IT201800009444A1 - Coniugati tra acido ialuronico e amminobisfosfonati e loro impiego terapeutico - Google Patents

Coniugati tra acido ialuronico e amminobisfosfonati e loro impiego terapeutico Download PDF

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Stefano Pluda
Mauro Pavan
Carlo Barbera
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Fidia Farm Spa
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Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo: “CONIUGATI TRA ACIDO IALURONICO E AMMINOBISFOSFONATI E LORO IMPIEGO TERAPEUTICO”
Campo dell’invenzione
L’invenzione si riferisce a coniugati tra acido ialuronico (HA) ed amminobisfosfonati (N-BP) da impiegarsi per la terapia intra-articolare e/o locoregionale dell’osteoartrosi e delle sue implicazioni a livello cartilagineo e subcondrale.
Stato dell’Arte
L’osteoartrosi è una patologia complessa e multifattoriale che coinvolge la cartilagine e l’osso subcondrale, in cui a causa di fenomeni di crosstalk, i cambiamenti a carico dell’osso subcondrale si ripercuotono sulla cartilagine. Può coinvolgere tutte le articolazioni del corpo, anche se in generale le aree più colpite sono le mani (dita e base del pollice), il collo, le ginocchia, le anche. Le manifestazioni più comuni includono dolore, rigidità, ridotta capacità motoria, gonfiore ed effusione articolare. Una delle caratteristiche più tipiche dell’osteoartrosi è l’impoverimento del liquido sinoviale in termini sia di concentrazione che di peso molecolare medio di acido ialuronico (HA), che si depolimerizza perdendo le sue proprietà viscoelastiche e quindi alterando la reologia del liquido sinoviale (Balazs EA. et al., J Rheumatol Suppl, 1993, 12:75-82; Belcher C. et al., Annals Rheum Dis, 1997, 56:299-307). Considerato che l’HA contenuto nel liquido sinoviale funziona come un lubrificante viscoso durante i movimenti lenti, mentre durante i movimenti veloci con le sue proprietà elastiche assorbe eventuali traumi o microtraumi che possono investire l’articolazione, è chiaro che la sua depolimerizzazione altera profondamente il funzionamento delle articolazioni (Balazs EA, 1974, in “Disorders of the Knee”, Lippincott Co, Philadelphia, p. 63-75).
In generale, HA è un etero-polisaccaride composto da residui alternati di acido D-glucuronico e N-acetil-D-glucosammina, a catena lineare, con peso molecolare (PM) che può variare tra 400 Da e 13 x 10<6 >Da, a seconda della fonte dalla quale viene ottenuto e dai metodi di preparazione impiegati. E’ presente in natura nei gel pericellulari, nella sostanza fondamentale del tessuto connettivo degli organismi vertebrati, nell’umor vitreo, nel cordone ombelicale e, come detto, nel fluido sinoviale delle articolazioni.
HA gioca un ruolo importante nell’organismo biologico, soprattutto come supporto meccanico delle cellule di molti tessuti come la pelle, i tendini, i muscoli e la cartilagine.
È inoltre in grado di modulare, attraverso il suo recettore di membrana CD44, molti processi cellulari come, ad esempio, la proliferazione, la migrazione, il differenziamento cellulare e l’angiogenesi; svolge, ancora, funzioni come idratante dei tessuti e lubrificante delle articolazioni. Ben noto è anche l’effetto di protezione di HA sulla degenerazione cui va incontro la cartilagine di un’articolazione danneggiata da una patologia o da un trauma; in questa situazione in cavità articolare è presente una forte concentrazione di citochine pro-infiammatorie, in modo particolare Interleukina-1 (IL-1), che promuovono la disgregazione della cartilagine stessa ed inibiscono la proliferazione condrocitaria (van Beuningen H.M. et al., Arthritis Rheum, 1991, 34:606-615). Diverse sperimentazioni scientifiche dimostrano che l’HA è in grado di contrastare l’azione di IL-1, riducendone drasticamente gli effetti negativi e quindi esplicando un effetto riparativo sul tessuto cartilagineo dell’articolazione in cui viene iniettato. (Stove J. et al., J Orthop Res, 2002, 20:551-555).
Infine, è stato dimostrato che l’HA ha un effetto antidolorifico, agendo come agonista parziale dei recettori k per gli oppioidi (Zavan B. et al., PLoS One, 2013; 8, e55510).
L’insieme di queste caratteristiche ne fanno uno dei prodotti più ampiamente utilizzati nella cura delle patologie osteoarticolari e cartilaginee, in forma di infiltrazioni intra-articolari a base di HA in quanto tale o nelle sue forme derivatizzate attraverso metodi chimici (crosslinking) o fisici (irraggiamento, etc.).
Oltre all’HA e a molti altri farmaci noti, per la terapia dell’osteoartrosi nella pratica clinica si somministrano anche i bisfosfonati (BP), una classe di farmaci conosciuta da tempo. Essi sono in grado di inibire il riassorbimento osseo da parte degli osteoclasti, e ciò ne giustifica il largo impiego in tutte le patologie che richiedono un consolidamento osseo. I BP vengono utilizzati inoltre per il trattamento dell'osteoporosi, dell'osteite deformante (malattia ossea di Paget), delle metastasi ossee (in presenza o meno d'ipercalcemia), del mieloma multiplo e di tutte le altre condizioni che possono indurre fragilità ossea; trovano per esempio un ruolo importante nel prevenire l'osteoporosi indotta dall’uso cronico di corticosteroidi. I BP agiscono inoltre come antiinfiammatori, grazie un effetto inibitorio sulle metalloproteasi di matrice, in modo particolare sulle MMP-13 (Heikkila et al, Anticancer Drugs, 2002, 13, 245-254); è noto che le MMP-13 sono coinvolte nei processi infiammatori caratteristici delle malattie osteoarticolari (per esempio, osteoartrosi e artrite reumatoide) che inducono pesanti danni al tessuto cartilagineo ed osseo dell’articolazione, alla sinovia ed ai tendini.
