CN110790845B - 一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法及应用，该方法为尿苷二磷酸4‑位巯基2‑位酰胺基葡萄糖或尿苷二磷酸4‑位巯基2‑位酰胺基半乳糖糖基供体类化合物酶催化构建含硫苷键糖胺聚糖式(XIV)的方法。

Description

一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法及应用
技术领域
本申请涉及医药技术领域，特别是涉及一种含硫苷键糖胺聚糖的 制备方法及应用。
背景技术
癌症是全球第二大死因。最新调查结果显示，2018年全球癌症 新发病例1810万，死亡病例960万。其中，中国癌症的发病人数和 死亡人数均居全球第一位。目前临床上恶性肿瘤的治疗方法以手术治 疗、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗为主，但都存在很大的局限性。 据研究统计，我国肿瘤患者5年生存率仅在30％左右，而引起患者 死亡的首要因素则是肿瘤转移。因此，针对肿瘤转移设计药物已成为 新型抗肿瘤药物开发的重要方向。
近年来，糖胺聚糖被报道可以通过抑制体内乙酰肝素酶从而抑制 肿瘤转移，在临床上具有重要的意义，但存在半衰期过短等缺点。非 天然的硫代糖苷键糖胺聚糖相比氧代糖苷键类似物对酸和水解酶更 加耐受，因而在代谢过程中更加稳定，更有潜力发展成新型的抗肿瘤 药物。然而在传统糖化学合成中，由于糖基供体易消除或水解以及受 体羟基和巯基的竞争性干扰，加上糖苷键的立体选择性难以控制，导 致硫苷键的构建一直是一大挑战。本发明通过设计尿苷二磷酸4-位巯 基2-位酰胺基葡萄糖和尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基半乳糖糖基 供体类化合物，利用糖基转移酶催化成功实现一系列含硫苷键的糖胺聚糖的制备。此发明中涉及的4-位巯基糖基供体化合物的结构、合成 路线以及糖基转移酶催化构建硫苷键寡糖的方法，至今未见报道。
申请内容
解决的技术问题：
本申请需要解决的技术问题是现有技术中存在半衰期过短、糖基 供体易消除或水解、受体羟基和巯基的竞争性干扰和糖苷键的立体选 择性难以控制等技术问题，提供一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法及 应用。
技术方案：
一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法，反应路线如下：
Figure BDA0002173981130000031
第一步，即步骤a：将1.5mmol尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡 萄糖糖基供体化合物(I)、1.2mmol化合物(X)和20μg/mL糖基转 移酶PmHS2在缓冲溶液中室温下反应15小时，所述缓冲溶液为含有 15mmol MnCl2，25mmol、pH 7.2的Tris，10mM DTT和10mL水， 反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，得到化合物 (XI)；
第二步，即步骤b：将1.2mmol化合物(XI)、1.5mmol葡萄糖醛 酸糖基供体(XII)和20μg/mL糖基转移酶PmHS2在缓冲溶液中室 温下反应15小时，所述缓冲溶液含有15mmolMnCl2，25mmol、pH 7.2的Tris，10mM DTT和10mL水，反应通过HPLC进行监测，产 物通过C18反相柱分离，得到化合物(XIII)；
第三步，重复步骤a和步骤b：将化合物(XIII)经过糖基转移 酶PmHS2催化尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合 物(I)，然后经过糖基转移酶PmHS2催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸供 体化合物(XII)，重复n次，其中，n为从1到100的自然数，因而 得到的含硫苷键胺聚糖(XIV)是一系列结构类似的化合物，糖链长 度随着数值n不同而变化，得到含硫苷键胺聚糖(XIV)。
作为本申请的一种优选技术方案：所述糖基转移酶为PmHS2、PmHS1、 PmCS、PmHA、KfiA、KfiC、KfoC或β3GnT。
作为本申请的一种优选技术方案：所述化合物(X)为糖胺聚糖 衍生物的寡糖或多糖，在糖链非还原端为葡萄糖醛酸，糖胺聚糖衍生 物包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、角质素或透 明质酸。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第一步中尿苷二磷酸4- 位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合物(I)可以用尿苷二磷酸4- 位巯基2-位酰胺基半乳糖糖基供体(II)替代。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第一步中尿苷二磷酸4-位巯基 2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合物其结构通式为式(I)，所述尿苷二 磷酸4-位巯基2-位酰胺基半乳糖糖基供体化合物其结构通式为式(II)
Figure BDA0002173981130000041
优选地，4-位巯基的构型是平伏键或直立键；
优选地，在通式(I)和(II)中：
糖基供体为二磷酸形式或二磷酸盐形式，具体为钠盐、钾盐、铵 盐、三乙胺盐或吡啶盐；
R1＝CH3、CF3、CH2-CH3、CH＝CH2、C≡CH、CH2N3或CH2CH2N3。 作为本申请的一种优选技术方案：所述式(I)的合成路线如下：
