ES2935415T3 - Conjugados de ácido hialurónico y aminobisfosfonatos y uso terapéutico de los mismos - Google Patents

Conjugados de ácido hialurónico y aminobisfosfonatos y uso terapéutico de los mismos Download PDF

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Abstract

La presente invención describe conjugados de ácido hialurónico (HA) y un amino-bisfosfonato (N-BP) de fórmula general (I): Fórmula (I) donde L, m, n y x son como se definen en la reivindicación 1, y las sales del mismo. Dichos conjugados y sus composiciones farmacéuticas son útiles en el tratamiento intraarticular y/o locorregional de la osteoartrosis y sus repercusiones a nivel cartilaginoso y subcondral; en el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica o inducida por fármacos; en el tratamiento de la fragilidad ósea debida a traumatismos o enfermedades; y en el tratamiento intraóseo y/o locorregional de trastornos caracterizados por alteración del recambio óseo metabólico, en particular la enfermedad de Paget. También son útiles para mejorar la osteointegración de prótesis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de ácido hialurónico y aminobisfosfonatos y uso terapéutico de los mismos
Campo de la invención
La invención se refiere a conjugados de ácido hialurónico (AH) y aminobisfosfonatos (N-BP) para uso en el tratamiento intraarticular y/o locorregional de osteoartrosis, y sus repercusiones en cartílago y a nivel subcondral. Estado de la técnica
La osteoartrosis es un trastorno complejo y multifactorial que implica al cartílago y al hueso subcondral, en donde cambios en el hueso subcondral tienen repercusiones en el cartílago debido a "interferencias". Puede implicar a todas las articulaciones del organismo pero, en general, las áreas más afectadas son las manos (dedos y base del pulgar), cuello, rodillas y caderas. Los síntomas más comunes incluyen dolor, rigidez, capacidad motora reducida, hinchazón y derrames articulares. Una de las características más habituales de la osteoartrosis es el empobrecimiento del líquido sinovial, tanto en concentración como en peso molecular promedio del ácido hialurónico (AH), que se despolimeriza, perdiendo sus propiedades viscoelásticas y, por consiguiente, alterando la reología del líquido sinovial (Balazs EA. et al., J Rheumatol Suppl, 1993, 12:75-82; Belcher C. et al., Annals Rheum Dis, 1997, 56:299-307). El AH contenido en el líquido sinovial actúa como lubricante viscoso durante los movimientos lentos, mientras que sus propiedades elásticas permiten que absorba traumatismos o microtraumatismos que afectan a la articulación durante los movimientos rápidos. Por tanto, su despolimerización altera significativamente el funcionamiento de las articulaciones (Balazs EA, 1974, en "Disorders of the Knee", Lippincott Co, Filadelfia, págs.
63-75).
En general, el AH es un heteropolisacárido de cadena lineal que consiste en restos alternos de ácido D-glucurónico y W-acetil-D-glucosamina, con un peso molecular (MW) que varía de 400 a 13 x 106 Da, dependiendo de la fuente a partir de la que se obtiene y de los métodos de preparación usados. En la naturaleza está presente en geles pericelulares, en la sustancia fundamental del tejido conjuntivo de vertebrados, en el humor vítreo y en el cordón umbilical y, como se ha expuesto, en el líquido sinovial de las articulaciones.
El AH desempeña un papel importante en organismos biológicos, especialmente como soporte mecánico para las células de muchos tejidos, tales como piel, tendones, músculos y cartílago.
A través de su receptor de membrana CD44, modula muchos procesos celulares tales como proliferación, migración y diferenciación celulares, y angiogénesis, y también realiza otras funciones, tales como hidratación tisular y lubricación articular. También se conoce bien el efecto protector del AH frente a la degeneración cartilaginosa que puede producirse cuando una enfermedad o un traumatismo dañan una articulación; en dicha situación, una gran concentración de citoquinas proinflamatorias, especialmente interleuquina-1 (IL-1), está presente en la cavidad articular, promoviendo la desintegración cartilaginosa e inhibiendo la proliferación de condrocitos (van Beuningen H.M. et al., Arthritis Rheum, 1991, 34:606-615). Diversos experimentos científicos demuestran que AH contrarresta la acción de IL-1, reduciendo drásticamente sus efectos adversos y reparando el tejido cartilaginoso de la articulación en que se inyecta (Stove J. et al., J Orthop Res, 2002, 20:551-555).
Por último, se ha demostrado que AH tiene efecto analgésico, actuando como agonista parcial de los receptores opioides k (Zavan B. et al., PLoS One, 2013; 8, e55510).
Dada la combinación de dichas características, es uno de los productos usados más ampliamente en el tratamiento de trastornos osteoarticulares y cartilaginosos, en forma de infiltraciones intraarticulares basadas en AH "como tal" o en sus formas derivatizadas, usando métodos químicos (reticulación) o métodos físicos (radiación, etc.).
Además del AH y otros muchos medicamentos conocidos, en la práctica clínica se administran bisfosfonatos (BP), una clase de medicamentos conocidos desde hace algún tiempo, para tratamiento de osteoartrosis. Inhiben la reabsorción ósea por los osteoclastos, lo que justifica su uso generalizado en todos los trastornos que requieren consolidación ósea. Los BP también se usan para tratar osteoporosis, enfermedad de Paget, metástasis óseas (en presencia o ausencia de hipercalcemia), mieloma múltiple y todas las afecciones que puedan causar fragilidad ósea; por ejemplo, desempeñan un papel importante en la prevención de osteoporosis inducida por uso crónico de corticosteroides. Los BP también actúan como antiinflamatorios, debido a su efecto inhibidor en las metaloproteasas de matriz, especialmente MMP-13 (Heikkila et al., Anticancer Drugs, 2002, 13, 245-254); se sabe que las MMP-13 están implicadas en los procesos inflamatorios característicos de enfermedades osteoarticulares (tales como osteoartrosis y artritis reumatoide), que causan graves daños en el tejido cartilaginoso y óseo de la articulación, así como en el líquido sinovial y en los tendones.