I BP si dividono in due gruppi principali: bisfosfonati non azotati o di prima generazione (etidronato, clodronato, tiludronato) e bisfosfonati azotati, o di seconda generazione. In particolare, questi ultimi comprendono i cosiddetti amminobisfosfonati (pamidronato, alendronato, ibandronato, neridronato) che contengono un atomo di azoto come parte di un gruppo amminico, e che sono quelli impiegati nella presente invenzione. Esiste infine lo zolendronato (di terza generazione) che contiene due atomi di azoto all’interno di un anello imidazolico.
In generale i BP sono somministrati per via iniettiva (endovenosa, intramuscolare) e orale.
La biodisponibilità orale dei BP di seconda generazione è estremamente bassa, su valori intorno o inferiori all’1% e anche minori quando assunti in concomitanza di un pasto. Inoltre circa il 78% si lega efficacemente con le proteine plasmatiche, mentre la quota restante viene per metà escreta per via urinaria nel giro di 24 ore e solamente quella rimanente viene ridistribuita a livello osseo in maniera aspecifica rispetto al sito di interesse. Ciò significa che per ottenere un effetto farmacologico si devono somministrare dosi piuttosto elevate di principio attivo per far sì che ne arrivi una quantità farmacologicamente attiva nel sito d’azione.
Indipendentemente dalla via di somministrazione, gli effetti collaterali sono piuttosto pesanti: cefalea e vertigini, eritemi, nausea e diarrea fino a ulcerazioni dell’esofago, dopo somministrazione orale. Per le somministrazioni parenterali gli effetti collaterali più comuni e significativi sono febbre, mialgie, dolore scheletrico. L’assunzione cronica può addirittura portare ad osteonecrosi della mandibola.
È importante quindi avere a disposizione un prodotto che sfrutti le proprietà farmacologiche dei BP, ma che abbia una ridotta tossicità e che possa essere veicolato direttamente nel sito di interesse in modo da evitare le dispersioni all’interno dell’organismo.
EP 1994945 descrive la formazione di coniugati HA-alendronato (HA-ALD) ottenuti mediante legame ammidico diretto tra l’ammina di ALD ed il carbossile di HA. Il coniugato che si ottiene non è idrolizzabile: è più che noto che il legame ammidico è un legame, forte, stabile e non idrolizzabile, tanto più in condizioni fisiologiche.
Nejadnik et al (Biomaterials, 2014, 35, 6918-29) descrive analoghi derivati provvisti di spaziatore molecolare; si tratta di derivati idrazidici di HA con funzionalità sulfidriliche in grado di legare derivati acrilici dell’ALD mediante irraggiamento UV e l’utilizzo di un fotoiniziatore. Anche in questo caso il legame tra HA e ALD risulta non idrolizzabile in condizioni fisiologiche.
EP 1284754 descrive una miscela fisica tra un BP ed un agente in grado di impedirne la diffusione immediata (tra cui HA), dopo iniezione sottocutanea. Gli autori sostengono che il rilascio graduale permette di utilizzare concentrazioni di BP superiori a quelle utilizzate normalmente quando questi si trovano in semplice soluzione acquosa. Come risulta evidente dalla seguente descrizione della presente invenzione, EP 1284754 non solo descrive un prodotto diverso dai coniugati dell’invenzione, trattandosi di una semplice miscela fisica, ma persegue anche una finalità del tutto differente in quanto uno degli scopi dell’invenzione è utilizzare dosi di BP inferiori a quelle di norma impiegate, arrivando ad ottenere un prodotto in cui HA e BP producono effetti sinergici.
Descrizione dell’invenzione
L’invenzione ha per oggetto un coniugato tra acido ialuronico (HA) ed un ammino-bisfosfonato (N-BP) in cui la coniugazione avviene attraverso l’impiego di uno spaziatore L costituito da una catena alchilica lineare o da una catena poliossietilenica. Nel coniugato dell’invenzione, il carbossile dell’HA è legato mediante legame estereo allo spaziatore L, a sua volta legato all’azoto dell’N-BP mediante legame carbammico.
Il coniugato dell’invenzione ha la formula generale (I)
in cui:
- L è uno spaziatore di formula -(CH2)m-, in cui m è un intero da 2 a 10;
oppure L è uno spaziatore di formula -(CH2CH2O)p-CH2CH2- in cui p è un intero da 1 a 4;
- n è un intero da 2 a 5;
- x è un numero che rappresenta il grado di derivatizzazione (DS) dell’HA con l’N-BP in rapporto ai carbossili di HA ed è compreso tra 0,05 e 0,30 mole N-BP/mole HA;
- il peso molecolare medio ponderale dell’HA è compreso tra i 30000 Da e 3x10<6 >Da.
L’invenzione comprende anche i sali del coniugato di formula (I) in cui i gruppi fosfonici della porzione ammino-bisfosfonica ed i gruppi carbossilici dell’HA non coinvolti nella coniugazione con l’N-BP sono parzialmente o completamente salificati con il catione di un metallo alcalino o a alcalino-terroso, con il catione ammonio o con un catione (C1-C4)tetraalchilammonio, preferibilmente con un catione di un metallo alcalino, più preferibilmente col catione Na<+>.
In seguito a idrolisi per via enzimatica o a pH acidi o basici o in condizioni fisiologiche, il legame estereo e quello carbammico del coniugato di formula (I) subiscono scissione, e vengono rilasciati in situ non solo il principio attivo (N-BP) ma anche HA che può così espletare le sue ben note caratteristiche reologiche, di biocompatibilità e di riconoscimento cellulare. A seguito dell’idrolisi lo spaziatore L dà origine a un α,ω-diolo alchilico o a un polietilenglicole a basso peso molecolare, che alle concentrazioni impiegate e somministrate per via intraarticolare e/o locoregionale sono praticamente prive di tossicità.
