CN102796144A - Tf抗原及其类似物、和其化学酶法合成方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TF抗原及其类似物、和其化学酶法合成方法及其应用，方法包含下列步骤：（1）化学合成氟代半乳糖及氟代半乳糖胺类似物；（2）酶法合成氟代TF抗原；（3）酶法合成唾液酸化Thomsen-Friedenreich抗原。本发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的高区域选择性和高效性结合到一起，首次实现了氟代TF-抗原的酶法合成，解决了目前化学合成氟代TF抗原中所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低等不足。由于氟代肿瘤相关糖抗原具有比天然糖抗原更优越的药代性质，因而，本发明的在发展新型抗肿瘤疫苗具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于糖类药物领域，涉及糖类物质的化学酶合成方法，尤其涉及肿瘤相关糖抗原及其类似物的化学酶法合成方法，还涉及所合成TF抗原和sT抗原及其类似物在药物研发领域的应用。
背景技术
目前研究表明，在不同肿瘤组织的产生和发展过程中存在一种共有现象，即在肿瘤细胞表面会过度表达异常的糖链结构，这些糖链结构被称为肿瘤相关糖抗原（TACAs）。同一肿瘤组织会表达不同肿瘤相关糖抗原，同一肿瘤相关糖抗原也会分布于不同肿瘤组织。这些肿瘤相关糖抗原与肿瘤发生、发展和预后都存在密切关联（D.H.Dube and C.R.Bertozzi,Nat.Rev.Drug Discov.,2005,4,477-488.;M.M.Fuster and J.D.Esko,Nat.Rev.Cancer.,2005,5,526-542）。以下是一些常见肿瘤相关糖抗原的结构。
常见肿瘤相关糖抗原
鉴于上述情况，肿瘤相关糖抗原被广泛的应用于抗肿瘤疫苗的研发并取得了长足的进展。目前已有多个药物进入临床研究阶段并表现出了较好的药效活性（Astronomo,R.D.,Burton,D.R.,Nat.Rev.Drug Discov.,2010,9,308-324）。但是，目前应用的多数是天然结构的肿瘤相关糖抗原。由于正常组织本身也会少量表达这些异常糖链结构，致使抗肿瘤疫苗的研发存在以下两方面的挑战：一，机体免疫系统不能够对其产生足够强的免疫应答；二，天然糖抗原会在生理条件下降解使得不能产生特异性的免疫反应（Z.W.Guo and Q.L.Wang,Curr.Opin.Chem.Biol.,2009,13,608-617）。
面临上述两个挑战，科学家们将目光聚焦在了对糖链结构进行非天然修饰上。如对肿瘤相关糖抗原进行氟代，生成硫苷、碳苷来替换天然的氧苷键等一系列方法被用于抗肿瘤疫苗的研发（Y.Cheng,A.L.Guo and D.S.Guo,Curr.Org.Chem.,2010,14,977-999;X.J.Yuan and R.J.Linhardt,Cur.Top.Med.Chem.,2005,5,1393-1430;K.Pachamuthu and R.R.Schmidt,Chem.Rev.,2006,106,160-187）。这一解决途径虽然取得成效，但是同时也带来了合成上的挑战。由上述肿瘤相关糖抗原的常见结构及近年来的研究可知：肿瘤相关糖抗原末端往往有唾液酸化修饰，并且过度唾液酸化也是肿瘤发生发展过程中细胞表面糖链结构异常的特征之一（Ajit.Varki,Glycobiology，1993,3,2,97-130），而化学唾液酸化目前仍然是糖化学合成中的一个难点。
T-抗原不仅是表达量最高的肿瘤相关糖抗原之一，也在多种肿瘤相关糖蛋白共有成分中表现出极高的过量表达，比如在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌过度表达量近乎90%（W.M.Lin,U.Karsten,S.Goletz,R.C.Cheng and Y.Cao,Int.J Exp.Pathol.,2011,92,97-105；S.E.Baldus,K.Engelmann and F.G.Hanisch,Crit.Rev.Cl.Lab.Sci.,2004,41,189-231）。近来，含有单氟代和双氟代取代的T-抗原的MUC 1糖蛋白类似物得以合成并在动物试验中表现出了强的免疫原性（M.Johannes,T.Oberbillig and A.Hoffmann-Roder,Org.Biomol.Chem.,2011,9,5541-5546;S.Wagner，C.Mersch and A.Hoffmann-Roder,Chem-Eur.J.,2010,16,7319-7330;C.Mersch,S.Wagner and A.Hoffmann-Roder,Synlet.t,2009,2167-2171;A.Hoffmann-Roder and M.Johannesy，Chem.Comm.,2011,47,9903-9905；T.Oberbillig,C.Mersch,S.Wagner and A.Hoffmann-Roder,Chem.Comm.,2012,48,1487-1489）。且有研究表明化合物的氟代会增强药物的稳定性和生物利用度(J.Xue,V.Kumar,S.D.Khaja,E.V.Chandrasekaran,R.D.Locke and K.L.Matta,Tetrahedron,2009,65,8325-8335;J.Xia,J.Xue,R.D.Locke,E.V.Chandrasekaran,T.Srikrishnan and K.L.Matta,J.Org.Chem.,2006,71,3696-3706)。而目前限制T-抗原及其类似物和sT-抗原及其类似物的研究与应用的最大屏障是高效快捷的化合物获取。
虽然近年来，化学糖苷化获得了快速的进展；但依然没有一个统一有效地普适性方法。由于T-抗原中含有l-3半乳糖苷键，化学法合成需要进行反复的保护与脱保护操作并且收率较低、立体选择性不高(H.Yu,V.Thon,K.Lau,L.Cai,Y.Chen,S.Mu,Y.Li,P.G.Wang and X.Chen,Chem.Comm.,2010,46,7507-7509)。而非天然的修饰又进一步加大了化学法合成上的难度。而目前通过糖基转移酶来催化的酶法合却又面临以下几方面的困难：一是反应往往需要价格昂贵的活性糖为中间体，二是反应的催化往往需要多酶体系，而相应酶的获得又比较困难；三是该系列酶往往有较强的底物专一性，底物适用性窄难以耐受非天然的修饰。sT-抗原中含有末端唾液酸化修饰。而九碳糖唾液酸由于其自身独特结构，不仅容易形成分子内氢键，且在C1位的羧基、C3位的脱氧、C7位的氮杂原子取代均降低了糖环上的电子密度，使得唾液酸糖苷键的生成成为糖合成领域的经典挑战（Xi Chen.,Ajit Varki.,ACS Chem.Biol.,2010,5,2,163–176）。因此，寻找一种快速、高效合成肿瘤相关糖抗原的合成方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种TF抗原及其类似物，它它们的化学酶法合成方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