Los BP se dividen en dos grupos principales: bisfosfonatos que no contienen nitrógeno o de primera generación (etidronato, clodronato y tiludronato) y bisfosfonatos que contienen nitrógeno o de segunda generación. En particular, los últimos incluyen aminobisfosfonatos (pamidronato, alendronato, ibandronato y neridronato) que contienen un átomo de nitrógeno como parte de un grupo amino, y se usan en la presente invención. Por último, el BP zolendronato de tercera generación contiene dos átomos de nitrógeno en un anillo de imidazol.
Los BP se administran normalmente por inyección (intravenosa o intramuscular) o por vía oral.
La biodisponibilidad oral de los BP de segunda generación es extremadamente baja, con valores aproximados o inferiores al 1 %, e incluso inferiores cuando se ingieren con una comida. Además, aproximadamente el 78 % de los mismo se une eficazmente con las proteínas plasmáticas, mientras que la mitad del resto se excreta en la orina en 24 horas, y solo la otra mitad se redistribuye en el hueso, específicamente con respecto al sitio objetivo. Esto significa que, para obtener un efecto farmacológico, deben administrarse dosis bastante altas del ingrediente activo para asegurar que una cantidad farmacológicamente activa alcance el sitio de acción.
Cualquiera que sea la vía de administración usada, los efectos secundarios son bastante graves, variando de dolor de cabeza y mareos, exantema, náuseas y diarrea a úlceras esofágicas, después de administración oral. En el caso de administración parenteral, los efectos secundarios significativos más comunes son fiebre, mialgia y dolor esquelético. La administración crónica puede causar incluso osteonecrosis de la mandíbula inferior.
Por tanto, es importante tener acceso a un producto que aproveche las propiedades farmacológicas de los BP, pero que tenga baja toxicidad y que pueda transportarse directamente al sitio deseado, evitando de ese modo dispersión en el organismo.
El documento de Patente EP 1994945 desvela la formación de conjugados de AH-alendronato (AH-ALD) obtenidos por enlace amido directo entre la amina del ALD y el carboxilo del AH. El conjugado resultante no es hidrolizable: se sabe bien que el enlace amido es un enlace fuerte, estable, no hidrolizable, especialmente en condiciones fisiológicas.
Nejadnik et al. (Biomaterials, 2014, 35, 6918-29) describen derivados similares con un espaciador molecular; se trata de derivados de hidrazida de AH con funcionalidad sulfhidrilo que pueden unirse a derivados acrílicos de ALD mediante radiación UV y el uso de un fotoiniciador. Una vez más, el enlace entre AH y ALD no es hidrolizable en condiciones fisiológicas.
El documento de Patente EP 1284754 describe una mezcla física entre un BP y un agente que puede prevenir su difusión inmediata (incluyendo AH), después de inyección subcutánea. Los autores afirman que la liberación gradual permite concentraciones de BP que superen las empleadas normalmente cuando se encuentra en una solución acuosa simple. Como será evidente a partir de la siguiente descripción de la presente invención, el documento de Patente EP 1284754 no solo describe un producto diferente de los conjugados de acuerdo con la invención, ya que se refiere a una mezcla física simple, sino que también persigue una finalidad completamente diferente, porque uno de los objetivos de la invención es usar dosis de BP menores que las dosis convencionales, para obtener un producto en donde AH y BP produzcan efectos sinérgicos.
Descripción de la invención
La invención se refiere a un conjugado entre ácido hialurónico (AH) y un aminobisfosfonato (N-BP) en donde la conjugación se produce con el uso de un espaciador L que consiste en una cadena de alquilo lineal o una cadena de polioxietileno. En el conjugado de acuerdo con la invención, el carboxilo de AH está unido al espaciador L mediante un enlace éster, que a su vez está unido al nitrógeno del N-BP mediante un enlace carbámico.
El conjugado de acuerdo con la invención tiene la fórmula general (I)
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- L es un espaciador de fórmula -(CH2)m-, en donde m es un número entero de 2 a 10; o L es un espaciador de fórmula -(CH2CH2O)P-CH2CH2- en donde p es un número entero de 1 a 4;
- n es un número entero de 2 a 5;
- x es un número que representa el grado de sustitución (GS) de AH con N-BP con respecto a los carboxilos de AH, y varía de 0,05 a 0,30 moles de N-BP/mol de AH;
- el peso molecular promedio en peso de AH es de 30.000 Da a 3 x 106 Da.
La invención también incluye las sales del conjugado de fórmula (I), en donde los grupos fosfónico del resto aminobisfosfónico y los grupos carboxilo de AH no implicados en la conjugación con N-BP están parcial o completamente salificados con un catión de metal alcalino o alcalinotérreo, el catión amonio o un catión tetraalquil (C-i-C âmonio, preferentemente un catión de metal alcalino y, más preferentemente, el catión Na+.
