ITMI20101642A1 - Processo per la produzione di acido ialuronico in escherichia coli o bacillus subtilis - Google Patents

Description

Processo per la produzione di acido ialuronico in Escherichia coli o Bacillus subtilis

OGGETTO DELL’INVENZIONE

La presente domanda di brevetto descrive e rivendica un metodo di produzione di acido ialuronico (HA) in Bacillus subtilis ed in Escherichia coli tramite vettori plasmidici in cui il controllo genico à ̈ sotto il promotore forte grac, e un sistema di selezione di ceppi batterici stabili, per la produzione di elevati livelli di HA.

CAMPO DELL’INVENZIONE

L’acido ialuronico à ̈ una polisaccaride lineare naturale composto dall’alternanza di β-1-4 D-acido glucuronico e β-1-3 N-acetyl glucosamina. L’acido ialuronico fa parte della famiglia dei glicosaminoglicani e può arrivare a raggiungere il peso molecolare dei 10<7>Da, con circa 300000 unità saccaridiche ripetute. Esso à ̈ ampiamente distribuito nella matrice extracellulare del tessuto connettivo e nell’epitelio degli organismi eucariotici dove à ̈ localizzato sulla superficie delle cellule, ma può essere sintetizzato anche in alcuni organismi procariotici, per esempio quelli della famiglia degli Streptococchi. I glicosaminoglicani sono ideali come lubrificanti delle articolazioni o delle giunzioni, ma ricoprono molti altri ruoli funzionali nella riparazione tissutale, nell’adesione, nello sviluppo, nella motilità cellulare, nel cancro e nell’angiogenesi. Sulla base di tali importanti caratteristiche sono stati sviluppati prodotti a base di acido ialuronico che trovano applicazioni nell’ortopedia, nella reumatologia e nella dermatologia.

Tra le più comuni fonti naturali di HA sono da ricordare le creste di gallo, classico materiale da cui HA viene estratto, ed alcuni batteri, in particolare quelli della famiglia degli Streptococchi. Ciascuna di queste diverse fonti presenta numerosi svantaggi: l’acido ialuronico da creste di gallo può, per esempio, provocare nell’uomo allergie perché di origine aviaria, mentre HA da fonti batteriche deve essere libero da tutte quelle tossine che normalmente sono presenti nei batteri stessi e che possono generare reazioni immunitarie/infiammatorie anche molto importanti. Di conseguenza, gli attuali processi industriali di purificazione di HA comprendono molte diverse fasi di lavorazione con conseguente aumento dei costi finali di produzione della materia prima. E’ quindi fortemente sentita la necessità di fonti alternative che superino tutti gli eventi avversi descritti mantenendo costi di produzione contenuti. Negli ultimi anni le vie biosintetiche per la sintesi di acido ialuronico sono state comprese in dettaglio in numerosi organismi. Mentre i geni necessari alla sintesi dell’acido ialuronico presenti negli organismi eucariotici sono distribuiti in tutto il genoma, nei sistemi batterici tali geni sono spesso presenti ed organizzati in operoni. Per esempio, nello Streptococcus equi l’operone per l’acido ialuronico comprende 5 geni: hasA, hasB, hasC, hasD e hasE. A volte, invece, i geni sono presenti in due operoni: nello Streptococcus equisimilis à ̈ presente un operone con i geni hasA, hasB e hasC, ed un altro con i geni hasC, hasD e hasE. I geni omologhi a hasB, hasC, hasD e hasE degli Streptococchi sono presenti in molti altri organismi perché provvedono alla sintesi degli enzimi necessari per la sintesi dei precursori dell’acido ialuronico, l’acido D-glucuronico e l’N-acetyl-D glucosamina, che sono anche i costituenti essenziali delle pareti batteriche. Nel caso degli Streptococchi, la ialuronato sintetasi (hasA, presente nella membrana plasmatica) à ̈ l’enzima chiave per la sintesi finale di acido ialuronico in quanto svolge due funzioni: catalizza l’unione del D-glucuronico a N-acetyl-D-glucosamina e provvede al trasporto della catena dell’acido ialuronico neoformato fuori della cellula. Lo studio degli enzimi deputati alla sintesi di acido ialuronico ha permesso la messa a punto di sistemi ricombinanti in diversi organismi, quali il Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Escherichia coli, e Agrobacterium radiobacter. Il primo organismo ingegnerizzato per produrre acido ialuronico à ̈ stato il B. subtilis attraverso la clonazione nel suo cromosoma di un operone che porta il gene hasA da Streptococco (mancante in Bacillus), con i geni tuaD e gtaB di Bacillus (corrispettivi di hasB e hasC di Streptococcus), sotto il controllo di un promotore costitutivo (US2003/175902). In questo modo à ̈ stata organizzata una via biosintetica in operoni simili a quelli dello Streptococcus equi, uno dei maggiori produttori naturali di acido ialuronico. Il sistema così perfezionato ha tuttavia evidenziato come si arrivi alla produzione industriale di un acido ialuronico di peso molecolare inferiore a 1MDa, con rese di produzione molto basse.

Il Bacillus subtilis à ̈ un batterio Gram-positivo, classificato come un aerobio obbligato, che normalmente si trova nel terreno. Ha la capacità di formare un’endospora, tenace e protettiva che consente all’organismo di sopportare condizioni ambientali estreme e, per questo motivo, i batteri del genere Bacillus sono tra i microrganismi più largamente diffusi in natura, con rappresentanti isolati dal suolo e da ambienti acquatici.

Tra tutte le specie sono conosciuti solo pochissimi patogeni, tra questi il Bacillus anthracis, che causa il carbonchio, il B. thuringiensis, un patogeno degli insetti e il Bacillus cereus, che causa l’avvelenamento di cibi. Al contrario, il Bacillus subtilis à ̈ considerato un microrganismo GRAS (Generally Regarded As Safe) e, in quanto microorganismo privo di endo/esotossine, viene utilizzato per la produzione di sostanze utilizzate nell’industria alimentare (sia cibi che bevande), di prodotti quali enzimi, antibiotici e insetticidi, e nell’industria dei detergenti. Tentativi d’utilizzo del Bacillus subtilis nella produzione di amino acidi quali triptofano, istidina, fenilalanina, e vitamine quali biotina, acidi folico e riboflavina, hanno fornito risultati promettenti.

La fonte principale delle specie di Bacillus à ̈ il suolo, il B. subtilis à ̈ un prototrofo capace di crescere a temperature mesofiliche su terreni sintetici definiti (anche minimi), contenenti come fonte di carbonio sia glucosio che altri zuccheri.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente domanda di brevetto descrive e rivendica un metodo di produzione di acido ialuronico (HA) in Bacillus subtilis ed in Escherichia coli tramite vettori plasmidici in cui il controllo genico à ̈ sotto il promotore forte grac, e un sistema di selezione di ceppi batterici stabili, per la produzione di elevati livelli di HA.

Durante la costruzione in E. coli dei vettori di espressione dell’acido ialuronico sotto forma di plasmidi, la Richiedente ha scoperto che i geni così introdotti (deputati alla sintesi degli enzimi per la produzione di acido ialuronico) sono tossici per la cellula quando il controllo della traduzione degli stessi à ̈ un promotore forte costitutivo. Infatti, in E. coli trasformato con i geni hasA e tuaD, la sola traduzione genica di hasA determina un forte calo dei precursori di N-acetyl glucosamina necessari per la costituzione della parete batterica, perciò la cellula muore; la traduzione genica della sola tuaD provoca invece la sintesi incontrollata di acido D-glucuronico che, acidificando il batterio e depauperandolo di glucosio (suo precursore), ne provoca la morte. La traduzione di entrambi i geni ad opera delle polimerasi del batterio, porta invece all’attivazione dei due enzimi in tempi diversi poiché essi richiedono diversi tempi di costruzione con modalità e siti d’azione differenti (ad esempio, hasA à ̈ una proteina transmembrana con diversi domini che la attraversano, richiede perciò un tempo molto più lungo sia per la sua sintesi che per il suo corretto ripiegamento rispetto alla sintesi/attivazione dell’enzima tuaD). Solo quando sono presenti quantità precise sia degli enzimi precursori che dell’enzima necessario alla sintesi di acido ialuronico, la cellula riesce a sopravvivere. In questo caso, l’eccesso di acido D-glucuronico, tossico ad alti livelli nella cellula, viene utilizzato dalla ialuronato sintasi (hasA) che unendolo alla glucosammina lo incorpora nell’acido ialuronico nascente esportandolo poi fuori dalla cellula, mantenendo perciò la cellula in vita.