通式Ⅲ所示的TF抗原及其类似物或通式Ⅳ所示的唾液酸化TF抗原及其类似物：
其中：
R1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基；
R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基；
R4，选自氟原子、羟基；
R5，选自氟原子、羟基；
R6，选自氟原子、羟基；
R7，选自氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮；
R8，选自氟原子、羟基、叠氮。
上述TF抗原及其类似物的化学酶法合成方法，包括以下步骤：
（1）选用通式Ⅰ所示的氟代半乳糖胺类似物或半乳糖胺类似物；
其中：
R1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基；
R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基；
和选用通式Ⅱ所示的氟代半乳糖或半乳糖：
其中:
R4，选自氟原子、羟基；
R5，选自氟原子、羟基；
R6，选自氟原子、羟基；
（2）利用一锅双酶法将通式Ⅰ和通式Ⅱ所示的化合物立体选择性偶联合成TF抗原及其类似物，所述一锅双酶法中先后用到的酶分别为半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；
通式Ⅲ所示的TF（Thomsen-Friedenreich）抗原及其类似物：
通式III
其中：
R1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基；
R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基；
R4，选自氟原子、羟基；
R5，选自氟原子、羟基；
R6，选自氟原子、羟基；
（3）利用一锅双酶法合成唾液酸化TF（Thomsen-Friedenreich）抗原及其类似物，所述唾液酸化采用唾液酸及其类似物，其中唾液酸的类似物为R7、R8取代的唾液酸，所述一锅双酶法唾液酸化中用到的酶指唾液酸CMP-合成酶和唾液酸转移酶；
通式Ⅳ所示的唾液酸化TF（Thomsen-Friedenreich）抗原及其类似物：
其中：
R1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基；α-或β-构型取代烷基；
R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基；
R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基；
R4，选自氟原子或羟基；
R5，选自氟原子、羟基；
R6，选自氟原子、羟基；
R7，选自氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮；
R8，选自氟原子、羟基、叠氮。
所述步骤（1）中的氟代半乳糖胺类似物采用以下方法合成：将半乳糖氨基盐酸盐与醋酐进行反应后，将其C-3、C-4位用2,2-二甲氧基丙烷（DMP）在樟脑磺酸（CSA）催化下进行丙酮叉保护；将仅裸露6-位羟基在微波条件下进行氟代，脱保护后即得。
所述步骤（1）中的氟代半乳糖采用以下方法合成：先将半乳糖的1,2-和3,4-位在丙酮中用浓硫酸催化进行丙酮叉保护，再在微波条件下进行氟代，脱保护后即得。
所述步骤（2）中的TF抗原及其类似物合成方法是：化合物I与、化合物II、ATP（腺嘌呤核苷三磷酸）的摩尔比为1：（1.0-10）：（1.0-10）（这里是比例，后面是具体值，二者不对等，建议统一成具体的摩尔范围值。下同），MgCl2（5-100mM）、Tris-HCl缓冲液（10-500mM,pH 5.0-10.0）配制水溶液，然后添加半乳糖激酶（GalK,H.Yu,V.Thon,K.Lau,L.Cai,Y.Chen,S.Mu,Y.Li,P.G.Wang and X.Chen,Chem.Comm.,2010,46,7507-7509.）；反应完成后，将反应体系的pH值调节至4.5-8.5并加入己糖磷酸化酶(HexGalNAcP，H.Yu,V.Thon,K.Lau,L.Cai,Y.Chen,S.Mu,Y.Li,P.G.Wang and X.Chen,Chem.Comm.,2010,46,7507-7509.)。待反应完成后，纯化即可直接获得TF抗原及其类似物。
添加半乳糖激酶后反应完成采用TLC(乙腈:水:醋酸=2:1:0.2)检测。加入己糖磷酸化酶后反应完成采用TLC(乙腈:水:醋酸=2:1:0.2或乙酸乙酯:甲醇:水:醋酸=4:2:1:0.1)检测。
所述步骤（3）中的唾液酸化TF抗原及其类似物的合成方法：化合物Ⅲ、、唾液酸及其类似物、CTP（胞苷三磷酸）三者之间的摩尔比为1：（0.5-20）：（0.5-20）（这里是比例，后面是具体值，二者不对等，建议统一成具体的摩尔范围值。下同），MgCl2(5.0-100mM)和Tris-HCl缓冲液(10-500mM,pH 5.0-10.5)配制水溶液，加入唾液酸CMP-合成酶（H.Yu andX.Chen,Org.Lett.,2006,8,2393-2396.;H.Yu,H.A.Chokhawala,S.Huang and X.Chen,Nat.protoc.,2007,1,2485-2492.;K.Lau,H.Yu,V.Thon,Z.Khedri,M.E.Leon,B.K.Tran and X.Chen,Org.Biomol.Chem.,2011,9,2784-2789.）和一种唾液酸转移酶（H.Yu,H.Chokhawala,R.Karpel,B.Wu,J.Zhang,Y.Zhang,Q.Jia and X.Chen,J.Am.Chem.Soc.,2005,127,17618-17619.;K.Lau,H.Yu,V.Thon,Z.Khedri,M.E.Leon,B.K.Tran and X.Chen,Org.Biomol.Chem.,2011,9,2784-2789.），实现一锅双酶法唾液酸化；反应完成后，纯化即可直接获得唾液酸化TF抗原及其类似物。