L’invenzione ha anche per oggetto le composizioni farmaceutiche contenenti un coniugato di formula (I) ed almeno un eccipiente e/o un veicolo adatto all’impiego farmaceutico, nonché gli usi in terapia dei coniugati di formula (I) e delle loro formulazioni, in particolare per la viscosupplementazione.
Ulteriore oggetto dell’invenzione è un viscosupplementante comprendente un coniugato di formula (I) ed almeno un eccipiente e/o un veicolo adatto all’impiego farmaceutico.
I coniugati dell’invenzione, le loro composizioni farmaceutiche ed i viscosupplementanti che li comprendono sono da utilizzarsi nel trattamento intraarticolare e/o locoregionale dell’osteoartrosi e delle sue implicazioni a livello cartilagineo e subcondrale; nella terapia dell’osteoporosi post-menopausale o da farmaci; nella terapia della fragilità ossea dovuta a traumi o malattie; nella terapia intraossea e/o locoregionale delle patologie caratterizzate da un alterato turnover metabolico osseo. Sono inoltre utili nel favorire l’osteointegrazione di protesi, quando cioè sia necessario creare un’intima connessione tra una protesi (generalmente di titanio, ma non solo), ed il tessuto osseo in cui essa viene inserita.
Descrizione delle figure
Figura 1. Quantificazione del rilascio in vitro di alendronato (ALD) dal coniugato HA-ALD.
Figura 2. Confronto dei valori dei moduli viscoelastici del coniugato HA-ALD dell’Esempio 3, di HA e di una miscela fisica di HA e ALD.
Figura 3. Confronto tra la viscosità dinamica η del coniugato HA-ALD dell’Esempio 3, una miscela fisica di HA e ALD, HA, Hymovis® e Synvisc®.
Figura 4. Citotossicità di concentrazioni di 25 µM, 50 µM e 100 µM di ALD e del coniugato HA-ALD dell’Esempio 3 su osteoblasti Saos-2 dopo 3 (Figura 4A) e 7 giorni (Figura 4B) di incubazione.
Figura 5. Citotossicità di concentrazioni di 25 µM, 50 µM e 100 µM di ALD e del coniugato HA-ALD dell’Esempio 3 su condrociti primari bovini dopo 3 (Figura 5A) e 7 giorni (Figura 5B) di incubazione.
Figura 6. Quantificazione del collagene solubile rilasciato a seguito di stimolo infiammatorio da un campione di cartilagine raccolta dal femore di un bovino adulto e trattato col coniugato HA-ALD dell’Esempio 3.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Il numero x rappresenta il grado di derivatizzazione (DS) dell’HA con l’N-BP, ovvero la frazione dei gruppi carbossilici dell’unità ripetitiva dell’HA che sono coinvolti nella formazione del coniugato con l’N-BP. Nei coniugati dell’invenzione x è un numero compreso tra 0,05 e 0,30, ovvero i gruppi carbossilici dell’HA coinvolti nella coniugazione sono compresi tra il 5% e il 30% su base molare del totale dei gruppi carbossilici disponibili per la coniugazione.
Preferibilmente, il grado di derivatizzazione x dell’HA con l’N-BP in rapporto ai carbossili dell’HA è compreso tra 0,10-0,30 mole/mole (DS compreso tra 10% e 30% mol/mol), più preferibilmente tra 0,10 e 0,20 mole/mole (DS compreso tra 10% e 20% mol/mol).
L’HA impiegato secondo l’invenzione può derivare da qualsiasi fonte, ad esempio, da creste di gallo (EP138572), da fermentazione (da Streptocuccus Equi o Zooepidemicus, EP0716688), o da biosintesi (da Bacillus, EP2614088, EP2614087), ed essere purificato secondo differenti tecniche (WO2018020458, IT102017000081449).
Il peso molecolare medio ponderale dell’HA è compreso tra 30000 Da e 3x10<6 >Da, in particolare tra 1x10<5 >Da e 1x10<6 >Da, più preferibilmente tra 150000 Da e 800000 Da, ed ancor più preferibilmente tra 170000 Da e 230000 Da o tra 500000 Da e 730000 Da. Per peso molecolare medio ponderale si intende quello calcolato col metodo della “intrinsic viscosity” (Terbojevich et al., Carbohydr Res, 1986, 363-377).
Preferibilmente l’N-BP è scelto tra pamidronato, neridronato, alendronato. L’alendronato (ALD) è particolarmente preferito.
Quando lo spaziatore L è una catena alifatica lineare di formula -(CH2)m-, il numero di atomi di carbonio m varia preferibilmente tra 2 e 5 ed ancor più preferibilmente è 2.
Quando lo spaziatore L è uno spaziatore di formula -(CH2CH2O)p-CH2CH2-, preferibilmente p è 1.
Particolarmente preferito è il coniugato di formula (I) in cui L è una catena alifatica lineare di formula -(CH2)m- in cui m è 2.
I coniugati di formula I possono essere preparati per reazione di un derivato di N-BP, preferibilmente di un sale di tetrabutilammonio (TBA), con un composto di formula X-L-OA dove L è come sopra definito, X è un gruppo uscente, tipicamente un atomo di alogeno e A è un gruppo attivante del gruppo idrossi. Il derivato ottenuto viene quindi fatto reagire, anche senza essere isolato con un derivato di acido ialuronico, tipicamente un sale di tetrabutilammonio in un solvente quale dimetilsolfossido o dimetilformammide. Nel caso dei coniugati in cui L è uno spaziatore di formula -(CH2)m-, in cui m è 2 il composto preferito di formula X-L-OA è 2-cloroetil-1H-imidazolo-1-carbossilato. Tipicamente i coniugati sono isolati sotto forma di sali disodici alla porzione dell’N-BP e sali monosodici al carbossile dell’HA mediante aggiunta di una soluzione satura di cloruro di sodio seguita da dialisi a pH 6 e liofilizzazione finale.