Figure BDA0002173981130000051
第一步：将520mg、1mmol化合物(III)溶解在5mL DCM和0.5mL 吡啶中，在-10℃下加入0.34mL、2mmol三氟甲磺酸酐，搅拌2小 时，Rf＝0.6的TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1 组成，反应完全，向反应液中加入20mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳 酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩 得化合物(IV)，所述化合物(IV)的浓缩物不经过纯化，直接进行 下一步；
第二步：将化合物(IV)的浓缩物溶解在5mL DMF中，加入340mg、 3mmol硫氰化钾，室温下搅拌5小时，Rf＝0.6的TLC检测，所述 TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1组成，反应完全后向反应液中 加入20mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，经体积比石油醚：乙酸乙酯 ＝4:1的硅胶柱层析纯化得到黄色油状化合物(V)360mg,第一步和 第二步两总产率为67％；
第三步：将207mg、0.38mmol化合物(V)溶解在5mL DCM中， 加入136mg、0.84mmol三氯化铁，室温下搅拌5小时，Rf＝0.5的 TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组成，反应完 全后向反应液中加入15mL DCM，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱 和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物(VI)；
第四步：将化合物(VI)的浓缩物溶解在5mL THF中，所述5mL THF 中含有0.42mL、2M N,N-二异丙基胺锂LDA溶液，降温至-78℃， 该温度下搅拌0.5小时，然后在-78℃加入[(BnO)2PO]2,并搅拌3小时， Rf＝0.4的TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组 成，反应完全后向反应液中加入饱和碳酸氢铵溶液淬灭反应，再加入 15mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤， 有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，经体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1 硅胶柱层析，纯化得到黄色油状化合物(VII)198mg,第三步和第四步 两步总产率73％；
第五步：将100mg、0.13mmol化合物(VII)溶解在10mL甲醇中， 加入10mg钯碳，室温常压下通入氢气0.5小时，Rf＝0.4的TLC检 测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组成，反应完全后浓 缩有机溶剂得化合物(VIII)，所述化合物(VIII)的浓缩物不经过纯化，直接进行下一步；
第六步：将化合物(VIII)的浓缩物溶解在10mL吡啶中，加入40mg、0.5 mmol四氮唑和140mg、0.2mmol的UMP morpholidate，常温下反 应24小时，浓缩有机溶剂，经P-2凝胶柱层析，层析用后水淋洗， 冻干馏分得到白色固体化合物(IX)70mg,第五步和第六步两步总产 率58％；
第七步：将60mg、0.07mmol化合物(IX)溶解在5mL甲醇中，所 述5mL甲醇中含有0.2mL、5.5M甲醇钠溶液，室温下反应12小时， 用Dowex 50WX8酸性树脂中和，浓缩有机溶剂，经P-2凝胶柱层析， 层析后用水淋洗，冻干馏分得到白色固体产物化合物(I)20mg,产率55％。
作为本申请的一种优选技术方案：所述式(II)的合成路线如下：
Figure BDA0002173981130000081
第一步：将520mg、1mmol化合物(XV)溶解在5mL DCM和0.5mL 吡啶中，在-10℃下加入0.34mL、2mmol三氟甲磺酸酐，搅拌2小 时，Rf＝0.6的TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1 组成，反应完全后向反应液中加入20mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳 酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩 得化合物(XVI)，所述化合物(XVI)的浓缩物不经过纯化，直接 进行下一步；
第二步：将化合物(XVI)的浓缩物溶解在5mL DMF中，加入340mg、 3mmol硫氰化钾，室温下搅拌5小时，Rf＝0.6的TLC检测，所述 TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1组成，反应完全后向反应液中 加入20mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，经体积比石油醚：乙酸乙酯 ＝4:1的硅胶柱层析纯化得到黄色油状化合物(XVII)360mg,第一步 和第二步两总产率为67％；