所述反应完成采用TLC（乙腈:水:醋酸=2:1:0.2 for compound 12 and 15;乙酸乙酯:甲醇:水:醋酸=4:2:1:0.1 for compound 13,14,16 and 17）检测。
所述步骤（2）中连续一锅双酶法中先后用到的酶分别是E.coli K-12 galactokinase（GalK）和Bifidobacterium infantis D-galactosyl-β1-3-N-acetyl-D-hexosamine phosphorylase（BiGalHexNAcP)，反应时间为25分钟-35小时。
所述步骤（3）中一锅双酶法唾液酸化中用到的酶是Neisseria meningitidis CMP-sialic acidsynthetase(NmCSS)和Pasteurella multocida sialyltransferase 1(PmST1)，反应时间为5分钟-30小时。
所述步骤（2）和步骤（3）中一锅双酶法合成中反应温度为0-37℃，转速为0-240rpm；所述酶反应的停止方法是向反应中加入与反应体系等体积的4℃无水乙醇并在4℃下培育0-30分钟。
通式Ⅲ或通式Ⅳ在制备抗肿瘤疫苗中的应用。由于氟代肿瘤相关糖抗原具有比天然糖抗原更优越的药代性质，因而，本发明的在发展新型抗肿瘤疫苗具有广泛的应用前景。
Thomsen-Friedenreich抗原，又名T-抗原，TF-抗原或CDl76，具体结构为Galβl-3GalNAcOR。唾液酸化Thomsen-Friedenreich抗原，即sTF抗原，sT抗原。
本发明提供了一种高效简捷的化学酶法合成TF抗原及其类似物的合成方法，本发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的高区域选择性和高效性结合到一起，首次实现了氟代TF-抗原的酶法合成，解决了目前化学合成氟代TF抗原中所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低等不足。由于氟代肿瘤相关糖抗原具有比天然糖抗原更优越的药代性质，因而，本发明的在发展新型抗肿瘤疫苗具有广泛的应用前景。
具体实施方式
1.化学酶法合成T抗原和sT抗原及其氟代衍生物
化合物2-乙酰氨基-2-脱氧-D-半乳糖的合成
反应方程式如下：
向500mL圆底烧瓶中，加入半乳糖氨基盐酸盐(7.01g,32.51mmol)、醋酐(60mL)、吡啶(Pyr 120mL)、二甲氨基吡啶(DMAP 1.06g,8.68mmol)，室温搅拌12h。薄层色谱检测（石油醚:乙酸乙酯=3:2），反应完全后，向反应液中加入20mL甲苯，旋蒸浓缩，反复进行3次。所得固体复溶于30mL甲醇，放置超声波0.25h后，在4℃条件下静置12h。过滤，弃除滤液，收集所得固体，干燥，获得白色固体化合物18(10.75g,收率85%)。
向500mL圆底烧瓶中，加入固体化合物18(5.69g,14.85mmol)和干燥的甲醇260mL，逐渐加入甲醇钠至反应夜pH值在9.0-10.0内。室温搅拌4小时，薄层色谱检测反应完全后，逐渐加入酸性离子交换树脂Dowex 50W至中性。过滤，收集滤液进行蒸干，得到化合物2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖(GalNAc,2；2.79g,收率85%)。
化合物3-叠氮丙基2-乙酰胺基-2-脱氧--D-吡喃半乳糖苷(GalNAc ProN3，3)的合成
反应方程式如下：
向250mL茄形瓶中，加入化合物18(5.06g,13.20mmol)、干燥的无水1,2-二氯乙烷(137mL)、无水硫酸钙(7.61g,55.91mmol)、三氯化铁(5.68g,35.05mmol)和3-氯-1-丙醇(4.5mL,53.83mmol)，在剧烈的搅拌下回流16小时。薄层色谱检测（石油醚:乙酸乙酯=3:2）反应完成后，使用硅藻土过滤，旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=3:2)，得到化合物19(3.92g,收率70%)。
向250mL反应瓶中，加入化合物19(2.05g,4.84mmol)、DMF(70mL)、叠氮化钠(2.03g,29.04mmol)、四丁基碘化铵(0.36g)，升温至110℃搅拌12h。薄层色谱检测反应完全后，使用硅藻土过滤，旋蒸浓缩，快速柱分离纯化获得白色固体化合物20(2.04g,收率98%)。
向250mL茄形瓶中，加入化合物20(2.04g,4.74mmol)、无水甲醇(85mL)，逐渐加入甲醇钠至pH值在9.0-10.0范围，室温搅拌4小时。薄层色谱检测（石油醚:乙酸乙酯=3:2）反应完全后，逐渐加入酸性离子交换树脂Dowex 50W至中性。过滤收集滤液蒸干，得到化合物3(1.42g,收率99%)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.76(d,J=3.8Hz,1H),4.01(dd,J=7.8,3.9Hz,1H),3.86-3.76(m,3H),3.69-3.58(m,3H),3.42-3.27(m,3H),1.90(s,3H),1.75(m,2H).LRMS(ESI)m/z calcd for C11H21N5O6(M+H+)304.15,found 305.40。
化合物3-叠氮丙基2-乙酰胺基-2,6-二脱氧-6-氟-α-D-吡喃半乳糖苷(GalNAc6FαProN3,4)的合成
反应方程式如下：
向250mL茄形瓶中，加入化合物3(1.42g,4.69mmol)、2,2-二甲氧基丙烷(55mL)、D(+)-10-樟脑磺酸(CSA，0.15g,0.66mmol)，加热至110℃回流1.2h。加三乙胺淬灭D(+)-10-樟脑磺酸中止反应，旋蒸浓缩至干，得糖稀状残留物。将其复溶于80%的甲醇(22mL)，加热回流3h。旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=2:1,2:3)，获得糖稀状化合物21(1.58g,收率98%)。
将化合物21(0.69g,2.00mmol)、二乙氨基三氟化硫(DAS T,0.51g,3.16mmol)、2,4,6-三甲基吡啶(collidine,0.84g,6.93mmol)和干燥的1,2-二氯乙烷(DCE，5mL)加入10mL微波反应管（MW）中，在80℃、100W的条件下反应1小时。冷却至室温后，加入甲醇终止反应。旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=3:2)，获得化合物22(0.56g,收率81%)。
