KR20070031274A - 히알루론산 유도체 및 그것을 포함하는 약제 - Google Patents

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Abstract

생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통하여, 히알루론산에 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 히알루론산 유도체 및 그 제조 방법.

Description

히알루론산 유도체 및 그것을 포함하는 약제{HYALURONIC ACID DERIVATIVE AND DRUG CONTAINING THE SAME}
본 발명은, 비스테로이드성 항염증 화합물이나 질환 수식성 항류머티스 화합물이 생체 내에서 분해 가능한 스페이서를 통하여 도입되어 있는 히알루론산 유도체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
변형성 무릎 관절증(OA)이나 류머티스성 무릎 관절증(RA) 등의 관절증의 치료제로서 히알루론산나트륨 용액이 사용되고 있다. 히알루론산나트륨 용액은 통상주사제로서 사용되며, 환부인 무릎, 어깨 등의 관절에 직접 투여하고, 관절증에 의한 기능 장해의 개선 및 동통 억제를 목적으로 하여 빈번하게 사용되고 있다.
이러한 관절증에 의한 통증의 억제, 완화제로서 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs 또는 NSAID라고도 함)나 관절 류머티스 등의 병태를 시정하는 질환 수식성 항류머티스 화합물(이하, DMARD라고도 함)도 사용되고 있다. 일반적으로 이들 NSAIDs는 경구 투여하는 경우가 많으며, 상기 히알루론산나트륨 용액 주사제의 주입 투여와 NSAIDs의 경구 투여를 병용하는 경우도 많다. 경구 투여에 의한 이들 NSAIDs의 사용에서는, NSAIDs가 흡수되어, 혈액 속을 순환하여, 환부에 도달할 때까지 그 대부분이 소실되어 버린다고 하는 문제가 있다. 그 때문에, 혈중 유효량을 유지하여, NSAIDs를 환부에 잘 도달하도록 하기 위해서는 대량의 NSAIDs의 복용이 필요하게 되고 있다. 이와 같은 대량의 NSAIDs 경구 복용에는 소화기 장해라는 큰 부작용이 있어, 문제가 되고 있다.
또한, DMARD로서는, 염증의 원인이라고 생각되고 있는 면역 이상 등의 제어에 관한 면역 요법약(면역 조정제나 면역 억제제)을 들 수 있다.
한편, 히알루론산은, N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산의 2당 단위를 기본 골격으로 하는 반복 구조에 의해 구성된 다당이며, 각 2당 단위에 카르복실기 및 다수의 수산기를 갖고 있으므로 매우 친수성이 높은 것이 알려져 있다. 히알루론산이 친수성 즉 수분자와의 수화성(水和性)이 높은 일례로서, 히알루론산은 자기 중량의 약 1000배의 물을 유지하는 것이 가능하다고 여겨지고 있다. 그러나, 종래, 이와 같이 높은 친수성을 갖는 히알루론산에 NSAIDs와 같은 소수성이 높은 약제를 도입하면 히알루론산 분자 자신의 소수성이 증대되기 때문에, 물에 반불용(半不溶)인 겔형 혹은 불용물의 형태가 된다고 알려져 있어, 주사제로서의 사용이 곤란하거나 혹은 불가능했다. 더욱이, 장기의 서방(徐放)을 목적으로 하여, 약제의 도입율이 증가함에 따라, 불용화도도 증가하여, 주사제로서 적당하지 않은 형태로 되어 있었다.
NSAIDs에 한하지 않고 약제를 히알루론산에 도입한 예로서는, 관절증 치료약인 매트릭스 프로테아제 억제제(MMP 억제제)와 히알루론산을 스페이서를 통하지 않고서 또는 스페이서를 통해 결합시킨 결합체의 보고가 있다(특허문헌 1). 그러나 이 보고에서는, MMP 억제제와 히알루론산과의 적합한 결합 양식으로서는 보다 강한 공유 결합을 거론하고 있으며, 투여 부위에 있어서 결합체가 MMP 억제제와 히알루론산으로 해리, 분해되지 않는 것을 전제로 하여, MMP 억제제의 작용과 히알루론산의 효과의 상승적인 약효를 기대할 수 있다고 시사하고 있다. 또한, 히알루론산과의 결합 부위로서는 카르복실기를 예로 들고 있지만, 이 카르복실기에의 약제 도입율은 매우 낮고, 또, 주사제로서 적성 형태(용액)를 유지하는 처리는 하지 않고 있다.
그 외에도, 히알루론산을 수용성 카르보디이미드로 활성화하여, 그것에 구핵시약을 반응시킨 것(특허문헌 2)이 있지만, 이들 약제는 NSAIDs가 아니고, 최종 제형은 불용성 필름이었다. 또한, 할로겐화 디저급알킬포스피노티오일(Rpt-X)을 축합제로서 이용하여, 히알루론산에 여러 가지 약제를 도입한 예(특허문헌 3)도 있지만, 조제한 유도체에 관한 제형까지는 언급하고 있지 않으며, 그 조제에 용액으로서 사용할 수 있는 처리도 공정에 포함되어 있지 않다.
특허문헌 1: WO99/59603
특허문헌 2: 일본 특허 공표 평3-502704
특허문헌 3: 일본 특허 공개 평9-188705
<발명의 해결하고자 하는 과제>
직접 환부에 NSAIDs를 주입함으로써 NSAIDs의 경구 투여에 의한 소화기 장해라는 문제점을 회피하는 방법도 이론상은 생각할 수 있지만, 예컨대 무릎 관절강 내에 NSAIDs를 직접 주입한 경우, 흡수가 빠르기 때문에, NSAIDs 효과의 지속 시간은 짧아, 이러한 방법은 채용되고 있지 않다. 또한, NSAIDs 자체가 통증의 완화, 억제를 목적으로 하기 때문에, 이러한 방법은 관절증의 근본적 치료가 될 수 없다.
그래서 본 발명은, 관절증의 치료제인 히알루론산나트륨에 NSAIDs나 DMARD를 화학적으로 도입한 신규 유도체를 작성하여 이것을 환부에 주입함에 의한, 관절증에 따른 통증의 완화, 억제 및 관절증의 근본 치료에 크게 기여할 수 있는 약제의 제공 및 NSAIDs나 DMARD의 방출을 컨트롤함에 의한 지속적 효과를 갖는 약제의 제공을 목적으로 한다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자들은, 상기 목적을 고려하여, 관절증 환자의 환부에 주입할 수 있는 주사제로서 사용 가능하고, 더욱이 관절증의 근본 치료뿐만 아니라 동통, 염증의 완화, 억제에도 높은 효과를 갖는 NSAIDs 도입 히알루론산 유도체나 DMARD 도입 히알루론산 유도체를 개발하기 위해 예의 검토를 했다.
그 결과, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통해 NSAIDs나 DMARD가 히알루론산에 도입된 유도체가 상기 목적에 적합하다는 것, 더욱 바람직하게는 제조 공정에 있어서, 알칼리 처리를 가함으로써 용해성이 향상되어, 주입제(주사제)로서 주입 가능한 용액으로서 이용할 수 있는 가용성 NSAIDs 도입 히알루론산 유도체나 가용성 DMARD 도입 히알루론산 유도체를 얻을 수 있음을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.
즉 본 발명은 다음과 같다.
(1) 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통하여, 히알루론산에 항염증 화합물이 공유 결합으로써 결합하고 있는 히알루론산 유도체.
(2) 항염증 화합물이, 비스테로이드성 항염증 화합물 및 질환 수식성 항류머티스 화합물로부터 선택되는 상기 (1)에 기재한 히알루론산 유도체.
(3) 항염증 화합물이, 카르복실기를 갖고 있는 상기 (1) 또는 (2)에 기재한 히알루론산 유도체.
(4) 항염증 화합물이, 살리실산, 아스피린, 메페남산, 톨페남산, 플루페남산, 디클로페낙, 설린닥, 펜부펜, 인도메타신, 아세메타신, 암페낙, 에토돌락, 펠비낙, 이부프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 프라노프로펜, 페노프로펜, 티아프로펜산, 옥사프로진, 록소프로펜, 알미노프로펜, 잘토프로펜, 피록시캠, 테녹시캠, 롤녹시캠, 멜록시캠, 티아라미드, 톨메틴, 디플루니살, 아세트아미노펜, 플록타페닌, 티노리딘 및 악타리트로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물의 잔기인 상기 (3)에 기재한 히알루론산 유도체.
(5) 스페이서가, 히알루론산과 결합하는 작용기 및 항염증 화합물과 결합하는 작용기를 각각 적어도 하나 이상 갖고 있는 화합물인 상기 (1)∼(4)의 어느 하나에 기재한 히알루론산 유도체.
(6) 스페이서가, 탄소수 2∼18의 디아미노알칸, 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼12의 아미노알킬알콜 및 아미노산에서 선택되는 상기 (1)∼(5)의 어느 하나에 기재한 히알루론산 유도체.
(7) 히알루론산의 중량 평균 분자량이 500,000∼3,000,000인 상기 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재한 히알루론산 유도체.
(8) 항염증 화합물이, 히알루론산의 반복 2당 단위당 5∼50 몰% 도입되어 있는 상기 (1)∼(7) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체.
(9) 히알루론산에 비스테로이드성 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 히알루론산의 유도체로서, 이 항염증 화합물이 도입되어 있는 히알루론산 구성 2당 단위당 부분 구조가, 하기 화학식 1로 나타내어지는 히알루론산 유도체.
Y-CO-NH-R1-(O-R2)n
Y-CO-는 히알루론산의 구성 2당 단위 1 잔기를 나타내고, R2는 Z-CO-로 나타내어지는 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기 또는 수소 원자를 나타내고(단, 전부가 수소 원자인 경우를 제외함), -HN-R1-(O-)n은 n개의 히드록실기를 갖는 H2N-R1-(OH)n로 나타내어지는 스페이서 화합물의 스페이서 잔기를 나타내고, R1은 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼12의 직쇄 혹은 분기를 갖는 탄화수소기를 나타내고, -CO-NH-는 히알루론산의 구성당인 글루쿠론산의 카르복실기와 스페이서 화합물이 갖는 아미노기의 아미드 결합을 나타내고, -O-CO-는 스페이서 화합물이 갖는 수산기와 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기가 갖는 카르복실기의 에스테르 결합을 나타내며, n은 1∼3의 정수를 나타낸다. 또한, 상기 히알루론산 유도체에서 비스테로이드성 항염증 화합물의 도입율은 히알루론산의 반복 2당 단위당 5∼50 몰%이며, 히알루론산 유도체를 구성하는 히알루론산 잔기 중의 카르보닐기는 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기의 도입율에 따라, 그 스페이서 결합 항염증 화합물 잔기와의 결합에 관여하는 아미드 결합으로서 또는 관여하지 않는 유리(遊離)된 카르복실기로서 존재하는 것으로 한다.
(10) 비스테로이드성 항염증 화합물이, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 상기 (9)에 기재한 히알루론산 유도체.
Figure 112006056318722-PCT00001
R3은 저급 알킬기 및 저급 알콕실기에서 선택되는 치환기 또는 수소 원자를 나타내고, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로, 저급 알킬기, 저급 알콕실기 및 히드록실기로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기, 할로겐 원자 또는 수소 원자를 나타내며, X는 각각 독립적으로 동일하거나 또는 다르고, 저급 알킬기 및 트리플루오로메틸기에서 선택되는 치환기 또는 할로겐 원자를 나타내고, 적어도 X의 어느 하나는 할로겐 원자이다.
(11) 비스테로이드성 항염증 화합물이, 디클로페낙 또는 그 유도체인 상기 (10)에 기재한 히알루론산 유도체.
(12) 상기 화학식 1에서 R1이, 치환기를 갖고 있더라도 좋은 에틸렌기, 트리 메틸렌기 또는 프로필렌기인 상기 (9)∼(11) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체.
(13) 히알루론산과 스페이서 결합 항염증 화합물을 반응시키거나, 혹은, 스페이서 결합 히알루론산과 항염증 화합물을 반응시키고, 이어서 그 반응액을 알카리성 조건으로 하는 공정을 포함하는 방법에 의해서 얻어지는, 상기 (1)∼(12) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체.
(14) 상기 히알루론산 유도체를 1.0 중량%로 수성 매체에 용해하여 얻어지는 용액이, 24℃의 온도 조건 하에, 5.0 kg/cm2의 가압 하에서 다공질 필터[구멍 직경(포어 사이즈) 0.45 μm, 직경 25 mm]를 1분 동안에 2 mL 이상 통과 가능한 것을 특징으로 하는, 상기 (1)∼(13) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체.
(15) 상기 히알루론산 유도체를 1.0 중량%로 수성 매체에 용해하여 얻어지는 용액이, 24℃의 온도 조건 하에, 5.0 kg/cm2의 가압 하에서 다공질 필터[구멍 직경(포어 사이즈) 0.22 μm, 직경 25 mm]를 1분 동안에 2 mL 이상 통과 가능한 것을 특징으로 하는, 상기 (1)∼(13) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체.
(16) 상기 (1)∼(15) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체가 수성 매체에 용해된, 주입구에 의해 압출 가능한 히알루론산 유도체 용액.
(17) 수성 매체가, 인산 완충 생리식염수, 생리식염수 및 주사용수에서 선택되는 수성 매체인 상기 (16)에 기재한 히알루론산 유도체 용액.
(18) 여과 멸균된 상기 (17)에 기재한 히알루론산 유도체 용액.
(19) 상기 (1)∼(15) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체를 유효 성분으로서 함유하는 약제.
(20) 관절증 처치제, 항염증제 또는 진통제인 상기 (19)에 기재한 약제.
(21) 비경구 투여용인 상기 (19) 또는 (20)에 기재한 약제.
(22) 국소 투여용의 주입제인 상기 (21)에 기재한 약제.
(23) 관절 투여용의 주입제인 상기 (21) 또는 (22)에 기재한 약제.
(24) 상기 (1)∼(15) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체를 유효 성분으로서 함유하고, 또한 이 히알루론산 유도체를 수성 매체에 용해한 용액으로 이루어지는, 주입구에 의해 압출할 수 있는 약제.
(25) 상기 (16)∼(18) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체 용액이, 그 용액을 압출할 수 있는 주입구에 충전된 히알루론산 유도체 주입용 키트.
(26) 충전된 용액이 상기 (19)∼(24) 중 어느 것에 기재한 약제인 상기 (25)에 기재한 키트.
(27) 상기 (1)∼(15) 중 어느 것에 기재한 히알루론산 유도체를 약학적으로 허용되는 인산 완충 생리식염수, 생리식염수 또는 주사용수에 용해한 용액을 주사통에 충전하고, 약제 압출용 플런저로 미끄럼 이동 가능하게 밀봉하여 이루어지는 의료용 주사제 키트.
(28) 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서와 항염증 화합물이 공유 결합한 유도체.
(29) 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서가, 디아미노알칸, 아미노알킬알콜 또는 아미노산의 잔기인 상기 (28)에 기재한 유도체.
(30) 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서가, 그 스페이서 1 분자에 대하여 2개 이상의 항염증 화합물을 결합할 수 있는 화합물의 잔기인 상기 (28) 또는 (29)에 기재한 유도체.
(31) 항염증 화합물이, 살리실산, 아스피린, 메페남산, 톨페남산, 플루페남산, 디클로페낙, 설린닥, 펜부펜, 인도메타신, 아세메타신, 암페낙, 에토돌락, 펠비낙, 이부프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 프라노프로펜, 페노프로펜, 티아프로펜산, 옥사프로진, 록소프로펜, 알미노프로펜, 잘토프로펜, 피록시캠, 테녹시캠, 롤녹시캠, 멜록시캠, 티아라미드, 톨메틴, 디플루니살, 아세트아미노펜, 플록타페닌, 티노리딘 및 악타리트로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물의 잔기인 상기 (28)∼(30) 중 어느 것에 기재한 유도체.
(32) 공유 결합이, 에스테르 결합 또는 아미드 결합인 상기 (28)∼(31) 중 어느 것에 기재한 유도체.
(33) 하기 화학식 3으로 나타내어지는 상기 (32)에 기재한 유도체.
H2N-R1-(O-R2)n
R2는 Z-CO-으로 나타내어지는 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기 또는 수소 원자를 나타내고(단, 전부가 수소 원자인 경우를 제외함), H2N-R1-(O-)n은 n개의 히 드록실기를 갖는 H2N-R1-(OH)n으로 나타내어지는 스페이서 화합물의 스페이서 잔기를 나타내고, R1은 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼12의 직쇄 혹은 분기를 갖는 탄화수소기를 나타내고, -O-CO-는 스페이서 화합물이 갖는 수산기와 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기가 갖는 카르복실기의 에스테르 결합을 나타내며, n은 1∼3의 정수를 나타낸다.
(34) 히알루론산과 스페이서 결합 항염증 화합물을 반응시키거나, 혹은, 스페이서 결합 히알루론산과 항염증 화합물을 반응시키는 것을 특징으로 하는, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통하여 히알루론산에 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 히알루론산 유도체의 제조 방법.
(35) 히알루론산과 스페이서 결합 항염증 화합물의 반응 생성물, 혹은, 스페이서 결합 히알루론산과 항염증 화합물의 반응 생성물의 용액을, 알카리성 조건 하에서 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 (34)에 기재한 히알루론산 유도체의 제조 방법.
<발명의 효과>
본 발명에 의해, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통하여 히알루론산에 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합한 히알루론산 유도체, 특히 비스테로이드성 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 비스테로이드성 항염증 화합물 도입 히알루론산 유도체(이하, 본 발명 물질 1이라고도 함), 마찬가지로 질환 수식성 항류머티스 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 질환 수식성 항 류머티스 화합물 도입 히알루론산 유도체(이하, 본 발명 물질 2라고도 함. 또한, 전술한 본 발명 물질 1과 본 발명 물질 2를 합쳐서, 본 발명 물질이라고도 함) 및 이들 유도체를 유효 성분으로서 함유하는 약제(이하, 본 발명 약제라고도 함)가 제공된다. 본 발명 물질은 주사제 등의 용매로서 사용되는 완충액, 생리식염수, 주사용수 등에 잘 용해하기 때문에, 환부에 직접 투여 가능한 주사제로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명 약제는 관절증의 치료, 염증의 억제나 동통의 억제에 이용할 수 있으며, 주입제로서 비경구 투여 또는 국소 투여(예컨대, 관절내 투여)도 가능하다.
