CN109628363A - 一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和在产高分子量透明质酸中的应用，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus subtilis；命名为BH‑2菌株保藏编号CGMCC No.16841；该工程菌选用枯草芽孢杆菌WB600为基础菌种，向其基因组中引入了透明质酸合酶hasA基因，UDP‑葡糖脱氢酶hasB基因，UDP‑葡糖焦磷酸化酶hasC基因，维持了工程菌低蛋白酶活性的特点，并通过温度调控工程菌的生长代谢，获得了分子量为6.9×106道尔顿的高分子量透明质酸，具有工业应用价值。

Description

一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种透明质酸工程菌的构建方法、及其得到的工程菌，属于基因工程和微生物领域。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是一种存在于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中的高分子糖胺聚糖，其市场需求与日俱增。透明质酸参与许多重要的生物学过程，可广泛应用于眼科学、整形手术和化妆品等领域。目前，工业上普遍采用弱化溶血性等毒性的C型链球菌来生产透明质酸。但由于其遗传不稳定性和复杂的处理手段，使得链球菌作为发酵菌种生产HA受到限制。随着合成生物学的发展，使得利用遗传背景清楚且是公认安全菌株(如枯草芽孢杆菌等)生产HA成为可能，另外，枯草芽孢杆菌含有除透明质酸合酶(hyaluronan synthase,HAS)外透明质酸合成途径的其他全部基因，因此枯草芽孢杆菌成为构建透明质酸重组菌株的首要选择。
透明质酸生理功能与其分子量大小密切相关，不同分子量具有不同的功能，高分子量 HA(Mr>2×106Da)具有较好的粘弹性，可广泛应用于眼科学、整形手术和伤口愈合等方面；中分子量HA(Mr:105～106Da)具有良好的保湿性和润滑性，可用于药物缓解作用；低分子量HA(Mr<104Da)可以抑制肿瘤扩散、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，并且保湿性好，可用于临床医学、化妆品和滴眼液中的润滑剂等。有研究表明，心磷脂(cardiolipin)在细胞膜上的分布和数量在一定程度上会影响所合成的透明质酸的分子量。因此，可以通过改变心磷脂的分布和数量来改变透明质酸的分子量。
目前缺乏一种工程菌，在改变某些培养条件(如温度等)下能分别产生高分子量和中分子量透明质酸，同时不会含有大量的蛋白酶和溶血素。
发明内容
本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一株生产高分子量透明质酸的工程菌，所述工程菌的建议分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus subtilis；并命名为BH-2 菌株；该菌株已于2018年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.16841。
本发明同时提供了一种上述生产高分子量透明质酸的工程菌的构建方法，其中，包括以下步骤：
第1、含透明质酸合成途径基因共表达的片段构建
第1.1、从含乳房链球菌(Streptococcus uberis)透明质酸合酶基因hasA的合成菌株中提取基因组，利用PCR反应扩增hasA片段A，PCR引物对为hasABC-F1/hasABC-R1；从枯草芽孢杆菌WB600中提取基因组，并通过PCR方法扩增UDP-葡萄糖脱氢酶基因 hasB序列片段B和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因hasC序列片段C，PCR引物对分别为 hasABC-F2/hasABC-R2和hasABC-F3/hasABC-R3；
第1.2、将PCR产物片段A、B和C进行重叠PCR，引物对为hasABC-F1/hasABC-R3，得到hasABC片段；
第2、将第1步得到的hasABC片段与表达载体pHY300plk连接，经过原核感受态细胞导入，涂布LB+AmpR平板筛选，经过菌落PCR验证后获得连接正确的 pHY300plk-hasABC质粒菌株；
第3、将第2步中获得的pHY300plk-hasABC质粒电转化入枯草芽孢杆菌WB600中，涂布LB+TetR平板，筛选；挑取转化子，进行菌落PCR验证转化子，引物为hasABC-VF 和hasABC-VR，挑取正确转化子，提取质粒，并进行酶切及PCR验证，即得透明质酸工程菌BH-2。
WB600作为工程菌供体的特点：
(1)非致病性：枯草芽孢杆菌对人畜无害。
(2)细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷壁质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素(热源性脂多糖)，而这一点是大肠杆菌无法比拟的。
(3)没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体：在E.coli表达系统中，若重组表达的外源蛋白质中含有大量连续的稀有密码子，则常常造成表达量低，或者翻译提前终止；而目标蛋白质产物形成包涵体会导致蛋白质不可溶，给分离纯化和回收目标蛋白质造成麻烦。而B.subtilis表达系统在这两个方面都不存在问题。