将化合物22(0.74g,2.12mmol)在80%的醋酸(31.25mL)中加热至80℃反应4h。薄层色谱检测反应完成后，旋蒸浓缩并用甲苯带三次(3x15mL)至干。经快速柱分离纯化，获得白色粉末状化合物4(0.58g,收率90%)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.96(d,J=3.7Hz,1H),4.74(dt,J=3.6,10.2Hz,1H),4.65(ddd,J=4.2,10.8,30.0Hz,1H),4.26(ddd,J=16.8,7.2,3.6,1H),4.21(dd,J=11.4,3.6Hz,1H),4.08(d,J=3.0Hz,1H),3.98(dd,J=11.4,3.6Hz,1H),3.82(dt,J=10.2,6.0Hz,1H),3.57(dt,J=10.3,6.0Hz,1H),3.48(ddt,J=18.9,12.5,6.2Hz,2H),2.07(s,3H),1.92(m,2H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.57,97.16,83.51(d,J=165.19Hz),69.37(d,J=19.93Hz),68.13(d,J=7.85Hz),67.31,65.14,49.82,48.11,27.90,21.92.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.95。
化合物6-脱氧-6-氟-D-半乳糖(Gal6F,5)的合成
反应方程式如下：
将半乳糖(1,10.82g,60.05mmol)溶于干燥的丙酮(380mL)，在冰浴条件下逐渐加入浓硫酸(12.0mL)。移除冰浴，在室温下搅拌3.5h。加入水(11.0mL)和碳酸钠(23g,217.00mmol)淬灭硫酸终止反应。使用硅藻土过滤，旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=1:5,1:10)，获得糖稀状化合物23(15.16g,97%)。将化合物23(0.71g,2.75mmol)、二乙氨基三氟化硫(DAS T,0.58g,3.60mmol)、2,4,6-三甲基吡啶(collidine,0.80g,6.60mmol)和干燥的1,2-二氯乙烷(DCE,5mL)加入10mL微波反应管中，在80℃、100W的条件下反应1小时。冷却至室温后，加入甲醇终止反应。旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯=15:1)，得化合物24(0.81g,收率84%)。
将化合物24(2.67g,10.17mmol)溶于80%醋酸(67mL)加热回流24小时。薄层色谱检测（乙酸乙酯：甲醇=10:1）反应完成后，旋蒸浓缩，快速柱分离纯化(乙酸乙酯：甲醇=10:1)，获得白色固体化合物5(1.50g,收率81%)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ5.25(d,J=3.8Hz,1H),4.69-4.49(m,8H),4.30(ddd,J=16.5,7.4,3.6Hz,1H),4.00(s,1H),3.95(ddd,J=14.4,6.9,3.3Hz,4H),3.81(ddd,J=35.9,10.3,3.6Hz,2H),3.63(dd,J=10.0,3.5Hz,2H),3.47(dd,J=9.9,8.0Hz,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ96.32,92.25,83.39(d,J=165.19Hz),83.03(d,J=165.65Hz),82.48,73.32(d,J=20.08Hz),72.42,71.58,68.92(d,J=12.53Hz),68.83,68.74,68.73,68.26(d,J=7.55Hz),68.07.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.62,-229.76.
2.一锅双酶法合成TF抗原及其氟代类似物
一锅双酶法的一般操作方法：
一锅双酶法的一般操作方法
受体(2,3 or 4,50-100mg)和半乳糖(1,)或6-氟代半乳糖(5)、ATP的摩尔比为1:1.5:1.5（这里是比例，后面是具体值，二者不对等，建议统一成具体的摩尔范围值。下同）、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)和氯化镁(20mM)溶于50mL离心管中，加双蒸水至总体积10mL后，加入第一个酶GalK(3.0-4.0mg)。将反应体系置摇床中37℃、140rpm培育15小时。薄层色谱(乙腈:水:醋酸=2:1:0.2)检测反应完成后，用盐酸溶液调节pH值到6.0左右，加入第二个酶(BiGalHexNAcP，2.0-3.0mg)，37℃、140rpm培育20-30小时。TLC检测反（乙腈:水=10:1）应完全后，加入等体积的冷无水乙醇4℃、140rpm培育30min以终止反应。将反应体系4℃、12000rpm离心21分钟，收集上清液。上清液过0.22μm的微孔滤膜后，浓缩。通过硅胶柱快速柱分离(乙腈:水=10:1)和Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行组合纯化，获得纯品Thomsen-Friedenreich抗原及其氟代类似物（收率80%-87%）。
以下为一锅双酶法合成获得的代表性化合物6-11的列表：
合成的代表性TF-抗原
以下为一锅双酶法合成获得的化合物6-11的收率及结构信息：
β-D-吡喃半乳糖基-(1–3)-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-半乳糖(Galβ1-3GalNAc,6,81%))
1H NMR(600MHz,D2O)δ5.21(s,0.6H),4.69(d,J=8.3Hz,0.4H),4.48(d,J=7.2Hz,0.6H),4.44(d,J=7.2Hz,0.4H),4.29(d,J=10.8Hz,0.6H),4.25(s,0.6H),4.18(s,0.4H),4.13(s,0.6H),4.03(d,J=10.8Hz,0.6H),4.00-3.55(m,8H),3.52(t,J=7.8Hz,1H),2.02(s,3H).13CNMR(151MHz,D2O)δ174.48,104.67,97.13,77.09,74.91,72.39,70.54,70.50,68.68,68.49,64.79,61.11,60.90,48.59,48.08,27.88,21.89.HRMS(ESI)m/z calcd for C14H26NO11(M+H+)384.1506,found 384.1502.