La Richiedente ha sorprendentemente trovato che, sebbene per la sintesi di acido ialuronico siano necessari sia la hasA che la hasB (tuaD), Ã ̈ fondamentale che i due geni lavorino di concerto lasciando alla cellula il tempo necessario a:

• produrre acido D-glucuronico a livelli tali da non essere tossico e

• innescare la trascrizione del gene hasA in modo tale che quest’ultimo riesca a smaltire gli alti livelli di acido D-glucuronico via via che si accumulano all’interno della cellula.

Nella presente invenzione le problematiche sopra esposte sono risolte ponendo i geni plasmidici sotto il controllo di un promotore inducibile grac che utilizza il repressore lac.

La Richiedente ha utilizzato il B. subtilis (e l’E. coli) per la sua trasformazione con il plasmide episomale contenente i geni per la sintesi dell’HA, poiché esso presenta diversi vantaggi come ospite per l’espressione di DNA eterologo:

• l’HA prodotto viene secreto con facilità;

• à ̈ libero da esotossine e endotossine, al contrario dei batteri gram-negativi.

Il sistema grac-lac trasferito in subtilis (ed in coli) controlla l’espressione dei geni deputati alla sintesi della via biosintetica dell’HA (clonati nello stesso plasmide episomale), garantisce un’altissima attività e selettività di trascrizione genica con conseguente elevata produzione delle proteine ricombinanti necessarie alla sintesi di acido ialuronico. La resa finale del prodotto desiderato risulterà molto elevata, decisamente superiore a quella che si ottiene in B. subtilis dove il sistema dell’operone à ̈ clonato sul cromosoma del batterio stesso ed à ̈ sotto il controllo di promotori costitutivi non inducibili.

Infatti, il sistema sopra descritto à ̈ inducibile: introdotto artificialmente nel batterio, viene attivato dalla Richiedente mediante l’aggiunta di sostanze come IPTG in quantità compresa tra 0,1 e 10 mM, preferibilmente tra 0,5 e 1 mM.

In loro presenza, il promotore si lega al repressore modificandone la conformazione, quindi il repressore si stacca dal promotore e permette alle polimerasi del batterio stesso la traduzione del gene per la sintesi degli enzimi necessari alla produzione di HA. In questo modo la Richiedente à ̈ in grado di controllare la sintesi di tutto il processo biosintetico di produzione di HA, riuscendo ad ottenere pesi molecolari anche sopra 1MDa con alte rese di HA.

La successiva purificazione dell’HA secreto sarà estremamente semplice e, quindi, il procedimento industriale di produzione avrà costi estremamente contenuti rispetto all’attuale stato dell’arte.

Nella presente invenzione viene rivendicata la costruzione in B. subtilis e/o in coli, di vettori plasmidici contenenti i due geni hasA e tuaD o i quattro geni hasA, tuaD, gtaB e pgi (corrispettivo di hasE), atti a permettere la produzione, secondo la metodologia sopra descritta, di alte rese di acido ialuronico. Preferibilmente, le sequenze codificanti per l’enzima ialuronato sintasi, UDP-glucosio idrogenasi, UDP-glucosio idrogenasi, UDP-glucosio pirofosforilasi e glucosio 6 fosfato isomerasi comprendono a monte una sequenza Shine-Dalgarno. Tali vettori possono inoltre essere costruiti in modo da contenere qualsiasi altro gene relativo alla biosintesi di acido ialuronico. A differenza di quanto sino ad oggi disponibile, il plasmide di partenza ha dimensioni piccole e ciò permette l’ingegnerizzazione della via biosintetica dell’acido ialuronico (i.e. i due geni hasA e tuaD o i quattro geni hasA, tuaD gtaB e pgi) in un unico plasmide che viene qui chiamato pHT01hasAtuaD o pHT01hasAtuaDgtaBpgi, rendendo l’invenzione descritta economicamente conveniente ed industrialmente applicabile con successo. Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ quindi il plasmide pHT01hasAtuaD e il plasmide pHT01hasAtuaDgtaBpgi.

Oggetto della presente invenzione à ̈ anche il sistema messo a punto dalla Richiedente per la selezione di ceppi batterici stabili, vitali, replicanti e secernenti HA, poiché trasformati con il plasmide contenente la via biosintetica dell’HA.

Il suddetto sistema comprende le seguenti fasi:

• Clonaggio del gene tuaD (UDP-glucose dehydrogenase) da Bacillus subtilis,

• Clonaggio del gene hasA (ialuronato sintetasi) da Streoptocooccus zooepidemicus

• Costruzione del plasmide pGEM4hasA e successivamente del plasmide pHT01hasA

• Costruzione di un plasmide con il gene tuaD di seguito alla hasA

• Costruzione del plasmide pHT01hasAtuaD, che

chiameremo pBS5

• Trasformazione del plasmide pBS5 in Bacillus subtilis o in E. coli

• Selezione di cellule secernenti acido ialuronico:

gradiente di IPTG

• Selezione delle cellule vitali e secernenti.

Nei seguenti esempi vengono descritte solo a scopo illustrativo e non limitativo le varie fasi necessarie alla realizzazione dell’invenzione.

Esempio 1

Clonaggio del gene tuaD (UDP-glucose dehydrogenase) da Bacillus subtilis

La sequenza del gene tuaD, lunga 9300 bp in B. subtilis, à ̈ presente nelle banche dati come numero di accesso AF015609; codifica per l’operone che porta alla sintesi di acido teicuronico e comprende 8 geni, tuaABCDEFGH. Nel nostro caso, il gene di interesse tuaD à ̈ compreso tra le basi 3582-4984 bp. Dall’analisi tramite software per enzimi di restrizione si nota che sono presenti i siti di restrizione ClaI, EcoRI, PstI, HindIII e SphI e che perciò non possono essere utilizzati per il clonaggio. Il codone di inizio non à ̈ una metionina ma un valina; nella presente invenzione esso à ̈ stato sostituito con il codone per metionina, molto più efficiente nella traduzione della proteina. Per recuperare questa sequenza sono stati impiegati due oligonucleotidi sintetizzati con la seguente sequenza: 5’atgaaaaaatagctgtcattggaacag 3’ (SEQ ID NO:2) e 5’ttataaattgtcgttcccaagtct 3’ (SEQ ID NO:3)

Il DNA genomico da B. subtilis (ceppo 168) à ̈ stato ottenuto mediante il kit di estrazione Qiagen. Attraverso PCR per 32 cicli, utilizzando il DNA da B. subtilis come templato e i due oligonucleotidi di cui sopra, si à ̈ ottenuto un amplificato del peso molecolare atteso. L’amplificato ottenuto à ̈ stato controllato per la presenza dell’enzima di restrizione EcoRI. Dopo taglio con questo enzima, in gel di agarosio al 1% sono presenti due bande di DNA del peso di 470bp e 920bp che corrispondono a quelle attese. Per poter clonare il gene della tuaD in un vettore di espressione sono stati sintetizzati altri due oligonucleotidi con sequenza 5’gctggatccatgaaaaaatagctgtcattgg 3’ (SEQ ID NO:4) e 5’ ctcgctagcttataaattgacgcttcccaag 3’(SEQ ID NO:5) in modo da poter inserire tale sequenza tra i siti di restrizione BamHI e NheI nel vettore di espressione, il plasmide pRSETB.