도 1은 래트 브라디키닌 야기 동통 모델에 대한 동통 스코어를 도시한 도면이다.
도 2는 래트 1% 질산은 용액 야기 동통 모델에 대한 동통 스코어를 도시한 도면이다.
도 3은 래트 1% 질산은 용액 야기 동통 모델에 대한 하중 부하율(%)을 도시한 도면이다.
도 4는 토끼 무릎 관절에의 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨(KP-HA), 케토프로펜과 HA 혼합물 및 케토프로펜의 투여에 의한, 토끼 무릎 관절에서의 시간 경과에 따른 잔존율을 도시한 도면이다.
도 5는 래트 1% 질산은 야기 동통 모델에 대한 도입율(DS)이 다른 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨의 효과를 도시한 도면이다.
도 6은 래트 1% 질산은 야기 동통 모델에 대한 디클로페낙나트륨의 경구 투여에 의한 효과를 도시한 도면이다.
도 7은 래트 1% 질산은 야기 동통 모델에 대한 디클로페낙 단제, 히알루론산에서의 효과를 도시한 도면이다.
도 8은 래트 1% 질산은 야기 동통 모델에 대한 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산(65 kDa)나트륨, 디아미노프로판-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨 및 아미노에탄올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨의 효과 비교를 도시한 도면이다.
도 9(a)는 COX-2에 대한 디클로페낙나트륨 단제, 및 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체의 작용(in vitro)을 도시한 도면, 도 9(b)는 COX-2에 대한 히알루론산나트륨 단제, 및 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체의 작용(in vitro)을 도시한 도면이다.
도 10(a)은 래트 아쥬반트 관절염(AIA) 모델에 대한 아쥬반트 투여 발에서의 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체의 투여에 의한 효과를 도시한 도면, 도 10(b)은 래트 아쥬반트 관절염(AIA) 모델에 대한 아쥬반트 비투여 발에서의 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체의 투여에 의한 효과를 도시한 도면이다.
이하, 본 발명을 발명의 실시형태에 의해 상세히 설명한다.
본 발명 물질은, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통하여, 히알루론산에 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 히알루론산 유도 체이다. 본 발명에 있어서는, 항염증 화합물이란, 비스테로이드성 항염증 화합물(NSAID 또는 NSAIDs) 및 질환 수식성 항류머티스 화합물(DMARD)에서 선택된다.
한편, 「NSAIDs」는 복수의 화합물이 분류되어 있는 비스테로이드성 항염증 화합물을 총칭하는 경우에 이용하며, 「NSAID」는 각각의 비스테로이드성 항염증 화합물을 가리키는 경우도 있지만, 본 명세서 중에서는 특별히 엄밀하게 구별하여 쓰지 않는다.
본 발명 물질 1은 비스테로이드성 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 히알루론산 유도체이며, 개념적 구조는 다음과 같은 일반식 4로 표시된다:
HA-SP-NSAID
(HA는 히알루론산쇄를, SP는 스페이서 잔기를, NSAID는 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기를, -은 공유 결합을 나타냄)
또한, 본 발명 물질 2는 질환 수식성 항류머티스 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 히알루론산 유도체이며, 개념적 구조는 다음과 같은 일반식 5로 표시된다:
HA-SP-DMARD
(HA는 히알루론산쇄를, SP는 스페이서 잔기를, DMARD는 질환 수식성 항류머티스 화합물 잔기를, -은 공유 결합을 나타냄)
본 발명 물질은 수성 용매에 용해 가능하며, 그 용액은 점성을 갖는 용액이 다.
여기서 「수성 용매」란, 물, 물을 포함하는 완충액, 약학적으로 허용되는 금속염, pH 조정제 등을 포함하는 수용액, 완충액 등을 의미하며, 구체적으로는 주사용수, 인산 완충 생리식염수, 생리식염수 등을 예시할 수 있다.
본 발명 물질에 이용되는 히알루론산은, N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산이 β1,3 결합으로 결합하여 이루어지는 2당 단위를 기본 골격으로 하며, 이 2당 단위가 반복 β1,4 결합하여 구성된 글루코사미노글리칸, 즉 통상 이용되는 히알루론산이라면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 동물 유래, 미생물 유래 및 화학적 합성 등 어느 것에 의하여 입수한 것도 이용하는 것이 가능하다.
히알루론산의 중량 평균 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 10,000∼5,000,000을 예시할 수 있다. 바람직하게는 500,000∼3,000,000, 보다 바람직하게는 관절증 치료제로서 이용되고 있는 규격인 600,000∼1,500,000 및 1,500,000∼3,000,000을 들 수 있다.
한편, 본 발명에 이용되는 히알루론산은 염을 형성하고 있지 않은 유리된 상태라도 좋고, 또한 약학적으로 허용될 수 있는 염의 상태라도 좋다. 히알루론산의 약학적으로 허용될 수 있는 염이란, 예컨대 나트륨염, 칼륨염과 같은 알칼리 금속 이온과의 염, 및 마그네슘염, 칼슘염과 같은 알칼리 토류 금속 이온과의 염 등을 들 수 있다. 히알루론산 유도체를 생체에 적용하기 위한 약제 등에 사용하는 경우에는, 생체에의 친화성이 특히 높으므로, 사용되는 히알루론산염은 약학적으로 허용되는 알칼리 금속 이온과의 염이 바람직하며, 그 중에서도 나트륨 이온과의 염이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서의 항염증 화합물의 하나인 NSAIDs로서는 통상, 비스테로이드성 항염증제라고 불리는 화합물 전반을 지칭하며, 특별히 한정되지 않지만, 그 중에서도 특히 관절증에의 적용이 있는 것이 바람직하다. 종래부터 NSAIDs의 분류법으로서 화학 구조에 있어서의 골격의 차이에 의한 분류가 있다. 본 발명에 적용되는 NSAIDs를 이 분류마다 예시하면, 살리실산계 NSAIDs로서 살리실산, 아스피린등이 있고, 페남산계 NSAIDs로서 메페남산, 톨페남산, 플루페남산 등, 아릴아세트산계 NSAIDs로서 디클로페낙, 설린닥, 펜부펜, 인도메타신, 아세메타신, 암페낙, 에토돌락, 펠비낙 등, 프로피온산계 NSAIDs로서 이부프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 프라노프로펜, 페노프로펜, 티아프로펜산, 옥사프로진, 록소프로펜, 알미노프로펜, 잘토프로펜 등, 옥시캠계 NSAIDs로서 피록시캠, 테녹시캠, 롤녹시캠, 멜록시캠 등, 그 밖의 NSAIDs로서 티아라미드, 톨메틴, 디플루니살, 아세트아미노펜, 플록타페닌, 티노리딘 등이 있다.
본 발명에 적용되는 NSAIDs로서는, 그 화학 구조 중에 카르복실기, 수산기, 아미노기 등의 작용기를 갖고 있는 것이 바람직하다. 본 발명 물질 1은 이들 NSAIDs가 갖고 있는 작용기에 맞춰 스페이서의 작용기를 선택하는 것이 가능하기 때문에, 특별히 한정은 되지 않지만, 카르복실기를 적어도 갖고 있는 NSAIDs가 특히 바람직하게 이용된다.
그 중에서도, 하기 화학식 6으로 표시되는 골격을 갖는 화합물이 보다 바람직하게 이용된다:
Figure 112006056318722-PCT00002
나아가서는, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이 특히 바람직하게 이용된다.
화학식 2
Figure 112006056318722-PCT00003
R3은 저급 알킬기 및 저급 알콕실기에서 선택되는 치환기 또는 수소 원자를 나타낸다. R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로, 저급 알킬기, 저급 알콕실기 및 히드록실기로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기, 할로겐 원자 또는 수소 원자를 나타낸다. X는 각각 독립적으로 동일하거나 또는 다르고, 저급 알킬기 및 트리플루오로메틸기에서 선택되는 치환기 또는 할로겐 원자를 나타내며, 적어도 X의 어느 하나는 할로겐 원자이다. 또한, 상기한 저급 알킬기 및 저급 알콕실기는 분기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 1∼12의 저급 알킬기 및 저급 알콕실기가 바람직하며, 분기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 1∼6의 저급 알킬기 및 저급 알콕실기가 더욱 바람직하다.
또한, R3은 R3이 결합하고 있는 벤젠 고리에 있어서 카르복시메틸기를 1위, 아미노잔기를 2위로 한 경우에, 5위의 위치에 결합하고 있는 것이 바람직하다.
상기 화학식 2으로 표시되는 화합물로서는, 예컨대, WO99/11605에 기재된 화합물을 들 수 있으며, 이 공보의 기재 내용은 본 명세서의 기재된 인용으로서 쓰인다.
한편, NSAID가 갖는 카르복실기는 유리형이라도, 염을 형성하고 있더라도 상관없다.
본 발명에 있어서의 또 하나의 항염증 화합물인 DMARD는 통상, 항류머티스제로서 이용되고 있는 약제 전반을 지칭하며, 특별히 한정되지 않지만, 그 화학 구조 중에 카르복실기, 수산기, 아미노기, 머캅토기 등의 작용기를 갖고 있는 것이 바람직하다. DMARD로서는, 악타리트, 메토트렉사이트, 살라조설파피리딘, 부시라민 등을 들 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서의 항염증 화합물로서는, 전술한 설명의 NSAID나 DMARD를 들 수 있지만, 그 중에서도 카르복실기를 갖고 있는 화합물이 바람직하다.
한편, 전술한 NSAIDs나 DMARD가 갖고 있는 작용기에 맞춰 스페이서의 작용기를 선택함으로써, 바람직한 결합 양식으로 히알루론산에 도입하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명 물질은 반드시 1종류의 NSAID 또는 DMARD가 도입되어 있을 필요는 없으며, 2가지 이상의 NSAIS나 DMARD를 도입하고 있는 히알루론산 유도체도 포함된다.
상기한 SP로 나타내어지는 스페이서는, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서이며, 히알루론산과 결합하는 작용기, 및 NSAIDs 또는 DMARD와 결합 하는 작용기를 각각 적어도 하나 이상 갖고 있는 화합물(이하, 스페이서 화합물이라고도 함) 의 잔기이다. 스페이서의 생체 내에서 분해될 수 있는 부위는 그 히알루론산 유도체로부터 유리되는 NSAIDs 또는 DMARD가 효력을 갖으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, NSAIDs 또는 DMARD와 스페이서와의 결합 부위에서 분해되는 것이 바람직하다.
스페이서 화합물의 작용기는, 각각 히알루론산 및 NSAIDs 또는 DMARD와의 결합 양식에 의해 다양하게 선택할 수 있다. 예컨대, 히알루론산의 카르복실기와 아미드 결합으로 스페이서를 도입하는 경우, 아미노기를 갖고 있는 스페이서 화합물을 선택하고, 히알루론산의 카르복실기와 에스테르 결합으로 도입하는 경우, 수산기를 갖고 있는 스페이서 화합물을 선택하고, 히알루론산의 수산기와 에스테르 결합으로 도입하는 경우, 카르복실기를 갖고 있는 스페이서 화합물을 선택할 수 있다.
이 경우, 히알루론산에의 도입 용이성 및 생체 내에서의 안정성으로부터 히알루론산의 카르복실기에 아미드 결합으로 도입할 수 있는 아미노기를 갖는 스페이서 화합물이 바람직한 형태의 하나로서 들 수 있다.
마찬가지로, NSAIDs 또는 DMARD와 결합하는 스페이서 화합물의 작용기도, NSAIDs 또는 DMARD가 갖고 있는 작용기에 맞춰 선택할 수 있다. 예컨대, 수산기를 갖고 있는 NSAIDs 또는 DMARD의 경우, 카르복실기를 갖는 스페이서 화합물을 선택하면 에스테르 결합에 의해 결합할 수 있고, 카르복실기를 갖고 있는 NSAIDs 또는 DMARD의 경우, 수산기를 갖는 스페이서 화합물을 선택하면 에스테르 결합에 의해 결합할 수 있고, 아미노기를 갖는 스페이서 화합물을 선택하면 아미드 결합에 의해 결합할 수 있고, 머캅토기를 갖고 있는 NSAIDs 또는 DMARD의 경우, 카르복실기를 갖는 스페이서 화합물을 선택하면 티오에스테르 결합에 의해 결합할 수 있다.
이 경우는, 생체 내에서의 분해 용이성을 고려하여 NSAIDs 또는 DMARD와 에스테르 결합으로 결합할 수 있는 작용기를 갖는 스페이서 화합물이 바람직하고, 또한 NSAIDs 또는 DMARD의 카르복실기와 스페이서 화합물의 수산기가 에스테르 결합으로 결합하고 있는 것이 특히 바람직하다.
스페이서 화합물은 전술한 것과 같이, 히알루론산이나 NSAIDs 또는 DMARD의 특성에 따라서 적절하게 선택 가능하다가, 예컨대, 탄소수 2∼18의 디아미노알칸, 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼12의 아미노알킬알콜, 아미노산 등을 들 수 있다. 아미노산으로서는, 천연, 비천연의 아미노산이라도 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 글리신, β-알라닌, γ-아미노부티르산을 들 수 있다.
전술한 것과 같이 히알루론산 및 NSAIDs와의 결합 양식을 고려한 경우, 스페이서 화합물의 바람직한 일례로서 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼12의 아미노알킬알콜을 들 수 있다.
또한, 1 분자 중에 NSAIDs 또는 DMARD와 결합하는 이들 작용기를 2개 이상 갖고 있는 스페이서 화합물(이하, 다가 스페이서 화합물이라고도 함)이라도 상관없다.
다가 스페이서 화합물을 선택한 경우, 하나의 스페이서에 복수의 NSAIDs 또는 DMARD를 동시에 결합하는 것이 가능하게 된다. 따라서, NSAIDs 또는 DMARD를 도 입하는 히알루론산의 작용기, 예컨대 하나의 카르복실기에 대하여 복수의 NSAIDs 또는 DMARD를 동시에 도입하는 것이 가능하게 된다. 이들 다가 스페이서 화합물의 예로서, 세리놀 및 그 유도체, 세린 유도체, 트레오닌 유도체, 2-아미노-1,5-펜탄디올 및 그 유도체, 3-아미노-1,2-프로판디올 및 그 유도체, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 및 그 유도체, 비스호모트리스 및 그 유도체 등을 들 수 있다.
이 다가 스페이서 화합물을 이용하는 이점은, 히알루론산의 친수성에 기여하는 카르복실기나 수산기의 대부분을 치환 반응에 관여시키는 일없이, 보다 많은 NSAIDs 또는 DMARD를 도입할 수 있기 때문에, 많은 NSAIDs 또는 DMARD가 도입되어 있음에도 불구하고, 친수성 즉 수성 매체에의 가용성을 보다 유지하는 것이 가능하게 되는 점이다.
본 발명 물질의 합성 방법은, 전술한 것과 같은 가용성의 본 발명 물질을 얻을 수 있는 방법이라면 특별히 한정되지 않는다.
한편, 일반적으로, 히알루론산에 화합물을 도입한 히알루론산 유도체에 있어서는, 히알루론산이 갖는 카르복실기나 수산기가 화합물의 결합에 관여하기 때문에, 물질의 도입율의 상승에 따라, 히알루론산 유도체의 친수성이 저하된다.
본 발명 물질 1의 합성 방법의 일례로서는, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통해 히알루론산에 NSAIDs를 도입하는 도입 반응 후에, 알칼리 처리를 하는 것을 특징으로 하는 방법을 들 수 있다.
상기 도입 반응 후의 반응 용액을 알카리성으로 하는 알칼리 처리는, 그 용액이 알카리성으로 되는 처리인 한 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는 유기 염 기 또는 무기 염기의 어느 것을 그 용액에 첨가하는 방법이 예시되지만, 그 후의 처리 등을 고려하면 무기 염기 쪽이 바람직하다. 나아가서는, 무기 염기 중에서도 수산화나트륨과 같은 강염기보다 탄산수소나트륨이나 탄산나트륨과 같은 약염기 쪽이, 히알루론산이나 NSAIDs에 영향을 미치게 할 우려가 낮으므로 바람직하다. 여기서의 알칼리 처리의 pH 조건은 7.2∼11, 바람직하게는 7.5∼10을 예시할 수 있다.
알칼리 처리의 처리 시간은 히알루론산의 저분자화에 영향을 미치게 하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 2∼12시간, 바람직하게는 2∼6시간을 들 수 있고, 이 시간 처리하면 히알루론산에 영향을 주지 않고서 가용성의 히알루론산 유도체를 얻을 수 있다.
구체적 일례로서는, 스페이서를 도입한 NSAIDs 유도체를 히알루론산과 반응한 후, 반응액에 예컨대 탄산수소나트륨 등의 약알칼리를 가하여, 수시간 교반 처리한 후, 중화, 에탄올 침전, 건조 등의 후처리를 함으로써 목적으로 하는 가용성의 히알루론산 유도체를 얻을 수 있다.
전술한 방법은, 본 발명 물질 2의 합성에도 적용할 수 있어, 가용성의 본 발명 물질 2를 얻을 수 있다.
한편, 히알루론산에 스페이서 및 NSAIDs 또는 DMARD를 도입하는 방법은 히알루론산에 스페이서를 도입한 후에, 그 스페이서 결합 히알루론산에 NSAIDs 또는 DMARD를 도입하는 방법, 혹은 미리 스페이서를 NSAIDs 또는 DMARD에 도입한 후에, 그 스페이서 결합 NSAIDs 또는 그 스페이서 결합 DMARD를 히알루론산에 도입하는 방법의 어느 쪽이나 좋지만, 후자 방법 쪽이 바람직하다.
NSAIDs 또는 DMARD, 히알루론산 및 스페이서를 각각 결합시키는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 에스테르 결합, 아미드 결합 및 티오에스테르 결합 등을 달성할 수 있는 방법이라면, 그 결합 반응을 하는 수단으로서 일반적으로 이용되는 통상의 방법을 이용하는 것이 가능하며, 반응 조건도 당업자가 적절하게 판단하여 선택할 수 있다.