3-叠氮丙基β-D-吡喃半乳糖基-(13)-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(Galβ1-3GalNAcaProN3,7,86%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.84(s,1H),4.41(d,J=7.8Hz,1H),4.28(d,J=10.8Hz,1H),4.20(s,1H),3.99(d,J=11.4Hz,1H),3.86(s,1H),3.77-3.68(m,4H),3.61-3.57(m,2H),3.50-3.41(m,4H),1.98(s,3H),1.86(m,2H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.87,174.58,104.79,104.61,95.08,91.10,79.98,76.95,74.86,74.75,72.44,72.39,70.53,70.47,70.10,68.65,68.47,67.98,61.08,60.89,60.85,52.34,48.89,22.15,21.91.HRMS(ESI)m/z calcd forC17H34N5O11(M+NH4+)484.2255,found 484.2249.
3-叠氮丙基β-D-吡喃半乳糖基-(1–3)-2-乙酰胺基-6-氟-2,6-二脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(Galβ1-3GalNAc6FProN3,8,88%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.83(s,1H),4.65-445(m,2H),4.36(d,J=7.0Hz,1H),4.26(d,J=10.9Hz,1H),4.21(s,1H),4.17(d,J=16.4Hz,1H),3.96(d,J=10.9Hz,1H),3.81(s,1H),3.71-3.63(m,3H),3.56-3.52(m,2H),3.46-3.36(m,4H),1.93(s,3H),1.81(m,2H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.52,104.71,97.30,83.48(d,J=165.34Hz),76.75,74.95,72.43,70.53,69.10(d,J=19.93Hz),68.54,68.38(d,J=8.30Hz),65.05,60.95,48.47,48.08,27.89,21.93.HRMS(ESI)m/z calcd for C17H30FN4O10(M+H+)469.1946,found 469.1939.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.40.
β-D-6-脱氧-6-氟-吡喃半乳糖基-(1–3)-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(Gal6Fβ1-3GalNAc,9,80%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ5.22(s,0.5H),4.60-4.50(m,2H),4.43(d,J=7.2Hz,0.5H),4.38(d,J=5.7Hz,0.5H),4.20(d,J=11.4Hz,0.5H),4.13(s,0.5H),4.05(d,J=15.4Hz,1H),3.93(d,J=11.0Hz,0.5H),3.87-3.80(m,2H),3.76(d,J=10.7Hz,0.5H),3.72-3.52(m,3H),3.48-3.40(m,1H),1.94(s,3H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.87,174.59,104.62,104.47,95.06,91.10,82.86(d,J=165.50Hz),82.816(d,J=165.65Hz)80.02,77.05,74.80,72.94.(d,J=20.69Hz),72.23,72.19,70.38,70.32,70.13,68.70,68.10(d,J=6.95Hz),68.03,61.15,60.93,52.33,48.86,22.15,21.92.HRMS(ESI)m/z calcd for C14H28FN2O10(M+NH4+)403.1728,found 403.1725.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.59,-229.74,-229.88,-229.95.
3-叠氮丙基β-D-6-脱氧-6-氟-吡喃半乳糖基-(13)-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(Gal6Fβ1-3GalNAcProN3,10,87%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.85(s,1H),4.66-4.49(m,2H),4.45(d,J=7.6Hz,1H),4.29(d,J=11.0Hz,1H),4.17(s,1H),3.98-3.87(m,4H),3.73-3.68(m,2H),3.60(d,J=9.9Hz,1H),3.50-3.41(m,3H),1.98(s,3H),1.86(m,2H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.47,104.49,97.11,82.86(d,J=165.65Hz),77.18,72.94(d,J=20.54Hz),72.16,70.56,70.33,68.69,68.04(d,J=7.10Hz),64.84,61.16,48.56,48.09,27.86,21.88.HRMS(ESI)m/z calcd forC17H33FN5O10(M+NH4+)486.2211,found 486.2201.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.86.
3-叠氮丙基β-D-6-脱氧-6-氟-吡喃半乳糖基-(13)-2-乙酰胺基-2,6-二脱氧-6-氟-α-D-吡喃半乳糖苷(Gal6Fβ1-3GalNAc6FProN3,11,82%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.83(s,1H),4.64-4.43(m,4H),4.40(d,J=7.0Hz,1H),4.26(d,J=10.9Hz,1H),4.18(s,1H),3.94(d,J=10.9Hz,1H),3.83(d,J=13.9Hz,1H),3.70(d,J=4.8Hz,1H),3.63(s,1H),3.54(d,J=9.7Hz,1H),3.49-3.27(m,3H),1.93(s,3H),1.81(m,2H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.53,104.56,97.29,83.50(d,J=165.19Hz),82.98(d,J=165.19Hz),76.87,73.02(d,J=20.38Hz),72.22,70.38,69.10(d,J=19.78Hz),68.36(d,J=7.8Hz),68.12(d,J=7.10),65.12,48.44,48.10,27.88,21.94.HRMS(ESI)m/z calcd forC17H29F2N4O9(M+H+)471.1903,found 471.1899.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.36,-229.81.