Nel gene tuaD à ̈ necessario introdurre una sequenza Shine-Dalgarno (SD) a monte del 5’ del gene per permettere il riconoscimento efficiente da parte della RNA polimerasi batterica. A questo scopo il DNA à ̈ stato amplificato con i seguenti oligonucleotidi

5’ cgacatatgaaaaaatagctgtcattgg 3’ (SEQ ID NO:6) e 5’ ctcgctagcttataaattgacgcttcccaag 3’ (SEQ ID NO:7). In essi sono presenti al 5’due siti di restrizione NdeI e NheI che ne permettono il clonaggio nel vettore pRSETB tra gli stessi siti. In questo modo, a monte del sito di restrizione del NdeI del plasmide pRSETB, à ̈ presente una sequenza SD particolarmente efficiente, necessaria per la RNA polimerasi al fine di sintetizzare la proteina. Prima ancora di questa sequenza à ̈ inoltre presente il sito di restrizione XbaI, che sarà necessario per i successivi clonaggi. Il vettore creato pRSETB à ̈ stato chiamato perciò pRSEtuaD. Quindi, in questo plasmide la sequenza codificante tuaD à ̈ compresa tra i siti di restrizione NdeI e NheI ; prima di questo e a monte à ̈ presente il sito di restrizione XbaI necessario per il successivo clonaggio e dietro il gene della tuaD sono presenti altri siti di restrizione tra cui quelli segnati sono BamHI-- BglII --XhoI

Lo schema seguente riassume i siti di interesse presenti nel plamide pRSEtuaD

XbaI-- NdeI-----------------tuaD----------------- NheI –BamHI-- BglI –XhoI

Il plasmide descritto à ̈ un vettore di espressione funzionante anche in E. coli perché il gene à ̈ sotto il controllo del promotore T7, perciò se viene trasformato in cellule batteriche BL21 DE3, che sono in grado di trascrivere la T7 RNA polimerasi, le rende capaci di esprimere il gene della tuaD. Dopo induzione con 1 mM di IPTG le cellule sono in grado di produrre la proteina del peso molecolare atteso, ma non l’acido ialuronico. La costruzione à ̈ particolarmente efficiente perché il livello di espressione à ̈ molto elevato. Le dimensioni delle colonie che portano il plasmide pRSEtuaD sono molto minute rispetto alle cellule di controllo (Figura 1) e ciò dimostra la tossicità del gene tuaD. Questo clonaggio à ̈ difficile perché apparentemente le colonie hanno difficoltà a crescere: à ̈ probabile che il livello d’espressione particolarmente elevato di questa proteina dreni il glucosio disponibile per una sintesi incontrollata di acido D-glucuronico, privando perciò la cellula della sua principale fonte d’energia. Le cellule nelle quali la sintesi di tuaD viene indotta con IPTG non sono in grado di sopravvivere, perciò il prodotto genico à ̈ tossico.

In conclusione, il gene tuaD à ̈ stato isolato, clonato in un plasmide e la sequenza si à ̈ dimostrata corretta. Il gene espresso in E. coli à ̈ in grado di produrre una proteina del peso molecolare atteso corrispondente a quello descritto per tuaD (54kDa, Figura 2), tuttavia, mancando della ialuronato sintetasi queste cellule non sono in grado di produrre quantità significativa di acido ialuronico, e il conseguente accumulo di glucuronato si rivela così tossico per la stessa cellula.

Esempio 2

Clonaggio del gene hasA (ialuronato sintetasi) da Streoptocooccus zooepidemicus

La sequenza del gene per la ialuronato sintetasi à ̈ presente nelle banche dati con numero di accesso AY173078 ed à ̈ lunga 3552 bp; la sequenza codificante la proteina à ̈ compresa tra le basi 1 e 1254. In questa sequenza sono presenti i siti di restrizione HindIII e StuI e che perciò non possono essere utilizzati per il clonaggio ma possono essere utilizzati per verificarne il clonaggio. Per recuperare la sequenza codificante sono stati disegnati e sintetizzati due oligonucleotidi da utilizzarsi poi con la PCR:

5’atgagaacattaaaaaacctcataac 3’ (SEQ ID NO:8) e 5’taataattttttacgtgttccccag 3’ (SEQ ID NO:9)

Il DNA genomico dal batterio Streoptocooccus zooepidemicus à ̈ stato recuperato tramite il kit di estrazione Qiagen. Mediante PCR à ̈ stata recuperata la sequenza codificante di 1254bp. L’amplificato atteso delle dimensioni corrette à ̈ stato controllato tramite l’enzima di restrizione HindIII e ha dato origine a due bande di circa 100bp e 1150bp che corrispondono al taglio atteso.

Esempio 3

Costruzione del plasmide di espressione pHT01hasA per Bacillus subtilis

Al fine del clonaggio del gene di cui sopra in un vettore di espressione pHT01 (Mobitec) contenente il sistema di promotore-repressore genico grac-lac, Ã ̈ necessario clonare la sequenza sopra scritta tra i siti di restrizione BamHI e XbaI. A questo scopo sono stati creati altri due oligonucleotidi con la seguente sequenza:

5’ ggaggatccatgagaacattaaaaaacctcat 3’ (SEQ ID NO:10) e 5’ cagtctagattataataatttttacgtgtcc 3’ (SEQ ID NO:11)

Nel primo oligonucleotide, vicino al 5’ à ̈ stato creato il sito di restrizione BamHI mentre, nel secondo oligonuclotide sempre al 5’, à ̈ stato creato il sito di restrizione XbaI. L’amplificato ottenuto tramite questi due oligonucleotidi à ̈ stato clonato nel plasmide pGEM4Z tra i siti di restrizione BamHI e XbaI, per dare il plasmide pGEM4hasA

La sequenza del DNA compresa tra questi due siti di restrizione à ̈ stata controllata tramite sequenziatore ABI 7000 e si à ̈ dimostrata corretta.

HindIII-BamHI ----------------hasA---------------XbaI-SalI

Il plasmide à ̈ stato controllato per l’espressione della proteina ricombinate in E. coli e ha mostrato un peso molecolare di circa 42 kDa (in accordo con il peso riportato da questa proteina in letteratura, sebbene essa abbia un peso molecolare teorico di 47,778kDa, Figura 3).

Per clonare la sequenza di cui sopra tra i siti di restrizione BamHI e XbaI del vettore pHT01, il plasmide pGEM4hasA à ̈ stato tagliato nei siti BamHI e XbaI e la banda da 1240bp à ̈ stata clonata negli stessi siti del plasmide pHT01, in modo da ottenere il plasmide pHT01hasA. Questo plasmide non à ̈ in grado di produrre acido ialuronico in quantità significative mancando del gene tuaD.

Esempio 4

Costruzione del plasmide di espressione pHT01hasA-tuaD per Bacillus subtilis.