Después de hidrólisis enzimática o hidrólisis a pH ácido o básico o en condiciones fisiológicas, el enlace éster y el enlace carbámico del conjugado de fórmula (I) se escinden, y el ingrediente activo (N-BP) se libera in situ junto con AH, que de ese modo puede ejercer sus características reológicas, de biocompatibilidad y reconocimiento celular bien conocidas. Después de la hidrólisis, el espaciador L da lugar a un a,w-alquildiol o un polietilenglicol de bajo peso molecular que, en las concentraciones usadas y administrado por vía intraarticular y/o locorregional, están prácticamente desprovistos de toxicidad.
La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen un conjugado de fórmula (I) y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables, y a los usos terapéuticos de los conjugados de fórmula (I) y las formulaciones de los mismos, en particular para viscosuplementación.
Un objeto adicional de la invención es un viscosuplemento que comprende un conjugado de fórmula (I) y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.
Los conjugados de acuerdo con la invención, las composiciones farmacéuticas de los mismos y los viscosuplementos que los contienen están previstos para uso en el tratamiento intraarticular y/o locorregional de osteoartrosis y sus repercusiones en cartílago y a nivel subcondral; en el tratamiento de osteoporosis posmenopáusica o inducida por fármacos; en el tratamiento de fragilidad ósea debida a traumatismos o enfermedades; y en el tratamiento intraóseo y/o locorregional de trastornos caracterizados por recambio óseo metabólico alterado. También son útiles para promover la osteointegración de prótesis, es decir, cuando es necesario crear una conexión cercana entre una prótesis (generalmente, pero no necesariamente, de titanio) y el tejido óseo en el que se inserta.
Descripción de figuras
Figura 1. Cuantificación de liberación in vitro de alendronato (ALD) del conjugado de AH-ALD.
Figura 2. Comparación de los valores de los módulos viscoelásticos del conjugado de AH-ALD del Ejemplo 3, AH, y una mezcla física de AH y ALD.
Figura 3. Comparación entre la viscosidad dinámica n del conjugado de AH-ALD del Ejemplo 3, una mezcla física de AH y ALD, AH, Hymovis® y Synvisc®.
Figura 4. Citotoxicidad de las concentraciones 25 j M, 50 j M y 100 j M de ALD y del conjugado de AH-ALD del Ejemplo 3 en osteoblastos Saos-2 después de 3 (Figura 4A) y 7 (Figura 4B) días de incubación.
Figura 5. Citotoxicidad de las concentraciones 25 j M, 50 j M y 100 j M de ALD y del conjugado de AH-ALD del Ejemplo 3 para condrocitos bovinos primarios después de 3 (Figura 5A) y 7 (Figura 5B) días de incubación.
Figura 6. Cuantificación de colágeno soluble liberado después de estímulo inflamatorio por una muestra de cartílago obtenida de un fémur bovino adulto y tratada con el conjugado de AH-ALD del Ejemplo 3.
Descripción detallada de la invención
El número x representa el grado de sustitución (GS) de AH con N-BP, es decir, la fracción de los grupos carboxilo de la unidad de repetición de AH que están implicados en la formación del conjugado con N-BP. En los conjugados de acuerdo con la invención, x es un número de 0,05 a 0,30; en otras palabras, los grupos carboxilo de AH implicados en la conjugación varían del 5 % al 30 % en una base molar de los grupos carboxilo totales disponibles para conjugación.
El grado de sustitución x de AH con N-BP con respecto a los carboxilos de AH varía preferentemente de 0,10­ 0,30 mol/mol (GS del 10 % al 30 % mol/mol) y más preferentemente de 0,10 a 0,20 mol/mol (GS del 10 % al 20 % mol/mol).
El AH usado de acuerdo con la invención puede obtenerse a partir de cualquier fuente, tal como crestas de gallo (documento de Patente EP138572), fermentación (de Streptococcus equi o zooepidemicus, documento de Patente EP0716688) o biosíntesis (de Bacillus, documentos de Patente EP2614088 y EP2614087), y puede purificarse mediante diversas técnicas (documentos de Patente WO2018020458 e IT102017000081449).
El peso molecular promedio en peso de AH varía de 30.000 Da a 3x106Da, en particular de 1 x 105 Da a 1 x 106 Da, más preferentemente de 150.000 Da a 800.000 Da, e incluso más preferentemente de 170.000 Da a 230.000 Da o de 500.000 Da a 730.000 Da. Aquí, "peso molecular promedio en peso" significa que se calcula por el método de "viscosidad intrínseca" (Terbojevich et al., Carbohydr Res, 1986, 363-377).
El N-BP se selecciona preferentemente entre pamidronato, neridronato y alendronato. Es particularmente preferente alendronato (ALD).
Cuando el espaciador L es una cadena alifática lineal de fórmula -(CH2)m-, el número de átomos de carbono m varía preferentemente de 2 a 5, e incluso más preferentemente es 2.
Cuando el espaciador L es un espaciador de fórmula -(CH2CH2O)p-CH2CH2-, p es preferentemente 1.
El conjugado de fórmula (I), en donde L es una cadena alifática lineal de fórmula -(CH2)m- en donde m es 2, es particularmente preferente.
Los conjugados de fórmula I pueden prepararse haciendo reaccionar un derivado de N-BP, preferentemente de una sal de tetrabutilamonio (TBA), con un compuesto de fórmula X-L-OA, en donde L es como se ha definido anteriormente, X es un grupo saliente, habitualmente un átomo de halógeno, y A es un grupo activador de hidroxi. A continuación, se hace que el derivado resultante reaccione, incluso sin aislarse, con un derivado de ácido hialurónico, habitualmente una sal de tetrabutilamonio en un disolvente tal como dimetilsulfóxido o dimetilformamida. En el caso de conjugados en donde L es un espaciador de fórmula -(CH2)m- en donde m es 2, el compuesto preferente de fórmula X-L-OA es 2-cloroetil-1H-imidazol-1-carboxilato. Habitualmente, los conjugados se aíslan en forma de sales disódicas en el resto de N-BP y sales monosódicas en el resto carboxilo de AH por adición de una solución saturada de cloruro sódico seguido de diálisis a pH 6 y liofilización final.