3.一锅双酶法合成唾液酸化TF抗原及其氟代类似物
一锅双酶法唾液酸化的一般操作方法：
一锅双酶法唾液酸化的一般操作方法
向50mL离心管中，加入由一锅双酶法合成得到的二糖受体(6,7,8,9,10或11,50-100mg)、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)或其类似物（KDN、Neu5Gc、Neu5Ac9N3等）、胞苷三磷酸胞苷三磷酸(CTP)，三者之间的摩尔比为1:1.5:1.5，Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.5)和氯化镁(20mM)，加双蒸水调节总体积为10mL，振动搅匀后加入酶NmCSS(0.5-0.8mg)和PmST1(0.2-0.3mg)，在37℃、140rpm条件下培育0.5h。薄层色谱（乙腈:水:醋酸=2:1:0.2for compound 12 and 15;乙酸乙酯:甲醇:水:醋酸=4:2:1:0.1 for compound 13,14,16 and 17）检测反应完成后，加入等体积的冷无水乙醇，4℃、140rpm培育0.5h。将反应体系4℃、12000rpm离心21分钟，收集上清液。上清液过0.22μm的微孔滤膜后，浓缩。通过硅胶柱快速柱分离(乙酸乙酯:甲醇:水=6:2:1)和Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行组合纯化，获得纯品唾液酸化的Thomsen-Friedenreich抗原及其氟代类似物（收率95-99%）。
以下为一锅双酶法唾液酸化合成获得的代表性化合物12-17的列表：
一锅双酶法唾液酸化合成获得的代表性化合物12-17
以下为一锅双酶法唾液酸化合成获得的化合物12-17的收率及结构信息：
5-乙酰胺基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-吡喃九碳酮糖酸-(2-3)-β-D-吡喃半乳糖基-(1–3)-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-半乳糖(Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAc,12,99%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ5.18(s,0.6H),4.64(d,J=7.8Hz,0.4H),4.52(d,J=6.7Hz,0.6H),4.46(d,J=6.7Hz,0.4H),4.24-4.20(m,1H),4.13-3.79(m,7H),3.72-3.50(m,8H),2.70(d,J=11.4Hz,1H),2.00(s,3H),1.98(s,3H)1.76(t,J=11.9Hz,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.91,174.87,174.60,173.38,173.34,104.53,104.53,104.36,104.36,99.33,99.33,95.10,95.10,91.06,91.06,80.24,80.24,77.20,77.20,75.56,75.56,75.48,75.48,74.75,74.75,74.61,74.61,72.76,72.76,71.95,71.95,71.56,71.56,70.10,70.10,68.99,68.99,68.91,68.91,68.48,68.48,68.13,68.13,67.96,67.96,67.83,67.83,67.30,67.30,62.48,62.36,61.35,61.10,60.87,60.81,52.22,51.54,48.88,39.44,22.21,21.97,21.94.HRMS(ESI)m/z calcd forC25H42N2O19Na(M+Na+)697.2279,found 697.2292.
3-叠氮丙基5-乙酰胺基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-吡喃九碳酮糖酸-(2-3)-β-D-吡喃半乳糖基-(1-3)-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAcαProN3,13,98%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.86(s,1H),4.49(d,J=7.4Hz,1H),4.27(d,J=10.8Hz,1H),4.20(s,1H),4.04(d,J=9.6Hz,1H),3.99(d,J=10.7Hz,1H),3.94(s,1H),3.89(s,1H),3.85-3.56(m,12H),3.54(d,J=8.8Hz,1H),3.44-3.41(m,5H),2.70(d,J=12.4Hz,1H),1.98(s,6H),1.85(m,2H),1.77(t,J=12.2Hz,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.86,174.48,173.24,104.37,99.32,97.09,77.35,75.51,74.63,72.77,71.95,71.53,68.97,68.49,68.09,67.95,67.33,64.79,62.49,61.12,60.84,51.52,48.57,48.06,39.38,27.88,21.94.HRMS(ESI)m/z calcd forC28H48N5O19(M+H+)758.2943,found 758.2957.
3-叠氮丙基5-乙酰胺基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-吡喃九碳酮糖酸-(2-3)-β-D-吡喃半乳糖基-(1–3)-6-氟-2-乙酰胺基-2,6-二脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAc6FαProN3,14,99%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.89(s,1H),4.74-4.53(m,3H),4.49(d,J=7.4Hz,1H),4.29(d,J=11.4Hz,1H),4.26(s,1H),4.22(d,J=14.1Hz,1H),4.03-4.01(m,2H),3.88(s,1H),3.85-3.77(m,2H),3.75(d,J=5.9Hz,1H),3.72-3.56(m,4H),3.54(d,J=8.9Hz,1H),3.51-3.41(m,4H),2.70(d,J=12.3Hz,1H),1.98(s,6H),1.85(m,2H),1.75(t,J=11.9Hz,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.88,174.52,173.59,104.43,99.48,97.23,83.46(d,J=165.50Hz),76.94,75.51,74.67,72.73,71.80(d,J=44.85Hz),69.07(d,J=20.23Hz),68.96,68.21,67.94,67.30,64.97,62.43,62.35,61.34,60.87,51.53,48.41,48.00,39.50,27.85,21.93.HRMS(ESI)m/zcalcd for C28H47FN5O18(M+H+)760.2980,found 760.2916.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.34.
5-乙酰胺基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-吡喃九碳酮糖酸-(2-3)-β-D-6-脱氧-6-氟-吡喃半乳糖基-(1–3)-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-半乳糖(Neu5Acα2,3Gal6Fβ1,3GalNAc,15,95%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ5.19(s,0.5H),4.64(d,J=7.8Hz,0.5H),4.60(s,0.5H),4.56(d,J=8.4Hz,1H),4.53(s,0.5H),4.50(d,J=7.8Hz,1H),4.24(d,J=10.8Hz,0.5H),4.19(s,0.5H),4.11-4.02(m,1.5H),4.00(d,J=10.8Hz,0.5H),3.94(s,1H),3.90-3.77(m,3.5H),3.74-3.46(m,8H),2.71(d,J=12.1Hz,1H),2.01(s,3H),1.98(s,3H),1.74(t,J=11.9Hz,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.91,174.88,174.88,174.61,173.83,173.79,104.32,104.19,99.58,99.58,95.09,91.05,91.05,82.99(d,J 166.70Hz),82.93(d,J=166.55Hz),82.38,80.36,80.19,77.21,77.21,75.31,75.05(d,J=66.74Hz),72.83(d,J=19.02Hz),72.76,72.71,72.71,71.95,71.95,71.73,71.73,70.13,70.13,68.83,68.74,68.53,68.53,68.30,68.30,67.94,67.94,67.88,66.98,66.93,62.36,62.36,61.35,61.35,61.16,61.16,60.95,59.18,52.20,51.54,48.86,39.56,21.96,21.93.HRMS(ESI)m/z calcd for C25H42FN2O18(M+H+)677.2417,found677.2412.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.19,-229.35,-229.54,-229.64.