Con questa costruzione si vuole mettere in tandem il gene hasA e il gene tuaD sotto il controllo del promotore inducibile grac presente nel plasmide pHT01 (Mobitec). Per fare questo si à ̈ utilizzato il plasmide pGEM4hasA (di cui all’esempio precedente) come vettore, dato che contiene già il gene hasA. Questo plasmide à ̈ stato tagliato nei siti XbaI e SalI, mentre la sequenza del gene tuaD à ̈ stata tagliata dal plasmide pRESEtuaD nei siti XbaI e XhoI e poi à ̈ stata clonata negli stessi siti (Xho I e SalI sono compatibili).

pGEM4hasA

HindIII-BamHI ---------------hasA---------------XbaI-SalI

pRESETtuaD

XbaI-- NdeI-----------------tuaD----------------- NheI –BamHI-- BglI –XhoI

ottenendo questa sequenza:

HindIII-BamHI ---------hasA----------XbaI--NdeI---------tuaD----------- NheI –BamHI-- BglI –XhoI

A questo punto il gene hasA à ̈ in tandem al gene tuaD; il frammento BamHI---- NheI che si ottiene dal plasmide tagliando con questi enzimi di restrizione contiene in tandem il gene hasA e il gene tuaD. Successivamente il frammento à ̈ stato clonato nel vettore pHT01 tra i siti di restrizione BamHI e XbaI (XbaI à ̈ compatibile con NheI) dando origine al plasmide pBS5, la cui sequenza completa, controllata, à ̈ di seguito riportata:

0 TTAAGTTATTGGTATGACTGGTTTTAAGCGCAAAAAAAGTTGCTTTTTCGTACCTATTAA

<60 TGTATCGTTTTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAA>

120 GCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGAT

180 AACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTT

240 TATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATAT

300 TTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAAAAAGCATTTTCAG

<360 GTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGT>

420 ATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTT

480 TAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTC

540 CGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGA 600 AAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAA 660 TATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCT 720 CTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAA<780 TTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCC>840 TTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTAT 900 CCAATTTTCGTTTGTTGAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGAATAAAGACCACATTAAAA 960 AATGTGGTCTTTTGTGTTTTTTTAAAGGATTTGAGCGTAGCGAAAAATCCTTTTCTTTCT 1020 TATCTTGATAATAAGGGTAACTATTGCCGATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACT<1080 ATGGCGTGCTGCTAGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCG>1140 GTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTA EcoRI 1200 AGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 1260 GAGCTCAGGCCTTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGA<1320 AACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGT>1380 ATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTT 1440 CACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCG 1500 AAAATCCTGTTTGATGGTGGTTGACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTC 1560 GTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCAT<1620 TGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATT>1680 CAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGC 1740 TATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGC 1800 CGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAG 1860 ATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGT<1920 CTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAAT>1980 GGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAG 2040 ATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCAC 2100 GCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTG 2160 CAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTG 2220 TGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGT 2280 TTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACC 2340 GGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCATCAAAATCGTCTCCCTCCGTTT 2400 GAATATTTGATTGATCGTAACCAGATGAAGCACTCTTTCCACTATCCCTACAGTGTTATG<2460 GCTTGAACAATCACGAAACAATAATTGGTACGTACGATCTTTCAGCCGACTCAAACATCA>2520 AATCTTACAAATGTAGTCTTTGAAAGTATTACATATGTAAGATTTAAATGCAACCGTTTT 2580 TTCGGAAGGAAATGATGACCTCGTTTCCACCGGAATTAGCTTGGTACCAGCTATTGTAAC 2640 ATAATCGGTACGGGGGTGAAAAAGCTAACGGAAAAGGGAGCGGAAAAGAATGATGTAAGC 2700 GTGAAAAATTTTTTATCTTATCACTTGAAATTGGAAGGGAGATTCTTTATTATAAGAATT<BamHI>

2760 GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCAATTAAAGGAGGAAGGATCCATGAGAACATTA

1 M R T L

2820 AAAAACCTCATAACTGTTGTGGCCTTTAGTATTTTTTGGGTACTGTTGATTTACGTCAAT

<1 K N L I T V V A F S I F W V L L I Y V N>

HindIII

2880 GTTTATCTCTTTGGTGCTAAAGGAAGCTTGTCAATTTATGGCTTTTTGCTGATAGCTTAC

1 V Y L F G A K G S L S I Y G F L L I A Y

<2940 CTATTAGTCAAAATGTCCTTATCCTTTTTTTACAAGCCATTTAAGGGAAGGGCTGGGCAA>

1 L L V K M S L S F F Y K P F K G R A G Q

3000 TATAAGGTTGCAGCCATTATTCCCTCTTATAACGAAGATGCTGAGTCATTGCTAGAGACC

1 Y K V A A I I P S Y N E D A E S L L E T

3060 TTAAAAAGTGTTCAGCAGCAAACCTATCCCCTAGCAGAAATTTATGTTGTTGACGATGGA

1 L K S V Q Q Q T Y P L A E I Y V V D D G

3120 AGTGCTGATGAGACAGGTATTAAGCGCATTGAAGACTATGTGCGTGACACTGGTGACCTA 1 S A D E T G I K R I E D Y V R D T G D L

3180 TCAAGCAATGTCATTGTTCACCGGTCAGAAAAAAATCAAGGAAAGCGTCATGCACAGGCC 1 S S N V I V H R S E K N Q G K R H A Q A

3240 TGGGCCTTTGAAAGATCAGACGCTGATGTCTTTTTGACCGTTGACTCAGATACTTATATC 1 W A F E R S D A D V F L T V D S D T Y I

3300 TACCCTGATGCTTTAGAGGAGTTGTTAAAAACCTTTAATGACCCAACTGTTTTTGCTGCG<1 Y P D A L E E L L K T F N D P T V F A A>

3360 ACGGGTCACCTTAATGTCAGAAATAGACAAACCAATCTCTTAACACGCTTGACAGATATT 1 T G H L N V R N R Q T N L L T R L T D I

<3420 CGCTATGATAATGCTTTTGGCGTTGAACGAGCTGCCCAATCCGTTACAGGTAATATTCTC>1 R Y D N A F G V E R A A Q S V T G N I L

3480 GTTTGCTCAGGCCCGCTTAGCGTTTACAGACGCGAGGTGGTTGTTCCTAACATAGATAGA 1 V C S G P L S V Y R R E V V V P N I D R

3540 TACATCAACCAGACCTTCCTGGGTATTCCTGTAAGTATCGGTGATGACAGGTGCTTGACC 1 Y I N Q T F L G I P V S I G D D R C L T

3600 AACTATGCAACTGATTTAGGAAAGACTGTTTATCAATCCACTGCTAAATGTATTACAGAT<1 N Y A T D L G K T V Y Q S T A K C I T D>

3660 GTTCCTGACAAGATGTCTACTTACTTGAAGCAGCAAAACCGCTGGAACAAGTCCTTCTTT 1 V P D K M S T Y L K Q Q N R W N K S F F 3720 AGAGAGTCCATTATTTCTGTTAAGAAAATCATGAACAATCCTTTTGTAGCCCTATGGACC 1 R E S I I S V K K I M N N P F V A L W T

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5460 GCTAAAGACTTGGGAAGCGTCAATTTATAAGCTAGAGTCGACGTCCCCGGGGCAGCCCGC 1 A K D L G S V N L

5520 CTAATGAGCGGGCTTTTTTCACGTCACGCGTCCATGGAGATCTTTGTCTGCAACTGAAAA 5580 GTTTATACCTTACCTGGAACAAATGGTTGAAACATACGAGGCTAATATCGGCTTATTAGG 5640 AATAGTCCCTGTACTAATAAAATCAGGTGGATCAGTTGATCAGTATATTTTGGACGAAGC 5700 TCGGAAAGAATTTGGAGATGACTTGCTTAATTCCACAATTAAATTAAGGGAAAGAATAAA<5760 GCGATTTGATGTTCAAGGAATCACGGAAGAAGATACTCATGATAAAGAAGCTCTAAAACT>5820 ATTCAATAACCTTACAATGGAATTGATCGAAAGGGTGGAAGGTTAATGGTACGAAAATTA HindIII

5880 GGGGATCTACCTAGAAAGCCACAAGGCGATAGGTCAAGCTTAAAGAACCCTTACATGGAT 5940 CTTACAGATTCTGAAAGTAAAGAAACAACAGAGGTTAAACAAACAGAACCAAAAAGAAAA<6000 AAAGCATTGTTGAAAACAATGAAAGTTGATGTTTCAATCCATAATAAGATTAAATCGCTG>EcoRI