第三步：将207mg、0.38mmol化合物(XVII)溶解在5mL DCM中， 加入136mg、0.84mmol三氯化铁，室温下搅拌5小时，Rf＝0.5的 TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组成，反应完 全后向反应液中加入15mL DCM，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物(XVIII)， 化合物(XVIII)的浓缩物不经过纯化，直接进行下一步；
第四步：将化合物(XVIII)的浓缩物溶解在5mL THF中，所述5mL THF中含有0.42mL、2M N,N-二异丙基胺锂LDA溶液，降温至-78℃， 该温度下搅拌0.5小时，然后在-78℃加入[(BnO)2PO]2,并搅拌3小时， Rf＝0.4的TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组 成，反应完全后向反应液中加入饱和碳酸氢铵溶液淬灭反应，再加入 15mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤， 有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，经体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1 硅胶柱层析，纯化得到黄色油状化合物(XIX)198mg,第三步和第四 步两步总产率73％；
第五步：将100mg、0.13mmol化合物(XIX)溶解在10mL甲醇中， 加入10mg钯碳，室温常压下通入氢气0.5小时，Rf＝0.4的TLC检 测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组成，反应完全后浓 缩有机溶剂得化合物(XX)，所述化合物(XX)的浓缩物不经过纯化， 直接进行下一步；
第六步：将化合物(XX)的浓缩物溶解在10mL吡啶中，加入40mg、0.5 mmol四氮唑和140mg、0.2mmol的UMP morpholidate，常温下反 应24小时，浓缩有机溶剂，经P-2凝胶柱层析，层析用后水淋洗， 冻干馏分得到白色固体化合物(XXI)70mg,第五步和第六步两步总产率58％；
第七步：将60mg、0.07mmol化合物(XXI)溶解在5mL甲醇中， 所述5mL甲醇中含有0.2mL、5.5M甲醇钠溶液，室温下反应12小 时，用Dowex 50WX8酸性树脂中和，浓缩有机溶剂，经P-2凝胶柱 层析，层析后用水淋洗，冻干馏分得到白色固体产物化合物(II)20mg, 产率55％。
一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法制备得到的含硫苷键糖胺聚 糖在抗肿瘤活性方面的应用。
一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法制备得到的含硫苷键糖胺聚 糖在抗凝血活性的应用。
一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法制备得到的含硫苷键糖胺聚 糖在抗炎和作为靶向药物载体领域的应用。
有益效果：
本申请所述一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法及应用采用以上 技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：
1、糖基供体易消除或水解以及受体羟基和巯基的竞争性干扰， 加上糖苷键的立体选择性难以控制，导致硫苷键的构建一直是一大挑 战。在本发明专利中，所有糖基转移酶催化的反应的立体选择性和区 域选择性都>99％。
2、传统糖化学合成中，为了控制糖基化偶联的区域选择性，需 要对供体和受体的其他位置的羟基进行保护，待偶联后再进行脱保护， 反应步骤繁琐，且导致总产率低。比如，现有黄达肝素的化学合成涉 及到不同类型的多个保护基操作和选择性硫酸化，总合成步数多达 60步，总产率小于0.1％(见参考文献Angew.Chem.,Int.Ed.2004,43, 3118-3133)。本发明充分利用了酶的高效选择性，避免了羟基的保 护与去保护，因而反应效率更高。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案做进一步的详细说明：
本技术领域技术人员可以理解的是，除非另外定义，这里使用的 所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普 通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典 中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义 一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的 含义来解释。
Dowex 50WX8酸性树脂购自Sigma公司，型号217514-500G。 糖基转移酶PmHS2是由本实验室的工程菌pmHS2发酵得到，具体 发酵方法已经在文献中公开(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2014, 98:1127–1134)。
合成路线中的起始化合物(III)和(XV)已经在文献中公开(J.Org. Chem.2017,82,2243-2248)
葡萄糖醛酸供体购自Millipore-Sigma公司，型号U6751。
实施例1:
一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法，反应路线如下：
Figure BDA0002173981130000121