La conjugación de AH, como se describe, representa un sistema de suministro farmacológico macromolecular para N-BP; después de su administración, a medida que avanza la hidrólisis, el conjugado libera el ingrediente activo, N-BP, que actúa en la reabsorción ósea, y AH, que vuelve a su forma original y realiza las acciones conocidas de lubricación, viscosuplementación, efecto analgésico actuando sobre los nociceptores, etc.
El conjugado en solución puede esterilizarse por filtración o por tratamiento térmico en autoclave, puede formularse en soluciones acuosas (tales como agua, solución salina o PBS), a un pH entre 6 y 7 (es decir, pH fisiológico), y puede extruirse incluso con agujas de pequeño calibre.
El conjugado de la invención también tiene características reológicas muy inusuales e inesperadas; en el momento de su preparación y uso adquiere la forma de una solución viscosa, pero en presencia de iones divalentes, en particular iones de calcio, y dependiendo de la concentración y grado de sustitución, su viscosidad cambia radicalmente y se forma un gel compacto, con características viscoelásticas comparables o incluso superiores a las de los productos viscoelásticos químicamente reticulados más ampliamente usados. Esta característica inusual es extremadamente importante porque, normalmente, los iones de calcio están presentes en el líquido sinovial (Madea et al., Forensic Sci Int, 2001, 118, 29-35), incluso cuando está "empobrecido" por osteoartrosis. Esto significa que el conjugado de la invención puede administrarse por vía intraarticular en forma de una solución viscosa, con las ventajas innegables que implica esto, tales como facilidad de extrusión, y a continuación se convierte en un gel compacto, sin la adición de otras sustancias (tales como agentes de reticulación) o tratamientos físicos (radiación UV, etc.).
El conjugado de la invención puede usarse:
- en el tratamiento intraarticular y/o locorregional de osteoartrosis, osteoporosis posmenopáusica u osteoporosis inducida por fármacos tales como esteroides, fragilidad ósea debida a traumatismos o enfermedades tales como mieloma múltiple y metástasis óseas;
- en el tratamiento intraóseo y/o locorregional de todos los trastornos caracterizados por recambio óseo metabólico alterado, tal como enfermedad de Paget;
- para mejorar la osteointegración de prótesis.
Para fines terapéuticos, el conjugado de la invención se usa en forma de una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho conjugado y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables. Dichas formulaciones pueden prepararse por métodos convencionales, tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co. Las dosis de los conjugados de acuerdo con la invención dependerán obviamente de la vía de administración y otros parámetros tales como el peso y la edad del paciente y la gravedad del trastorno, y también puede determinarlo el médico basándose en la información conocida sobre las dosis clínicas eficaces de bisfosfonatos.
El conjugado de acuerdo con la invención, además de sus propiedades de sistema de suministro farmacológico (DDS) para la liberación de N-BP y AH, también ofrece mayor eficacia y menor toxicidad que dosis similares de N-BP administradas directamente.
Las características reológicas que adquiere el conjugado de acuerdo con la invención en presencia de iones divalentes también significan que es un candidato excelente para aplicaciones de impresión y/o bioimpresión 3D, tales como la creación de partes de estructuras óseas faltantes como resultado de traumatismos, cirugía ortopédica, etc.
Una aplicación adicional del conjugado de la invención es el tratamiento y relleno de lesiones óseas subcondrales, incluyendo lesiones de médula ósea, por infusión intraósea radioguiada del conjugado reivindicado en el presente documento. Debido a sus propiedades reológicas, consolida mecánicamente la lesión subcondral, actuando como una especie de cemento óseo y, sobre todo, aprovecha las propiedades condroprotectoras y osteogénicas del N-BP, contribuyendo de ese modo activamente a la reparación de la lesión.
El conjugado de la invención resuelve de manera innovadora el problema técnico de proporcionar un producto que aprovecha las propiedades farmacológicas de los BP, pero que tiene baja toxicidad y que puede transportarse directamente al sitio deseado para evitar dispersiones en el organismo, dado que:
1. Es un sistema de suministro farmacológico de N-BP de liberación controlada que usa administración localizada que reduce la necesidad de altas dosis de N-BP y, simultáneamente, transporta el ingrediente activo al lugar exacto en el que se desea su efecto;
2. Combina las ventajas del efecto condroprotector y osteogénico del N-BP con las de un tratamiento de infiltración basado en AH (viscosuplementación, lubricación, actividad analgésica, etc.);
3. Aumenta significativamente la eficacia farmacológica del ingrediente activo que, a igualdad de dosis, es mucho menos tóxico, evitando de ese modo los posibles efectos secundarios derivados de la distribución sistémica o de dosis elevadas;
4. Tiene características reológicas inesperadas cuando se usa en presencia de cationes divalentes.
El conjugado de la invención aprovecha sinérgicamente las propiedades tanto de N-BP como de AH.
Además, la invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.
El grado de sustitución se calcula por el método ICP-OES (espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente) por lectura del fósforo a 213,5 nm, después de digestión de la muestra en ácido nítrico.