6060 CACGAAATTCTGGCAGCATCCGAAGGGAATTCATATTACTTAGAGGATACTATTGAGAGA 6120 GCTATTGATAAGATGGTTGAGACATTACCTGAGAGCCAAAAAACTTTTTATGAATATGAA 6180 TTAAAAAAAAGAACCAACAAAGGCTGAGACAGACTCCAAACGAGTCTGTTTTTTTAAAAA<6240 AAATATTAGGAGCATTGAATATATATTAGAGAATTAAGAAAGACATGGGAATAAAAATAT>6300 TTTAAATCCAGTAAAAATATGATAAGATTATTTCAGAATATGAAGAACTCTGTTTGTTTT 6360 TGATGAAAAAACAAACAAAAAAAATCCACCTAACGGAATCTCAATTTAACTAACAGCGGC 6420 CAAACTGAGAAGTTAAATTTGAGAAGGGGAAAAGGCGGATTTATACTTGTATTTAACTAT 6480 CTCCATTTTAACATTTTATTAAACCCCATACAAGTGAAAATCCTCTTTTACACTGTTCCT<6540 TTAGGTGATCGCGGAGGGACATTATGAGTGAAGTAAACCTAAAAGGAAATACAGATGAAT>6600 TAGTGTATTATCGACAGCAAACCACTGGAAATAAAATCGCCAGGAAGAGAATCAAAAAAG 6660 GGAAAGAAGAAGTTTATTATGTTGCTGAAACGGAAGAGAAGATATGGACAGAAGAGCAAA 6720 TAAAAAACTTTTCTTTAGACAAATTTGGTACGCATATACCTTACATAGAAGGTCATTATA 6780 CAATCTTAAATAATTACTTCTTTGATTTTTGGGGCTATTTTTTAGGTGCTGAAGGAATTG 6840 CGCTCTATGCTCACCTAACTCGTTATGCATACGGCAGCAAAGACTTTTGCTTTCCTAGTC 6900 TACAAACAATCGCTAAAAAAATGGACAAGACTCCTGTTACAGTTAGAGGCTACTTGAAAC 6960 TGCTTGAAAGGTACGGTTTTATTTGGAAGGTAAACGTCCGTAATAAAACCAAGGATAACA 7020 CAGAGGAATCCCCGATTTTTAAGATTAGACGTAAGGTTCCTTTGCTTTCAGAAGAACTTT<7080 TAAATGGAAACCCTAATATTGAAATTCCAGATGACGAGGAAGCACATGTAAAGAAGGCTT>7140 TAAAAAAGGAAAAAGAGGGTCTTCCAAAGGTTTTGAAAAAAGAGCACGATGAATTTGTTA 7200 AAAAAATGATGGATGAGTCAGAAACAATTAATATTCCAGAGGCCTTACAATATGACACAA 7260 TGTATGAAGATATACTCAGTAAAGGAGAAATTCGAAAAGAAATCAAAAAACAAATACCTA 7320 ATCCTACAACATCTTTTGAGAGTATATCAATGACAACTGAAGAGGAAAAAGTCGACAGTA<7380 CTTTAAAAAGCGAAATGCAAAATCGTGTCTCTAAGCCTTCTTTTGATACCTGGTTTAAAA>7440 ACACTAAGATCAAAATTGAAAATAAAAATTGTTTATTACTTGTACCGAGTGAATTTGCAT 7500 TTGAATGGATTAAGAAAAGATATTTAGAAACAATTAAAACAGTCCTTGAAGAAGCTGGAT 7560 ATGTTTTCGAAAAAATCGAACTAAGAAAAGTGCAATAAACTGCTGAAGTATTTCAGCAGT 7620 TTTTTTTATTTAGAAATAGTGAAAAAAATATAATCAGGGAGGTATCAATATTTAATGAGT<7680 ACTGATTTAAATTTATTTAGACTGGAATTAATAATTAACACGTAGACTAATTAAAATTTA>7740 ATGAGGGATAAAGAGGATACAAAAATATTAATTTCAATCCCTATTAAATTTTAACAAGGG 7800 GGGGATTAAAATTTAATTAGAGGTTTATCCACAAGAAAAGACCCTAATAAAATTTTTACT 7860 AGGGTTATAACACTGATTAATTTCTTAATGGGGGAGGGATTAAAATTTAATGACAAAGAA HindIII

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10320 CACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA

10380 CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAA

10440 CGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTT

<10500 CTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGA>

10560 TACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA

10620 GCGCCCAATACG

(SEQ ID NO:1)

In questa sequenza il gene hasA à ̈ presente tra le basi 2808 e 4062 e prima del gene à ̈ correttamente presente una sequenza Shine-Dalgarno (GGAGGA) per aumentare l’efficienza di trascrizione. Di seguito a questo, tra le basi 4105bp fino a 5490bp, à ̈ presente il gene tuaD ed anche qui prima del gene à ̈ presente una efficiente sequenza Shine-Dalgarno (AGGAGA). Inoltre, il codone iniziale Valina presente nel gene della tuaD à ̈ stato sostituto qui con quello più efficiente della Metionina. Il plasmide, controllato per gli enzimi di restrizione HindIII e EcoRI, da un pattern di restrizione corretto con le seguenti bande: 3957bp, 1650bp, 1522bp, 1243bp, 610bp.

Questo vettore à ̈ in grado di esprimere acido ialuronico in Bacillus subtilis ma anche in E. Coli, infatti, il test con carbazolo effettuato verso il vettore senza queste sequenze mostra la presenza di acido glucuronico (Figura 4 - picco attorno 540nm) che à ̈ uno dei costituenti dell’acido ialuronico.

Il plasmide pHT01 à ̈ un vettore shuttle in grado di crescere sia in E. coli che in B. subtilis. Durante la costruzione del plasmide pBS5 in E.coli si à ̈ notato che, nonostante diversi accorgimenti, il batterio non cresce con alta efficienza come invece i batteri trasformati con il plasmide parentale pHT01: infatti, terminata la fase di crescita, le quantità di plasmide ottenute dopo purificazione mediante colonne Qiagen erano dell’ordine di 1/10 rispetto a quello del plasmide parentale. Una resa così bassa non à ̈ naturalmente accettabile da un punto di vista industriale, perché pone dei problemi per un suo utilizzo per successive modificazioni e per le quantità necessarie per le trasformazioni in Bacillus subtilis, ed à ̈ per questo che si à ̈ trasformato il plasmide in ceppi batterici differenti, dopo averli resi competenti con calcio cloruro. Da questa analisi à ̈ stato sorprendentemente rilevato che il plasmide può essere cresciuto efficientemente solo nel ceppo di E. Coli cellulare INV-1α e non, come ci si aspettava, nel ceppo TOP-10 molto più efficiente nella trasformazione, normalmente impiegato per tutte le costruzioni batteriche. La differenza principale tra le cellule TOP-10 e le cellule INV-1α à ̈ che queste ultime contengono il repressore per il lattosio lac costitutivamente espresso. Il plasmide ingegnerizzato infatti contiene, oltre al sistema grac-lac, la sequenza genica per la sintesi del repressore lac, quindi, il sistema diviene operativo solo quando il repressore viene sintetizzato e può bloccare il promotore grac. Le cellule di coli INV-1α, contenendo già il repressore lac (che può immediatamente bloccare il promotore grac), sono effettivamente ed efficacemente in grado di controllare la trascrizione dei geni posti sotto questo controllo, mentre, nel ceppo TOP-10 il sistema grac-lac richiede la sintesi del repressore per essere effettivo. Nel frattempo, il promotore permette alle polimerasi batteriche la trascrizione dei geni per la sintesi dell’HA, geni non più controllati dal sistema e i cui prodotti possono risultare tossici per la cellula stessa.

Il plasmide pBS5 contiene il promotore inducibile grac che utilizza il repressore lac. In E. coli, questo promotore, indotto con IPTG 1mM, à ̈ dunque in grado di codificare i geni che stanno a valle. Successivamente abbiamo ottenuto la trasformazione di questo plasmide anche in cellule JM110, cellule batteriche deficienti di due geni Dam Dcm che portono alla metilazione del DNA a livello della sequenza di riconoscimento GATC (Dam) e CCAGG CCTGG (Dcm). Questo DNA trasferito nelle cellule di B. subtilis à ̈ in grado di produrre acido ialuronico con peso molecolare più elevato rispetto a quello ottenibile col DNA cresciuto nelle cellule INV-1α.