한편, 히알루론산과, 스페이서 결합 NSAIDs 또는 스페이서 결합 DMARD, 혹은, 스페이서 화합물과의 결합은, 히알루론산의 카르복실기 혹은 수산기의 어느 쪽을 이용하더라도 달성할 수 있지만, 작용기가 갖는 반응성의 높이로부터 카르복실기 쪽이 용이하게 달성할 수 있다. 이러한 결합을 달성하는 방법으로서, 예컨대 수용성 카르보디이미드 등(예컨대, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염(EDCI·HCl), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드메티오시드 등)의 수용성의 축합제를 사용하는 방법, N-히드록시호박산이미드(HOSu)나 N-히드록시벤조트리아졸(HOBt) 등의 축합 보조제와 상기한 축합제를 사용하는 방법, 활성 에스테르법, 산무수물법 등을 들 수 있다. 이들 중에서는 수성 용매의 존재하의 반응으로서, 수용성의 축합제를 사용하는 방법, 또는 축합 보조제와 수용성의 축합제를 사용하는 방법이 바람직하며, 특히 부반응의 억제라는 관점에서 축합 보조제와 수용성의 축합제를 사용하는 방법이 보다 바람직하다. 이러한 히알루론산의 카르복실기와, 스페이서 결합 NSAIDs 또는 스페이서 결합 DMARD, 혹은 스페이서 화합물과의 결합은 에스테르 결합 또는 아미드 결합으로 이루어지는 것이 바람직하고, 아미드 결합으로 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명 물질에 있어서의 히알루론산에의 NSAIDs 또는 DMARD의 도입율은, 본 발명 물질의 합성 공정에 있어서, 축합제, 축합 보조제, 스페이서 결합 NSAIDs 또는 스페이서 결합 DMARD의 투입량을 바꿈으로써 조정 가능하다. 한편, 도입율은 흡광도의 측정이나 HPLC, NMR 등을 이용하는 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 상기 유도체의 수성 용매에의 가용성이 유지되면, NSAIDs 또는 DMARD의 도입율은 특별히 제한은 되지 않지만, 히알루론산의 반복 2당 단위당 0.1∼80 몰%가 바람직하고, 5∼50 몰%가 보다 바람직하다. 또한, 본 발명 물질을 의약품의 유효 성분으로서 이용하는 경우, 환부에 있어서의 NSAIDs 또는 DMARD의 유효 농도 혹은 서방 효율을 고려하여 적성 도입율이 결정된다.
전술한 것과 같이, 히알루론산의 카르복실기에 스페이서 결합 NSAIDs 또는 스페이서 결합 DMARD가 도입되면, 카르복실기는 아미드 결합 혹은 에스테르 결합을 형성함으로써 그 친수성을 저하, 상실하게 된다.
이 문제점을 해결하는 수단의 하나로서, 다가 스페이서 화합물을 이용함으로써, 친수성을 보다 유지한 채로, 많은 NSAIDs 또는 DMARD의 도입이 가능하게 된다. 예컨대, 3개의 수산기와 1개의 아미노기를 갖는 아미노트리올 유도체를 스페이서 화합물에 이용한 경우, 3개의 수산기 전부에 NSAIDs를 도입하면 스페이서 1 분자에 3 분자의 NSAIDs가 도입되게 된다. 이 아미노트리올 결합 NSAIDs가 히알루론산의 카르복실기에 대하여 예컨대 20%의 치환율(히알루론산 2당 단위당 치환율)로 도입된 경우, NSAIDs의 도입율은 3배인 60%가 된다.
더욱이 앞서 말한 바와 같이, 본 발명 물질의 합성 방법의 일례로서 들 수 있는, 항염증 화합물 도입 히알루론산 유도체를 합성하기 위한 도입 반응 후에 알칼리 처리를 하는 방법을 이용하면, 얻어지는 히알루론산 유도체의 수성 매체에의 용해성은 유지된다. 이 용해성의 유지 효과는 스페이서 화합물의 종류나 약제의 도입율 등을 그다지 고려할 필요가 없으며, 또한, 간이한 처리이기 때문에 매우 유용하다.
전술한 설명을 총괄하면, 예컨대 구체적인 본 발명 물질 1의 적합한 형태로서 하기 화학식 1로 표시되는 히알루론산 구성 2당 단위를 갖는 히알루론산 유도체를 들 수 있다. 한편, 하기 화학식 1은, 항염증 화합물이 도입되어 있는 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산이 β-1,3 결합하고 있는 히알루론산 구성 2당 단위당의 부분 구조를 나타낸다.
화학식 1
Y-CO-NH-R1-(O-R2)n
Y-CO-는 히알루론산의 구성 2당 단위 1 잔기를 나타내고, R2는 Z-CO-으로 나타내어지는 NSAID 잔기 또는 수소 원자를 나타내고(단, 전부가 수소 원자인 경우를 제외함), -HN-R1-(O-)n은 n개의 히드록실기를 갖는 H2N-R1-(OH)n로 나타내어지는 스페이서 화합물의 스페이서 잔기를 나타내고, R1은 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼12의 직쇄 혹은 분기를 갖는 탄화수소기를 나타내고, -CO-NH-는 히알루론산의 구성당인 글루쿠론산의 카르복실기와 스페이서 화합물이 갖는 아미노기와의 아미드 결합을 나타내고, -O-CO-는 스페이서 화합물이 갖는 수산기와 NSAID가 갖는 카르복실기와의 에스테르 결합을 나타내며, n은 1∼3의 정수를 나타낸다. 한편, 히알루론산 유도체를 구성하는 히알루론산 잔기 중의 카르보닐기는 NSAID 잔기의 도입율에 따라서, 그 스페이서 결합 항염증 화합물 잔기와의 결합에 관여하는 아미드 결합으로서, 또는 관여하지 않는 유리된 카르복실기로서 존재하는 것으로 한다.
R1에 있어서의 치환기로서는, 알킬기, 알케닐기, 아릴기, 알콕실기, 아실기, 카르복실기, 할로겐 등을 들 수 있으며, 알킬기, 알케닐기, 알콕실기, 아실기에 있어서의 탄소수는 1∼11이 바람직하고, 1∼4가 더욱 바람직하며, 아릴기로서는 페닐기가 바람직하다. 예컨대 치환기로서 카르복실기를 갖는 스페이서 화합물로서는 세린이, 카르복실기와 메틸기를 갖는 스페이서 화합물로서는 트레오닌을 들 수 있다.
한편, 상기 화학식 1에 의하면, Y-COOH는 반응전의 히알루론산 구성 2당 단위 하나를 나타내고, H2N-R1-(OH)n은 반응전의 스페이서 화합물을 나타내고, HOOC-Z는 반응전의 NSAID를 나타낸다.
상기 화학식 1으로 나타내어지는 히알루론산 구성 2당 단위를 합성하는 가장 적합한 방법으로서는, 스페이서 화합물과 NSAID를 결합시킨 후, 이어서, 히알루론산과 반응시키는 방법을 들 수 있다. 이 반응을 개념적으로 나타내면 다음과 같다.
R7HN-R1-(OH)n + HOOC-Z→(에스테르 형성)
→(탈보호)→H2N-R1-(O-R2)n
H2N-R1-(O-R2)n + Y-COOH→
Y-CO-NH-R1-(O-R2)n
R7은 아미노기의 보호기를 나타내고, 보호기로서는, 아미노기의 보호기로서 통상 사용되고 있는 보호기를 사용하는 것이 가능하며 특별히 한정되지 않지만, tert-부톡시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기와 같은 우레탄형 보호기나 포르밀기, 프탈로일기와 같은 아실형 보호기를 들 수 있고, 바람직하게는 우레탄형 보호기를 들 수 있다. 한편, R1, R2 및 Z는 상기와 같은 의의이다.
단, 상기한 것은 반응 경로를 개념적으로 나타낸 것이며, 당업자라면 생각할 수 있는 반응을 효율적으로 행하는 연구 등에 대해서는 생략하고 있다.
상기 화학식 1에 있어서, R1은 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼5의 직쇄 혹은 분기를 갖는 탄화수소기가 보다 바람직하고, 그 중에서도 탄소수 2 또는 3의 탄화수소기가 바람직하며, 예컨대, 에틸렌기, 트리메틸렌기 또는 프로필렌기를 들 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에 있어서 이용되는 NSAID로서는, 앞에서 기재한 NSAID에서 선택하는 것이 가능하다. 나아가서는, 하기 화학식 7로 표시되는 화합물을 바람직하게 들 수 있다.
Figure 112006056318722-PCT00004
R8은 저급 알킬기 및 저급 알콕실기에서 선택되는 치환기 또는 수소 원자를 나타내며, 분기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 1∼12의 저급 알킬기 또는 수소 원자가 보다 바람직하고, 그 중에서도 탄소수 1∼4의 저급 알킬기 또는 수소 원자가 보다 바람직하다.
X1, X2는 각각 독립적으로, 저급 알킬기 및 트리플루오로메틸기에서 선택되는 치환기 또는 할로겐 원자를 나타내고, 적어도 어느 쪽 하나는 할로겐 원자이다. X1, X2는 동일하거나 또는 다른 할로겐 원자가 보다 바람직하며, 그 중에서도 불소 원자 또는 염소 원자에서 선택되면 보다 바람직하다.
또한, R8은 R8이 결합하고 있는 벤젠 고리에 있어서 카르복시메틸기를 1위, 아미노 잔기를 2위로 한 경우에, 5위의 위치에 결합하고 있는 것이 바람직하다.
상기 화학식 7로 표시되는 화합물의 전형적인 예로서는, 하기 화학식 8 및 9로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
Figure 112006056318722-PCT00005
Figure 112006056318722-PCT00006
예컨대, 식 9로 표시되는 디클로페낙을 이용한 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체를 합성한 경우, 상기 화학식 1에 있어서의 -CO-Z는 하기 화학식 10으로 표시된다:
Figure 112006056318722-PCT00007
한편, 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체는 매우 강력한 진통 작용, 항염증 작용을 갖는다.
상기 화학식 1로 나타내어지는 히알루론산 구성 2당 단위를 갖는 본 발명 물질에 이용할 수 있는 히알루론산으로서는, 중량 평균 분자량 50,000∼3,000,000을 갖는 히알루론산이 바람직하며, 중량 평균 분자량 50,000∼2,000,000을 갖는 히알루론산이 보다 바람직하게 선택된다.
상기 화학식 1로 나타내어지는 히알루론산 구성 2당 단위를 갖는 본 발명 물질에 있어서의 NSAIDs의 도입율(DS)은 히알루론산의 반복 2당 단위당, 5∼50 몰%가 바람직하고, 10∼50%가 보다 바람직하다.
본 발명 물질의 큰 특징으로서, 본 발명 물질이 수성 용매에 용해 가능한, 즉, 이(易)수용성인 점을 들 수 있으며, 본 발명 물질에 수성 용매를 첨가하면, 가온이나 가용화 처리 등을 하지 않고서 용해한다. 한편, 도입율이 높더라도, 예컨대 5% 이상, 나아가서는 10% 이상이라도 용해 가능하다. 그 때문에, 본 발명 물질을 수성 매체에 용해시킨 용액은 주입 가능한 액체형이며, 또한, 여과 필터에 대하여 통과성을 갖고 있다. 가하여서 말하면, 전술한 것과 같이, 통상, 높은 친수성을 갖는 히알루론산에 NSAIDs 또는 DMARD와 같은 소수성이 높은 약제를 도입하면 히알루론산 분자 자신의 소수성이 증대되기 때문에, 물에 반불용인 점탄성이 높은 겔형 혹은 불용물의 형태로 된다는 것이 알려지고 있으며, 주입구로부터 압출하는 식의 주입제로서는 부적당하다.
그러나, 본 발명 물질은, 예컨대 전술한 것과 같이 제조 공정에 있어서 알칼리 처리를 함으로써 히알루론산 유도체의 용해성이 유지되기 때문에, 여과 필터에의 통과성을 갖는 투명한 용액으로 될 수 있다.
따라서, 본 발명 물질의 용액은 필터 여과가 가능하고, 필터 여과에 의한 제진, 제균, 멸균이 가능하게 된다. 즉, 5 μm 혹은 0.45 μm의 필터를 통과시킴으로써 제진, 제균이 가능해지고, 더욱 바람직하게는 0.22 μm의 필터를 통과시킴으로써 멸균하는 것도 가능하게 된다.
보다 구체적으로는, 본 발명 물질을 1.0 중량%로 수성 매체에 용해하여 얻어지는 용액이, 24℃의 온도 조건 하에, 5.0 kg/cm2의 가압 하에서 다공질 필터(구멍 직경(포어 사이즈) 0.45 μm, 직경 25 mm)를 1분 동안에 2 mL 이상 통과 가능한 것 이 바람직하다.
또한, 본 발명 물질을 1.0 중량%로 수성 매체에 용해하여 얻어지는 용액이, 상기와 같은 조건에서, 다공질 필터(구멍 직경(포어 사이즈) 0.22 μm, 직경 25 mm)를 1분 동안에 2 mL 이상 통과 가능한 것이 한층 더 바람직하다.
후술하는 것과 같이 본 발명 물질을 생체(포유동물, 특히 인간이 바람직함)에 적용하는 약제로서 이용하는 경우, 제진 및 살균, 멸균은 필수 사항이 되기 때문에, 본 발명 물질의 이와 같은 특성은 매우 유용하다. 또한, 가열이나 자외선 조사 등에 의한 멸균에 있어서는, 히알루론산 유도체의 분해나 저분자화 등이 우려되지만, 여과 멸균에 있어서는 그와 같은 문제는 피할 수 있다.
본 발명 약제란, 본 발명 물질인 히알루론산 유도체를 유효 성분으로서 함유하는 약제이다. 본 발명 약제는 전술한 것과 같은 본 발명 물질의 특성을 살려, 주사구(주입구) 등에 의해 압출할 수 있는 형태를 취하는 것이 가능하며, 수성 매체에 본 발명 물질을 용해한 용액으로서도 이용된다. 예컨대, 생체 내에 투여할 수 있는 생리식염수, 인산 완충 생리식염수 또는 주사용수를 용매로 하여, 0.1 중량%∼10 중량%의 본 발명 물질 농도를 갖는 용액을 들 수 있다. 이 용액은 탁하지 않고 투명한 것이 바람직하다.
전술한 것과 같이 본 발명 약제는, 필터 여과에 의한 제진, 제균, 멸균이 가능하다. 5 μm 혹은 0.45 μm의 필터를 통과시킴으로써 제진, 제균이 가능하게 되고, 0.22 μm의 필터를 통과시킴으로써 멸균하는 것도 가능하게 된다. 또한, 본 발명 약제는, 본 발명 약제가 갖는 여과 멸균 가능하다고 하는 이점을 손상하지 않는 범위에서, 본 발명 물질과 제약상 허용될 수 있는 담체와 조합하여 사용하는 것도 가능하다.
이와 같이 조제된 본 발명 약제는 여과 멸균을 적용할 수 있고, 또한, 점탄성을 어느 정도 갖고 있는 상태인 것이 바람직하다.
본 발명 약제는, 비경구 투여용 약제나 국소 투여용 약제로서 이용하는 것이 가능하다. 비경구 투여 및 국소 투여에 이용하는 형태로서는, 전술한 본 발명 물질을 수성 용매에 용해한 용액이 바람직하며, 주사나 주입 등의 투여 방법을 바람직하게 들 수 있다(본 명세서 중에서는, 「주입」이 「주사」를 포함하는 경우도 있음). 주입에 의해 국소 투여를 함으로써, 소화기계에서의 부작용을 피할 수 있다. 또한, 소화기계에 의한 대사도 피할 수 있기 때문에, 경구 투여보다 투여량을 감소시키는 것이 가능하며, 나아가서는, 대량의 경구 투여에 의한 전신성 독성의 문제도 피할 수 있다.
주사나 주입 등에 있어서 이용되는 압출 장치는, 충전되어 있는 약제를 압출함으로써 투여하는 것을 목적으로 하는 통상 이용되고 있는 주사기나 주입구 등의 기구를 이용하는 것이 가능하다.
한편, 본 발명 약제나 본 발명 물질의 용액이 약제 압출용 플런저 등을 구비한 압출 가능한 주입구 내에 충전된 키트도 제공 가능하다. 또한, 이 키트는, 본 발명 물질을 약학적으로 허용되는 인산 완충 생리식염수, 생리식염수 또는 주사용수에 용해한 용액을 주사통에 충전하여, 약제 압출용 플런저로 미끄럼 이동 가능하게 밀봉하여 이루어지는 의료용 주사제 키트로 하는 것이 가능하다. 한편, 약제 압 출용 플런저는 통상 이용되고 있는 것을 이용하는 것이 가능하지만, 고무 또는 합성 고무 등의 탄성체에 의해서 형성되어, 시린지에 미끄럼 이동이 가능하게 밀착 상태로 삽입된다. 또한, 키트에는 플런저를 집어넣기 조작하여, 약제를 압출하기 위한 플런저 로드도 포함되어 있더라도 좋다.
본 발명 약제의 대상 질환, 투여 루트는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 관절증의 처치, 염증의 억제나 동통의 억제 등을 목적으로 하는 처치제(이하, 본 발명 처치제라고도 함)로서 이용하는 것이 가능하며, 바람직하다. 한편, 본 명세서에 있어서 「처치제」란, 치료에만 이용되는 「치료제」뿐만 아니라, 예방이나 증상의 완화 목적으로 사용되는 약제도 포함한다.
본 발명 처치제는, 후술하는 것과 같이 NSAIDs 등의 항염증 화합물의 서방 작용이나 약품 송달 시스템(Drug Delivery System) 작용을 가질 뿐만 아니라, 관절증의 처치에 있어서, 항염증 화합물에 의한 치료 효과 이외에도, 현재 임상에서 이용되고 있는 히알루론산 제제에 의한 관절증에의 효과도 동시에 기대할 수 있다.
또한, 본 발명 처치제의 투여량은 투여 루트, 투여 형태, 사용 목적, 투여 대상이 되는 동물의 구체적 증상, 연령, 체중 등에 따라서, 치료 효과가 가장 적절하게 발휘되도록 개별적으로 결정되어야 하는 사항이며, 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 인간용의 주사제인 경우, 히알루론산 유도체로서, 성인 1명 1회당 1 mg∼1,000 mg 정도, 바람직하게는 5 mg∼500 mg 정도, 보다 바람직하게는 10 mg∼100 mg 정도를 들 수 있다. 그러나, 본 발명 처치제의 작용의 강함에는, 유효 성분인 본 발명 물질에 이용되고 있는 NSAIDs 또는 DMARD 자체가 갖는 약효의 세기가 크게 영향을 준다고 생각되기 때문에, 반드시 상기 범위가 적합하다고는 할 수 없으며, NSAIDs 또는 DMARD 단일체로 환산한 용량을 고려하여 설정할 필요가 있다. 또한, 후술하는 실시예에 있어서 나타내어져 있는 것과 같이, 본 발명 약제는 NSAIDs 단일체를 투여하는 경우와 달리, 투여 부위에 안정적으로 또 지속적으로 존재하기 때문에, 이 점도 고려하여 설정할 필요가 있다.