Ejemplo 1. Síntesis de sal de tetrabutilamonio de alendronato (ALD-TBA)
La síntesis se realiza como se describe en la bibliografía (Arns, S. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20:2131-2140).
Una suspensión de ácido alendrónico (1,50 g, 6,02 mmol, 1,0 eq) en agua MilliQ (40 ml) se trató con hidróxido de tetrabutilamonio (hidrato de TBA-OH-304,82 g, 6,03 mmol, 1,0 eq).
La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir la solubilización completa, dando una solución transparente e incolora. El agua se retiró por liofilización, para obtener sal de tetrabutilamonio de alendronato (ALD-TBA) como un sólido blanco higroscópico (3,1 g, 100 %).
Ejemplo 2. Síntesis de 2-cloroetil-1H-imidazol-1-carboxilato
Se añadió 2-cloroetanol (3,00 ml; 0,04 mol; 1,00 eq) a una solución de carbonildiimidazol (CDI) (14,51 g; 0,09 mol; 2,00 eq) en tetrahidrofurano (THF) (40 ml) en un matraz a 0°C con agitación constante. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente, y se dejó que la reacción transcurriera durante 3 horas.
El disolvente (THF) se retiró al vacío, y el producto sólido se disolvió en diclorometano y se lavó con HCl 1 M en un embudo separador. La fase orgánica se deshidrató con sulfato de magnesio y el disolvente se retiró en un rotavapor, para obtener el producto como un líquido incoloro (7,8 g, rendimiento 100 %).
Ejemplo 3. Síntesis de conjugado de AH-alendronato (MW de AH: 200 kDa, GS 20 % mol/mol)
Una solución de sal de tetrabutilamonio de alendronato preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1 (ALD-TBA 394 mg, 0,8 mmol, 1 eq) en DMSO (30 ml) se trató con 2-cloroetil-1H-imidazol-1-carboxilato (280 mg, 1,6mmol, 2 eq; preparado como se ha descrito en el Ejemplo 2) y se dejó que reaccionara a 40 °C durante 18 horas.
La mezcla de reacción se añadió a una solución de sal de tetrabutilamonio de AH (AH-TBA, 500 mg, 0,8 mmol, 1 eq) en DMSO (50 ml) y se dejó que reaccionara a 40 °C durante 48 horas con agitación.
El producto se purificó por precipitación con la adición de una solución saturada de cloruro sódico (2 ml) y etanol (500 ml) y, por último, se sometió a diálisis en agua destilada (Spectra/Por® MWCO 20 KDa durante 3 días) a pH 6 y se liofilizó. El producto, obtenido como sal sódica, tiene el aspecto de un sólido blanco esponjoso (380 mg, rendimiento 95 %).
Ejemplo 4. Síntesis de conjugado de AH-alendronato (MW de AH: 200 kDa, GS 10 % mol/mol)
El derivado se sintetizó, se caracterizó y se purificó como se ha descrito en el Ejemplo 3, partiendo de 1,2 g de sal de TBA de AH (2 mmol, 1 eq) solubilizada en DMSO (80 ml) y se hizo que reaccionara con la mezcla de reacción de ALD-TBA (1.000 mg, 2 mmol, 1 eq) y 2-cloroetil-1H-imidazol-1-carboxilato (470 mg, 2,45 mmol, 1,22 eq).
Se obtuvieron 774 mg de producto blanco esponjoso en forma de sal sódica. (Rendimiento: 82 %).
Ejemplo 5. Síntesis de conjugado de AH-alendronato (MW de AH: 500 kDa, GS 20 % mol/mol)
El derivado se sintetizó, se caracterizó y se purificó como se ha descrito en el Ejemplo 3, partiendo de 1,2 g de sal de TBA de AH (2 mmol, 1 eq) solubilizada en DMSO (80 ml) y se hizo que reaccionara con la mezcla de reacción de ALD-TBA (1.000 mg, 2 mmol, 1 eq) y 2-cloroetil-1H-imidazol-1-carboxilato (470 mg, 2,45 mmol, 1,22 eq).
Se obtuvieron 620 mg de producto blanco esponjoso en forma de sal sódica. (Rendimiento: 68 %).
Ejemplo 6. Síntesis de conjugado de AH-alendronato (MW de AH: 200 kDa, GS 5 % mol/mol)
El derivado se sintetizó, se caracterizó y se purificó como se ha descrito en el Ejemplo 3, partiendo de 1 g de sal de TBA de AH (1,6 mmol, 1 eq) solubilizada en DMSO (80 ml) y se hizo que reaccionara con la mezcla de reacción de ALD-TBA (790 mg, 1,6 mmol, 1 eq) y 2-cloroetil-1H-imidazol-1-carboxilato (140 mg, 0,8 mmol, 0,5 eq).
Se obtuvieron 603 mg de producto blanco esponjoso en forma de sal sódica. (Rendimiento: 90 %).
Ejemplo 7. Síntesis de conjugado de AH-alendronato (MW de AH: 200 kDa, GS 30 % mol/mol)
El derivado se sintetizó, se caracterizó y se purificó como se ha descrito en el Ejemplo 3, partiendo de 1 g de sal de TBA de AH (1,6 mmol, 1 eq) solubilizada en DMSO (80 ml) y se hizo que reaccionara con la mezcla de reacción de ALD-TBA (1,6 g, 3,2 mmol, 2 eq) y 2-cloroetil-1H-imidazol-1-carboxilato (560 mg, 3,2 mmol, 0,5 eq).
Se obtuvieron 675 mg de producto blanco esponjoso en forma de sal sódica. (Rendimiento: 85 %).