(4)枯草芽孢杆菌WB600(上海Genemy BioTech公司)是在Bacillus subtilis 168中敲除中性蛋白酶A基因、中性蛋白酶B基因、枯草溶菌素基因、胞外蛋白酶基因、金属蛋白酶基因和杆菌肽酶F基因等6个基因，其蛋白酶活性只是野生型菌株的0.32％，有利于外源蛋白的分泌与表达。
本发明所述工程菌的具体构建过程中：
第1.1步所述hasA基因为合成序列，序列见SEQ ID NO：9，涉及引物为hasABC-F1和hasABC-R1，序列见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述hasB的GeneID:936766，涉及引物为hasABC-F2和hasABC-R2，序列见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，所述hasC 的GeneID:936797，涉及引物为hasABC-F3和hasABC-R3，序列见SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
PCR反应体系(50μl)：
PCR反应条件：
第1.2步所述将A,B和C进行重叠PCR，得到的hasABC片段的长度为5142bp，引物对为hasABC-F1/hasABC-R3。
PCR反应体系(50μl)：
PCR反应条件：
第2步中，所述pHY300plk的载体特点：该载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，即在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中都可以自主复制；含氨苄青霉素抗性AmpR和四环素抗性 TetR，其中AmpR主要用于筛选大肠杆菌中的转化子，工作浓度为100ng/μl；TetR用于筛选枯草芽孢杆菌中的转化子，工作浓度为10ng/μl。
酶切反应体系(50μl)：
酶切反应温度为37℃，反应时间为2h。
第3步中得到的酶切产物用纯化试剂盒(品牌：Tiangen，货号：DP204-02)纯化，得到纯化片段D和载体E，将二者进行连接反应，得到pHY300plk-hasABC。
连接反应体系(10μl)：
连接反应温度为16℃，过夜连接。
第2步所述将得到的连接产物转化到感受态细胞DH5α(品牌：ZOMANBIO，货号：ZC101-1)，具体方法如下：
1.将10μl连接体系加入到50μl DH5α感受态，轻弹使其混匀，冰浴30min；
2.42℃热激90s，立即冰浴2min；
3.加500μl LB，放入37℃摇床，110rpm复苏45min；
4.将复苏后的大肠杆菌离心5000rpm，2min收集菌体；
5.弃上清，留取200μl重悬菌体，涂布LB+AmpR平板，37℃培养。
6.待转化子长出，挑单菌落于LB+AmpR中培养。然后进行菌落PCR验证，涉及引物为hasABC-VF和hasABC-VR，序列见SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，PCR产物大小为1736bp)。
LB培养基为分子克隆常用基础培养基(分为固态培养基和液体培养基，详见分子克隆实验指南，第四版，冷泉港实验室)。
菌落PCR反应体系(25μl)：
菌落PCR反应条件：
转接得到正确条带的菌株，提取质粒，并进行PCR验证；
第3步中所述将得到的质粒电转入受体菌WB600，涂布LB+TetR平板，筛选；挑取转化子，进行菌落PCR验证转化子，引物为hasABC-VF/hasABC-VR。挑取正确转化子，提取质粒，并进行PCR验证，得到透明质酸工程菌BH-2。
所述电转条件根据试剂盒说明书或实验室工具书的记载进行调整，本发明提供一种电转方法，仅供参考。
试剂：
LB：酵母粉5g/l蛋白胨10g/l NaCl 5g/l pH7.0～7.2
GM：LB+0.5M山梨醇
ETM：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油
RM：LB+0.5M山梨醇+0.5M甘露醇
具体方法：
1)新鲜平板挑WB600单菌落接种于5ml LB中过夜培养；
2)测量试管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19～0.2之间，培养基为GM。37℃，200rmp培养至OD600＝1.0左右；
3)取全部菌液冰浴10min，5000rpm，10min，4℃离心收集菌体；
4)用40ml预冷的ETM洗涤菌体，5000rpm，10min，4℃离心去上清。重复3次。
5)将洗涤后的菌体重悬于500μl的ETM中，每管分装90μl，每管加入5μl构建完成的质粒，冰浴30min；
6)电转仪1.8kV电击一次，持续时间5ms；
7)电击完毕后立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏1h后，涂布 LB+TetR平板，37℃过夜培养。
本发明进一步提供一种上述工程菌在生产透明质酸中的应用，其中，包括以下步骤：
a)配制发酵培养基成分；
b)挑BH-2菌株单菌落于LB+TetR液体培养基中，摇瓶培养；