第一步：将1.5mmol尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供 体化合物(I)、1.2mmol化合物(X)和20μg/mL糖基转移酶PmHS2 在缓冲溶液中室温下反应15小时，所述缓冲溶液含有15mmol MnCl2和25mmol、pH 7.2的Tris,10mM DTT和10mL水，反应通过HPLC 进行监测，产物通过C18反相柱分离，得到化合物(XI)；
第二步：将1.2mmol化合物(XI)、1.5mmol葡萄糖醛酸糖基供体 XII和20μg/mL糖基转移酶PmHS2在缓冲溶液中室温下反应15小 时，所述缓冲溶液含有15mmol MnCl2和25mmol、pH 7.2的Tris,10 mM DTT和10mL水，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反 相柱分离，得到化合物(XIII)；
第三步：将化合物(XIII)经过糖基转移酶PmHS2催化尿苷二磷酸 4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合物(I)，然后经过糖基转移 酶PmHS2催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸供体化合物(XII)。其中，n 为从1到100的自然数，因而得到的含硫苷键糖胺聚糖(XIV)是一系 列结构类似的化合物，糖链长度随着数值n不同而变化。所述糖基 转移酶除了采用PmHS2,还可以采用PmHS1,PmCS,PmHA,KfiA, KfiC,KfoC或β3GnT。
化合物(X)为糖胺聚糖衍生物的寡糖或多糖，在糖链非还原端为葡 萄糖醛酸，糖胺聚糖衍生物包括肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素， 硫酸皮肤素，角质素或透明质酸。
所述通过控制步骤a和b的次数得到相应长度的糖链。
所述第一步中尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合 物其结构通式为式(I)，
Figure BDA0002173981130000131
优选地，4-位巯基的构型是平伏键或直立键；
优选地，在通式(I)和(II)中：
糖基供体为二磷酸形式或二磷酸盐形式，具体为钠盐、钾盐、铵 盐、三乙胺盐或吡啶盐；
R1＝CH3、CF3、CH2-CH3、CH＝CH2、C≡CH、CH2N3或CH2CH2N3。 所述式(I)的合成路线如下：
Figure BDA0002173981130000141
第一步：将520mg、1mmol化合物(III)溶解在5mL DCM和0.5mL 吡啶中，在-10℃下加入0.34mL、2mmol三氟甲磺酸酐，搅拌2小 时，Rf＝0.6的TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1 组成，反应完全，向反应液中加入20mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳 酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩 得化合物(IV)，所述化合物(IV)的浓缩物不经过纯化，直接进行 下一步；
第二步：将化合物(IV)的浓缩物溶解在5mL DMF中，加入340mg、 3mmol硫氰化钾，室温下搅拌5小时，Rf＝0.6的TLC检测，所述 TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1组成，反应完全后向反应液中 加入20mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，经体积比石油醚：乙酸乙酯 ＝4:1的硅胶柱层析纯化得到黄色油状化合物(V)360mg,第一步和 第二步两总产率为67％；
第三步：将207mg、0.38mmol化合物(V)溶解在5mL DCM中， 加入136mg、0.84mmol三氯化铁，室温下搅拌5小时，Rf＝0.5的 TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组成，反应完 全后向反应液中加入15mL DCM，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱 和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物(VI)；
第四步：将化合物(VI)的浓缩物溶解在5mL THF中，所述5mL THF 中含有0.42mL、2M N,N-二异丙基胺锂LDA溶液，降温至-78℃， 该温度下搅拌0.5小时，然后在-78℃加入[(BnO)2PO]2,并搅拌3小时， Rf＝0.4的TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组 成，反应完全后向反应液中加入饱和碳酸氢铵溶液淬灭反应，再加入 15mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤， 有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，经体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1 硅胶柱层析，纯化得到黄色油状化合物(VII)198mg,第三步和第四步 两步总产率73％；
第五步：将100mg、0.13mmol化合物(VII)溶解在10mL甲醇中， 加入10mg钯碳，室温常压下通入氢气0.5小时，Rf＝0.4的TLC检 测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组成，反应完全后浓 缩有机溶剂得化合物(VIII)，所述化合物(VIII)的浓缩物不经过纯化，直接进行下一步；