본 발명 처치제의 적용 부위는 비경구 투여에 의해 투여 가능한 부위라면 특별히 한정되지 않지만, 그 중에서도 관절이 바람직하며, 무릎 관절, 어깨 관절, 고관절, 턱관절 등이 특히 바람직하다. 특히 변형성 무릎 관절증(OA) 및 류머티스성 무릎 관절증(RA)에의 적용이 바람직하다.
한편, 본 발명 약제를 관절증의 처치제로서 이용할 때는, 전술한 것과 같이 관절에의 주입(주사)제로서 적정한 농도를 적절하게 선택할 수 있지만, 용액의 농도로는 0.3∼3.0 중량%가 바람직하고, 0.5∼1.5 중량%가 보다 바람직하다.
본 발명 약제의 가장 바람직한 하나의 형태로서는 이하의 구성을 들 수 있다.
NSAID : 상기 화학식 2으로 표시되는 화합물
스페이서 및 결합 형태 : 아미노알킬알콜이 NSAID와 에스테르 결합, 히알루론산과 아미드 결합으로 결합
히알루론산의 분자량 : 중량 평균 분자량 500,000∼3,000,000
NSAID의 도입율 : 히알루론산 2당 단위당 5∼50 몰%
농도 및 용매 : 0.3∼3.0 중량% 농도의 인산 완충 생리식염 수용액
제공 상태 : 멸균 상태로 시린지에 충전되어 있음
더욱이, NSAID로서는, 상기 화학식 7으로 표시되는 화합물이 보다 바람직하며, 상기 화학식 8) 및 상기 화학식 9으로 표시되는 화합물이 더욱 바람직하고, 그 중에서도 디클로페낙 또는 그 유도체가 보다 바람직하다. 스페이서로서는 아미노프로필알콜 또는 아미노에틸알콜에서 선택되면 보다 바람직하다.
도입율로서는, 히알루론산 2당 단위당 10∼50 몰%가 보다 바람직하다.
또한, 5 μm 혹은 0.45 μm의 필터 여과가 가능하고, 나아가서는, 0.22 μm의 필터 여과가 가능하다면 가장 바람직하다.
후술하는 실시예에서 나타내어지는 것과 같이, 본 발명 약제는 관절증의 처치제, 특히 관절증 처치용의 관절 주입제로서 이용하는 것이 특히 적합하다. 예컨대, 관절강 내에 NSAIDs 등의 저분자 화합물을 직접 주입한 경우는, 이들 화합물은 즉시 활막을 통과하여 혈중으로 이행하기 때문에, 큰 효과는 기대할 수 없다.
한편, 본 발명 물질인 NSAIDs를 공유 결합으로써 도입한 NSAIDs 도입 히알루론산 유도체의 용액을 관절강 내에 투여한 경우는, 상기와 같이 저분자 화합물 단일체에서는 활막에 있어서 대사가 빠름에도 불구하고, 후술하는 실시예에서 나타내어지는 것과 같이 활막 조직에서 NSAIDs가 지속적으로 존재한다. 일반적으로 알려져 있는 것과 같이 히알루론산은 활막에의 친화성을 지니므로, 본 발명 약제는 히알루론산과 NSAIDs가 결합한 상태일수록 활막 내에 멈춰, 조직 혹은 세포에 서서히 받아들여진 후, NSAIDs가 히알루론산으로부터 유리되어 작용한다고 추측된다. 즉, 본 발명 약제의 투여에서는, NSAIDs는 바로 혈중으로 이행하지 않고, 지속적으로 관절액이나 활막 조직에 NSAIDs가 존재하고 있기 때문에, 지속적 효과를 보인다고 추측된다.
이로써, 본 발명 약제는, 히알루론산과 스페이서 화합물과의 결합이 NSAIDs와 스페이서 화합물과의 결합보다 생체 내에서의 분해에 내성을 보이는 것이 바람직하다. 또한, NSAIDs와 스페이서 화합물의 결합 부분은 관절강 내에서는 분해되지 않고, 활막에 받아들여진 후, 활막 조직 내에서 분해되는 형태가 바람직하다. NSAIDs와 스페이서 화합물 및 히알루론산과 스페이서 화합물과의 결합 양식을 바꿈으로써, 생분해에의 내성을 바꿀고 있고, 이에 따라 유리 용이성이나 유리 속도를 컨트롤하는 것도 가능하게 된다. 예컨대, 생체 내에서 발생하는 가수분해를 생각한 경우, 에스테르 결합은 아미드 결합에 비하여 분해를 받기 쉽다. 이 때문에, 히알루론산과 아미드 결합, NSAIDs와 에스테르 결합에 의해 결합하는 스페이서를 선택한 경우, 에스테르 결합은 가수분해를 받기 쉽고, 가수분해를 받은 본 발명 물질은 NSAIDs를 유리하여, 작용하게 된다. 본 발명 약제는 서방용 제제도 가능하다.
한편, 후술하는 실시예에서는, 히알루론산과 스페이서 화합물을 아미드 결합으로 결합하고, NSAIDs와 스페이서 화합물을 아미드 결합 또는 에스테르 결합으로 한 본 발명 물질 2종류를 각각 투여한 바, NSAIDs와 스페이서 화합물이 에스테르 결합한 본 발명 물질 쪽이 보다 현저한 동통 억제 효과를 보였다.
NSAIDs에 의한 관절증에 동반되는 염증이나 동통의 억제에는, 표적 세포 내의 시클로옥시게나아제(COX) 억제 활성에 의한 프로스타그란딘의 산출 억제가 기서로 되어 있음이 알려져 있다. COX-2 억제 작용의 평가를 위한 범용 방법인 Chemiluminescent COX Inhibitor Screening Assay kit(Cayman사 제조)를 이용하여 본 발명 물질의 평가를 했다. 그 결과, NSAIDs 단일체가 분명히 COX-2 억제 작용을 보인 투여량과 NSAIDs 환산으로 단일체 투여량에 상당하는 양의 NSAIDs를 함유하는 본 발명 물질 1의 투여량에 있어서도, 본 발명 물질 1에는 COX-2 억제 작용은 확인되지 않았다.
이 in vitro에서의 평가에 의해, 여러 가지 조건이나 상태가 관여하는 생체내 투여에서의 거동에 일률적으로 적용할 수는 없지만, 본 발명 약제가, 작용 부위에 있어서 NSAIDs를 유리하는 쪽이 보다 적합하다는 것은 분명하게 추측된다.
또한, 본 발명 물질은, 저분자 화합물이기 때문에 단독 투여에서는 생체내 대사가 빨리, 효율적으로 표적 부위(세포)로 송달하기 어려운 것이 알려져 있는 NSAIDs 또는 DMARD의 약품 송달 시스템(DDS) 기재로서도 유용하다. 본 발명의 NSAIDs 또는 DMARD 도입 히알루론산 유도체의 형태로, NSAIDs 또는 DMARD를 표적 세포까지 송달하고, 또한 그 형태로 세포 내에 받아들여져, 지속적으로 표적 부위에 존재시키는 것은, 대사의 영향을 저감하여, 효율적인 효과를 얻기 위해서는 매우 중요하다.
본 발명 물질을 이용함으로써, 약제의 단독 투여보다도, 투여 부위에 있어서 치료에 유효한 약제량이 효율적으로 유지되기 때문에, 경구 투여보다 훨씬 미량으로 훨씬 강력한 치료 효과를 기대할 수 있다. 또한, 효과의 서방성 및 지속성의 상승도 도모할 수 있기 때문에, 임상에 있어서 투여 횟수의 감소 등도 기대할 수 있다.
<실시예>
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 상세히 설명한다. 그러나, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위의 한정을 의도하는 것은 아니다.
한편, 이하의 실시예에 있어서, 히알루론산 및 히알루론산나트륨은 전부 세이가가쿠고교 주식회사 제조의 것을 이용했다.
이하, 특별히 거절이 없는 한, 이하의 실시예에서는 인산 완충 생리식염수(PBS)로서, 5 mM의 PBS를 이용했다.
<시험예> 필터 통과성 시험
1.0 중량%로 피험 물질을 용해한 PBS를 조제했다. 24℃ 조건 하에, 5.0 kg/cm2의 가압 하에서 0.45 μm 다공질 필터(직경 25 mm)에 하기 실시예에서 조제한 피험 물질의 용액을 통과시켜, 1분 동안의 통과량(mL)을 측정했다. 2 mL 이상 통과한 경우를 「A」, 2 mL 미만 통과한 경우를 「B」, 통과하지 않는 경우를 「C」로 나타낸다.
<제조예>
(참고예 1) t-부톡시카르보닐-아미노프로판올(Boc-NH(CH2)3OH)(Boc-아미노프로판올)의 합성
아미노프로판올 1.542 g(20.5 mmol)을 디클로로메탄 10 mL에 용해하고, 빙냉 하에 디-t-부틸-디카르보나이트(Boc2O) 4.484 g(20.5 mmol)/디클로로메탄 용액 10 mL을 천천히 적하했다. 그 후 반응액을 실온으로 되돌려, 2시간 40분 교반하여, 원 료의 소실을 박층 크로마토그래피(TLC)로 확인한 후, 디클로로메탄을 감압유거했다. 반응은 정량적으로 진행하고, 수량 3.92 g으로 오일형 물질을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.46(9H, s, Boc), 1.66(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.27(3H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.66(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.91(1H, br, CH2 OH)
(실시예 1) 아미노프로판올-케토프로펜염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-케토프로펜의 합성
Boc-아미노프로판올 2.371 g(13.5 mmol)과 케토프로펜 3.441 g(13.5 mmol)(도쿄가세이고교 주식회사 제조)를 디클로로메탄 14 mL에 용해하여, 빙냉 하에서 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 323 mg(2.6 mmol), 수용성 카르보디이미드염산염(WSCI·HCl) 2.833 g(14.8 mmol)/디클로로메탄 14 mL을 순차 가했다. 실온으로 되돌려, 한 낮과 밤 교반한 후, 디클로로메탄을 감압유거하고, 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산으로 2회, 물, 5% 중조로 2회, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 아세트산에틸을 감압유거하여, 표기 화합물을 5.430 g(수율 98%)로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.43(9H, s, Boc), 1.54(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.77(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.09(2H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.82(1H, q, -OCOCH(CH3)-), 4.15(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.69(1H, br, -NHCH2-), 7.42-7.83(9H, m, Aromatic H)
2) 아미노프로판올-케토프로펜염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-케토프로펜 5.330 g(12.95 mmol)에 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 20 mL을 가하고, 빙냉 하에서 15분, 실온에서 2시간 교반했다. Boc-아미노프로판올-케토프로펜의 소실을 TLC로 확인한 후, 용매를 감압유거하여, 잔사를 디에틸에테르로 2회 따라버리기(decantation)했다. 그 후, 감압 건조하여 표기 물질을 정량적으로 수량 4.569 g으로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.50(5H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 2.08(2H, m, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.04(2H, br, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.82(1H, q, -OCOCH(CH3)-), 4.16(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 7.36-7.80(9H, m, Aromatic H), 8.20(br, H 3 N + CH2-)
(실시예 2) 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산나트륨 200 mg(0.5 mmol/2당 단위)을 물 22.5 mL/디옥산 22.5 mL에 용해시킨 후, 2M 히드록시호박산이미드(HOSu) 수용액 0.25 mL, 1 mol/L WSCI·HCl 수용액 0.25 mL, 실시예 1에서 얻어진 0.5M 아미노프로판올-케토프로펜염산염 수용액 0.5 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반 응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액 3 mL 가하여, 3시간 20분 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 86 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 800 mg을 가하여 교반했다. 에탄올 200 mL에 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 2회 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 198 mg의 백색 고체를 얻었다. HPLC에 의한 케토프로펜의 도입율은 15.5%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여, 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 3) 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산 400 mg(1.0 mmol/2당 단위)을 물 45 mL/디옥산 45 mL에 용해시킨 후, HOSu 1.66 mmol/물 1 mL, WSCI·HCl 0.83 mmol/물 1 mL, 실시예 1에서 얻어진 아미노프로판올-케토프로펜염산염 0.83 mmol/물 4 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 탄산수소나트륨 300 mg/물 1 mL 가하여, 3시간 10분 교반했다. 반응액에 아세트산 86 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 400 mg을 가하여 교반했다. 에탄올 300 mL을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 2회 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 246 mg의 백색 고체를 얻었다. HPLC에 의한 케토프로펜의 도입율은 26.3%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여, 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 4) 아미노프로판올-나프록센염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-나프록센의 합성
Boc-아미노프로판올 350 mg(2 mmol)과 나프록센 462 g(2 mmol)(와코쥰야쿠고교 주식회사 제조)를 디클로로메탄 2 mL에 용해하여, 빙냉 하에서 DMAP 48 mg(0.4 mmol), WSCI·HCl 422 g(2.2 mmol)/디클로로메탄 2 mL을 순차 가했다. 실온으로 되돌려, 4시간 50분 교반한 후, 디클로로메탄을 감압유거하고, 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산으로 2회, 물, 5% 중조로 2회, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 아세트산에틸을 감압유거하여, 표기 화합물을 720 mg(수율 93%)의 백색 결정으로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm) =1.42(9H, s, Boc), 1.58(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.75(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.07(2H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.85(1H, q, -OCOCH(CH3)-), 3.91(3H, s, -OCH 3 ), 4.13(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.63(1H, br, -NHCH2-), 7.09-7.75(6H, m, Aromatic H)
2) 아미노프로판올-나프록센염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-나프록센 684 mg(1.76 mmol)을 디클로로메탄 1 mL 용해에 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 2 mL을 가하여, 빙냉 하에서 20분간, 실온에서 1시간 교반했다. Boc-아미노프로판올-나프록센의 소실을 TLC로 확인한 후, 디에틸에테르를 가하여, 3회 따라버리기를 했다. 그 후, 감압 건조하여 표기 물질을 정량적으로 수량 564 mg으로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했 다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3+CD3OD) δ(ppm)=1.57(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 2.02(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 2.88(2H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.87(1H, q, -OCOCH(CH3)-), 3.90(3H, s, -OCH 3 ), 4.17(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 7.08-7.73(6H, m, Aromatic H), 8.10(br, H 3 N + CH2-)
(실시예 5) 아미노프로판올-나프록센 도입 히알루론산나트륨의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산나트륨 100 mg(0.25 mmol/2당 단위)을 물 11.5 mL/디옥산 11.5 mL에 용해시킨 후, HOSu(0.2 mmol)/물 0.1 mL, WSCI·HCl(0.1 mmol)/물 0.1 mL, 실시예 4에서 얻어진 아미노프로판올-나프록센염산염(0.1 mmol)/물 0.3 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액 1.5 mL 가하여, 3시간 35분 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 43 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 500 mg을 가하여 교반했다. 에탄올 50 mL을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 95 mg의 백색 고체를 얻었다. HPLC에 의한 나프록센의 도입율은 13.1%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여, 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 6) 아미노프로판올-이부프로펜염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-이부프로펜의 합성
Boc-아미노프로판올 352 mg(2 mmol)과 이부프로펜 412 g(2 mmol)(와코쥰야쿠고교 주식회사 제조)를 디클로로메탄 2 mL에 용해하여, 빙냉 하에서 DMAP 48 mg(0.4 mmol), WSCI·HCl 423 g(2.2 mmol)/디클로로메탄 2 mL을 순차 가했다. 실온으로 되돌려, 한 낮과 밤 교반한 후, 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산으로 2회, 물, 5% 중조로 2회, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 아세트산에틸을 감압유거하여, 표기 화합물을 665 mg(수율 91%)로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=0.88(6H, d, -CH(CH 3 ) 2 ), 1.44(9H, s, Boc), 1.49(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.75(2H, m, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 1.85(1H, m, -CH2 CH(CH3)2), 2.45(2H, d, -CH 2 CH(CH3)2), 3.05(2H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.69(1H, q, -OCOCH(CH3)-), 4.13(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.63(1H, br, -NHCH2-), 7.07-7.21(4H, m, Aromatic H)
2) 아미노프로판올-이부프로펜염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-이부프로펜 636 mg(1.75 mmol)을 디클로로메탄에 1 mL 용해하고, 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 4 mL을 가하여, 빙냉 하에서 10분간, 실온으로 3시간 교반했다. Boc-아미노프로판올-이부프로펜의 소실을 TLC로 확인한 후, 디에틸에테르를 가하여, 3회 따라버리기를 했다. 그 후, 감압 건조하여 표기 물질을 수량 406 mg(77%으로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=0.89(6H, d, -CH(CH 3 ) 2 ), 1.47(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.83(1H, m, -CH2 CH(CH3)2), 2.08(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 2.44(2H, d, -CH 2 CH(CH3)2), 3.01(2H, t, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.71(1H, q, -OCOCH(CH3)-), 4.11-4.27(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 7.06-7.20(4H, m, Aromatic H), 8.25(br, H 3 N + CH2-)
(실시예 7) 아미노프로판올-이부프로펜 도입 히알루론산나트륨의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산나트륨 100 mg(0.25 mmol/2당 단위)을 물 11.5 mL/디옥산 11.5 mL에 용해시킨 후, HOSu(0.2 mmol)/물 0.1 mL, WSCI·HCl(0.1 mmol)/물 0.1 mL, 실시예 6에서 얻어진 아미노프로판올-이부프로펜염산염(0.1 mmol)/물 0.3 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액 1.5 mL을 가하여, 3시간 35분 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 43 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 500 mg을 가하여 교반했다. 에탄올 50 mL을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 93 mg의 백색 고체를 얻었다. HPLC에 의한 이부프로펜의 도입율은 16.4%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여, 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험 은 「A」였다.