Esempio 5

Trasformazione batterica in Bacillus subtilis: terreni e ceppi batterici per la formazione di cellule competenti.

Il trasferimento di plasmidi in Bacillus subtilis utilizza la capacità naturale di entrata dei plasmidi durante una determinata fase della crescita del batterio stesso, ed à ̈ quindi un effetto naturale. Le trasformazioni sono state effettuate con diversi ceppi batterici, in particolare WB800N (MOBITEC) o 1012 (MOBITEC). Il primo ceppo batterico à ̈ stato sviluppato per l’espressione di proteine ricombinanti in quanto à ̈ privo di 8 proteasi che potrebbero degradare soprattutto le proteine che vengono secrete (il prodotto del gene hasA, la ialuronato sintetasi, à ̈ una proteina transmembrana che quindi potrebbe andare incontro a proteolisi). Il ceppo 1012 à ̈ stato invece utilizzato come cellula ospite per l’espressione dei plasmidi della serie pHT.

Per la trasformazione sono necessari i seguenti terreni:

SOLUZIONE STOCK DI METALLI 1000x

2 M MgCl2

0,7 M CaCl2

50 mM MnCl2

5 mM FeCl3

1 mM ZnCl2

10x S-base 10xMM

2 g (NH4)2SO4

14 g K2HPO4

6 g KH2PO4

aggiungere acqua distillata a 100 ml e autoclavare HS mezzo

Per100 ml:

10 ml 10 x S-base

12,5 ml glucosio 4% (m/v)

5 ml L-triptofano 0,1% (m/v)

2 ml casaminoacidi 1% (m/v)

25 ml estratto di lievito 2% (m/v)

10 ml arginina 8%(m/v), istidina 0,4%(m/v) 10 ml sodio citrato 1%(m/v)

0,01 ml MgSO41M

25,49 ml acqua distillata

LS mezzo

Per100 ml:

10 ml 10 x S-base

12,5 ml glucosio 4% (m/v)

0,5 ml L-triptofano 0,1% (m/v)

1 ml casaminoacidi 1% (m/v)

5 ml estratto di lievito 2% (m/v)

0,5 ml MgCl20,5 M

0,5 ml CaCl20,1 M

10 ml sodio citrato 1%(m/v)

0,01 ml MgSO41M

59,990 ml acqua distillata

Esempio 6

Preparazione di cellule competenti da Bacillus subtilis.

Una colonia singola di Bacillus subtilis viene cresciuta in 5 ml di terreno HS a 37°C per tutta una notte. Il giorno seguente 500µl di questa coltura sono incubati con 50 ml di terreno HS e di nuovo cresciuti in vigorosa agitazione a 200rpm. Quando le cellule hanno raggiunto la fase stazionaria vengono raccolte aliquote da 10 ml ogni 15 minuti. Ad ognuna viene aggiunto 1 ml di glicerolo, lasciando in ghiaccio per 15 minuti. Vengono poi prelevate delle aliquote da 1 ml che vengono conservate a -80°C fino all’uso. Le frazioni con il più alto tasso di trasformazione vengono impiegate per le trasformazioni.

Esempio 7

Trasformazione di cellule competenti di Bacillus subtilis

Le cellule batteriche rese competenti vengono scongelate velocemente in un bagno termostatico a 37°C quindi diluite in 20 ml di terreno LS in una beuta da 250 ml e messe in agitazione per 2 ore a 30°C. Trascorso questo tempo, aliquote da 1 ml vengono poste in tubi da 15 ml a cui si aggiungono 10µl di EDTA e si mantengono a temperatura ambiente per 5 minuti. Il DNA plasmidico pBS5 viene aggiunto alla provetta e incubato per 2h a 37°C, in agitazione con la massima aerazione. Dopo leggera centrifugazione le cellule sono piastrate in terreno selettivo preriscaldato. Dopo due giorni si ottengono delle colonie batteriche. La crescita delle cellule in soluzione non à ̈ attuabile in quanto esse crescono molto lentamente e dopo aggiunta di IPTG muoiono ma, soprattutto le poche cellule vive non presentano più il plasmide ricombinante. Per selezionare batteri vitali in grado di esprimere alti livelli di acido ialuronico, le cellule sono state piastrate in presenza di un gradiente di IPTG. Come si vede nella Figura 6, le cellule poste nella vicinanza di un’alta concentrazione di IPTG muoiono (perché la tuaD espressa ad alti livelli à ̈ tossica per il B. subtilis); sopravvivono invece le cellule piastrate in una posizione dove si riscontra una dose minore di IPTG.

Quando queste ultime vengono esaminate, si presentano in colonie larghe e traslucide (Figura 7), segnale di espressione di acido ialuronico; queste cellule, selezionate e cresciute in presenza di IPTG, sopravvivono anche a dosi più alte di IPTG e durante la fermentazione conservano il plasmide.

Attraverso questo sistema di selezione si ottengono linee batteriche vitali, stabili ma soprattutto secernenti alti livelli di acido ialuronico anche dopo molte divisioni cellulari.

La stabilità del plasmide à ̈ stata verificata facendo crescere le cellule per 24 ore in presenza di IPTG e saccarosio, ed in presenza o assenza di Cloramfenicolo. Come ben visibile in Figura 8, il numero di colonie rimane identico, a dimostrazione di quanto affermato. Esempio 8

Fermentazione di cellule di B. subtilis trasformate e selezionate

Le cellule di Bacillus subtilis trasformate e selezionate su gradiente di IPTG sono state coltivate in fermentatore da 20L in 5L di terreno MM e glucosio come fonte di carbonio.

IPTG à ̈ stato aggiunto come induttore dopo l’avvio della fermentazione.

Le fermentazioni hanno evidenziato la presenza di un meccanismo anabolico cellulare a due vie per la produzione di HA, in cui la scelta di una via rispetto all’altra dipende dalla concentrazione iniziale della fonte di carbonio utilizzata dai due enzimi hasA e tuaD.

Pertanto, in base alla quantità di glucosio inizialmente disponibile, gli enzimi ricombinanti veicolano la sintesi di acido ialuronico verso la produzione della molecola ad alto peso molecolare o a basso peso molecolare.

La conferma di ciò si à ̈ avuta eseguendo due processi fermentativi per la produzione di HA differenti tra loro solo per la concentrazione iniziale della fonte di carbonio (0.01% verso 1%) e con un feed di glucosio al 10% attivato dopo 7 ore dall’induzione con IPTG 0,4-0,5 M.

Le condizioni di fermentazione prevedono il mantenimento della coltura con un’agitazione a 1300 rpm, un’areazione con 10-12 litri air/min, una temperatura di 37°C, ed un pH 6,9-7,1.

Una concentrazione di glucosio iniziale allo 0.01% induce la sintesi di acido ialuronico con un peso molecolare superiore al 1x10<6>Da ed una concentrazione di HA nel brodo di fine fermentazione di grammi/litro, mentre una concentrazione di glucosio iniziale all’1% sposta il processo di sintesi di HA verso un peso molecolare medio di circa 2-3x10<5>Da ed una concentrazione di HA nel brodo di fine fermentazione di almeno 3-4 g/L.