第六步：将化合物(VIII)的浓缩物溶解在10mL吡啶中，加入40mg、0.5 mmol四氮唑和140mg、0.2mmol的UMP morpholidate，常温下反 应24小时，浓缩有机溶剂，经P-2凝胶柱层析，层析用后水淋洗， 冻干馏分得到白色固体化合物(IX)70mg,第五步和第六步两步总产 率58％；
第七步：将60mg、0.07mmol化合物(IX)溶解在5mL甲醇中，所述5 mL甲醇中含有0.2mL、5.5M甲醇钠溶液，室温下反应12小时，用 Dowex 50WX8酸性树脂中和，浓缩有机溶剂，经P-2凝胶柱层析， 层析后用水淋洗，冻干馏分得到白色固体产物化合物(I)20mg,产率55％。
实施例2：
一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法，反应路线如下：
Figure BDA0002173981130000171
第一步：将1.5mmol尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供 体化合物(I)、1.2mmol化合物(X)和20μg/mL糖基转移酶PmHS2 在缓冲溶液中室温下反应15小时，所述缓冲溶液为含有15mmol MnCl2，25mmol、pH 7.2的Tris，10mM DTT和10mL水，反应 通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，得到化合物(XI)；
第二步：将1.2mmol化合物(XI)、1.5mmol葡萄糖醛酸糖基供体 (XII)和20μg/mL糖基转移酶PmHS2在缓冲溶液中室温下反应15 小时，所述缓冲溶液含有15mmol MnCl2，25mmol、pH 7.2的Tris， 10mM DTT和10mL水，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18 反相柱分离，得到化合物(XIII)；
第三步：将化合物(XIII)经过糖基转移酶PmHS2催化尿苷二磷酸 4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合物(I)，然后经过糖基转移 酶PmHS2催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸供体化合物(XII)，重复n次， 其中，n为从1到100的自然数，因而得到的含硫苷键胺聚糖(XIV) 是一系列结构类似的化合物，糖链长度随着数值n不同而变化，得 到含硫苷键胺聚糖(XIV)。
所述糖基转移酶采用PmHS2,PmHS1,PmCS,PmHA,KfiA,KfiC, KfoC或β3GnT。
所述化合物(X)为糖胺聚糖衍生物的寡糖或多糖，在糖链非还原端 为葡萄糖醛酸，糖胺聚糖衍生物包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨 素、硫酸皮肤素、角质素或透明质酸。
所述通过控制步骤a和b的次数得到相应长度的糖链。
所述第一步中尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合 物(I)可以用尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基半乳糖糖基供体(II) 替代。
所述第一步中尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合 物其结构通式为式(I)，所述尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基半乳糖 糖基供体化合物其结构通式为式(II)
Figure BDA0002173981130000181
优选地，4-位巯基的构型是平伏键或直立键；
优选地，在通式(I)和(II)中：
糖基供体为二磷酸形式或二磷酸盐形式，具体为钠盐、钾盐、铵 盐、三乙胺盐或吡啶盐；
R1＝CH3、CF3、CH2-CH3、CH＝CH2、C≡CH、CH2N3或CH2CH2N3。 所述式(II)的合成路线如下：
Figure BDA0002173981130000191
第一步：将520mg、1mmol化合物(XV)溶解在5mL DCM和0.5mL 吡啶中，在-10℃下加入0.34mL、2mmol三氟甲磺酸酐，搅拌2小 时，Rf＝0.6的TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1 组成，反应完全后向反应液中加入20mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳 酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩 得化合物(XVI)，所述化合物(XVI)的浓缩物不经过纯化，直接 进行下一步；
第二步：将化合物(XVI)的浓缩物溶解在5mL DMF中，加入340mg、 3mmol硫氰化钾，室温下搅拌5小时，Rf＝0.6的TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1组成，反应完全后向反应液中 加入20mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液 洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，经体积比石油醚：乙酸乙酯 ＝4:1的硅胶柱层析纯化得到黄色油状化合物(XVII)360mg,第一步 和第二步两总产率为67％；