(실시예 8) 아미노프로판올-플루르비프로펜염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-플루르비프로펜의 합성
Boc-아미노프로판올 352 mg(2 mmol)과 플루르비프로펜 489 g(2 mmol)(와코쥰야쿠고교 주식회사 제조)를 디클로로메탄 2 mL에 용해하여, 빙냉 하에서 DMAP 48 mg(0.4 mmol), WSCI·HCl 423 g(2.2 mmol)/디클로로메탄 2 mL을 순차 가했다. 실온으로 되돌려, 한 낮과 밤 교반한 후, 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산으로 2회, 물, 5% 중조로 2회, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 아세트산에틸을 감압유거하여, 표기 화합물을 753 mg(수율 94%으로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.26(9H, s, Boc), 1.54(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.80(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.13(2H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.76(1H, q, -OCOCH(CH3)-), 4.15(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.66(1H, br, -NHCH2-), 7.10-7.55(9H, m, Aromatic H)
2) 아미노프로판올-플루르비프로펜염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-플루르비프로펜 720 mg(1.79 mmol)을 디클로로메탄 1 mL에 용해하고, 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 4 mL을 가하여, 빙냉 하에서 3분간, 실온으로 3시간 10분 교반했다. Boc-아미노프로판올-플루르비 프로펜의 소실을 TLC로 확인한 후, 디에틸에테르를 가하여, 2회 따라버리기를 했다. 그 후, 감압 건조하여 표기 물질을 수량 352 mg(94%으로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.51(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 2.10(2H, quant, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.05(2H, t, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.76(1H, q, -OCOCH(CH3)-), 4.13-4.29(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 7.07-7.53(9H, m, Aromatic H), 8.27(br, H 3 N + CH2-)
(실시예 9) 아미노프로판올-플루르비프로펜 도입 히알루론산나트륨의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산나트륨 100 mg(0.25 mmol/2당 단위)을 물 11.5 mL/디옥산 11.5 mL에 용해시킨 후, HOSu(0.2 mmol)/물 0.1 mL, WSCI·HCl(0.1 mmol)/물 0.1 mL, 상기 실시예 8에서 얻어진 아미노프로판올-플루르비프로펜염산염(0.1 mmol)/물 0.3 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액 1.5 mL을 가하여, 3시간 35분 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 43 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 500 mg을 가하여 교반했다. 에탄올 50 mL을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 94 mg의 백색 고체를 얻었다. HPLC에 의한 플루르비프로펜의 도입율은 21.1%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 10) 아미노프로판올-아세틸살리실산염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-아세틸살리실산의 합성
Boc-아미노프로판올(2.11 mmol), 아세틸살리실산(2.11 mmol)(와코쥰야쿠고교 주식회사 제조), DMAP(0.42 mmol)을 디클로로메탄-디옥산(2:1,6 ml)에 용해하고, 빙냉 하에서 WSCI·HCl(2.35 mmol)을 가했다. 실온으로 되돌려, 한 낮과 밤 교반한 후, 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 아세트산에틸을 감압유거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=3:1, 0.5% 트리에틸아민)로 정제하여, 표기 화합물(298.0 mg, 수율 48%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.44(9H, s, Boc), 1.90-1.96(2H, m, BocHNCH2 CH 2 CH2O-), 2.35(3H, s, -COCH 3 ), 3.24-3.28(2H, m, BocHNCH 2 CH2CH2O-), 4.35(2H, t, BocHNCH2CH2 CH 2 O-), 4.78(1H, s, NH), 7.11(1H, dd, Aromatic), 7.32(1H, td, Aromatic), 7.55-7.59(1H, m, Aromatic), 8.01(1H, dd, Aromatic)
2) 아미노프로판올-아세틸살리실산염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-아세틸살리실산(0.814 mmol)을 디클로로메탄(1 ml)에 용해하고, 빙냉 하에서 4N 염산/아세트산에틸(3 ml)을 가하여 2시간 교반했다. Boc-아미노프로판올-아세틸살리실산의 소실을 TLC로 확인한 후, 디에틸 에테르를 가했다. 생긴 침전을 원심 분리하여, 상청을 따라버리기했다. 얻어진 침전을 감압 건조하여, 표기 화합물 213.9 mg(수율 96%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=2.22(2H, t, H2NCH2 CH 2 CH2O-), 2.35(3H, s, -COCH 3 ), 3.13(2H, t, H2NCH 2 CH2CH2O-), 4.41(2H, t, H2NCH2CH2 CH 2 O-), 7.09(1H, dd, Aromatic), 7.31(1H, dt, Aromatic), 7.56(1H, dt, Aromatic), 7.99(1H, dd, Aromatic)
(실시예 11) 아미노프로판올-아세틸살리실산 도입 히알루론산의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산(100 mg) 0.25 mmol/2당 단위를 물-디옥산(1:1)에 용해하고, 2 mol/L HOSu(0.1 ml), 1 mol/L WSCI·HCl(0.1 ml), 상기 실시예 10에서 얻어진 아미노프로판올-아세틸살리실산염산염(0.10 mmol)의 물-디옥산(1:1) 용액(2 ml)을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액(1.5 ml)을 가하여 3시간 교반했다. 50% 아세트산 수용액(43 μl)을 가하여 중화한 후, 염화나트륨(0.4 g)을 가하여 교반했다. 에탄올(100 ml)을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올 수용액, 에탄올, 디에틸에테르로 각 2회 순차 세정했다. 그 후 감압 건조하여, 표기 화합물(97.7 mg)을 얻었다. 흡광 광도법에 의한 아세틸살리실산의 도입율은, 13.5%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 12) 아미노프로판올-펠비낙염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-펠비낙의 합성
Boc-아미노프로판올(2.04 mmol), 펠비낙(2.04 mmol)(Aldrich Chem. Co. 제조), DMAP(0.41 mmol)을 디옥산(7 ml)에 용해시킨 후, 빙냉 하에서 WSCI·HCl(2.35 mmol)의 디옥산-디클로로메탄(3:4) 용액(7 ml)을 가했다. 반응액에 디메틸포름아미드(DMF)(3 ml)를 가하여 맑게 한 후, 실온으로 되돌려, 한 낮과 밤 교반했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 용매를 감압유거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=3:1, 0.5% 트리에틸아민으로 정제하여, 표기 화합물(623.0 mg, 수율 83%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.44(9H, s, Boc), 1.80-1.85(2H, m, BocHNCH2 CH 2 CH2O-), 3.15-3.19(2H, m, BocHNCH 2 CH2CH2O-), 3.67(2H, s, PhCH 2 -), 4.18(2H, t, BocHNCH2CH2 CH 2 O-), 4.67(1H, s, NH), 7.34-7.59(9H, m, Aromatic)
2) 아미노프로판올-펠비낙염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-펠비낙(1.69 mmol)을 디클로로메탄(1 ml)에 용해하여, 빙냉 하에서 4N 염산/아세트산에틸(3 ml)을 가했다. 실온으로 되돌려 2시간 교반했다. Boc-아미노프로판올-펠비낙의 소실을 TLC로 확인한 후, 디에틸에테르를 가하여, 생긴 침전을 원심 분리했다. 얻어진 침전을 디에틸에테르로 3회 따라버리기를 한 후 감압 건조하여, 표기 화합물(511.7 mg, 수율 99%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3:CD3OD=1:1)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3:CD3OD=1:1) δ(ppm)=1.98-2.04(2H, m, H2NCH2 CH 2 CH2O-), 2.95(2H, t, H2NCH 2 CH2CH2O-), 3.73(2H, s, -PhCH 2 -), 4.23(2H, t, H2NCH2CH2 CH 2 O-), 7.33-7.59(9H, m, Aromatic)
(실시예 13) 아미노프로판올-펠비낙 도입 히알루론산의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산(200 mg) 0.5 mmol/2당 단위를 물-디옥산(1:1, 45 ml)에 용해하고, 2 mol/L HOSu(0.25 ml), 1 mol/L WSCI·HCl(0.25 ml), 실시예 12에서 얻어진 0.5M 펠비낙-프로판올아민염산염 수용액(0.5 ml)을 순차 가하여 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액(3 ml)을 가하여 3시간 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 수용액(86 μl)을 가하여 중화한 후, 염화나트륨(0.8 g)을 가하여 교반했다. 에탄올(200 ml)을 가하여 교반했다. 생긴 침전을 원심 분리하여, 얻어진 침전을 80% 에탄올 수용액, 에탄올, 디에틸에테르로 각 2회 순차 세정했다. 이것을 실온에서 밤새 감압 건조하여, 표기 화합물(205.1 mg)을 얻었다. HPLC에 의한 펠비낙의 도입율은 27.8%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필 터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 14) 아미노프로판올-펜부펜염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-펜부펜의 합성
Boc-아미노프로판올(2.18 mmol), 펜부펜(2.18 mmol)(ICN Biochemicals. Inc. 제조), DMAP(0.44 mmol)을 DMF-디클로로메탄(5:3,8 ml)에 용해하고, 빙냉 하에서 WSCI·HCl(2.48 mmol)의 디클로로메탄 용액(5 ml)을 가했다. 서서히 반응 온도를 실온으로 하여, 한 낮과 밤 교반했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 용매를 감압유거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:아세트산에틸=40:1, 0.5% 트리에틸아민)로 정제하여, 표기 화합물(747.8 mg, 수율 83%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.44(9H, s, Boc), 1.82-1.87(2H, m, BocHNCH2 CH 2 CH2O-), 2.79(2H, t, -COC 2 H 4 CO-), 3.20-3.24(2H, m, BocHNCH 2 CH2CH2O-), 3.36(2H, t, -COC 2 H 4 CO-) 4.19(2H, t, BocHNCH2CH2 CH 2 O-), 4.76(1H, s, NH), 7.39-7.64(5H, m, Aromatic), 7.70(2H, td, Aromatic), 8.06(2H, td, Aromatic)
2) 아미노프로판올-펜부펜염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-펜부펜(1.82 mmol)을 디클로로메탄(4 ml)에 용해하여, 빙냉 하에, 4N 염산·아세트산에틸 용액(4 ml)을 가하고, 그 후 서서 히 실온으로 하여 90분간 교반했다. 반응 개시 직후에, 백색 침전의 석출이 보였다. Boc-아미노프로판올-펜부펜의 소실을 TLC로 확인한 후, 반응액에 디에틸에테르를 가하여, 백색 침전을 원심 분리했다. 침전을 디에틸에테르로 3회 세정한 후 감압 건조하여, 표기 화합물(621.4 mg, 수율 98%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3:CD3OD=1:1)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3:CD3OD=1:1) δ(ppm)=2.01-2.07(2H, m, H2NCH2 CH 2 CH2O-), 2.79(2H, t, -COC 2 H 4 CO-), 3.05(2H, t, H2NCH 2 CH2CH2O-), 3.44(2H, t, -COC 2 H 4 CO-), 4.26(2H, t, H2NCH2CH2 CH 2 O-), 7.41-7.50(3H, m, Aromatic), 7.66(dd, 2H, Aromatic), 7.75(d, 2H, Aromatic), 8.08(d, 2H, Aromatic)
(실시예 15) 아미노프로판올-펜부펜 도입 히알루론산의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산(200 mg) 0.5 mmol/2당 단위의 물-디옥산(1:1, 45 ml)에 용해시킨 후, 2 mol/L HOSu(0.25 ml), 1 mol/L WSCI·HCl(0.25 ml), 실시예 14에서 얻어진 아미노프로판올-펜부펜염산염(0.25 mmol)의 물-디옥산(25:8) 용액(0.66 ml)을 가하여 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액(3 ml)을 가하여 3시간 교반했다. 50% 아세트산 수용액(86 μl)을 가하여 중화한 후, 염화나트륨(0.8 g)을 가하여 교반했다. 에탄올(200 ml)을 가하여 교반했다. 생긴 침전을 원심 분리하여, 얻어진 침전을 80% 에탄올 수용액, 에탄올, 디에틸에테르로 각 2회 세정했다. 감압 건조하여, 표기 화합물(214.1 mg)을 얻었다. HPLC에 의한 펜부펜의 도입율은 23.8%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 16) 아미노프로판올-메페남산염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-메페남산
Boc-아미노프로판올(0.616 mmol), 메페남산(0.620 mmol)(와코쥰야쿠고교 주식회사 제조), DMAP(0.126 mmol)을 디클로로메탄(3 ml)에 용해하고, 빙냉 하에서 WSCI·HCl(0.758 mmol)의 디클로로메탄 용액(1.5 ml)을 가했다. 서서히 반응 온도를 실온으로 하여, 한 낮과 밤 교반했다. 재차 반응액을 빙냉하고, WSCI·HCl(0.207 mmol)의 디클로로메탄 용액(1 ml)을 가하여 서서히 실온으로 하면서 5시간 교반했다. 반응액에 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 용매를 감압유거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=6:1, 0.5% 트리에틸아민)로 정제하여, 표기 화합물(190.4 mg, 수율 78%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.45(9H, s, Boc), 1.96-2.01(2H, m, BocHNCH2 CH 2 CH2O-), 2.18(3H, s, PhCH 3 ), 2.33(3H, s, PhCH 3 ), 3.31-3.32(2H, m, BocHNCH 2 CH2CH2O-), 4.38(2H, t, BocHNCH2CH2 CH 2 O-), 4.78(1H, s, NH), 6.64-6.67(1H, m, Aromatic), 6.74(1H, dd, Aromatic), 7.02-7.26(4H, m, Aromatic), 7.94(1H, dd, Aromatic), 9.24(1H, s, -PhNHPh-)
2) 아미노프로판올-메페남산염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-메페남산(0.462 mmol)을 디클로로메탄(0.5 ml)에 용해하고, 빙냉 하에서 4N 염산/아세트산에틸(1.5 ml)을 가하여 3시간 교반했다. Boc-아미노프로판올-메페남산의 소실을 TLC로 확인한 후, 반응액에 디에틸에테르를 가하여, 생긴 침전을 원심 분리했다. 얻어진 침전을 디에틸에테르로 세정한 후 감압 건조하여, 표기 화합물(154.4 mg, qu.)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=2.16(3H, s, PhCH 3 ), 2.25-2.30(2H, m, H2NCH2 CH 2 CH2O-), 2.31(3H, s, PhCH 3 ), 3.20(2H, t, H2NCH 2 CH2CH2O-), 4.44(2H, t, H2NCH2CH2 CH 2 O-), 6.63-6.66(1H, m, Aromatic), 6.70-6.72(1H, dd, Aromatic), 7.02(1H, d, Aromatic), 7.09(1H, t, Aromatic), 7.14(1H, d, Aromatic), 7.22-7.25(1H, m, Aromatic), 7.92(1H, dd, Aromatic), 9.17(1H, s, -PhNHPh-)
(실시예 17) 아미노프로판올-메페남산 도입 히알루론산의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산(100 mg) 0.25 mmol/2당 단위를 물-디옥산(1:1, 22.5 ml)에 용해하고, 2 mol/L HOSu(0.1 ml), 1 mol/L WSCI·HCl(0.1 ml), 실시예 16에서 얻어진 아미노프로판올-메페남산염산염(0.10 mmol)의 물-디옥 산(1:1) 용액(2 ml)을 순차 가하여 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액(1.5 ml)을 가하여 4시간 교반했다. 50% 아세트산 수용액(43 μl)을 가하여 중화한 후, 염화나트륨(0.4 g)을 가하여 교반했다. 에탄올(100 ml)을 가하여 교반하고, 생긴 침전을 원심 분리했다. 얻어진 침전을 80% 에탄올 수용액, 에탄올, 디에틸에테르로 각 2회 순차 세정했다. 감압 건조하여, 표기 화합물(101.7 mg)을 얻었다. 흡광 광도법에 의해 산출한 메페남산 도입율은, 17.5%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 18) 아미노프로판올-디클로페낙염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-디클로페낙의 합성
Boc-아미노프로판올 135.8 mg(0.775 mmol)을 디클로로메탄 1 mL에 용해하여, 디클로페낙 229.6 mg(0.775 mmol)(와코쥰야쿠고교 주식회사 제조)의 디클로로메탄 용액 4 mL, DMAP 18.9 mg(0.155 mmol)의 디클로로메탄 용액 1 mL, DMF 0.5 mL을 순차 가하고, 빙냉 하에서 WSCI·HCl 191.4 mg(0.998 mmol)의 디클로로메탄 용액 2 mL을 가하여 서서히 실온으로 하면서 7시간 교반했다. 또한 반응액을 빙냉하고, 추가 조작으로서 디클로페낙 91.9 mg(0.310 mmol)의 디클로로메탄 용액 1 mL, DMAP 7.5 mg(0.061 mmol), WSCI·HCl 70.9 mg(0.370 mmol)의 디클로로메탄 용액 1 mL을 순차 가하여 서서히 실온으로 하면서 교반했다. 이 추가 조작을 합계 5회 행했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액으로 2회, 5% 중조수로 2회, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수한 후, 아세트산에틸을 감압유거했 다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 표기 화합물을 280.2 mg(80%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.44(9H, s, Boc), 1.85(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.16(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.82(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.22(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.68(1H, s, NH), 6.54-7.35(8H, m, Aromatic H, NH)
2) 아미노프로판올-디클로페낙염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-디클로페낙 1019 mg을 디클로로메탄 2 mL에 용해하고, 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 8 mL을 가하여 3시간 교반했다. 디에틸에테르 150 mL을 가하여 침전시키고, 침전을 감압 건조했다. 표기 화합물을 791 mg(90%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=2.13(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.08(2H, t, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.84(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.25(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 6.52-7.33(8H, m, Aromatic H, NH)
(실시예 19) 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨의 합성
중량 평균 분자량 80만의 히알루론산 500 mg(1.25 mmol/2당 단위)를 물 56.3 mL/디옥산 56.3 mL에 용해시킨 후, HOSu(1 mmol)/물 0.5 mL, WSCI·HCl(0.5 mmol)/물 0.5 mL, 상기 실시예 18에서 얻어진 아미노프로판올-디클로페낙염산염(0.5 mmol)/(물:디옥산=1:1, 5 mL)을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액 7.5 mL을 가하여, 3시간 40분 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 215 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 2.5 g을 가하여 교반했다. 에탄올400 ml을 가하여 침전시키고, 침전물을 85% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 2회 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 541 mg의 백색 고체를 얻었다. 분광 광도계에 의한 디클로페낙의 도입율은 18.2%였다.