3-叠氮丙基5-乙酰胺基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-吡喃九碳酮糖酸-(2-3)-β-D-6-脱氧-6-氟-吡喃半乳糖基-(1-3)-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(Neu5Acα2,3Gal6Fβ1,3GalNAcαProN3,16,98%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ5.40(s,1H),4.86(s,1H),4.75(s,1H),4.62-4.49(m,2H),4.27(d,J=10.7Hz,1H),4.18(s,1H),4.06(d,J=9.5Hz,1H),3.99(d,J=10.8Hz,1H),3.94(s,2H),3.87(d,J=12.2Hz,1H),3.81(d,J=10.2Hz,2H),3.76(d,J=6.0Hz,1H),3.74-3.56(m,5H),3.54(d,J=9.0Hz,1H),3.53-3.46(m,2H),3.45-3.36(m,2H),2.70(d,J=12.1Hz,1H),1.98(s,6H),1.86(m,2H),1.75(t,J=12.1Hz,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.86,174.48,173.56,104.17,99.51,97.07,82.95(d,J=166.40Hz),77.40,75.25,72.72,71.79(d,J=43.79Hz),70.55,68.82,68.50,68.21,67.92,66.94,64.83,62.41,62.34,61.25(d,J=23.71Hz),51.52,48.54,48.07,39.45,27.85,21.93.HRMS(ESI)m/z calcd for C28H47FN5O18(M+H+)760.2900,found760.2904.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.58.
3-叠氮丙基5-乙酰胺基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-吡喃九碳酮糖酸-(2-3)-β-D-6-脱氧-6-氟-吡喃半乳糖基-(1–3)-2-乙酰胺基-6-氟-2,6-二脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(Neu5Acα2,3Gal6Fβ1,3GalNAc6FαProN3,17,99%)
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.90(s,1H),4.68-4.49(m,3H),4.30(d,J=10.8Hz,1H),4.21-4.17(m,2H),4.05(d,J=9.6Hz,1H),4.01(d,J=10.9Hz,1H),3.94(s,1H),3.87(d,J=11.5Hz,1H),3.80(d,J=10.2Hz,2H),3.75(d,J=5.4Hz,1H),3.69-3.51(m,5H),3.45-3.36(m,2H),3.56-3.48(m,2H),3.47-3.34(m,2H),2.70(d,J=12.3Hz,1H),1.98(s,6H),1.86(m,2H),1.75(t,J=12.0Hz,1H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.89,174.53,173.64,104.25,99.56,97.23,83.48(d,J=165.65Hz),83.00(d,J=165.95Hz)77.04,75.25,72.83,(d,J=20.54Hz)72.74,71.69,69.08(d,J=19.63Hz),68.82,68.24,68.18(d,J=8.15Hz),67.94,66.98(d,J=7.70Hz),65.04,62.43,61.35,51.54,48.38,48.02,39.48,27.83,21.93.HRMS(ESI)m/z calcdfor C28H46F2N5O17(M+H+)762.2857,found 762.2857.19F NMR(282MHz,D2O)δ-229.29,-229.50.
Claims (10)
1.通式Ⅲ所示的TF抗原及其类似物或通式Ⅳ所示的唾液酸化TF抗原及其类似物：
其中：
R1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基；
R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基；
R4，选自氟原子、羟基；
R5，选自氟原子、羟基；
R6，选自氟原子、羟基；
R7，选自氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮；
R8，选自氟原子、羟基、叠氮。
2.一种权利要求1所述的TF抗原及其类似物的化学酶法合成方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）选用通式Ⅰ所示的氟代半乳糖胺类似物或半乳糖胺类似物；
其中：
R1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基；
R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基；
和选用通式Ⅱ所示的氟代半乳糖或半乳糖：
其中:
R4，选自氟原子、羟基；
R5，选自氟原子、羟基；
R6，选自氟原子、羟基；
（2）利用一锅双酶法将通式Ⅰ和通式Ⅱ所示的化合物立体选择性偶联合成TF抗原及其类似物，所述一锅双酶法中先后用到的酶分别为半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；
通式Ⅲ所示的TF抗原及其类似物：
其中：
R1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基；
R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基；
R4，选自氟原子、羟基；
R5，选自氟原子、羟基；
R6，选自氟原子、羟基；
（3）利用一锅双酶法合成唾液酸化TF抗原及其类似物，所述唾液酸化采用唾液酸及其类似物，其中唾液酸的类似物为R7、R8取代的唾液酸，所述一锅双酶法唾液酸化中用到的酶指唾液酸CMP-合成酶和唾液酸转移酶；
通式Ⅳ所示的唾液酸化TF抗原及其类似物：
其中：
R1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基；α-或β-构型取代烷基；
R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基；
R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基；
R4，选自氟原子或羟基；
R5，选自氟原子、羟基；
R6，选自氟原子、羟基；
R7，选自氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮；
R8，选自氟原子、羟基、叠氮。
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤（1）中的氟代半乳糖胺类似物采用以下方法合成：将半乳糖氨基盐酸盐与醋酐进行反应后，将其C-3，C-4位用2,2-二甲氧基丙烷在樟脑磺酸催化下进行丙酮叉保护；将仅裸露6-位羟基的氮取代氨基半乳糖苷在微波条件下进行氟代，脱保护后即得。
4.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤（1）中的氟代半乳糖采用以下方法合成：先将半乳糖的1,2-和3,4-位在丙酮中用浓硫酸催化进行丙酮叉保护，再在微波条件下进行氟代，脱保护后即得。
5.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤（2）中的TF抗原及其类似物合成方法是：将0.5-20当量的化合物I、1.0-10.0当量化合物II、0.5-20当量ATP、5-100mMMgCl2、10-500mM,pH 5.0-10.0的Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后添加半乳糖激酶；反应完成后，将反应体系的pH值调节至4.5-8.5并加入己糖磷酸化酶；待反应完成后，纯化即可直接获得TF抗原及其类似物。