La coniugazione di HA secondo quanto descritto rappresenta un sistema di rilascio macromolecolare (macromolecular drug delivery system) di N-BP: dopo somministrazione, col progredire dell’idrolisi dal coniugato si liberano il principio attivo, cioè l’N-BP che agisce sul riassorbimento osseo, ed anche l’HA, che ritorna nella sua forma nativa, e che esplica le ben note azioni di lubrificazione, viscosupplementazione, effetto antidolorifico per azione sui nocicettori, etc.
Il coniugato in soluzione risulta sterilizzabile per filtrazione o per trattamento termico in autoclave, può essere formulato in soluzioni acquose (per esempio, acqua, soluzione fisiologica, PBS), ad un pH compreso tra 6 e 7 (quindi fisiologico) ed è estrudibile con aghi anche di piccolo calibro.
Il coniugato dell’invenzione ha inoltre caratteristiche reologiche del tutto peculiari ed inattese; al momento della sua preparazione ed impiego è in forma di soluzione viscosa, ma in presenza di ioni bivalenti, in particolare ioni calcio, ed in funzione della concentrazione e del grado di derivatizzazione, la sua viscosità cambia radicalmente e si crea un gel compatto, con caratteristiche viscoelastiche paragonabili, o addirittura superiori, a quelle dei più usati viscoelastici reticolati chimicamente. Questa peculiarità è estremamente importante in quanto gli ioni calcio sono normalmente presenti all’interno del liquido sinoviale (Madea et al., Forensic Sci Int, 2001, 118, 29-35), anche quando “impoverito” da una malattia osteoartrosica. Ciò significa che il coniugato dell’invenzione può essere somministrato intra-articolarmente in forma di soluzione viscosa, con gli innegabili vantaggi che ciò comporta, quale ad esempio la facilità di estrusione, per poi convertirsi in gel compatto, senza l’aggiunta di altre sostanze (ad esempio, agenti reticolanti) o senza trattamenti fisici (irraggiamento UV, etc.).
Il coniugato dell’invenzione trova impiego:
− Nella terapia intra-articolare e/o locoregionale dell’osteoartrosi, dell’osteoporosi post-menopausale o da farmaci, ad esempio steroidi, della fragilità ossea dovuta a traumi o malattie quali, ad esempio, mieloma multiplo e metastasi ossee;
− Nella terapia intraossea e/o locoregionale di tutte le patologie caratterizzate da un alterato turnover metabolico osseo, quali morbo di Paget;
− Nel miglioramento dell’osteointegrazione di protesi.
Per gli impieghi in terapia il coniugato dell’invenzione viene impiegato sotto forma di una composizione farmaceutica contenente una quantità terapeuticamente efficace dello stesso ed almeno un eccipiente e/o veicolo adatto all’impiego farmaceutico. Tali formulazioni possono essere preparate con metodi convenzionali, ad esempio quelli descritti in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. Mack Publishing Co. I dosaggi dei coniugati dell’invenzione dipenderanno ovviamente dalla via di somministrazione e da altri parametri quali peso ed età del paziente, gravità della patologia e potrà essere determinato dal clinico anche sulla base di quanto noto sui dosaggi clinico efficaci dei bisfosfonati.
Il coniugato dell’invenzione, oltre alle proprietà Drug Delivery System (DDS) per il rilascio di N-BP e di HA, consente una maggiore efficacia e minore tossicità di analoghe dosi di N-BP somministrate direttamente.
Le caratteristiche reologiche che il coniugato dell’invenzione acquisisce in presenza di ioni bivalenti ne fanno inoltre un ottimo candidato per applicazioni di 3D printing e/o bioprinting, per esempio per la creazione di parti di strutture ossee mancanti in seguito a traumi, interventi ortopedici, etc.
Il coniugato dell’invenzione risolve in maniera innovativa il problema tecnico di rendere disponibile un prodotto che sfrutti le proprietà farmacologiche dei BP, ma che abbia una ridotta tossicità e che possa essere veicolato direttamente nel sito di interesse in modo da evitare le dispersioni all’interno dell’organismo, in quanto:
1. È un sistema di drug delivery a rilascio controllato dell’N-BP mediante somministrazione localizzata che riduce la necessità di alte dosi di N-BP e contemporaneamente veicola il principio attivo esattamente dove il suo effetto è desiderato;
2. Associa i vantaggi dell’effetto condroprotettivo e osteogenico dell’N-BP con quelli di una terapia infiltrativa a base di HA (viscosupplementazione, lubrificazione, attività antidolorifica, etc.); 3. Aumenta significativamente l’efficacia farmacologica del principio attivo che, a parità di dosi, risulta molto meno tossico, evitando quindi i possibili effetti collaterali derivanti sia da una distribuzione sistemica che da dosaggi elevati;
4. Possiede caratteristiche reologiche inaspettate quando impiegato in presenza di cationi bivalenti.
Il coniugato dell’invenzione esplica sinergicamente le proprietà sia dell’N-BP sia dell’HA.
L’invenzione è ulteriormente illustrata dai seguenti esempi.
Il grado di derivatizzazione è calcolato col metodo ICP-OES (spettroscopia di emissione al plasma) mediante lettura del fosforo a 213,5 nm, previa digestione del campione in acido nitrico.
Esempio 1. Sintesi del sale di tetrabutilammonio di alendronato (ALD-TBA)
La sintesi viene fatto secondo quanto descritto in letteratura (Arns, S. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20: 2131–2140).