(실시예 20) 아미노프로판올-에토돌락염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-에토돌락의 합성
Boc-아미노프로판올 178.8 mg(1.02 mmol), 에토돌락 293.8 mg(1.02 mmol)(와코쥰야쿠고교 주식회사 제조), DMAP 23.8 mg(0.20 mmol)을 디클로로메탄 4 mL에 용해하고, 빙냉 하에서 WSCI·HCl 233.8 mg(1.22 mmol)의 디클로로메탄 용액 2 mL을 가하여 서서히 실온으로 하면서 한 낮과 밤 교반했다. 또한 빙냉 하에서 WSCI·HCl 68.8 mg(0.36 mmol)의 디클로로메탄 용액 2 mL을 가하여 서서히 실온으로 하면서 80분간 교반했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액으로 2회, 5% 중조수로 2회, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수한 후, 아세트산에틸을 감압유거했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 표기 화합물을 436.3 mg(96%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=0.83(3H, t, -CH2 CH 3 ), 1.37(3H, t, -CH2 CH 3 ), 1.43(9H, s, Boc), 1.79(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.14(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2O-), 4.10-4.22(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.63(1H, s, NH), 7.00-7.37(3H, m, Aromatic H), 8.97(1H, s, NH)
2) 아미노프로판올-에토돌락염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-에토돌락 421.5 mg(0.948 mmol)을 디클로로메탄 1 mL에 용해하여, 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 3 mL을 가하여 3시간 교반했다. 디에틸에테르, 헥산을 가하여 침전시키고, 침전을 감압 건조했다. 침전을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 표기 화합물을 197.6 mg(55%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=0.81(3H, t, -CH2 CH 3 ), 1.35(3H, t, -CH2 CH 3 ), 1.92-2.17(4H, m, -CH 2 CH3, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 4.12(1H, quant, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.20(1H, quant, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 6.99-7.35(3H, m, Aromatic H), 8.99(1H, s, NH)
(실시예 21) 아미노프로판올-에토돌락 도입 히알루론산나트륨의 합성
중량 평균 분자량 80만의 히알루론산 114 mg(0.285 mmol/2당 단위)을 물 12.8 mL/디옥산 12.8 mL에 용해시킨 후, HOSu(0.228 mmol)/물 0.1 mL, WSCI·HCl(0.114 mmol)/물 0.1 mL, 실시예 20에서 얻어진 아미노프로판올-에토돌락염산염(0.114 mmol)/(물:디옥산=1:1, 2 mL)을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액 1.71 mL을 가하여, 4시간 30분 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 49 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 456 mg을 가하여 교반했다. 에탄올 110 ml을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 2회 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 111 mg의 백색 고체를 얻었다. HPLC에 의한 에토돌락의 도입율은 14.4%였다.
(실시예 22) 아미노프로판올-악타리트염산염의 합성
1) Boc-아미노프로판올-악타리트의 합성
참고예 1에서 얻어진 Boc-아미노프로판올 123.1 mg(0.703 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해하여, 악타리트 136.0 mg(0.704 mmol)의 DMF 용액(1 mL)을 가하고, 빙냉 하에서 DMAP 17.1 mg(0.140 mmol), WSCI·HCl 175.4 mg(0.915 mmol)을 순차 가하여 서서히 실온으로 하면서 한 낮과 밤 교반했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액, 5% 중조수, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수한 후, 아세트산에틸을 감압유거했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 표기 화합물을 203.1 mg(83%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.44(9H, s, Boc), 1.80(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 2.18(3H, s, NAc), 3.14(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.59(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.15(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.66(1H, s, NH), 7.13(1H, s, NH), 7.23(2H, d, Aromatic H), 7.46(2H, d, Aromatic H)
한편, 악타리트는 하기 합성법으로 조제했다.
p-아미노페닐아세트산(와코쥰야쿠고교 주식회사 제조)(1.02 mmol)을 디클로로메탄-메탄올-물(1:3:1, 50 ml)에 용해하고, 빙냉 하에서 무수아세트산(2.12 mmol)을 가하여 서서히 실온으로 하면서 한 낮과 밤 교반했다. 용매를 감압유거하여, 표기 화합물(196.4 mg, 수율 99%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CD3OD) d(ppm)=2.11(3H, s, Ac), 3.55(2H, s, Ph-CH 2 -), 7.21-7.49(4H, m, Aromatic H)
2)아미노프로판올-악타리트염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-악타리트 201.3 mg(0.574 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해하고, 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 3 mL을 가하여 3시간 교반했다. 디에틸에테르를 가하여 침전시키고, 침전을 디에틸에테르로 2회 세정한 후, 감압 건조하여, 표기 화합물을 161.3 mg(98%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CD3OD) δ(ppm)=1.94-1.99(2H, m, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 2.11(3H, s, NAc), 2.94(2H, t, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.63(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.19(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 7.22-7.51(4H, m, Aromatic H)
(실시예 23) 아미노프로판올-악타리트 도입 히알루론산나트륨의 합성
중량 평균 분자량 80만의 히알루론산 100 mg(0.25 mmol/2당 단위)를 물 11.25 mL/디옥산 11.25 mL에 용해시킨 후, HOSu(0.2 mmol)/물 0.1 mL, WSCI·HCl(0.1 mmol)/물 0.1 mL, 실시예 22에서 얻어진 아미노프로판올-악타리트염산염(0.1 mmol)/(물:디옥산=1:1, 2 mL)을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액 1.5 mL을 가하여, 3시간 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 43 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 400 mg을 가하여 교반했다. 에탄올 100 ml을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 97 mg의 백색 고체를 얻었다. HPLC에 의한 악타리트의 도입율은 13.2%였다.
(실시예 24) 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산나트륨 200 mg(0.5 mmol/2당 단위)을 물 23 mL/디옥산 23 mL에 용해시킨 후, HOSu 수용액 0.3 mmol/2 mL, WSCl·HCl 수용액 0.15 mmol/2 mL, 실시예 1에서 얻어진 아미노프로판올-케토프로펜염산염 수용액 1.5 mmol/2 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액을 11.5 mL 채취하고, 염화나트륨 100 mg을 가하여 교반했다. 에탄올 50 mL을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 2회 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 35 mg의 백색 고체를 얻었다. HPLC에 의한 케토프로펜의 도입율은 7.2%였다.
얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「C」였다.
(참고예 2) Boc-세리놀의 합성
세리놀(10.1 mmol)(Aldrich Chem. Co. 제조)을 물-디옥산(1:1, 20 ml)에 용해하고, 빙냉 하에서 Boc2O(10.8 mmol)의 디옥산 용액(15 ml)을 가하여, 실온으로 되돌려 한 낮과 밤 교반했다. 용매를 감압유거했다. 잔사를 헥산으로 세정한 후 감압 건조하여, 표기 화합물(1847 mg, 수율 95%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CD3OD) δ(ppm)=1.44(9H, s, Boc), 3.57-3.58(5H, m, Serinol)
(실시예 25) 세리놀-케토프로펜염산염의 합성
1) Boc-세리놀-케토프로펜의 합성
케토프로펜(1.11 mmol)(도쿄가세이고교 주식회사 제조)을 디클로로메탄(3 ml)에 용해하고, 트리에틸아민(1.11 mmol), 염화디메틸포스피노티오일(Mpt-Cl)(1.11 mmol)의 디클로로메탄 용액(2 ml)을 순차 가하여 25분간 교반했다. 또한 트리에틸아민(0.36 mmol)을 가하여 20분간 교반했다. 반응액을 빙냉하고, 트리에틸아민(1.11 mmol), DMAP(0.19 mmol), 참고예 2에서 얻은 Boc-세리놀(0.50 mmol)을 순차 가하여, 실온으로 되돌려 한 낮과 밤 교반했다. 반응액을 다시 빙냉하고, 25% 암모니아수(2 ml), 디옥산(10 ml)을 순차 가하여 20분간 교반했다. 반응액을 5 ml에 농축하여, 아세트산에틸을 가했다. 물, 5% 시트르산 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 분액 세정하고, 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 용매를 감압유거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸 =2:1, 0.5% 트리에틸아민)로 정제하여, 표기 화합물(287.3 mg, 수율 87%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.38-1.40(9H, m, Boc), 1.51-1.53(6H, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.76-3.81(2H, m, -OCOCH(CH3)-), 3.96-4.11(4H, m, -CH 2 CH(NHBoc) CH 2 -), 4.61(1H, btd, -CH2 CH(NHBoc)CH2-), 7.40-7.80(18H, m, Aromatic)
2) 세리놀-케토프로펜염산염의 합성
Boc-세리놀-케토프로펜(0.428 mmol)을 디클로로메탄(1 ml)에 용해하여, 빙냉 하에서 4N 염산/아세트산에틸(4 ml)을 가하고, 그 후 서서히 실온으로 하여 2시간 교반했다. Boc-세리놀-케토프로펜의 소실을 TLC로 확인한 후, 디에틸에테르, 헥산을 가하여, 석출한 침전을 원심 분리했다. 얻어진 침전을 감압 건조하여, 표기 화합물(243.6 mg, qu.)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.49(6H, t, -OCOCH(CH 3 )-), 3.79(1H, m, -CH2 CH(NHBoc)CH2-), 4.00-4.53(6H, m, Serinol, Ketoprofen), 7.31-7.80(18H, m, Aromatic)
(실시예 26)세리놀-케토프로펜 도입 히알루론산의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산(100 mg) 0.25 mmol/2당 단위를 물-디옥 산(1:1, 22.5 ml)에 용해하고, 2 mol/L HOSu(0.1 ml), 1 mol/L WSCI·HCl(0.1 ml), 실시예 25에서 얻어진 세리놀-케토프로펜염산염(0.10 mmol)의 디옥산 용액(2 ml)을 가하여 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액(1.5 ml)을 가하여 4시간 교반했다. 50% 아세트산 수용액(43 μl)을 가하여 중화하고, 염화나트륨(0.4 g)을 가하여 교반했다. 에탄올(100 ml)을 가하여 교반하여, 생긴 침전을 원심 분리했다. 얻어진 침전을 80% 에탄올 수용액, 에탄올, 디에틸에테르로 각 2회 순차 세정했다. 감압 건조하여, 표기 화합물(92.3 mg)을 얻었다. HPLC에 의한 케토프로펜의 도입율은 11.2%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 27) 2-아미노-1,5-펜탄디올-케토프로펜염산염의 합성
1) Boc-아미노-1,5-펜탄디올-케토프로펜의 합성
Boc-아미노-1,5-펜탄디올(Boc-NHCH(CH2OH)CH2CH2CH2OH, Aldrich Chem. Co. 제조)(1.98 mmol)을 디클로로메탄(2 ml)에 용해하고, 케토프로펜(3.96 mmol)(도쿄가세이고교 주식회사 제조)의 디클로로메탄 용액(4 ml), DMAP(0.791 mmol)의 디클로로메탄 용액(1 ml)을 순차 가하여 교반했다. 반응액을 빙냉하고, WSCI·HCl(4.93 mmol)의 디클로로메탄 용액(5 ml)을 가하여 서서히 실온으로 하면서 한 낮과 밤 교반했다. 반응액을 아세트산에틸로 희석하고, 5% 시트르산 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 세정하여, 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 용매를 감압유거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=5:2, 0.5% 트리에틸아민)로 정제하여, 표기 화합물(1.361 g, 수율 99%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.39-1.40(9H, m, Boc), 1.51-1.55(6H, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.75-4.55(8H, m, Ketoprofen, 2-amino-1,5-pentanediol), 7.40-7.80(18H, m, Aromatic)
2) 2-아미노-1,5-펜탄디올-케토프로펜염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노-1,5-펜탄디올-케토프로펜(1.95 mmol)을 디클로로메탄(1 ml)에 용해하여, 빙냉 하에서 4N 염산/아세트산에틸(4 ml)을 가하고, 그 후 서서히 실온으로 하여 3시간 교반했다. 반응액에 헥산을 가하여, 석출한 백색 침전을 원심 분리했다. 얻어진 침전을 감압 건조하여, 표기 화합물(1.20 g, 수율 98%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.50(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.51(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 3.47(1H, bd, 2-amino-1,5-pentanediol), 3.44-4.48(6H, m, Ketoprofen, 2-amino-1,5-pentanediol), 7.33-7.84(18H, m, Aromatic)
(실시예 28) 2-아미노-1,5-펜탄디올-케토프로펜 도입 히알루론산의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산(137 mg) 0.34 mmol/2당 단위를 물-디옥 산(1:1, 30.8 ml)에 용해시킨 후, 2 mol/L HOSu(0.137 ml), 1 mol/L WSCI·HCl(0.137 ml), 실시예 27에서 얻어진 2-아미노-1,5-펜탄디올-케토프로펜염산염(0.137 mmol)의 물-디옥산(1:1) 용액(4 ml)을 순차 가하여 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액(2.1 ml)을 가하여 5시간 교반했다. 50% 아세트산 수용액(59 μl)을 가하여 중화한 후, 염화나트륨(0.548 g)을 가하여 교반했다. 에탄올(140 ml)을 가하여 교반하고, 생긴 침전을 원심 분리했다.
얻어진 침전을 80% 에탄올 수용액, 에탄올, 디에틸에테르로 세정했다. 감압 건조하여, 표기 화합물(135.1 mg)을 얻었다. HPLC에 의한 케토프로펜의 도입율은 18.5%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(실시예 29) 3-아미노-1, 2-프로판디올-케토프로펜염산염의 합성
1) Boc-아미노-1, 2-프로판디올-케토프로펜의 합성
Boc-아미노-1, 2-프로판디올(Boc-NHCH2CH(OH)CH2OH, Aldrich Chem. Co. 제조)(2.05 mmol)을 디클로로메탄(2 ml)에 용해하고, 케토프로펜(4.11 mmol)(도쿄가세이고교 주식회사 제조)의 디클로로메탄 용액(4 ml), DMAP(0.803 mmol)의 디클로로메탄 용액(1 ml)을 순차 가하여 교반했다. 반응액을 빙냉하고, WSCI·HCl(4.94 mmol)의 디클로로메탄 용액(5 ml)을 가하여 서서히 실온으로 하면서 한 낮과 밤 교반했다. 반응액을 빙냉하고, WSCI·HCl(1.24 mmol)의 디클로로메탄 용액(1 ml)을 가하여 실온에서 1시간, 35℃에서 2시간 교반했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 시 트르산 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 용매를 감압유거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=2:1, 0.5% 트리에틸아민)로 정제하여, 표기 화합물(1.175 g, 수율 87%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.36-1.40(9H, m, Boc), 1.42-1.53(6H, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.10-3.30(2H, m, BocNHCH 2 -), 3.65-3.82(2H, m, -OCOCH(CH3)-), 3.99-4.36(2H, m, BocNHCH2(CHO-)CH 2 O-), 4.49-4.76(1H, m, BocNH-), 5.04-5.09(1H, m, BocNHCH2(CHO-)CH2O-), 7.38-7.80(18H, m, Aromatic)
2) 3-아미노-1,2-프로판디올-케토프로펜염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-아미노-1,2-프로판디올-케토프로펜(1.76 mmol)을 디클로로메탄(1 ml)에 용해하고, 빙냉 하에서 4N 염산/아세트산에틸(4 ml)을 가하여, 3시간 교반했다. 반응액에 헥산을 가하여, 석출한 백색 침전을 감압 건조하여, 표기 화합물(1.029 g, 수율 97%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.33-1.49(6H, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.02-3.20(m, 2H, H2NCH 2 (CHO-)CH2O-), 3.56-3.82(1H, m, -OCOCH(CH3)-), 3.90-4.15(2H, m, H2NCH2(CHO-)CH 2 O-, -OCOCH(CH3)-), 4.18-4.50(1H, m, H2NCH2CH(O-)CH 2 O-), 5.35- 5.37(1H, m, H2NCH2 CH(O-)CH2O-), 7.30-7.80(18H, m, Aromatic)
(실시예 30) 3-아미노-1,2-프로판디올-케토프로펜 도입 히알루론산의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산(200 mg) 0.5 mmol/2당 단위를 물-디옥산(1:1, 45 ml)에 용해하고, 2 mol/L HOSu(0.25 ml), 1 mol/L WSCI(0.25 ml), 실시예 29에서 얻어진 3-아미노-1, 2-프로판디올-케토프로펜염산염(0.20 mmol)의 물-디옥산(1:1) 용액(4 ml)을 순차 가하여 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액(3 ml)을 가하여 4시간 교반했다. 50% 아세트산 수용액(86 μl)을 가하여 중화하고, 염화나트륨(0.8 g)을 가하여 교반했다. 에탄올(200 ml)을 가하여 교반하여, 생긴 침전을 원심 분리했다. 얻어진 침전을 80% 에탄올 수용액, 에탄올, 디에틸에테르로 세정했다. 침전을 감압 건조하여, 표기 화합물(217.4 mg)을 얻었다. HPLC에 의한 케토프로펜의 도입율은 40.3%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(참고예 3) Boc-트리스(히드록시메틸)아미노메탄의 합성
트리스(히드록시메틸)아미노메탄(10.1 mmol)을 물-디옥산(1:2, 30 ml)에 용해하고, Boc2O(10.8 mmol)의 물-디옥산 용액(1:9, 10 ml)을 가하여, 실온에서 45분간, 40℃에서 70분간 교반했다. Boc2O(5.41 mmol)의 디옥산 용액(3 ml)을 가하여 서서히 실온으로 하면서 한 낮과 밤 교반했다. 용매를 감압유거했다. 잔사를 헥산으로 세정한 후 감압 건조하여, 표기 화합물(2.21 g, 수율 99%)을 얻었다. 구조는 1H- NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CD3OD) d(ppm)=1.44(9H, s, Boc),3.68(6H, s, -C(CH 2 OH)3)
(실시예 31) 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜염산염의 합성
1) Boc-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜의 합성
케토프로펜 419 mg(1.65 mmol)(도쿄가세이고교 주식회사 제조)를 디클로로메탄 3 mL을 용해하고, 빙냉 하에서 트리에틸아민 230 μL(1.65 mmol), Mpt-Cl 213 mg(1.65 mmol)/디클로로메탄 2 mL을 순차 가하여, 10분간 교반했다. 트리에틸아민 230 μL(1.65 mmol), DMAP 33 mg(0.27 mmol), 참고예 3에서 얻은 Boc-트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Boc-NHC(CH2OH)3) 110 mg(0.5 mmol)을 순차 가하고, 실온으로 되돌려, 한 낮과 밤 교반했다. 암모니아수 2 mL을 가하여, 디클로로메탄과 암모니아수가 균일하게 될 때까지 디옥산을 가하여 40분간 교반했다. 디클로로메탄을 감압유거하고, 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산으로 2회, 물, 5% 중조로 2회, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 아세트산에틸을 감압유거하여, 실리카겔 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=100:1→75:1)로 정제했다. 표기 화합물을 정량적으로 467 mg 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인하여, Boc-트리스(히드록시메틸)아미노메탄 1 분자에 대하여 케토프로펜 3 분자가 도입되고 있음을 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.29(9H, s, Boc), 1.44-1.54(3H×3, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.76(1H×3, q, -OCOCH(CH3)-), 4.04-4.27(6H, m, -NHC(CH 2 O-KP)3), 4.81(1H, br, -NH-), 7.37-7.85(9H×3, m, Aromatic H)
2) 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜 453 mg(0.49 mmol)을 디클로로메탄 1 mL 용해에 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸3 mL을 가하여, 빙냉 하에서 30분간, 실온에서 1시간 30분 교반했다. Boc-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜의 소실을 TLC로 확인한 후, 디에틸에테르, 헥산을 가하여, 따라버리기를 했다. 그 후, 감압 건조하여 표기 물질을 수량 411 mg(97%으로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.39-1.50(3H×3, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.96(1H×3, q, -OCOCH(CH3)-), 4.09-4.46(6H, m, -NHC(CH 2 O-KP)3), 7.25-7.80(9H×3, m, Aromatic H), 9.31(br, H 3 N + CH2-)
(실시예 32) 글리신-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜염산염의 합성
1) Boc-글리신-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜의 합성
Boc-글리신 133 mg(0.76 mmol)을 클로로포름 1 mL에 용해하고, 빙냉 하에서 트리에틸아민 106 μL(0.76 mmol), Mpt-Cl 98 mg(0.76 mmol)/클로로포름 1 mL을 가하여 10분간 교반했다. 그 후, 실시예 31에서 얻어진 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜염산염 433 mg(0.5 mmol)/트리에틸아민 70 μL(0.5 mmol)/클로로포름 2 mL, 트리에틸아민 106 μL(0.76 mmol)을 4회로 나눠 서서히 가했다. 실온에서 1시간 교반한 후, 또한 빙냉 하에서 트리에틸아민 106 μL(0.76 mmol)을 가하여, Boc-글리신 131 mg(0.75 mmol)을 클로로포름 1 mL로 용해하고, 빙냉 하에서 트리에틸아민 105 μL(0.75 mmol), Mpt-Cl 95 mg(0.75 mmol)/클로로포름 1 mL을 가하여 활성화한 Boc-글리신의 혼합 산무수물을 가하여, 실온에서 한 낮과 밤 교반했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산으로 2회, 물, 5% 중조로 2회, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수 건조한 후, 아세트산에틸을 감압유거하여, 실리카겔 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=3:2)로 정제했다. 표기 화합물을 411 mg(수율 55%) 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.43(9H, s, Boc), 1.45-1.52(3H×3, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.56(2H, br, -NHCH 2 CO-), 3.76(1H×3, q, -OCOCH(CH3)-), 3.98-4.28(6H, m, -NHC(CH 2 O-KP)3), 5.51(1H, br, -NHCH2CO-), 6.63(1H, br, -NHC(CH2O-KP)3), 7.34-7.83(9H×3, m, Aromatic H)
2) 글리신-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜염산염의 합성
상기에서 얻은 Boc-글리신-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜 361 mg(0.37 mmol)에 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 2 mL을 가하여, 실온에서 2시간 교반했다. Boc-글리신-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜의 소실을 TLC로 확인한 후, 디에틸에테르, 헥산을 가하여, 따라버리기를 했다. 그 후, 감압 건조하여 표기 물질을 정량적으로 수량 336 mg로 얻었다. 구조는 1H-NMR(CDCl3)로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.40(3H×3, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.68-4.24(11H, m, 2H; -NHCH 2 CO-, 1H×3; -OCOCH(CH3)-, 6H; -NHC(CH 2 O-KP)3), 7.27-7.82(9H×3, m, Aromatic H), 8.31(br, H 3 N + CH2-)
(실시예 33) 글리신-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜 도입 히알루론산의 합성
중량 평균 분자량 90만의 히알루론산나트륨 100 mg(0.25 mmol/2당 단위)을 물 11.5 mL/디옥산 11.5 mL에 용해시킨 후, 2 mol/L HOSu/물 0.1 mL, 1 mol/L WSCI·HCl/물 0.1 mL, 실시예 32에서 얻어진 글리신-트리스(히드록시메틸)아미노메탄-케토프로펜염산염 93 mg(0.1 mmol)/디옥산 3 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액 1.5 mL을 가하여, 4시간 45분 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 43 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 400 mg을 가하여 교반했다. 에탄올 100 mL을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄 올로 2회, 디에틸에테르로 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 95 mg의 백색 고체를 얻었다. HPLC에 의한 케토프로펜의 도입율은 39%였다. 얻어진 물질을 농도 1.0 중량%가 되도록 PBS에 용해하여 용액을 제작했다. 이 용액은 무색 투명한 액이며, 필터 통과성 시험은 「A」였다.