Claims (21)

1. RIVENDICAZIONI 1. Processo per la produzione di acido ialuronico in Escherichia coli o Bacillus subtilis comprendente le seguenti fasi: (a) coltura di cellule batteriche ospite di Escherichia coli che esprimono costitutivamente il repressore lac o di Bacillus subtilis trasformate con il sistema lac, in condizioni idonee alla produzione di acido ialuronico ed in presenza rispettivamente di β-isopropil-tiogalattopiranoside (IPTG) come induttore, in cui dette cellule batteriche ospite sono caratterizzate dal fatto di essere trasformate con: (i) almeno un vettore plasmidico episomale comprendente una sequenza codificante per l’enzima ialuronato sintasi, una sequenza codificante per l’enzima UDP-glucosio idrogenasi in tandem, sotto il controllo del promotore forte inducibile grac che utilizza il repressore lac; o (ii) almeno un vettore plasmidico episomale comprendente una sequenza codificante per l’enzima ialuronato sintasi, una sequenza codificante per l’enzima UDP-glucosio idrogenasi, una sequenza codificante per l’enzima UDP-glucosio pirofosforilasi e una sequenza codificante per l’enzima glucosio 6 fosfato isomerasi, sotto il controllo del promotore forte inducibile grac che utilizza il repressore lac; (b) recupero dell’acido ialuronico dal terreno di coltura; in cui dette cellule batteriche ospite di Escherichia coli o di Bacillus subtilis trasformate con il vettore plasmidico (i) o (ii) in grado di produrre acido ialuronico della fase a) vengono preventivamente selezionate in piastra su gradiente di IPTG.
2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui quando si impiegano le cellule batteriche ospite di Bacillus subtilis il vettore plasmidico episomiale (i) o (ii) comprende ulteriormente una sequenza codificante per il repressore lac.
3. 3. Processo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui l’induttore IPTG viene aggiunto nella fase a) in quantità compresa tra 0,1 e 10 mM, preferibilmente tra 0,5 e 1 mM.
4. 4. Processo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui dette cellule batteriche ospite di Bacillus subtilis appartengono al ceppo WB800N o 1012.
5. 5. Processo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui dette cellule batteriche ospite di Escherichia Coli appartengono al ceppo BL21.
6. 6. Processo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-5, in cui la sequenza codificante per l’enzima ialuronato sintasi (hasA) à ̈ ottenuta da un ceppo di Streptococcus, preferibilmente da Streptococcus zooepidemicus, e le sequenze codificanti per gli enzimi UDP-glucosio idrogenasi (hasB o tuaD), UDP-glucosio pirofosforilasi (hasC o gtaB) e glucosio 6 fosfato isomerasi (hasE o pgi) sono ottenute da Bacillus subtilis.
7. 7. Processo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6, in cui le sequenze codificanti per l’enzima ialuronato sintasi, UDP-glucosio idrogenasi, UDP-glucosio pirofosforilasi e glucosio 6 fosfato isomerasi comprendono a monte una sequenza Shine-Dalgarno.
8. 8. Processo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-7, in cui detto vettore plasmidico (i) comprende o consiste nella sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 13.
9. 9. Vettore plasmidico comprendente un promotore forte inducibile grac legato operativamente ad una sequenza codificante per l’enzima ialuronato sintasi ed una sequenza codificante per l’enzima UDP-glucosio idrogenasi in tandem.
10. 10. Vettore plasmidico comprendente un promotore forte inducibile grac legato operativamente ad una sequenza codificante per l’enzima ialuronato sintasi, una sequenza codificante per l’enzima UDP-glucosio idrogenasi, una sequenza codificante per l’enzima UDP-glucosio pirofosforilasi e una sequenza codificante per l’enzima glucosio 6 fosfato isomerasi.
11. 11. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 9 o 10, ulteriormente comprendente una sequenza codificante per il repressore lac.
12. 12. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 9 o 11, in cui detta sequenza codificante per l’enzima ialuronato sintasi à ̈ il gene hasA da Streptococcus zooepidemicus e detta sequenza codificante per l’enzima UDP-glucosio idrogenasi à ̈ il gene tuaD da Bacillus subtilis.
13. 13. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 12, comprendente o consistente nella seguente sequenza nucleotidica : TTAAGTTATTGGTATGACTGGTTTTAAGCGCAAAAAAAGTTGCTTTTTCGTACCTATTAA TGTATCGTTTTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAA GCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGAT AACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTT TATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATAT TTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAAAAAGCATTTTCAG GTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGT ATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTT TAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTC CGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGA AAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAA TATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCT CTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAA TTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCC TTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTAT CCAATTTTCGTTTGTTGAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGAATAAAGACCACATTAAAA AATGTGGTCTTTTGTGTTTTTTTAAAGGATTTGAGCGTAGCGAAAAATCCTTTTCTTTCT TATCTTGATAATAAGGGTAACTATTGCCGATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACT ATGGCGTGCTGCTAGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCG GTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTA AGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTC GAGCTCAGGCCTTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGA AACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGT ATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTT CACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCG AAAATCCTGTTTGATGGTGGTTGACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTC GTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCAT TGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATT CAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGC TATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGC 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GTCATTAAAACAAACCTAGAAAGTGCAGAAATGATTAAATACGCCGCGAATGCATTTCTG GCGACAAAGATTTCCTTTATCAACGATATCGCAAACATTTGTGAGCGAGTCGGCGCAGAC GTTTCAAAAGTTGCTGATGGTGTTGGTCTTGACAGCCGTATCGGCAGAAAGTTCCTTAAA GCTGGTATTGGATTCGGCGGTTCATGTTTTCCAAAGGATACAACCGCGCTGCTTCAAATC GCAAAATCGGCAGGCTATCCATTCAAGCTCATCGAAGCTGTCATTGAAACGAACGAAAAG CAGCGTGTTCATATTGTAGATAAACTTTTGACTGTTATGGGAAGCGTCAAAGGGAGAACC ATTTCAGTCCTGGGATTAGCCTTCAAACCGAATACGAACGATGTGAGATCCGCTCCAGCG CTTGATATTATCCCAATGCTGCAGCAGCTGGGCGCCCATGTAAAAGCATACGATCCGATT GCTATTCCTGAAGCTTCAGCGATCCTTGGCGAACAGGTCGAGTATTACACAGATGTGTAT GCTGCGATGGAAGACACTGATGCATGCCTGATTTTAACGGATTGGCCGGAAGTGAAAGAA ATGGAGCTTGTAAAAGTGAAAACCCTCTTAAAACAGCCAGTCATCATTGACGGCAGAAAT TTATTTTCACTTGAAGAGATGCAGGCAGCCGGATACATTTATCACTCTATCGGCCGTCCC