Una sospensione di acido alendronico (1,50 g, 6,02 mmol, 1,0 eq.) in acqua milliQ (40 mL) è stata trattata con tetrabutilammonio idrossido (TBA-OH-30 idrato 4,82 g, 6,03 mmol, 1,0 eq.).
La miscela di reazione è stata agitata a temperatura ambiente per 2 ore per permettere la solubilizzazione completa fino a dare una soluzione limpida incolore. L’acqua è stata rimossa mediate liofilizzazione, ottenendo alendronato sale di tetrabutilammonio (ALD-TBA) come solido bianco igroscopico (3,1 g, 100%).
Esempio 2. Sintesi 2-cloroetil-1H-imidazolo-1-carbossilato
A una soluzione di carbonildiimidazolo (CDI) (14,51 g; 0,09 mol; 2,00 eq.) in tetraidrofurano (THF) (40 mL) in un pallone a 0°C è stato aggiunto 2-cloroetanolo (3,00 mL; 0,04 mol; 1,00 eq.) in agitazione costante. La miscela di reazione è stata portata a temperatura ambiente e la reazione lasciata procedere per 3 ore.
Il solvente (THF) è stato rimosso sotto vuoto e il prodotto solido disciolto in diclorometano e lavato con HCl 1M in imbuto separatore. La fase organica è stata disidrata con magnesio solfato e il solvente rimosso in Rotavapor, ottenendo il prodotto come liquido incolore (7,8 g, resa 100%).
Esempio 3. Sintesi del coniugato HA-Alendronato (PM di HA: 200 kDa, DS 20% mol/mol)
Una soluzione di alendronato sale di tetrabutilammonio preparato come da Esempio 1 (ALD-TBA 394 mg, 0,8 mmol, 1 Eq.) in DMSO (30 mL) è stata trattata con 2-cloroetil-1H-imidazolo-1-carbossilato (280 mg, 1,6 mmol, 2 Eq.; preparato come da Esempio 2) e lasciata reagire a 40°C per 18 ore.
La miscela di reazione è stata aggiunta ad una soluzione di HA sale di tetrabutilammonio (HA-TBA, 500 mg, 0,8 mmol, 1 Eq.) in DMSO (50 mL) e lasciata reagire a 40°C per 48 ore sotto agitazione.
Il prodotto è stato purificato mediante precipitazione con aggiunta di soluzione satura di cloruro di sodio (2 mL) e etanolo (500 mL) ed infine dializzato in acqua distillata (Spectra/Por® MWCO 20 KDa per 3 giorni) a pH 6 e liofilizzato. Il prodotto, ottenuto come sale sodico, appare come un solido bianco spugnoso (380 mg, resa 95%).
Esempio 4. Sintesi del coniugato HA-Alendronato (PM di HA: 200 kDa, DS 10% mol/mol)
Il derivato è stato sintetizzato, caratterizzato e purificato come descritto nell’Esempio 3, partendo da 1,2 g di HA sale TBA (2 mmol, 1 Eq.) solubilizzato in DMSO (80 mL) e fatto reagire con la miscela di reazione di ALD-TBA (1000 mg, 2 mmol, 1 Eq.) e 2-cloroetil-1H-imidazolo-1-carbossilato (470 mg, 2,45 mmol, 1,22 Eq.).
Sono stati ottenuti 774 mg di prodotto spugnoso bianco sotto forma di sale sodico. (Resa 82%).
Esempio 5. Sintesi del coniugato HA-Alendronato (PM di HA: 500 kDa, DS 20% mol/mol)
Il derivato è stato sintetizzato, caratterizzato e purificato come descritto nell’Esempio 3, partendo da 1,2 g di HA sale TBA (2 mmol, 1 Eq.) solubilizzato in DMSO (80 mL) e fatto reagire con la miscela di reazione di ALD-TBA (1000 mg, 2 mmol, 1 Eq.) e 2-cloroetil-1H-imidazolo-1-carbossilato (470 mg, 2,45 mmol, 1,22 Eq.)
Sono stati ottenuti 620 mg di prodotto spugnoso bianco sotto forma di sale sodico. (Resa 68%).
Esempio 6. Sintesi del coniugato HA-Alendronato (PM di HA: 200 kDa, DS 5% mol/mol)
Il derivato è stato sintetizzato, caratterizzato e purificato come descritto nell’Esempio 3, partendo da 1 g di HA sale TBA (1,6 mmol, 1 Eq.) solubilizzato in DMSO (80 mL) e fatto reagire con la miscela di reazione di ALD-TBA (790 mg, 1,6 mmol, 1 Eq.) e 2-cloroetil-1H-imidazolo-1-carbossilato (140 mg, 0,8 mmol, 0,5 Eq.)
Sono stati ottenuti 603 mg di prodotto spugnoso bianco sotto forma di sale sodico. (Resa 90%).
Esempio 7. Sintesi del coniugato HA-Alendronato (PM di HA: 200 kDa, DS 30% mol/mol)
Il derivato è stato sintetizzato, caratterizzato e purificato come descritto nell’Esempio 3, partendo da 1 g di HA sale TBA (1,6 mmol, 1 Eq.) solubilizzato in DMSO (80 mL) e fatto reagire con la miscela di reazione di ALD-TBA (1,6 g, 3,2 mmol, 2 Eq.) e 2-cloroetil-1H-imidazolo-1-carbossilato (560 mg, 3,2 mmol, 0,5 Eq.)
Sono stati ottenuti 675 mg di prodotto spugnoso bianco sotto forma di sale sodico. (Resa 85%).
Esempio 8. Rilascio di ALD dal coniugato HA-Alendronato. Test in vitro Al fine di dimostrare che il coniugato dell’invenzione funziona come un DDS macromolecolare si sono comparati i rilasci di ALD da:
- miscela fisica costituita da HA PM 200 kDa e ALD (HA+ALD);
- coniugato HA-Alendronato preparato come da Esempio 3 (HA-ALD); - coniugato HA-Alendronato ottenuto mediante legame ammidico, preparato come descritto in EP 1994945 (HA-ALD ammide).