(참고예 4) Boc-아미노프로필브로마이드의 합성
3-브로모프로필아민브롬화수소산염 1.222 g(5.58 mmol)을 디클로로메탄 20 mL에 용해하여, 빙냉 하에서 트리에틸아민 0.778 mL(5.58 mmol)을 가하고, 또한 Boc2O 1.214 g(5.56 mmol)의 디클로로메탄 용액 50 mL을 10분 동안 적하하여 교반했다. 실온에서 50분간 교반한 후, 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수한 후, 용매를 감압유거했다. 표기 화합물 1.304(98%)를 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.44(9H, s, Boc), 2.05(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2Br), 3.28(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2Br), 3.44(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 Br), 4.64(1H, s, NH)
(실시예 34) 아미노프로판올-디클로페낙염산염의 합성
(1) Boc-아미노프로판올-디클로페낙디클로페낙나트륨 1.476 g(4.64 mmol)을 DMF 3 mL에 용해하여, 빙냉 하에서 참고예 6에서 얻어진 Boc-아미노프로필브로마이드 1.105 g(4.64 mmol)의 DMF 용액 7 mL을 적하했다. 실온에서 밤새 교반후, 60℃ 에서 10시간 교반했다. 실온에서 밤새 교반한 후, 60℃에서 9시간, 또한 실온에서 3일간 교반했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 중조수, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수한 후, 아세트산에틸을 감압유거했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=7:1, 0.5% 트리에틸아민)로 정제하여, 표기 화합물을 1.702 g(81%) 얻었다.
(2) 아미노프로판올-디클로페낙염산염
상기에서 얻은 Boc-아미노프로판올-디클로페낙 1019 mg(2.25 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해하여, 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 8 mL을 가하여 3시간 교반했다. 디에틸에테르 150 mL을 가하여 침전시키고, 침전을 감압 건조했다. 표기 화합물을 791 mg(90%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=2.13(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.08(2H, t, -NHCH 2 CH2CH2O-),3.84(2H, s, Ph-CH2-CO), 4.25(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 6.52-7.33(8H, m, Aromatic H, NH)
(실시예 35) 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨(DS 4.3%)의 합성
중량 평균 분자량 80만의 히알루론산 500 mg(1.25 mmol/2당 단위)를 물 57.5 mL/디옥산 57.5 mL에 용해시킨 후, 0.33 M·HOSu/물 0.75 mL, 0.16 M·WSCI·HCl/물 0.75 mL, 상기 실시예 34에서 얻어진 0.16M 아미노프로판올-디클로페낙염산염/ 물 0.75 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 탄산수소나트륨 375 mg/물 3 mL을 가하여, 4시간 교반했다. 반응액에 아세트산 108 μL을 가하고 중화한 후, 염화나트륨 3.0 g을 가하여 교반했다. 에탄올 200 ml을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 2회 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 505 mg의 백색 고체를 얻었다. 분광 광도계에 의한 디클로페낙의 도입율은 4.3%였다.
(실시예 36) 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨(DS 9.7%)의 합성
중량 평균 분자량 80만의 히알루론산 500 mg(1.25 mmol/2당 단위)를 물 57.5 mL/디옥산 57.5 mL에 용해시킨 후, 0.5M·HOSu/(물:디옥산=1:1) 1.0 mL, 0.25M·WSCI·HCl/(물:디옥산=1:1) 1.0 mL, 상기 실시예 34에서 얻어진 0.25M 아미노프로판올-디클로페낙염산염/(물:디옥산=1:1) 1.0 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 탄산수소나트륨 380 mg/물 5 mL을 가하여, 4시간 교반했다. 반응액에 아세트산 108 μL을 가하고 중화한 후, 염화나트륨 3.0 g을 가하여 교반했다. 에탄올 200 ml을 가하여 침전시키고, 침전물을 80% 에탄올로 3회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 2회 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 503 mg의 백색 고체를 얻었다. 분광 광도계에 의한 디클로페낙의 도입율은 9.7%였다.
(실시예 37) 평균 분자량 65 kDa의 히알루론산을 이용한 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산(65 kDa)나트륨(DS 17.1%)의 합성
평균 분자량 65 kDa의 히알루론산 200.8 mg(0.50 mmol/2당 단위)를 물 22.5 mL/디옥산 22.5 mL에 용해시킨 후, 1M·HOSu 0.4 mL, 0.5M·WSCI·HCl 0.4 mL, 상기 실시예 34에서 얻어진 0.1M 아미노프로판올-디클로페낙염산염/(물:디옥산=1:1) 2.0 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액 3 mL을 가하여, 3시간 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 86 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 1.0 g을 가하여 교반했다. 에탄올 200 ml을 가하여 침전시키고, 침전물을 85% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 190.5 mg의 백색 고체를 얻었다. 분광 광도계에 의한 디클로페낙의 도입율은 17.1%였다.
(참고예 5) Boc-아미노에틸브로마이드
3-브로모에틸아민브롬화수소산염 2.155 g(10.5 mmol)을 디클로로메탄 20 mL에 용해하여, 빙냉 하에서 트리에틸아민 1.463 mL(10.5 mmol)을 가하고, 또한 Boc2O 2.299 g(10.5 mmol)의 디클로로메탄 용액 5 mL을 가하여 교반했다. 실온에서 90분간 교반한 후, 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수한 후, 용매를 감압유거했다. 표기 화합물2.287 g(97%)을 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.45(9H, s, Boc), 3.45-3.55(4H, m, -NHCH 2 CH 2 Br), 4.93(1H, s, NH)
(실시예 38) 아미노에탄올-디클로페낙염산염의 합성
(1) Boc-아미노에탄올-디클로페낙
참고예 5에서 얻어진 Boc-아미노에틸브로마이드 2.287 g(10.2 mmol)의 DMF 용액 5 mL을 빙냉하고, 디클로페낙나트륨 3.255 g(10.2 mmol)의 DMF 용액 6 mL을 가하여, 실온에서 밤새 교반했다. 60℃에서 11시간 교반하고, 실온에서 밤새 교반했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 물, 포화 식염수로 순차 분액 세정했다. 황산나트륨으로 탈수한 후, 아세트산에틸을 감압유거했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(톨루엔:아세트산에틸=20:1, 0.5% 트리에틸아민)로 정제하여, 표기 화합물을 2.675 g(60%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.42(9H, s, Boc), 3.41(2H, d, -NHCH 2 CH2O-), 3.83(2H, s, Ph-CH2-CO), 4.21(2H, t, -NHCH2 CH 2 O-), 4.72(1H, s, NH), 6.54-7.47(8H, m, Aromatic H, NH)
(2) 아미노에탄올-디클로페낙염산염
상기에서 얻어진 Boc-아미노에탄올-디클로페낙 2.108 g(4.80 mmol)을 디클로로메탄 5 mL에 용해하고, 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 20 mL을 가하여 2.5시간 교반했다. 디에틸에테르, 헥산을 가하여 침전시키고, 침전을 감압 건조했다. 표기 화합물을 1.775 g(98%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=3.18(2H, t, NH2 CH 2 CH2O-), 3.94(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.37(2H, t, NH2CH2 CH 2 O-), 6.47-7.31(8H, m, Aromatic H, NH)
(실시예 39) 아미노에탄올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨(DS 14.7%)의 합성
중량 평균 분자량 80만의 히알루론산 500 mg(1.25 mmol/2당 단위)를 물 57.5 mL/디옥산 57.5 mL에 용해시킨 후, 2M·HOSu 0.5 mL, 1M·WSCI·HCl 0.5 mL, 실시예 38에서 얻어진 아미노에탄올-디클로페낙염산염 188.6 mg(0.5 mmol)의 용액(물:디옥산=1:1) 3 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 5% 탄산수소나트륨 수용액 7.5 mL을 가하여, 4시간 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 215 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 2.5 g을 가하여 교반했다. 에탄올 500 ml을 가하여 침전시키고, 침전물을 85% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 2회 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 473.7 mg의 백색 고체를 얻었다. 분광 광도계에 의한 디클로페낙의 도입율은 14.7%였다.
(실시예 40) 디아미노프로판-디클로페낙염산염의 합성
(1) Boc-프로필아미드-디클로페낙
N-(2-아미노프로필)칼바민산 tert-부틸 338.4 mg(1.94 mmol, 도쿄가세이고교 주식회사 제조), 디클로페낙 694.4 mg(2.34 mmol)을 디클로로메탄 3 mL에 용해하고, 빙냉 하에서 DMAP 59.0 mg(0.483 mmol), WSCI·HCl 505.3 mg(2.64 mmol)을 가하여 70분간 교반하여, 실온으로 하면서 90분간 교반했다. 아세트산에틸을 가하여, 5% 시트르산 수용액, 5% 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 분액 세정했 다. 황산나트륨으로 탈수한 후, 아세트산에틸을 감압유거했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=2:1)로 정제하여, 표기 화합물을 835.5 g(95%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.45(9H, s, Boc), 1.60(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2NHBoc), 3.14(2H, q, -NHCH2CH2 CH 2 NHBoc), 3.31(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2NHBoc), 3.69(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.93(1H, s, NH), 6.50-7.60(9H, m, Aromatic H, NH)
(2) 디아미노프로판-디클로페낙염산염
상기에서 얻어진 Boc-프로필아미드-디클로페낙 825.0 mg(1.82 mmol)의 디클로로메탄 용액 1 mL에 빙냉 하에서 4M 염산/아세트산에틸 20 mL을 가하여 2시간 교반했다. 디에틸에테르를 가하여 침전시키고, 침전을 감압 건조했다. 표기 화합물을 714.5 mg(101%) 얻었다. 구조는 1H-NMR로 확인했다.
1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ(ppm)=1.90(2H, t, -NHCH2 CH 2 CH2NH2), 2.99(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 NH2), 3.26(2H, d, -NHCH 2 CH2CH2NH2), 3.71(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 6.40-7.49(8H, m, Aromatic H, NH)
(실시예 41) 디아미노프로판-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨(DS 18.1%)의 합성
중량 평균 분자량 80만의 히알루론산 200 mg(0.5 mmol/2당 단위)를 물 22.5 mL/디옥산 22.5 mL에 용해시킨 후, 2M·HOSu 0.2 mL, 1M·WSCI·HCl 0.2 mL, 실시예 40에서 얻어진 디아미노프로판-디클로페낙염산염 78.4 mg(0.2 mmol)의 용액(물:디옥산=1:1) 1 mL을 순차 가하여, 한 낮과 밤 교반했다. 5% 탄산수소나트륨 수용액3 mL을 가하여, 4시간 교반했다. 반응액에 50% 아세트산 86 μL을 가하여 중화한 후, 염화나트륨 1 g을 가하여 교반했다. 에탄올 200 ml을 가하여 침전시키고, 침전물을 85% 에탄올로 2회, 에탄올로 2회, 디에틸에테르로 세정하여, 실온에서 밤새 감압 건조했다. 206.2 mg의 백색 고체를 얻었다. 분광 광도계에 의한 디클로페낙의 도입율은 18.1%였다.
(실시예 42) 생물 시험용 1% 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨 용액의 조제
실시예 3에서 얻어진 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨(도입율 26.3%) 22 mg에 총량 2.19 g가 되도록 5 mM 인산 완충 생리적 식염수를 가하고, 밤새 교반하여, 1% 용액을 조제했다. 용액을 0.45 μm 필터로 여과하여, 표기 용액으로 했다. 이 용액의 엔도톡신 함량을 일본약방 게재의 일반 시험법인 엔도톡신 시험법(비색법으로 측정한 바, 엔도톡신치 0.0073 EU/Ml이었다.
<투여 실험>
(실시예 43)
래트 브라디키닌 야기 동통 모델에 대한 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨의 효과
1) 피험 물질의 투여
전신 마취제로서 소동물용 마취기(TK-4, 바이오마시나리 제조)에 충전한 아이소플루레인(포렌(등록상표), 다이니폰세이야쿠 주식회사 제조)의 흡입 마취(농도 3.0%, 유량 2.0 L/min)를 이용했다.
PBS, 1%의 히알루론산나트륨 용액(HA), PBS에 케토프로펜을 용해한 3.7 mg/mL의 케토프로펜나트륨 용액(KP) 및 실시예 42에서 조제한 1%의 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨의 PBS 용액(KP-HA)을 피험 물질로서 이용했다.
래트(Crj:SD계(SPF), 수컷, 7주령)를 에테르 마취 하에 배위(背位) 고정하여, 좌후지 무름 관절 주변을 넓게 바리캉으로 밀었다. 관절 주위를 70% 알콜로 분무 소독하고, 29G 인슐린용 바늘이 달린 시린지(데루모 제조)를 이용하여 상기 각 피험 물질을 20 μL/joint의 용량으로 좌후지 무릎 관절강 내에 투여했다. 각 피험 물질군마다 5예(n=5)로 실시했다.
2) 발통 물질(BK+PGE2 용액)의 투여
각 피험 물질 투여 1일 후에, 무마취 하에서, 래트를 배위 고정하여, 관절 주위를 70% 알콜로 분무 소독한 후, 29G 인슐린용 바늘이 달린 시린지(데루모 제조, 주사 바늘의 굵기는 0.33 mm)를 이용하여, 좌후지 무릎 관절강 내에 발통 물질인 브라디키닌(BK)과 프로스타그란딘 E2(PGE2)의 혼합 용액을 50 μL/관절의 용량으로 투여했다. 한편, 이 발통 물질 용액은 BK 및 PGE2 각각 종농도 4 μg/mL, 2 μg/mL로 되도록 조제했다. 발통 물질 투여 직후부터 동통 반응을 육안 관찰했다.