Ejemplo 8. Liberación de ALD del conjugado de AH-alendronato. Ensayo in vitro
Para demostrar que el conjugado de la invención actúa como un DDS macromolecular, se compararon las liberaciones de ALD de las siguientes sustancias:
- mezcla física que consiste en AH y ALD (AH ALD) de MW 200 kDa;
- conjugado de AH-alendronato preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3 (AH-ALD);
- conjugado de AH-alendronato obtenido mediante un enlace amido, preparado como se ha descrito en el documento de Patente EP 1994945 (AH-ALD amida).
Todas las muestras contenían la misma dosis de ALD, estaban en tampón TRIS 0,1 M, pH 7,4, y se sometieron a ensayo en una membrana de diálisis (MWCO 10 kDa), a 37 °C. La liberación de ALD se cuantificó por análisis de ICP-OES de fósforo en solución, como se ha descrito anteriormente.
Los resultados se exponen en la Figura 1.
Claramente, parece que la liberación de ALD del derivado de amida es insignificante, como se esperaba, mientras que la mezcla de AH ALD libera el ingrediente activo muy rápidamente; al séptimo día, casi el 80 % del ALD ya se ha liberado, mientras que el conjugado de AH-alendronato de la invención apenas ha superado el 50 %. Por tanto, su cinética es mucho más lenta, lo que confirma que el ingrediente activo se libera gradualmente después de hidrólisis.
Ejemplo 9. Propiedades reológicas
El análisis de los módulos viscoelásticos se realizó en las siguientes muestras, disueltas a la concentración especificada en TRIS 0,1 M, pH = 7:
- conjugado de AH-alendronato preparado como se ha descrito en el Ejemplo 5, 20 mg/ml (que contiene 2,4 mg/ml de alendronato);
- 20 mg/ml de AH de MW 500 kDa;
- mezcla de 20 mg/ml de AH de MW 500 kDa con alendronato (2,4 mg/ml), obtenida solubilizando directamente AH en una solución de TRIS 0,1 M, pH = 7 que contiene la cantidad de alendronato.
Las muestras se analizaron después de añadir 20 pl/ml de una solución de 100 mg/ml de CaCh en H2O (concentración final de CaCh: 2 mg/ml), para simular lo más posible la situación en la articulación en donde, como ya se ha mencionado, el líquido sinovial contiene iones de calcio incluso en el estadio de osteoartrosis.
Método de análisis: reómetro Anton Paar MCR92; Cono 50 mm 1°; espacio 0,102 mm; temperatura 20 °C. Barrido de frecuencia de 0,1 a 100 rad/s, tensión 10 %, 15 puntos adquiridos en una escala logarítmica.
Los resultados se describen en la Figura 2, que compara los valores de los módulos viscoelásticos; G' expresa el componente elástico del fluido y G" el componente viscoso.
Los módulos de la mezcla y de AH solo son claramente comparables: el alendronato "como tal" no tiene efecto, evidentemente, en el comportamiento reológico.
El comportamiento del conjugado de AH-alendronato es completamente diferente: los módulos elástico y viscoso son muy superiores a los de la muestra de comparación, y los valores de G' y G" configuran un gel compacto.
A modo de confirmación adicional de estos datos, se compararon las mismas muestras con dos viscosuplementos (Hymovis® y Synvisc®) entre los usados más ampliamente en el tratamiento intraarticular de osteoartrosis, para evaluar su viscosidad dinámica (n). La viscosidad dinámica, un parámetro altamente significativo para evaluar las propiedades viscoelásticas de un fluido, mide la tensión de cizalladura del fluido después de aplicar una fuerza tangencial.
Hymovis® es la hexadecilamida de AH, que forma un gel compacto debido a la creación de una reticulación móvil. Synvisc® es una mezcla de dos formas diferentes de AH reticulado, Hilano-A e Hilano-B, en una proporción de 80:20. La reticulación da AH con MW muy elevado, del orden de millones de Da. Una vez más, el producto es un gel compacto. Los resultados se exponen en la Figura 3.
El conjugado de la invención tiene claramente una viscosidad dinámica elevada, incluso superior a la de los dos productos comerciales, considerados productos de primera elección en la práctica clínica; sin embargo, el rendimiento de AH solo y de la mezcla de AH alendronato es muy inferior.
Por tanto, el conjugado de acuerdo con la invención, en términos de viscosuplementación, es superior a los productos conocidos y usados en la actualidad. Este resultado es sorprendente en cuanto a los valores de viscosidad dinámica de la mezcla de AH alendronato y AH de MW 500 kDa solo, teniendo en cuenta que el alendronato "como tal" no tiene efecto en la viscosidad.
Esto es incluso más significativo en vista del hecho de que el conjugado está formulado como una solución viscosa. AH-ALD libera el alendronato gradual y progresivamente, actuando de ese modo como un sistema suministro farmacológico macromolecular, que transporta selectivamente el ingrediente activo al sitio en el que se pretende que actúe. AH-ALD también puede inyectarse por vía intraarticular en forma de una solución viscosa. Su administración es fácil, con agujas de pequeño calibre, y causa menos dolor o molestias al paciente. Por último, AH-ALD se convierte en la cavidad articular en un gel con excelentes propiedades reológicas, mejores que las de productos similares ya usados en el campo de la viscosuplementación.