Tutti i campioni contengono la stessa dose di ALD, sono in tampone TRIS 0,1 M pH 7,4 e sono stati testati su membrana da dialisi (MWCO 10 kDa), a 37°C. Il rilascio di ALD è stato quantificato mediante analisi ICP-OES del fosforo in soluzione, come precedentemente descritto.
I risultati sono presentati nella Figura 1.
Appare evidente che il rilascio di ALD dal derivato ammidico è irrilevante, come atteso, mentre la miscela HA+ ALD libera molto velocemente il principio attivo; al settimo giorno infatti, quasi 80% dell’ALD è già stato liberato, mentre il coniugato HA-Alendronato dell’invenzione ha di poco superato il 50%. La sua cinetica è quindi nettamente più lenta, a conferma del fatto che il principio attivo viene liberato progressivamente in seguito ad idrolisi.
Esempio 9. Proprietà reologiche
L’analisi dei moduli viscoelastici è stata condotta sui seguenti campioni, sciolti alla concentrazione indicata in di TRIS 0,1 M, pH=7:
- coniugato HA-Alendronato preparato come da Esempio 5, 20 mg/mL (contenente 2,4 mg/mL di Alendronato);
- HA PM 500 kDa 20 mg/mL;
- miscela di HA PM 500 kDa 20 mg/mL con Alendronato (2,4 mg/mL), ottenuta solubilizzando direttamente HA in una soluzione TRIS 0,1 M, pH=7 contenente la quantità di Alendronato.
I campioni sono stati analizzati dopo l'aggiunta di 20 µL/mL di una soluzione CaCl2 100 mg/mL in H2O (concentrazione finale CaCl2: 2 mg/mL), così da avvicinarsi al massimo alla situazione presente in articolazione dove, come detto, pur in fase osteoartrosica il liquido sinoviale contiene ioni calcio.
Metodo di analisi: Reometro Anton Paar MCR92; Cono 50 mm 1°; gap 0,102 mm; temperatura 20°C. Frequency sweep da 0,1 a 100 rad/s, strain 10%, acquisiti 15 punti su scala logaritmica.
I risultati sono descritti nella Figura 2 che confronta i valori dei moduli viscoelastici; G’ esprime la componente elastica del fluido, mentre G’’ esprime la componente viscosa.
E’ evidente che i moduli della miscela e del solo HA sono del tutto sovrapponibili: l’alendronato in quanto tale non ha evidentemente alcun effetto sul comportamento reologico.
Completamente differente è il comportamento del coniugato HA-Alendronato: i moduli elastico e viscoso sono nettamente superiori a quelli delle specie di confronto e i valori di G’ e G’’ configurano un gel compatto.
Ad ulteriore conferma di questi dati, gli stessi campioni sono stati paragonati con due prodotti viscosupplementanti (Hymovis® e Synvisc®) tra i più impiegati nella terapia intra-articolare dell’osteoartrosi, valutandone la viscosità dinamica (η). La viscosità dinamica, parametro molto significativo per valutare le proprietà viscoelastiche di un fluido, misura la resistenza del fluido allo scorrimento dopo applicazione di una forza tangenziale.
Hymovis® è l’ammide esadecilica dell’HA, che forma un gel compatto grazie alla creazione di un reticolo mobile. Synvisc® è una miscela di due diverse forme di HA crosslinkato, Hylan-A e Hylan-B, in rapporto 80:20. Il crosslinking conferisce ad HA un PM molto elevato, nell’ordine di milioni di Da. Anche in questo caso il prodotto è un gel compatto. I risultati sono riportati in Figura 3.
È evidente che il coniugato dell’invenzione ha un’elevata viscosità dinamica, addirittura più elevata di quella dei due prodotti del commercio, riconosciuti nella pratica clinica come prodotti di elezione; decisamente inferiore è invece la performance sia del solo HA che della miscela HA Alendronato.
Il coniugato dell’invenzione, in termini di viscosupplementazione, risulta pertanto superiore a quanto ad oggi noto ed impiegato. Questo risultato è sorprendente in relazione ai valori di viscosità dinamica della miscela HA+Alendronato e del solo HA PM 500kDa, anche alla luce del fatto che l’Alendronato come tale non ha alcuna influenza sulla viscosità.
Ciò diventa ancor più significativo considerando che il coniugato viene formulato in soluzione viscosa. HA-ALD rilascia Alendronato in modo graduale e progressivo, comportandosi quindi come un sistema di rilascio macromolecolare, che porta selettivamente il principio attivo nel sito in cui deve agire. HA-ALD può essere inoltre iniettato intra-articolarmente in forma di soluzione viscosa. La somministrazione è facile, prevede aghi di piccolo calibro e provoca meno dolore o disagio nel paziente. Infine, in cavità articolare HA-ALD si trasforma in un gel con proprietà reologiche eccellenti, migliori di quelle di analoghi prodotti già usati nel settore della viscosupplementazione.
Esempio 10. Citotossicità del coniugato HA-Alendronato su osteoblasti. Test in vitro
La citotossicità del coniugato, legata alla sua capacità di rilasciare Alendronato in maniera controllata, è stata valutata tramite test in vitro su una linea cellulare di osteoblasti (Saos-2, ATCC HTB-85). Le cellule Saos-2 sono state coltivate in medium McCoy’s 5A (Life Technologies, cat. n. 36600-021, Italia) contenente siero fetale bovino 10% (Life Technologies, cat. n. 10270106, Italia) in condizioni standard (37°C, 5% CO2) fino allo stato di semi-confluenza. Le cellule sono quindi state seminate alla concentrazione 1 x 10<4 >cellule/pozzetto in piastre Multiwell da 96 pozzetti (Sarstedt, cat. n.83.3924, Germania) e divise in tre gruppi:
1) un gruppo di controllo, nel quale le cellule non sono state trattate o stimolate;
2) un gruppo trattato con Alendronato libero, nel quale le cellule sono state incubate con concentrazioni decrescenti di Alendronato libero per 3 e 7 giorni;
3) un gruppo trattato con il coniugato HA-Alendronato preparato come da Esempio 3, nel quale le cellule sono state trattate come quelle del gruppo 2).
