galβ1,4(Fucα1,2)GlcβProN3]。
向50ml离心管中加入受体化合物2[Galβ1,4(Fucα1,2)GlcβProN3](60mg,0.1mmol)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc,34mg,0.15mmol)、腺苷三磷酸(ATP,76mg,0.15mmol)、尿苷三磷酸(UTP,87mg,0.15mmol),Tris-HCl(100mmol,pH7.5)和氯化镁(20mmol),溶于少许三蒸水,震荡至完全溶解,用1MHCl或1MNaOH将pH调至7.5,之后加入酶BlNahK/EcGlmU(3.0mg)和BgtA(2.0mg),最后用三蒸水将反应液总体积补至6ml,在37℃,100rpm/min条件下反应12h,反应进程用薄层色谱(乙酸乙酯:甲醇:水:醋酸=4:2:1:0.2,v/v)检测,茴香醛染色液显色。反应完成后,加入等体积冰乙醇终止反应,4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃,12000rpm/min条件下离心30min,收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化,获得A抗原化合物4(86mg,94%)。参数如下:1HNMR(600MHz,D2O)δ5.35(d,J=3.3Hz,1H),5.20(d,J=3.6Hz,1H),4.58(d,J=7.6Hz,1H),4.44(d,J=7.9Hz,1H),4.32(q,J=6.4Hz,1H),4.24–4.20(m,3H),4.02–3.71(m,16H),3.66(d,J=4.8Hz,1H),3.58(t,J=9.3Hz,1H),3.47(m,3H),3.33(t,J=9.0Hz,1H),2.04(s,3H),1.92(p,J=6.2Hz,2H),1.25(d,J=6.3Hz,3H);13CNMR(151MHz,D2O)δ174.75,102.23,100.03,98.54,91.24,75.92,75.62,75.29,75.05,74.29,72.87,72.31,71.61,71.00,69.86,68.41,67.68,67.58,67.36,66.81,62.97,61.24,61.11,60.08,49.43,47.80,28.17,21.91,15.09。
化合物4的合成路线如图9所示。
Claims (10)
1.一种ABH血型抗原的合成方法:包括利用“一锅多酶”体系将岩藻糖以α1-2糖苷键偶联到式(I)所示的二糖上,合成式(II)所示的三糖的步骤;利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1-3糖苷键偶联到式(II)所示的三糖上,合成式(III)所示的四糖的步骤;以及利用“一锅多酶”体系将N-乙酰氨基半乳糖以α1-3糖苷键偶联到式(II)所示的三糖上,合成式(IV)所示的四糖的步骤;
式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)中,R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基。
2.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于,利用“一锅多酶”体系合成式(II)所示的三糖的步骤中,先后用到的酶分别为:岩藻糖焦磷酸化酶和α1-2岩藻糖转移酶。
3.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于,利用“一锅多酶”体系合成式(III)所示的四糖的步骤中,先后用到的酶分别为:半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-3半乳糖转移酶。
4.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于,利用“一锅多酶”体系合成式(IV)所示的四糖的步骤中,先后用到的酶分别为:N-乙酰氨基葡萄糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-3N-乙酰氨基半乳糖转移酶。
5.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于,式(I)所示的β-构型的乳糖化合物的合成方法为:将乳糖与醋酐进行反应后,将其全部裸露羟基用乙酰基保护;然后利用微波反应仪将全乙酰化的乳糖进行β-构型糖苷化反应,然后依次叠氮化和脱保护后即得。
6.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于,式(II)所示的三糖化合物合成方法为:将式(I)所示的β-构型的乳糖化合物、1.3-3.0当量岩藻糖、1.3-5.0当量腺嘌呤核苷三磷酸、1.3-5.0当量鸟嘌呤核苷三磷酸、5-100mmo MgCl2、10-500mmol、pH 5.0-10.0Tris-HCl缓冲液配制水溶液,然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5,然后添加鸟苷二磷酸岩藻糖焦磷酸化酶和α1-2岩藻糖转移酶,反应时间为3-72小时,待反应完成后,纯化即可直接获得式(II)所示的三糖化合物。
7.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于,式(III)所示的B抗原四糖化合物的合成方法为:将式(II)所示的三糖化合物、1.3-3.0当量半乳糖、1.3-5.0当量腺嘌呤核苷三磷酸、1.3-5.0当量尿嘧啶核苷三磷酸、5-100mmol MgCl2、10-500mmol、pH 5.0-10.0Tris-HCl缓冲液配制水溶液,然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5,然后添加半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-3半乳糖转移酶,反应时间为3-72小时,待反应完成后,纯化即可直接获得式(III)所示四糖化合物。
8.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于,式(IV)所示的四糖化合物的合成方法为:将式(II)所示的三糖化合物2、1.3-3.0当量N-乙酰氨基半乳糖、1.3-5.0当量腺嘌呤核苷三磷酸、1.3-5.0当量尿嘧啶核苷三磷酸、5-100mmol MgCl2、10-500mmol、pH 5.0-10.0Tris-HCl缓冲液配制水溶液,然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5,然后添加N-乙酰氨基半乳糖激酶、UDP-N-乙酰氨基半乳糖合成酶以及α1-3N-乙酰氨基半乳糖转移酶,反应时间为3-72小时,待反应完成后,纯化即可直接获得式(IV)所示的四糖化合物。
9.如权利要求6-8任一项所述的合成方法,其特征在于,反应完成后采用薄层色谱法跟踪反应进程,展开剂为EA:CH3OH:H2O:HOAc=4:2:1:0.2来检测。
10.如权利要求6-8任一项所述的合成方法,其特征在于,合成式(II)、式(III)和式(IV)所示的多糖所采用的“一锅多酶”体系中,反应温度为0-37℃,转速为0-240r/min;酶反应的停止方法是向反应中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0-50分钟。
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