Ejemplo 10. Citotoxicidad del conjugado de AH-alendronato para osteoblastos. Ensayo in vitro
La citotoxicidad del conjugado, asociada a su capacidad de liberar alendronato de forma controlada, se evaluó mediante ensayos in vitro en una línea celular de osteoblastos (Saos-2, ATCC HTB-85). Las células Saos-2 se cultivaron en medio 5A de McCoy (Life Technologies, n.° cat. 36600-021, Italia) que contenía suero bovino fetal al 10% (Life Technologies, n.° cat. 10270106, Italia) en condiciones convencionales (37 °C, CO2 al 5%) hasta semiconfluencia. A continuación, las células se sembraron a la concentración de 1 x 104 células/pocillo en placas Multiwell de 96 pocillos (Sarstedt, n.° cat. 83.3924, Alemania) y se dividieron en tres grupos:
1) un grupo de control, en donde las células ni se trataron ni se estimularon;
2) un grupo tratado con alendronato libre, en donde las células se incubaron con concentraciones decrecientes de alendronato libre durante 3 y 7 días;
3) un grupo tratado con el conjugado de AH-alendronato preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3, en donde las células se trataron de la misma manera que las del grupo 2.
Cada muestra se sometió a ensayo en cuatro replicados.
Al final de los tiempos de incubación preestablecidos, la viabilidad celular se cuantificó con el ensayo Alamar blue® (Life Technologies, n.° cat. DAL1025, Italia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para determinar la viabilidad celular basándose en la cantidad de alendronato liberado con el tiempo. Los datos se exponen en las Figuras 4A y 4B.
Después de 3 días de incubación (Figura 4A), se observó un efecto citotóxico del alendronato libre a concentraciones de 100 pM y 50 pM (viabilidad celular <70% de la del control). La citotoxicidad del alendronato libre aumenta significativamente en proporción al período de incubación.
En las mismas condiciones, siendo igual la concentración de alendronato, el conjugado de AH-alendronato solo exhibía efecto citotóxico a la concentración de 100 pM después de 7 días de incubación (Figura 4B), demostrando que el ingrediente activo contenido en el conjugado se libera gradualmente. Por tanto, el conjugado de la invención es claramente mucho menos tóxico que el alendronato, siendo iguales la dosis y el tiempo de exposición.
Ejemplo 11. Citotoxicidad del conjugado de AH-alendronato en condrocitos. Ensayo in vitro
Se evaluó la capacidad del conjugado para liberar alendronato de forma controlada y también para tener un efecto en tejido cartilaginoso mediante ensayo in vitro en condrocitos bovinos primarios. Los condrocitos bovinos primarios se aíslan del cartílago del cóndilo femoral de un bovino adulto, de acuerdo con el protocolo que se describe en la bibliografía (Mouw JK et al., Osteoarthritis and Cartilage 2005, 13:828-836). Los condrocitos aislados se cultivaron en medio DMEM/F-12 (1:1) (Life Technologies, n.° cat. 11320074, Italia) que contenía suero bovino fetal al 10% (Life Technologies, n.° cat. 10270106, Italia) en condiciones convencionales (37 °C, CO2 al 5%), hasta semiconfluencia. A continuación, las células se sembraron a la concentración de 1 x 104 células/pocillo en placas Multiwell de 96 pocillos (Sarstedt, n.° cat. 83.3924, Alemania) y se dividieron en tres grupos:
1) un grupo de control, en donde las células ni se trataron ni se estimularon;
2) un grupo tratado con alendronato libre, en donde las células se incubaron con concentraciones decrecientes de alendronato libre durante 3 y 7 días;
3) un grupo tratado con el conjugado de AH-alendronato preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3, en donde las células se trataron de la misma manera que las del grupo 2.
Cada muestra se sometió a ensayo en cuatro replicados. Al final de los tiempos de incubación preestablecidos, la viabilidad celular se cuantificó con el ensayo Alamar blue® (Life Technologies, n.° cat. DAL1025, Italia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para determinar la viabilidad celular basándose en la cantidad de alendronato liberado con el tiempo. Los datos se exponen en las Figuras 5A y 5B.
En las mismas condiciones, siendo igual la concentración de alendronato, el conjugado de AH-alendronato solo exhibía un ligero efecto citotóxico a la concentración de 100 pM después de 7 días de incubación, demostrando que el ingrediente activo se libera gradualmente del conjugado. Por el contrario, el alendronato libre actúa en los condrocitos primarios bovinos después de 72 horas de incubación solo, y tiene un efecto citotóxico máximo a las concentraciones de 100 pM y 50 pM después de 7 días. El análisis de los datos demuestra claramente que el conjugado tiene una toxicidad considerablemente menor que el alendronato libre, especialmente para osteoblastos. Este aspecto es particularmente importante ya que los osteoblastos son responsables de la producción de matriz ósea orgánica, y su integridad es fundamental para reparación ósea.
Ejemplo 12. Liberación de colágeno del cartílago
La eficacia del conjugado se evaluó midiendo la cantidad de colágeno liberado de una muestra sometida a estímulo inflamatorio, ya que se sabe que el alendronato actúa como antiinflamatorio. El modelo seleccionado es un modelo ex vivo de inflamación de cartílago después de estímulo con agentes inflamatorios, como se describe en Arns, S. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20:2131-2140. En detalle, el cartílago se extrajo del surco patelofemoral y los cóndilos femorales se obtuvieron de un fémur bovino adulto, y se realizaron biopsias de cartílago (0 = 3 mm) con un punzón de acero. Las biopsias se cultivaron en una placa Multiwell de 48 pocillos (BD Falcon, n.° cat.