c)取摇瓶培养的BH-2菌液于发酵培养基中发酵；
d)收集发酵液，离心，取上清于另一离心管中，加入无水乙醇充分混匀，室温下静置，再离心，去除上清，晾干沉淀；加入与发酵液等体积蒸馏水充分溶解，采用硫酸-咔唑法测定透明质酸含量；
e)溶解后的发酵产物透析后，用多角度激光光散射仪(MALLS)测定分子量。
所述发酵培养基成分为：
步骤b)所述，挑BH-2菌株单菌落于5ml LB+TetR液体培养基中，37℃，200rpm 过夜培养。
步骤c)所述，取1ml过夜培养的BH-2菌株于发酵培养基中，分别置于27℃，32℃，37℃，42℃和47℃，200rpm培养54h。
步骤d)所述，收集发酵液，10 000rpm离心15min，取上清于另一离心管中，加入 2倍体积的无水乙醇充分混匀，室温下静置1h，再10000rpm离心20min，去除液体，晾干沉淀。加入与发酵液等体积蒸馏水充分溶解，采用硫酸-咔唑法测定透明质酸含量。
步骤e)所述，溶解后的发酵产物透析2-3d，过0.22μm滤器，用多角度散射激光色谱仪测定分子量。
本发明进一步阐述了温度影响透明质酸分子量的机理。
1)将获得的BH-2菌株接种于LB，分别置于27℃，32℃，37℃，42℃和47℃， 200rpm过夜培养。
2)将步骤1)培养的菌液使用商品试剂盒(RNA prep pure Bacteria Kit)提取RNA，具体步骤参考说明书。
3)将步骤2)提取得到的RNA进行反转录PCR，获得cDNA。
反转录体系I(10μl)：
反应条件:42℃，3min；反应结束后迅速置于冰上。
反转录体系II(10μl)：
将反应体系I和II混匀，反应条件如下：
42℃，15min；95℃，3min。
反应结束后置于4℃或冰上。
4)将步骤3)得到的cDNA进行实时定量PCR(qRT-PCR)反应，其中内参基因为 16S，GeneID:936774，涉及引物为qRT-16S-F和qRT-16S-R，序列见SEQ ID NO：10和 SEQ ID NO：11；对心磷脂合酶基因clsA进行相对定量，所述的clsA的GeneID:936957,涉及引物为qRT-clsA-F和qRT-clsA-R，序列见SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。
qRT-PCR反应体系(20μl)：
qRT-PCR反应条件：
5)处理数据，结果分析。
本发明的优点和有益效果：
根据前期实验，发明人发现，在枯草芽孢杆菌WB600中共表达透明质酸合酶基因和透明质酸合成途径基因，所得的透明质酸产量较在枯草芽孢杆菌168中有所提升。另外，通过改变培养温度，从而影响细胞膜的流动性，导致细胞膜上心磷脂含量的分布和数量改变，进而影响了透明质酸合酶合成的透明质酸的分子量。本发明获得一株不同温度下产不同分子量的透明质酸，并在47℃获得的透明质酸分子量是目前异源表达透明质酸菌中最高的。具体对比见表1。
表1本发明工程菌和现有工程菌的发酵参数对比
<u>现有工程菌(枯草芽孢杆菌168)</u> <u>本发明工程菌</u>
<u>培养条件</u> 37℃ 27℃，32℃，37℃，42℃和47℃
<u>蛋白酶的活性</u> 以此为参照1，100％ 0.32％
<u>产量</u> 摇瓶发酵：0.6～1.8g/l 3.21g/l
<u>分子量分布</u> 1.8～2.2MDa 0.392～6.937MDa
具体实施方式
下面的实施例仅用于进一步说明本发明但不限于本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明范围。
实施例1 BH-2菌株构建
BH-2获得方法如下：
1)从含有透明质酸合酶(hyaluronan synthase,HAS)的合成菌(由Genewiz公司合成)，通过基因组提取(品牌：Axygen货号：AP-MN-BT-GDNA-250G)和PCR方法获得透明质酸合酶基因hasA序列A，序列见SEQ ID NO：9，PCR引物对为hasABC-F1/hasABC-R1，序列见SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2；从枯草芽孢杆菌WB600中提取基因组，并通过 PCR方法扩增UDP-葡萄糖脱氢酶基因hasB序列B，序列见SEQ ID NO：14；UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因hasC序列C，序列见SEQ ID NO：15，PCR引物对分别为 hasABC-F2/hasABC-R2，序列见SEQ ID NO：3和SEQID NO：4；hasABC-F3/hasABC-R3，序列见SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6
PCR反应体系(50μl)：
PCR反应条件：
2)将A,B和C进行重叠PCR，获得hasABC片段，长度为5142bp，引物为 hasABC-F1/hasABC-R3，序列见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6；
PCR反应体系(50μl)：
PCR反应条件：
3)将所述hasABC片段和表达载体pHY300plk进行酶切反应。
酶切反应体系(50μl)：
酶切反应温度为37℃，反应时间为2h。
4)酶切产物用纯化试剂盒(品牌：Tiangen，货号：DP204-02)纯化，得到纯化片段 D和载体E，将二者进行连接反应。