GCTGTTCGGGGAACGGAACCCTCTGACAAGTATTTTCCGGGCTTGCCGCTTGAAGAATTG GCTAAAGACTTGGGAAGCGTCAATTTATAAGCTAGAGTCGACGTCCCCGGGGCAGCCCGC CTAATGAGCGGGCTTTTTTCACGTCACGCGTCCATGGAGATCTTTGTCTGCAACTGAAAA GTTTATACCTTACCTGGAACAAATGGTTGAAACATACGAGGCTAATATCGGCTTATTAGG AATAGTCCCTGTACTAATAAAATCAGGTGGATCAGTTGATCAGTATATTTTGGACGAAGC TCGGAAAGAATTTGGAGATGACTTGCTTAATTCCACAATTAAATTAAGGGAAAGAATAAA GCGATTTGATGTTCAAGGAATCACGGAAGAAGATACTCATGATAAAGAAGCTCTAAAACT ATTCAATAACCTTACAATGGAATTGATCGAAAGGGTGGAAGGTTAATGGTACGAAAATTA GGGGATCTACCTAGAAAGCCACAAGGCGATAGGTCAAGCTTAAAGAACCCTTACATGGAT CTTACAGATTCTGAAAGTAAAGAAACAACAGAGGTTAAACAAACAGAACCAAAAAGAAAA AAAGCATTGTTGAAAACAATGAAAGTTGATGTTTCAATCCATAATAAGATTAAATCGCTG CACGAAATTCTGGCAGCATCCGAAGGGAATTCATATTACTTAGAGGATACTATTGAGAGA GCTATTGATAAGATGGTTGAGACATTACCTGAGAGCCAAAAAACTTTTTATGAATATGAA TTAAAAAAAAGAACCAACAAAGGCTGAGACAGACTCCAAACGAGTCTGTTTTTTTAAAAA AAATATTAGGAGCATTGAATATATATTAGAGAATTAAGAAAGACATGGGAATAAAAATAT TTTAAATCCAGTAAAAATATGATAAGATTATTTCAGAATATGAAGAACTCTGTTTGTTTT TGATGAAAAAACAAACAAAAAAAATCCACCTAACGGAATCTCAATTTAACTAACAGCGGC CAAACTGAGAAGTTAAATTTGAGAAGGGGAAAAGGCGGATTTATACTTGTATTTAACTAT CTCCATTTTAACATTTTATTAAACCCCATACAAGTGAAAATCCTCTTTTACACTGTTCCT TTAGGTGATCGCGGAGGGACATTATGAGTGAAGTAAACCTAAAAGGAAATACAGATGAAT TAGTGTATTATCGACAGCAAACCACTGGAAATAAAATCGCCAGGAAGAGAATCAAAAAAG GGAAAGAAGAAGTTTATTATGTTGCTGAAACGGAAGAGAAGATATGGACAGAAGAGCAAA TAAAAAACTTTTCTTTAGACAAATTTGGTACGCATATACCTTACATAGAAGGTCATTATA CAATCTTAAATAATTACTTCTTTGATTTTTGGGGCTATTTTTTAGGTGCTGAAGGAATTG CGCTCTATGCTCACCTAACTCGTTATGCATACGGCAGCAAAGACTTTTGCTTTCCTAGTC TACAAACAATCGCTAAAAAAATGGACAAGACTCCTGTTACAGTTAGAGGCTACTTGAAAC TGCTTGAAAGGTACGGTTTTATTTGGAAGGTAAACGTCCGTAATAAAACCAAGGATAACA CAGAGGAATCCCCGATTTTTAAGATTAGACGTAAGGTTCCTTTGCTTTCAGAAGAACTTT TAAATGGAAACCCTAATATTGAAATTCCAGATGACGAGGAAGCACATGTAAAGAAGGCTT TAAAAAAGGAAAAAGAGGGTCTTCCAAAGGTTTTGAAAAAAGAGCACGATGAATTTGTTA AAAAAATGATGGATGAGTCAGAAACAATTAATATTCCAGAGGCCTTACAATATGACACAA TGTATGAAGATATACTCAGTAAAGGAGAAATTCGAAAAGAAATCAAAAAACAAATACCTA ATCCTACAACATCTTTTGAGAGTATATCAATGACAACTGAAGAGGAAAAAGTCGACAGTA CTTTAAAAAGCGAAATGCAAAATCGTGTCTCTAAGCCTTCTTTTGATACCTGGTTTAAAA ACACTAAGATCAAAATTGAAAATAAAAATTGTTTATTACTTGTACCGAGTGAATTTGCAT TTGAATGGATTAAGAAAAGATATTTAGAAACAATTAAAACAGTCCTTGAAGAAGCTGGAT ATGTTTTCGAAAAAATCGAACTAAGAAAAGTGCAATAAACTGCTGAAGTATTTCAGCAGT TTTTTTTATTTAGAAATAGTGAAAAAAATATAATCAGGGAGGTATCAATATTTAATGAGT ACTGATTTAAATTTATTTAGACTGGAATTAATAATTAACACGTAGACTAATTAAAATTTA ATGAGGGATAAAGAGGATACAAAAATATTAATTTCAATCCCTATTAAATTTTAACAAGGG GGGGATTAAAATTTAATTAGAGGTTTATCCACAAGAAAAGACCCTAATAAAATTTTTACT AGGGTTATAACACTGATTAATTTCTTAATGGGGGAGGGATTAAAATTTAATGACAAAGAA AACAATCTTTTAAGAAAAGCTTTTAAAAGATAATAATAAAAAGAGCTTTGCGATTAAGCA AAACTCTTTACTTTTTCATTGACATTATCAAATTCATCGATTTCAAATTGTTGTTGTATC ATAAAGTTAATTCTGTTTTGCACAACCTTTTCAGGAATATAAAACACATCTGAGGCTTGT TTTATAAACTCAGGGTCGCTAAAGTCAATGTAACGTAGCATATGATATGGTATAGCTTCC ACCCAAGTTAGCCTTTCTGCTTCTTCTGAATGTTTTTCATATACTTCCATGGGTATCTCT AAATGATTTTCCTCATGTAGCAAGGTATGAGCAAAAAGTTTATGGAATTGATAGTTCCTC TCTTTTTCTTCAACTTTTTTATCTAAAACAAACACTTTAACATCTGAGTCAATGTAAGCA TAAGATGTTTTTCCAGTCATAATTTCAATCCCAAATCTTTTAGACAGAAATTCTGGACGT AAATCTTTTGGTGAAAGAATTTTTTTATGTAGCAATATATCCGATACAGCACCTTCTAAA AGCGTTGGTGAATAGGGCATTTTACCTATCTCCTCTCATTTTGTGGAATAAAAATAGTCA TATTCGTCCATCTACCTATCCTATTATCGAACAGTTGAACTTTTTAATCAAGGATCAGTC CTTTTTTTCATTATTCTTAAACTGTGCTCTTAACTTTAACAACTCGATTTGTTTTTCCAG ATCTCGAGGGTAACTAGCCTCGCCGATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTCAGGTGGCACTTT TCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAT GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGT TTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACG AGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGA AGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCG TATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGT TGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGG AGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGA TCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCC TGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTC CCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTC GGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCG CGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACAC GACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTC ACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTT AAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACC ACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT AACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGG CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACC AGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTT ACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGA GCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCT TCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCG CACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAA CGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTT CTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGA TACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA GCGCCCAATACG (SEQ ID NO:1)
14. 14. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 10 o 11, in cui detta sequenza codificante per l’enzima ialuronato sintasi à ̈ il gene hasA da Streptococcus zooepidemicus, detta sequenza codificante per l’enzima UDP-glucosio idrogenasi à ̈ il gene tuaD da Bacillus subtilis, detta sequenza codificante per l’enzima UDP-glucosio pirofosforilasi à ̈ il gene gtaB da Bacillus subtilis e detta sequenza codificante per l’enzima glucosio 6 fosfato isomerasi à ̈ il gene pgi da Bacillus subtilis.
15. 15. Vettore plasmidico secondo ognuna delle rivendicazioni 9-14, in cui la sequenza codificante per l’enzima ialuronato sintasi, UDP-glucosio idrogenasi, UDP-glucosio idrogenasi, UDP-glucosio pirofosforilasi e glucosio 6 fosfato isomerasi comprendono a monte una sequenza Shine-Dalgarno.
16. 16. Uso di almeno un vettore plasmidico come definito secondo ognuna delle rivendicazioni 9-15 per la trasformazione di una cellula batterica ospite appartenente al genere Escherichia o Bacillus per la produzione di acido ialuronico mediante tali cellule tramite induzione con IPTG, previa selezione in piastra su gradiente di IPTG.
17. 17. Uso secondo la rivendicazione 16, in cui dette cellule batteriche ospite sono cellule di Escherichia coli o Bacillus subtilis.
18. 18. Cellula batterica ospite ricombinante appartenente al genere Escherichia o Bacillus, comprendente almeno un vettore plasmidico come definito secondo ognuna delle rivendicazioni 9-15.
19. 19. Cellula batterica ospite ricombinante secondo la rivendicazione 18, che à ̈ Escherichia coli o Bacillus subtilis.
20. 20. Uso di cellule batteriche ospite come definite nelle rivendicazioni 18-19, per la produzione di acido ialuronico tramite induzione con IPTG, previa selezione in piastra su gradiente di IPTG.
21. 21. Metodo per l’ottenimento delle cellule batteriche ospite ricombinanti come definite secondo le rivendicazioni 18-19 in grado di produrre alti livelli di acido ialuronico comprendente la selezione in piastra su gradiente di IPTG.