第三步：将207mg、0.38mmol化合物(XVII)溶解在5mL DCM中， 加入136mg、0.84mmol三氯化铁，室温下搅拌5小时，Rf＝0.5的 TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组成，反应完 全后向反应液中加入15mL DCM，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物(XVIII)， 化合物(XVIII)的浓缩物不经过纯化，直接进行下一步；
第四步：将化合物(XVIII)的浓缩物溶解在5mL THF中，所述5mL THF中含有0.42mL、2M N,N-二异丙基胺锂LDA溶液，降温至-78℃， 该温度下搅拌0.5小时，然后在-78℃加入[(BnO)2PO]2,并搅拌3小时， Rf＝0.4的TLC检测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组 成，反应完全后向反应液中加入饱和碳酸氢铵溶液淬灭反应，再加入 15mL乙酸乙酯，分别使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤， 有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，经体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1 硅胶柱层析，纯化得到黄色油状化合物(XIX)198mg,第三步和第四 步两步总产率73％；
第五步：将100mg、0.13mmol化合物(XIX)溶解在10mL甲醇中， 加入10mg钯碳，室温常压下通入氢气0.5小时，Rf＝0.4的TLC检 测，所述TLC由体积比石油醚：乙酸乙酯＝2:1组成，反应完全后浓 缩有机溶剂得化合物(XX)，所述化合物(XX)的浓缩物不经过纯化， 直接进行下一步；
第六步：将化合物(XX)的浓缩物溶解在10mL吡啶中，加入40mg、0.5 mmol四氮唑和140mg、0.2mmol的UMP morpholidate，常温下反 应24小时，浓缩有机溶剂，经P-2凝胶柱层析，层析用后水淋洗， 冻干馏分得到白色固体化合物(XXI)70mg,第五步和第六步两步总产率58％；
第七步：将60mg、0.07mmol化合物(XXI)溶解在5mL甲醇中，所述 5mL甲醇中含有0.2mL、5.5M甲醇钠溶液，室温下反应12小时， 用Dowex 50WX8酸性树脂中和，浓缩有机溶剂，经P-2凝胶柱层析， 层析后用水淋洗，冻干馏分得到白色固体产物化合物(II)20mg,产率 55％。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干 改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法，其特征在于，反应路线如下：
Figure FDA0003130873730000011
第一步，即步骤a：将1.5mmol尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合物(I)、1.2mmol化合物(X)和20μg/mL糖基转移酶PmHS2在缓冲溶液中室温下反应15小时，所述缓冲溶液为含有15mmol MnCl2，25mmol、pH 7.2的Tris，10mM DTT和10mL水，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，得到化合物(XI)；
第二步，即步骤b：将1.2mmol化合物(XI)、1.5mmol葡萄糖醛酸糖基供体(XII)和20μg/mL糖基转移酶PmHS2在缓冲溶液中室温下反应15小时，所述缓冲溶液含有15mmol MnCl2，25mmol、pH 7.2的Tris，10mM DTT和10mL水，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，得到化合物(XIII)；
第三步，重复步骤a和步骤b：将化合物(XIII)经过糖基转移酶PmHS2催化尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合物(I)，然后经过糖基转移酶PmHS2催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸供体化合物(XII)，重复n次，其中，n为从1到100的自然数，因而得到的含硫苷键糖胺聚糖(XIV)是一系列结构类似的化合物，糖链长度随着数值n不同而变化，得到含硫苷键糖胺聚糖(XIV)；所述化合物(X)为糖胺聚糖衍生物的寡糖或多糖，在糖链非还原端为葡萄糖醛酸，糖胺聚糖衍生物为肝素。
2.根据权利要求1所述的一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法，其特征在于：所述第一步中尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合物(I)用尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基半乳糖糖基供体(II)替代。
3.根据权利要求2所述的一种含硫苷键糖胺聚糖的制备方法，其特征在于：所述第一步中尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基葡萄糖糖基供体化合物其结构通式为式(I)，所述尿苷二磷酸4-位巯基2-位酰胺基半乳糖糖基供体化合物其结构通式为式(II)
Figure FDA0003130873730000021
在通式(I)和(II)中：
糖基供体为二磷酸形式或二磷酸盐形式，具体为钠盐、钾盐、铵盐、三乙胺盐或吡啶盐；R1＝CH3、CF3、CH2-CH3、CH＝CH2、C≡CH、CH2N3或CH2CH2N3。
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