连接反应体系(10μl)：
连接反应温度为16℃，过夜连接。
5)转化到感受态细胞DH5α(品牌：ZOMANBIO货号：ZC101-1)，具体方法如下：
1.将10μl连接体系加入到50μl DH5α感受态，轻弹使其混匀，冰浴30min；
2.42℃热激90s，立即冰浴2min；
3.加500μl LB，放入37℃摇床，110rpm复苏45min；
4.将复苏后的大肠杆菌离心5000rpm，2min收集菌体；
5.弃上清，留取200μl重悬菌体，涂布LB+AmpR平板，37℃培养。
6.待转化子长出，挑单菌落于LB+AmpR中培养。然后进行菌落PCR验证，引物为hasABC-VF和hasABC-VR，全长1736bp)。
菌落PCR反应体系(25μl)：
菌落PCR反应条件：
转接得到正确条带的菌株，提取质粒，并PCR验证；
6)将质粒电转入受体菌WB600，涂布LB+TetR平板筛选，挑取转化子，菌落PCR 验证转化子，引物为hasABC-VF和hasABC-VR。挑取正确转化子，提取质粒，并PCR 验证，得到透明质酸工程菌。
发酵培养菌株
1.发酵培养基成分：
现有发酵培养基碳源大多为葡萄糖，在同等情况下，本菌在葡萄糖培养基中的发酵产物产量(0.532g/l)较蔗糖(1.32g/l)低。因此发酵培养优选蔗糖类培养基。
2.挑BH-2菌株单菌落于5ml LB+TetR液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。
3.取1ml过夜培养的BH-2菌株于发酵培养基中，37℃，200rpm培养72h。
4.收集发酵液，10000rpm离心15min，取上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇充分混匀，室温下静置1h，再10000rpm离心20min，去除液体，晾干沉淀。加入与发酵液等体积蒸馏水充分溶解，采用硫酸-咔唑法测定透明质酸含量。
硫酸-咔唑法
试剂：
A：0.025M四硼酸钠-硫酸溶液：称取0.478g四硼酸钠溶解于100ml浓硫酸中；
B：0.125％(W/W)咔唑溶液：称取咔唑75mg溶解于50ml无水乙醇中；
C：处理后的发酵产物
具体方法：
1)取3ml A于试管，4度冷却；
2)加入0.5ml C(或ddH2O为对照)，振荡混匀置于冰上；
3)在沸水浴中加热10min，冷却到室温；
4)加入0.1ml B，再次振荡；
5)沸水浴中加热15min，冷却到室温；
6)测OD530值。
最终测得透明质酸的含量为Y(g/L)＝4.38*OD530+0.0999＝3.21g/l。本技术方案采用多角度激光散射仪-体积排阻法联用(MALLS-SEC)测定分子量，测得透明质酸分子量为0.392～6.937MDa。
而同一发酵方法中现有菌株枯草芽孢杆菌168Y(g/L)＝0.6～1.8g/l。且得到的透明质酸分子量仅为1.8～2.2MDa。
技术方案中为详述的技术参数和细节均为本领域的公知常识和常规技术，能够为本领域普通技术人员根据自身的知识和参考工具书所理解，不影响本技术方案的实施和实现。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改造，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用
<141> 2019-01-03
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
acgcgtcgac tatcaccgcc cagcctaa 28
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<211> 36
<212> DNA
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<400> 3
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
tgatcgaaaa atctagacag cttcaaccaa gtaaca 36
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
tgttacttgg ttgaagctgt ctagattttt 30
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<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
tcccccgggt ttggaaagcg agggaag 27
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<212> DNA
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<400> 7
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<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 8
tcacttgtca gcgggtca 18
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<211> 1981