6.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤（3）中的唾液酸化TF抗原及其类似物的合成方法：将1.0-10.0当量的化合物Ⅲ、0.5-20.0当量的唾液酸及其类似物、0.5-20.0当量的CTP、5.0-100mM的MgCl2和10-500mM,pH 5.0-10.5的Tris-HCl缓冲液配制水溶液，加入唾液酸CMP-合成酶和唾液酸转移酶，实现一锅双酶法唾液酸化；反应完成后，纯化即可直接获得唾液酸化TF抗原及其类似物。
7.如权利要求5所述的合成方法，其特征是，所述一锅双酶法中先后用到的酶分别是E.coli K-12 galactokinase（GalK）和Bifidobacterium infantis D-galactosyl-β1-3-N-acetyl-D-hexosamine phosphorylase（BiGalHexNAcP)，反应时间为25分钟-35小时。
8.如权利要求6所述的合成方法，其特征是，所述一锅双酶法唾液酸化中用到的酶是Neisseria meningitidis CMP-sialic acid synthetase(NmCSS)和Pasteurella multocidasialyltransferase 1(PmST1)，反应时间为5分钟-30小时。
9.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，所述的酶法合成中反应温度为0-37℃，转速为0-240rpm；所述酶反应的停止方法是向反应中加入等体积的4℃无水乙醇并在4℃下培育0-30分钟。
10.权利要求1所述的通式Ⅲ或通式Ⅳ在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103555796A (zh) * | 2013-10-24 | 2014-02-05 | 山东大学 | 双唾液酸化四糖的合成方法 |
| CN106488774A (zh) * | 2014-04-18 | 2017-03-08 | 纽约州立大学研究基金会 | 人源化抗‑tf‑抗原抗体 |
| CN108164573A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-06-15 | 天津科技大学 | 唾液酸化tf抗原及其氟代衍生物的合成方法及其应用 |
| CN108251474A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-07-06 | 山东大学 | Abh人血型抗原的合成方法 |
| CN109678913A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-04-26 | 天津科技大学 | 一种唾液酸化tf抗原内酯及其氟代类似物的合成方法 |
| CN110156851A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-08-23 | 南京博源医药科技有限公司 | 一种n-乙酰氨基半乳糖的制备方法 |
| CN111909910A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-11-10 | 山东大学 | 一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法 |
| CN113150046A (zh) * | 2021-04-26 | 2021-07-23 | 安徽银丰药业股份有限公司 | 一种n-乙酰基-d-半乳糖胺的制备方法 |
| CN114306586A (zh) * | 2022-01-04 | 2022-04-12 | 天津科技大学 | 基于tf抗原和壳寡糖内源性佐剂的肿瘤疫苗、方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001079846A2 (en) * | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Research Corporation Technologies, Inc. | Diagnostic assay for endometriosis |
| CN101319201A (zh) * | 2008-04-18 | 2008-12-10 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法和用途 |
-
2012
- 2012-08-22 CN CN2012103007107A patent/CN102796144A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001079846A2 (en) * | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Research Corporation Technologies, Inc. | Diagnostic assay for endometriosis |
| CN101319201A (zh) * | 2008-04-18 | 2008-12-10 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法和用途 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KAM LAU，等: "Sequential two-step multienzyme synthesis of tumor-associated sialyl T-antigens and derivatives", 《ORG. BIOMOL. CHEM.》 * |
| THOMAS OBERBILLIG，等: "Antibody recognition of fluorinated MUC1 glycopeptide antigens", 《CHEM. COMMUN.》 * |
| 尹晓娟，等: "肝素类寡糖合成研究进展", 《有机化学》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103555796A (zh) * | 2013-10-24 | 2014-02-05 | 山东大学 | 双唾液酸化四糖的合成方法 |
| CN103555796B (zh) * | 2013-10-24 | 2015-02-04 | 山东大学 | 双唾液酸化四糖的合成方法 |
| CN106488774A (zh) * | 2014-04-18 | 2017-03-08 | 纽约州立大学研究基金会 | 人源化抗‑tf‑抗原抗体 |
| CN108164573A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-06-15 | 天津科技大学 | 唾液酸化tf抗原及其氟代衍生物的合成方法及其应用 |
| CN108251474A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-07-06 | 山东大学 | Abh人血型抗原的合成方法 |
| CN109678913A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-04-26 | 天津科技大学 | 一种唾液酸化tf抗原内酯及其氟代类似物的合成方法 |
| CN110156851A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-08-23 | 南京博源医药科技有限公司 | 一种n-乙酰氨基半乳糖的制备方法 |
| CN111909910A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-11-10 | 山东大学 | 一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法 |
| CN113150046A (zh) * | 2021-04-26 | 2021-07-23 | 安徽银丰药业股份有限公司 | 一种n-乙酰基-d-半乳糖胺的制备方法 |
| CN114306586A (zh) * | 2022-01-04 | 2022-04-12 | 天津科技大学 | 基于tf抗原和壳寡糖内源性佐剂的肿瘤疫苗、方法和应用 |
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