Ciascun campione è stato testato in quattro replicati.
Al termine dei tempi di incubazione prestabiliti, la vitalità cellulare è stata quantificata mediante il saggio Alamar blue<® >(Life Technologies, cat. n. DAL1025, Italia), secondo le indicazioni fornite dal produttore, al fine di determinare la vitalità cellulare in funzione della quantità di Alendronato rilasciata nel tempo. I dati sono presentati nelle Figure 4A e 4B.
Dopo 3 giorni di incubazione (Figura 4A), si osserva un effetto citotossico dell’Alendronato libero alle concentrazioni 100 µM e 50 µM (vitalità cellulare < 70% rispetto al controllo). La citotossicità dell’Alendronato libero aumenta in modo rilevante all’aumentare del periodo di incubazione.
Alle stesse condizioni e a parità di concentrazione in Alendronato, il coniugato HA-Alendronato ha fatto registrare un effetto citotossico solamente alla concentrazione 100 µM dopo 7 giorni di incubazione (Figura 4B), a dimostrazione che il rilascio del principio attivo contenuto nel coniugato avviene in maniera graduale. È evidente che, a parità di dose e di tempo di esposizione, il coniugato dell’invenzione è molto meno tossico dell’Alendronato.
Esempio 11. Citotossicità del coniugato HA-Alendronato su condrociti. Test in vitro
La capacità del coniugato di rilasciare Alendronato in maniera controllata e di avere un’attività anche sul tessuto cartilagineo è stata valutata tramite test in vitro su condrociti primari bovini. I condrociti primari bovini sono stati isolati dalla cartilagine dei condili femorali di un bovino adulto, secondo il protocollo descritto in letteratura (Mouw JK et al., Osteoarthritis and Cartilage 2005, 13: 828-836). I condrociti isolati sono stati coltivati in medium DMEM/F-12 (1:1) (Life Technologies, cat. n 11320074, Italia) contenente siero fetale bovino 10% (Life Technologies, cat. n. 10270106, Italy) in condizioni standard (37°C, 5% CO2) fino a semi-confluenza. Le cellule sono quindi state seminate alla concentrazione di 1 x 10<4 >cellule/pozzetto in piastre Multiwell da 96 pozzetti (Sarstedt, cat. n. 83.3924, Germania) e divise in tre gruppi:
1) un gruppo di controllo, nel quale le cellule non sono state trattate o stimolate;
2) un gruppo trattato con Alendronato, nel quale le cellule sono state incubate con concentrazioni decrescenti di Alendronato per 3 e 7 giorni;
3) un gruppo trattato con il coniugato HA-Alendronato preparato come da Esempio 3, nel quale le cellule sono state trattate come quelle del gruppo 2).
Ciascun campione è stato testato in quattro replicati. Al termine dei tempi di incubazione prestabiliti, la vitalità cellulare è stata quantificata mediante il saggio Alamar blue® (Life Technologies, DAL1025, Italia), secondo le indicazioni fornite dal produttore, al fine di determinare la vitalità cellulare in funzione della quantità di Alendronato rilasciata nel tempo. I dati sono presentati nelle Figure 5A e 5B.
Alle stesse condizioni e a parità di concentrazione in Alendronato, il coniugato HA-Alendronato ha fatto registrare un lieve effetto citotossico solo alla concentrazione 100 µM dopo 7 giorni di incubazione, a dimostrazione che il rilascio del principio attivo dal coniugato avviene in maniera graduale. Al contrario, l’Alendronato libero agisce sui condrociti primari bovini già dopo 72 h di incubazione e ha un effetto citotossico massimo alle concentrazioni 100 µM e 50 µM dopo 7 giorni. Dall’analisi dei dati appare evidente che il coniugato ha una tossicità notevolmente inferiore rispetto all’Alendronato libero, soprattutto sugli osteoblasti. Questo aspetto è particolarmente importante dato che gli osteoblasti sono responsabili della produzione della matrice ossea organica e la loro integrità è fondamentale ai fini della riparazione ossea.
Esempio 12. Rilascio di collagene da cartilagine
L’efficacia del coniugato è stata valutata misurando la quantità di collagene rilasciato da un campione sottoposto a stimolo infiammatorio. È noto infatti che l’Alendronato agisce come un vero e proprio antiinfiammatorio. Il modello scelto è un modello ex vivo di infiammazione cartilaginea dopo stimolo con agenti infiammatori, come descritto in Arns, S. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20: 2131–2140. Nel dettaglio, la cartilagine è stata raccolta dal solco patellofemorale e dai condili femorali provenienti dal femore di un bovino adulto e sono state effettuate delle biopsie di cartilagine (Ø = 3 mm) utilizzando un apposito punch in acciaio. Le biopsie sono state coltivate in una Multiwell 48-wells (BD Falcon, cat. n. 353078, Italia) a 37°C 5% CO2 per 24 ore in DMEM/F-12 (1:1) (Life Technologies, cat. n 11320074, Italia) contenente siero fetale bovino 2% (Life Technologies, cat. n. 10270106, Italia). Trascorsa l'incubazione, le biopsie sono state lavate con PBS 1X e sono state divise nei seguenti gruppi:
1) gruppo di controllo, nel quale le biopsie non sono state né trattate né stimolate;
2) gruppo stimolato con le citochine pro-infiammatorie OSM e IL-1β (10 ng/mL ciascuna);
3) gruppo stimolato a OSM e IL-1β e trattato col coniugato HA-Alendronato preparato come da Esempio 3, 1 mM;
4) gruppo stimolato a OSM e IL-1β e trattato col coniugato HA-Alendronato preparato come da Esempio 3, 0,1 mM;
5) gruppo stimolato a OSM e IL-1β e trattato col coniugato HA-Alendronato preparato come da Esempio 3, 0,01 mM.