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 9
tatcaccgcc cagcctaaac ggatatcatc atcgctcatc catgtcgaga gttatatcac 60
ccttgtcact aagaaaataa atgcagggta aaatttatat ccttcttgtt ttatgtttcg 120
gtataaaaca ctaatatcaa tttctgtggt tatactaaaa gtcgtttgtt ggttcaaata 180
atgattaaat atctcttttc tcttccaatt gtctaaatca attttattaa agttcatttg 240
atatgcctcc taaattttta tctaaagtga atttaggagg cttacttgtc tgctttcttc 300
attagaatca atcctttttt aaaagtcaat attactgtaa cataaatata tattttaaaa 360
atatcccact ttatccaatt ttcgtttgtt caactaatgg gtgctttagt tgaagaataa 420
aagaccacat taaaaaatgt ggtcttttgt gtttttttaa aggatttgag cgtagcgaaa 480
aatccttttc tttcttatct tgataataag ggtaactatt gccgatgata agctgtcaaa 540
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aaaggggggt tgacattatt ttactgatat gtataatata atttgtataa gaaaatggag 660
ctcgcaaaag tttaaaggag gaattatgga aaaactaaaa aatctcatta catttatgac 720
ttttattttc ctgtggctca taattattgg gcttaatgtt tttgtatttg gaactaaagg 780
aagtctaaca gtgtatggga ttattctatt aacctatttg tcgataaaaa tgggattatc 840
ttttttttat cgtccctata aaggaagtgt aggtcaatat aaggtagcag ctattatccc 900
atcttataat gaggatggtg tcggtttact agaaactcta aagagtgttc aaaaacaaac 960
atatccaatt gcagaaattt tcgtaattga cgatgggtca gtagataaaa caggtataaa 1020
attggtcgaa gactatgtga agttaaatgg ctttggagac caagttatcg ttcatcagat 1080
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ccctgtaagc ataggggatg accgttgttt gacaaattat gcaactgatt tgggaaaaac 1500
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taaaaagaca agtaaataat tcaattagag aaaggacaaa ataggtaccg acactgcgac 1980
c 1981
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 10
cggtttcgct gccctttgtt 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 11
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<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 12
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<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 13
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<210> 14
<211> 1457
<212> DNA
<213> Bacillus Subtilis
<400> 14
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gtattacaca gatgtgtatg ctgcgatgga agacactgat gcatgcctga ttttaacgga 1200
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<213> Bacillus Subtilis
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caaagaagaa atctaaacaa aaaggctatt ggacattgga tcctacatag ctggaattcg 960