353078, Italia) a 37 °C, CO2 al 5%, durante 24 horas en DMEM/F-12 (1:1) (Life Technologies, n.° cat. 11320074, Italia) que contenía suero bovino fetal al 2 % (Life Technologies, n.° cat. 10270106, Italia). Después de incubación, las biopsias se lavaron con PBS IX y se dividieron en los siguientes grupos:
1) grupo control, en donde las biopsias ni se trataron ni se estimularon;
2) grupo estimulado con citoquinas proinflamatorias OSM e IL-1p (10 ng/ml cada una);
3) grupo estimulado con OSM e IL-1p y tratado con conjugado de AH-alendronato preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3, 1 mM;
4) grupo estimulado con OSM e IL-1p y tratado con conjugado de AH-alendronato preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3, 0,1 mM;
5) grupo estimulado con OSM e IL-1p y tratado con conjugado de AH-alendronato preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3, 0,01 mM.
A los 0, 7, 14 y 21 días el medio de cultivo se aspiró de las biopsias y se reemplazó por medio de cultivo fresco que contenía citoquinas inflamatorias y conjugado de AH-alendronato. Después de 21 días de incubación, se recogió el medio de biopsia y se midió el colágeno soluble liberado mediante ensayo colorimétrico usando el kit de ensayo de colágeno Sircol (Biocolor, n.° cat. S1000, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se exponen en la Figura 6. Las biopsias del grupo estimulado con OSM e IL-1p liberan una cantidad significativamente mayor de colágeno soluble en el medio de cultivo que el control. El conjugado reduce significativamente la pérdida de colágeno inducida por el estímulo inflamatorio, reduciendo a la mitad la cantidad de colágeno soluble medida en el medio de las biopsias tratadas con una solución que contiene el derivado a una concentración de ácido alendrónico de 1 mM. Dicho efecto también se observa, en menor medida, a las concentraciones de 0,1 mM y 0,05 mM, lo que confirma la capacidad del compuesto para inhibir la liberación de colágeno.
La eficacia demostrada del conjugado de la invención para contrarrestar la liberación de colágeno inducida por un estímulo inflamatorio confirma que mantiene las propiedades farmacológicas del alendronato, que sigue actuando como antiinflamatorio, incluso en forma conjugada.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado entre ácido hialurónico y un aminobisfosfonato, de fórmula (I)
Figure imgf000011_0001
- L es un espaciador de fórmula -(CH2)m-, en donde m es un número entero de 2 a 10; o L es un espaciador de fórmula -(CH2CH2O)p-CH2CH2- en donde p es un número entero de 1 a 4;
- n es un número entero de 2 a 5;
- x es un número que representa el grado de sustitución (GS) del ácido hialurónico con el aminobisfosfonato con respecto a los grupos carboxílicos del ácido hialurónico, que varía de 0,05 a 0,30 moles de aminobisfosfonato/mol de ácido hialurónico:
- el peso molecular promedio en peso del ácido hialurónico varía de 30.000 Da a 3 x 106 Da;
- los grupos fosfónico del resto aminobisfosfónico y los grupos carboxilo del ácido hialurónico que no están implicados en la conjugación con el aminobisfosfonato están, opcionalmente, parcial o completamente salificados con el catión de un metal alcalino o alcalinotérreo, con el catión amonio o con un catión tetraalquil (C1-C4)amonio, preferentemente con un catión de un metal alcalino, más preferentemente con el catión Na+.
2. Conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde m es un número entero de 2 a 5.
3. Conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde p es 1.
4. Conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde n es 2, 3 o 5.
5. Conjugado de acuerdo con las reivindicaciones 1,2 y 4, en donde tanto m como n son 2.
6. Conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el peso molecular promedio en peso del ácido hialurónico varía de 1 x 105 Da a 1 x 106 Da, más preferentemente de 150.000 Da a 800.000 Da, e incluso más preferentemente de 170.000 Da a 230.000 Da o de 500.000 Da a 730.000 Da.
7. Conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde x varía de 0,10 a 0,30 mol/mol, más preferentemente de 0,10 a 0,20 mol/mol.
8. Un conjugado de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 para uso como medicamento.
9. Composición farmacéutica que contiene un conjugado de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1, y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.
10. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1 o una composición de acuerdo con la reivindicación 9 para uso en el tratamiento intraarticular y/o locorregional de osteoartrosis y sus repercusiones en cartílago y a nivel subcondral; en el tratamiento de osteoporosis posmenopáusica u osteoporosis inducida por fármacos, especialmente esteroides; en el tratamiento de fragilidad ósea debida a traumatismos o enfermedades, en particular mieloma múltiple y metástasis óseas; en el tratamiento intraóseo y/o locorregional de enfermedades caracterizadas por recambio óseo metabólico alterado, en particular enfermedad de Paget; y en el tratamiento y relleno de lesiones óseas subcondrales, incluyendo lesiones de médula ósea.
11. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1 o una composición de acuerdo con la reivindicación 9, para uso para mejorar la osteointegración de prótesis.
12. Un viscosuplemento que comprende un conjugado de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1, y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.
13. Un viscosuplemento de acuerdo con la reivindicación 12 para uso en el tratamiento intraarticular y/o locorregional de osteoartrosis y sus repercusiones en cartílago y a nivel subcondral; en el tratamiento de osteoporosis posmenopáusica u osteoporosis inducida por fármacos, especialmente esteroides; en el tratamiento de fragilidad ósea debida a traumatismos o enfermedades, en particular mieloma múltiple y metástasis óseas; y en el tratamiento intraóseo y/o locorregional de enfermedades caracterizadas por recambio óseo metabólico alterado, en particular enfermedad de Paget.
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