Ai tempi 0, 7, 14 e 21 giorni, il medium di coltura delle biopsie è stato aspirato e sostituito con medium di coltura fresco contenente le citochine infiammatorie e il coniugato HA-Alendronato. Dopo 21 giorni di incubazione, il medium delle biopsie è stato raccolto e il collagene solubile rilasciato misurato tramite il saggio colorimetrico Sircol collagen assay kit (Biocolor, cat. n. S1000, UK), seguendo le indicazioni fornite dal produttore. I risultati sono riportati nella Figura 6. Le biopsie del gruppo stimolato con OSM e IL-1β rilasciano una quantità significativamente più elevata di collagene solubile nel medium di coltura rispetto al controllo. Il coniugato è in grado di diminuire significativamente la perdita di collagene indotta da stimolo infiammatorio, di fatto dimezzando la quantità di collagene solubile misurata nel medium delle biopsie trattate con una soluzione contenente il derivato ad una concentrazione in acido Alendronico pari a 1 mM. Tale effetto si osserva, in misura leggermente inferiore, anche alle concentrazioni 0,1 mM e 0,05 mM, confermando la capacità del composto di inibire il rilascio di collagene.
La provata efficacia del coniugato dell’invenzione nel contrastare il rilascio di collagene indotto da uno stimolo infiammatorio conferma che esso mantiene le proprietà farmacologiche dell’Alendronato, che continua, anche in forma coniugata, ad agire come un vero e proprio antiinfiammatorio.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un coniugato di formula (I) tra acido ialuronico e un ammino-bisfosfonato
    in cui: - L è uno spaziatore di formula -(CH2)m-, in cui m è un intero da 2 a 10; oppure L è uno spaziatore di formula -(CH2CH2O)p-CH2CH2- in cui p è un intero da 1 a 4; - n è un intero da 2 a 5; - x è un numero che rappresenta il grado di derivatizzazione (DS) dell’acido ialuronico con l’ammino-bisfosfonato in rapporto ai carbossili dell’acido ialuronico ed è compreso tra 0,05 e 0,30 mole amminobisfosfonato/mole acido ialuronico: - il peso molecolare medio ponderale dell’acido ialuronico è compreso tra i 30000 Da e 3x10<6 >Da; - i gruppi fosfonici della porzione ammino-bisfosfonica ed i gruppi carbossilici dell’acido ialuronico non coinvolti nella coniugazione con l’ammino-bisfosfonato sono opzionalmente parzialmente o completamente salificati con il catione di un metallo alcalino o alcalino-terroso, con il catione ammonio o con un catione (C1-C4)tetraalchilammonio, preferibilmente con un catione di un metallo alcalino, più preferibilmente col catione Na<+>.
  2. 2. Coniugato secondo la rivendicazione 1, in cui m è un intero da 2 a 5.
  3. 3. Coniugato secondo la rivendicazione 1, in cui p è 1.
  4. 4. Coniugato secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui n è 2, 3 o 5.
  5. 5. Coniugato secondo le rivendicazioni 1, 2 e 4, in cui m e n sono entrambi 2.
  6. 6. Coniugato secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui il peso molecolare medio ponderale dell’acido ialuronico è compreso tra 1x10<5 >Da e 1x10<6 >Da, più preferibilmente tra 150000 Da e 800000 Da, ed ancor più preferibilmente tra 170000 Da e 230000 Da o tra 500000 Da e 730000 Da.
  7. 7. Coniugato secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui x è compreso tra 0,10-0,30 mole/mole, più preferibilmente tra 0,10 e 0,20 mole/mole.
  8. 8. Un coniugato di formula (I) come definito nella rivendicazione 1 per uso come medicamento.
  9. 9. Composizione farmaceutica contenente un coniugato di formula (I) come definito nella rivendicazione 1 ed almeno un eccipiente e/o veicolo adatto all’uso farmaceutico.
  10. 10. Un coniugato secondo la rivendicazione 1 o una composizione secondo la rivendicazione 9 per uso nel trattamento intra-articolare e/o locoregionale dell’osteoartrosi e delle sue implicazioni a livello cartilagineo e subcondrale; nel trattamento dell’osteoporosi post-menopausale o da farmaci, in particolare steroidi; nel trattamento della fragilità ossea dovuta a traumi o malattie, in particolare mieloma multiplo e metastasi ossee; e nel trattamento intraosseo e/o locoregionale delle patologie caratterizzate da un alterato turnover metabolico osseo, in particolare il morbo di Paget.
  11. 11. Un coniugato secondo la rivendicazione 1 o una composizione secondo la rivendicazione 9 per uso nel miglioramento dell’osteointegrazione di protesi.
  12. 12. Un viscosupplementante comprendente un coniugato di formula (I) come definito nella rivendicazione 1 ed almeno un eccipiente e/o un veicolo adatto all’impiego farmaceutico.
  13. 13. Un viscosupplementante secondo la rivendicazione 12 per uso nel trattamento intra-articolare e/o locoregionale dell’osteoartrosi e delle sue implicazioni a livello cartilagineo e subcondrale; nel trattamento dell’osteoporosi post-menopausale o da farmaci, in particolare steroidi; nel trattamento della fragilità ossea dovuta a traumi o malattie, in particolare mieloma multiplo e metastasi ossee; e nel trattamento intraosseo e/o locoregionale delle patologie caratterizzate da un alterato turnover metabolico osseo, in particolare il morbo di Paget.
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