taacgcagaa gccttccctc gctttccaaa 990

Claims (10)

1.一株生产高分子量透明质酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus subtilis；命名为BH-2菌株；已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号CGMCC No.16841。
2.一种权利要求1所述产高分子量透明质酸工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
第1、含透明质酸合酶基因的片段构建
第1.1、从含乳房链球菌(Streptococcus uberis)透明质酸合酶基因hasA的合成菌株中提取基因组，利用PCR反应扩增hasA片段A，从枯草芽孢杆菌WB600中提取基因组，利用PCR反应扩增hasB片段B和hasC片段C，PCR引物对分别为hasABC-F1/hasABC-R1，hasABC-F2/hasABC-R2和hasABC-F3/hasABC-R3；
第1.2、将扩增片段A、B和C进行重叠PCR，重叠PCR引物为hasABC-F1/hasABC-R3，获得hasABC片段；
第2、将第1步获得的hasABC片段与表达载体pHY300plk连接，经过原核感受态细胞导入，涂布平板LB+AmpR平板，筛选，经过菌落PCR验证后获得连接正确的pHY300plk-hasABC质粒菌株；
第3、将第2步中获得的pHY300plk-hasABC质粒电转化入枯草芽孢杆菌WB600中，涂布LB+TetR平板，筛选；挑取转化子，菌落PCR验证转化子，引物为hasABC-VF和hasABC-VR，挑取正确转化子，提取质粒，并酶切及PCR验证，即得透明质酸工程菌BH-2。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述hasA涉及引物为
hasABC-F1 ACGCGTCGACTATCACCGCCCAGCCTAA
hasABC-R1 GATCTTCCAATTTATAATGGTCGCAGTGTCGGTACC。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述hasB的GeneID:936766，涉及引物为
hasABC-F2 GGTACCGACACTGCGACCATTATAAATTGGAAGATC
hasABC-R2 TGATCGAAAAATCTAGACAGCTTCAACCAAGTAACA。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述hasC的GeneID:936797，涉及引物为
hasABC-F3 TGTTACTTGGTTGAAGCTGTCTAGATTTTTCGATCA
hasABC-R3 TCCCCCGGGTTTGGAAAGCGAGGGAAG。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述hasABC验证涉及引物为
hasABC-VF AGTCGGAACGCCTATGTC
hasABC-VR TCACTTGTCAGCGGGTCA。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，第2步所述载体质粒pHY300plk的载体抗性为AmpR和TetR抗性。
8.根据权利要求2的构建方法，其特征在于，第2步所述的原核感受态细胞优选DH5α。
9.一种权利要求1所述工程菌在生产透明质酸中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
a)配制发酵培养基成分；
b)挑BH-2菌株单菌落于LB+TetR液体培养基中，摇瓶培养；
c)取摇瓶培养的BH-2菌液于发酵培养基中发酵；
d)收集发酵液，离心，取上清于另一离心管中，加入无水乙醇充分混匀，室温下静置，再离心，去除上清，晾干沉淀；加入与发酵液等体积蒸馏水充分溶解，采用硫酸-咔唑法测定透明质酸含量；
e)溶解后的发酵产物透析后，用多角度激光光散射仪(MALLS)测定分子量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应当的具体操作如下：
步骤a)所述发酵培养基成分为：
其余为水；
其中，1L所述微量金属溶液成分为：
步骤b)所述，挑BH-2菌株单菌落于5mL LB+TetR液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；
步骤c)所述，取1mL过夜培养的BH-2菌株于发酵培养基中，37℃(27℃，32℃，42℃或47℃)200rpm培养54h；
步骤d)所述，收集发酵液，10 000rpm离心15min，取上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇充分混匀，室温下静置1h，再10 000rpm离心20min，去除液体，晾干沉淀；加入与发酵液等体积蒸馏水充分溶解，采用硫酸-咔唑法测定透明质酸含量；
步骤e)所述，溶解后的发酵产物透析2-3d，过0.22μm滤器，用多角度激光光散射仪测定分子量。
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