3) 동통 관찰
발통 물질 투여 직후부터, 약 2분간, 보행 상태를 발 올림의 유무, 세다리 보행, 파행 정도를 육안으로 관찰하여, 스코어화했다. 동통 스코어는, 발 올림 : 1점 가산, 파행 혹은 세다리 보행 : 1점 가산으로 하여, 0∼2점의 단계로 평가했다. 한편, 평가는 블라인드 하에서 실시했다. 각 개체의 동통 반응을 스코어화한 그래프를 도 1에 나타낸다.
도 1에 있어서, 결과는 평균 동통 스코어±표준 편차에 의해서 나타내어진다.
결과, PBS 투여군과 비하여, KP-HA>KP>HA의 순으로 동통 억제 효과가 인정되었다.
(실시예 44)
래트 1% 질산은 야기 동통 모델에 대한 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨의 관절강내 투여에 의한 효과
1) 동통 야기 물질의 투여
전신 마취제로서 소동물용 마취기(TK-4, 바이오마시나리 제조)에 충전한 아이소플루레인(포렌(등록상표), 다이니폰세이야쿠 주식회사 제조)의 흡입 마취(농도 3.0%, 유량 2.0 L/min)를 이용했다.
래트(Crj:SD 계(SPF), 수컷, 6주령)를 에테르 마취 하에 배위 고정하여, 좌후지 무릎 관절 주변을 넓게 바리캉으로 밀었다. 관절 주위를 70% 알콜로 분무 소독하고, 29G 인슐린용 바늘이 달린 시린지(데루모 제조)를 이용하여, 1% 질산은 용 액을 50 μL/관절의 용량으로 좌후지 무릎 관절강 내에 투여했다.
2) 피험 물질의 투여
각각 PBS를 용매로 하는, 1% 히알루론산나트륨 용액(HA) 및 실시예 42에서 조제한 1% 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨 용액(KP-HA)을 피험 물질로서 제작했다. 1% 질산은 용액 투여한 후 24시간에, 래트를 5마리씩 2군으로 나눠, 각 군에 피험 물질을 투여했다. 투여 방법은 동통 야기 물질과 마찬가지로, 아이소플루레인에 의한 흡입 마취 하에, 관절 주위를 70% 알콜로 분무 소독하고, 29G 인슐린용 바늘이 달린 시린지를 이용하여 40 μL/관절의 용량으로 좌후지 무릎 관절강 내에 투여했다(n=5).
3) 평가 방법
보행 상태를 블라인드 하에서 스코어화한 하기 동통 스코어표를 이용하여, 각 군의 보행 상태를 육안 관찰했다. 결과는 도 2에 나타낸다.
도 2에 있어서, 결과는, 평균 동통 스코어±표준 편차에 의해서 나타내어진다.
스코어 0 : 정상(거의 정상을 포함함) 1 : 경도의 파행 2 : 중증의 파행 3 : 세다리 보행
또, 질산은 투여 발(좌후지)에 걸리는 하중을 사지 하중 측정 장치((유)토켄사 제조)를 이용하여 측정하여, 체중으로 제산한 것을 하중 부하율로 하여 측정했다(한편, 하중 부하율은 정상시 약 32%임). 피험 물질 투여한 후 2일까지 매일 1회 측정했다. 결과는 도 3에 나타낸다. 결과를, 평균 동통 스코어±표준 편차에 의해 서 나타냈다.
도 2로부터 HA 투여군, KP-HA 투여군 모두 동통 스코어는 서서히 경감하지만, KP-HA 투여군은, HA 투여군보다 동통 경감의 정도(동통으로부터의 회복도)가 빨랐다. 또한, 하중 부하율 측정에서는 통상 동통에서 회복할수록 하중 부하율이 높아지지만, 도 3의 결과로부터, KP-HA 투여군은 HA 투여군보다 하중 부하율의 값이 보다 짧은 시간에 의미 있게 높아졌다. 도 2와 도 3의 결과에 있어서의 KP-HA군과 HA군의 상관 관계는 동일했다.
(실시예 45) 토끼 무릎 관절에 있어서의 NSAIDs 도입 히알루론산의 서방성의 검토
1) 피험 물질의 투여 방법
실시예 42에서 얻은 1% 아미노프로판올-케토프로펜 도입 히알루론산나트륨 용액(KP-HA), 1.42 mg의 케토프로펜을 1 mL의 PBS에 용해한 케토프로펜 용액(KP) 및 1.41 mg의 케토프로펜을 1 mL의 1% HA 용액에 용해한 케토프로펜과 HA의 혼합 용액(KP+HA)을 피험 물질로서 이용했다.
각 피험 물질에 대해서 토끼를 5마리씩 이용하여, 케타민 전신 마취 하(1 mL/head, i.v.)에 배위 고정하여, 좌측 무릎 관절 주변을 넓게 바리캉으로 밀고, 25G의 주사 바늘(데루모 제조, 주사 바늘의 굵기는 0.5 mm)을 장착한 데루모 1 mL 시린지로 토끼 무릎 외측에서부터 관절강 내에 상기 피험 물질을 각각 300 μL 투여했다.
피험 물질 투여에서부터 6시간, 12시간, 24시간, 2일, 4일 후에 부검을 실시 했다.
2) 관절액 중의 유리형 KP량 및 결합형 KP량의 측정 방법
토끼를 케타민 전신 마취 하에서 방혈 도살하여, 관절액을 전량 회수한 후, 분리한 무릎 관절부의 관절강에 25G 주사 바늘을 이용하여 생리적 식염액 2 mL 주입하여 관절강내를 세정하고, 이 세정액도 회수했다. 이 세정은 2회 행했다. 회수한 세정액을 합한 관절액 중의 KP량 및 HA-KP량을 하기 순서로 측정했다.
관절액(4 ml vol.)에 1N HCl(0.2 ml)을 가하여 염산산성을 확인한 후, 용액과 같은 체적의 아세트산에틸을 가하여 격하고 교반하여, 상부의 유기층을 회수했다. 이 추출 조작을 합계 3회 실시했다. 회수한 유기층에 아세토니트릴 용액을 첨가하여 아세토니트릴 용액으로 하고, HPLC를 이용하여, 유리 KP량을 측정했다.(관절액 중의 유리형 KP량)
이어서, 상기한 추출 조작으로 얻어진 수층에 1N NaOH를 가하여 강염기성으로 하여, 실온 하에 1시간 교반했다. 이어서, 수층을 빙냉하여, 4N HCl을 천천히 가하면서 교반하여 염산산성으로 한 후, 용액과 같은 체적의 아세트산에틸을 가하여 격하게 교반하여, 상부의 유기층을 회수했다. 이 추출 조작을 합계 3회 행했다. 회수한 유기층에 아세토니트릴 용액을 첨가하여 아세토니트릴 용액으로 하고, HPLC를 이용하여, HA-KP량(결합형 KP량)을 측정했다.(관절액 중 결합체 HA-KP량)
3) 활막 조직의 소화액 중의 KP량의 측정 방법
상기 (2)의 관절액을 회수한 후의 무릎 관절로부터 활막 조직을 분리, 채취했다. 채취한 활막 조직은 생리적 식염액 100 mL로 정성 들여 세정하여, 부착되는 관절액을 완전히 제거했다. 활막 조직은 슬개골을 제거한 후, 튜브에 넣고, 10 mM 아세트산나트륨 용액(pH 7.5으로 2 mg/mL 농도로 조제한 프로테아제 K(Lot No. 102K8633, SIGMA 제조) 5 mL을 첨가하여, 적절하게 볼텍스로 교반하면서, 55℃에서 41시간 효소 소화를 했다. 소화한 후, 100℃, 5분간 효소를 실활시켜, 얻어진 소화액 중의 KP량을 하기 순서로 측정했다.
얻어진 소화액에 1/4량의 4N NaOH를 가하여, 실온 하에 1시간 교반했다. 계속해서, 용액을 빙냉하여, 4N HCl을 가하여 염산산성으로 한 후, 용액과 동일 체적의 디에틸에테르를 가하여 격하게 교반하여, 상부 유기층을 제거했다. 이 탈지 조작을 합계 3회 행했다. 빙냉 하에, 탈지 조작한 후의 용액에 4N HCl을 가하여 교반하여, 염산산성을 확인한 후, 용액과 동일 체적의 아세트산에틸을 가하여 격하게 교반하여, 상부 유기층을 회수했다. 이 추출 조작을 합계 3회 행했다. 회수한 유기층에 아세토니트릴 용액을 첨가하여 아세토니트릴 용액으로 하고, HPLC를 이용하여, 유리 KP량을 측정했다.(활막 조직 소화액 중의 유리형 KP량)
관절액 중, 활막 조직 소화액 중의 계시적인 KP 및 HA-KP의 잔존율을 산출했다.(표 1, 도 4)
피험물질 회수부위 존재양식 6시간(%) 12시간(%) 24시간(%) 2일간(%) 4일간(%)
KP 단제 관절액 활막조직 유리형 KP 0 0
KP+HA (혼합물) 관절액 활막조직 유리형 KP 0.07 0 0 0
KP-HA (결합체) 관절액 활막조직 유리형 KP 결합체형KP 0.13 46.56 11.3 0.14 34.94 5.20 0.22 18.95 32.90 0.16 8.11 12.10 0 0.63 7.40
피험 물질로서 KP(단제) 혹은 KP+HA(혼합물)을 투여한 경우에는, 6시간, 12시간 후에는, 관절액 및 활막 조직으로부터 KP는 소실되었다. 그러나, 본 발명 물질인 KP-HA(결합체)를 투여한 경우에는, 4일 후에도 관절액 및 활막 조직 모두 KP의 존재가 인정되고 있어, 투여 부위에 있어서 KP가 지속적으로 존재하여, 지속적 효과를 보인다고 추측된다.
관절에서 발생하는 동통은 무신경 조직인 연골이 아니라, 활막 조직을 통하여 발생한다고 추측되어 있으며, 또한, NSAIDs를 관절강 내에 투여하면, NSAIDs는 활막으로 신속하게 이행하고, 활막으로 이행하여 작용을 보인다고 생각되고 있다. 그 때문에, 활막 중의 NSAIDs 농도의 유지는 동통 억제의 지속적 효과나 서방적 효과에 크게 관여한다고 생각된다. 상기 표로부터, KP(단제)의 투여에서는, 6시간 후에는 활막의 통과나 대사에 의해 활막 조직으로부터 소실되고 있지만, KP-HA(결합체)를 투여한 경우에는, 활막 조직에도 지속적으로 KP가 유지되고 있고, NSAIDs의 서방성 제제로서, 보다 유효하다는 것이 시사된다.
(실시예 46) 래트 1% 질산은 야기 동통 모델에 대한 도입율(DS)이 다른 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨의 관절강내 투여에 의한 효과
상기 실시예 44의 실험 순서에 준하여 실험을 실시하여, 하기 피험 물질에 관한 관절강내 투여에 대해서 평가를 했다.
피험 물질 :
(ⅰ) 실시예 19에서 얻어진 1% 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨(DS 18.2%)의 PBS 용액
(ⅱ) 실시예 36에서 얻어진 1% 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨(DS 9.7%)의 PBS 용액
(ⅲ) 실시예 35에서 얻어진 1% 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨(DS 4.3%)의 PBS 용액
(ⅳ) PBS
상기 실시예 44와 마찬가지로, 보행 상태를 블라인드 하에서 스코어화한 동통 스코어표를 이용하여, 각 군의 보행 상태를 육안 관찰했다. 결과는 도 5에 나타낸다. 결과는, 평균 동통 스코어±표준 편차에 의해서 나타내어지며, DS 18%, DS 10% 및 DS 4%가, 각각 DS 18.2%, DS 9.7% 및 DS 4.3%에 대응한다. 또한, 도 5에 있어서, *는 위험율 0.01<p<0.05로 PBS에 대하여 유의차가 있고, **는 위험율 p<0.01로 PBS에 대하여 유의차가 있음을 나타낸다.
결과로부터, 피험 물질인 DS 18.2%, DS 9.7% 및 DS 4.3%의 디클로페낙 도입 히알루론산나트륨 유도체는 모두, 진통 효과를 보였다. 그 중에서도 DS 18.2% 및 DS 9.7%의 피험 물질은 PBS와 비하여 극적으로 진통 효과를 보였다.
또한, 진통 효과는, 디클로페낙의 도입율(DS)의 증가에 의존적으로 향상되었다.
(참고예 6) 래트 1% 질산은 야기 동통 모델에 대한 디클로페낙나트륨의 경구 투여에 의한 효과
상기 실시예 44에 준하여 실험을 하고, 피험 물질의 투여 방법에 관해서는 하기 피험 물질의 경구 투여를 행하여 평가했다. 단, 피험 물질의 투여는 래트용 경구 존데(프치가미기까이텐)를 이용하여 1 mL/head의 용량으로 경구 투여했다.
피험 물질 :
(ⅰ) 1% 디클로페낙나트륨 현탁액(10% 아라비안 고무)
(ⅱ) 0.02% 디클로페낙나트륨 현탁액(10% 아라비안 고무)
한편, (ⅰ) (고용량군)은 디클로페낙나트륨으로서 50 mg/kg의 투여에 상당하고, (ⅱ) (저용량군)은 디클로페낙나트륨으로서, 거의 임상 투여량과 동량인 1 mg/kg의 투여에 상당하고 있다.
상기 실시예 46과 마찬가지로, 보행 상태를 블라인드 하에서 스코어화한 동통 스코어표를 이용하여, 각 군의 보행 상태를 육안 관찰했다. 결과는 도 6에 나타낸다. 도 6에 있어서, 「Diclofenac Na(p.o.) 50 mg/kg」는 상기 (ⅰ)(고용량군)에, 「Diclofenac Na(p.o.) 1 mg/kg」는 상기 (ⅱ)(저용량군)에 대응한다. 한편, 도 6에는, 참고로서 상기 실시예 46에서 측정된 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체(DS 18.2%) 및 PBS의 관절강내 주입에 의한 동통 스코어의 결과도 아울러, 각각「Diclofenac-HA」, 「PBS」로서 기재했다.
결과로부터, 디클로페낙나트륨의 고용량군(50 mg/kg)의 경구 투여에 있어서는, 동통 억제 효과는 인정되었지만, 다음날부터 변잠혈 반응 양성, 황달과 같은 증상, 체중 감소가 인정되었다. 고용량군의 용량은 임상 투여량의 수십배의 용량이며, 부작용, 독성적으로 현실적인 용량이 아니다.
거의 임상 투여량인 저용량군(1 mg/kg)의 경구 투여군은, PBS의 관절 주입군과 비교하더라도 효과가 인정되지 않았다.
한편, 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체의 관절강내 투여에서는, 투여 후부터 동통 억제가 보이고, 또한, 디클로페낙나트륨의 고용량군(50 mg/kg)의 경구 투여와 같은 부작용이라고 생각되는 증상도 관찰되지 않아, 높은 유용성이 확인되었다.
(참고예 7) 래트 1% 질산은 야기 동통 모델에 대한 디클로페낙 단제, 히알루론산의 관절강내 투여에 의한 효과
상기 실시예 44에 준하여 실험을 하고, 피험 물질의 투여 방법에 대해서는, 하기 피험 물질에 관한 관절강내 투여를 하여 평가했다.
피험 물질 :
(ⅰ) 0.1% 디클로페낙용액
(ⅱ) 0.1% 디클로페낙/1% 히알루론산 혼합 용액
(ⅲ) PBS
상기 실시예 46과 마찬가지로, 보행 상태를 블라인드 하에서 스코어화한 동통 스코어표를 이용하여, 각 군(n=9)의 보행 상태를 육안 관찰했다. 결과는 도 7에 나타낸다. 도 7에 있어서, 결과는, 평균 동통 스코어±표준 편차에 의해서 나타내어지고, 0.1% Diclofenc Na는 상기 (ⅰ) 0.1% 디클로페낙 용액에, 「0.1% Diclo+HA」는 상기 (ⅱ) 0.1% 디클로페낙/1% 히알루론산 혼합 용액에 대응한다. 한편, 도 7에는, 참고로서 상기 실시예 46에서 측정된 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체(DS 18.2%)의 결과도 아울러, 「Dic-HA(결합체)」로서 기재했다.
결과로부터, 디클로페낙 단제 및 디클로페낙과 히알루론산과의 혼합물은, 대조군인 PBS와 비교하여 의미 있는 효과는 보이지 않았다.
(실시예 47) 래트 1% 질산은 야기 동통 모델에 대한 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산(65 kDa)나트륨, 디아미노프로판-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨 및 아미노에탄올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨의 관절강 내 투여에 의한 효과
상기 실시예 44에 준하여 실시하여, 하기 피험 물질에 관한 관절강내 투여에 관해서 평가했다.
피험 물질 :
(ⅰ) 실시예 37에서 얻어진 1% 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산(65 kDa)나트륨의 PBS 용액
(ⅱ) 실시예 41에서 얻어진 1% 디아미노프로판-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨의 PBS 용액
(ⅲ) 실시예 39에서 얻어진 1% 아미노에탄올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨의 PBS 용액
(ⅳ) PBS
상기 실시예 44와 마찬가지로, 보행 상태를 블라인드 하에서 스코어화한 동통 스코어표를 이용하여, 각 군(n=7)의 보행 상태를 육안 관찰했다. 결과는 도 8에 나타낸다. 도 8에 있어서, 결과는, 평균 동통 스코어±표준 편차에 의해서 나타내어지며, 「65 kDa」는 상기 (ⅰ) 1% 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산(65 kDa)나트륨의 PBS 용액에, 「디아미드」는 상기 (ⅱ) 1% 디아미노프로판-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨의 PBS 용액에, 「C2」는 상기 (ⅲ) 1% 아미노에탄올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨의 PBS 용액에 대응한다. 또한, 도 8에 있어서, Δ는 위험율 0.05<p<0.1로 PBS에 대하여 유의차가 있고, *는 위험율0.01<p<0.05로 PBS에 대하여 유의차가 있고, **는 위험율 p<0.01로 PBS에 대하여 유의차가 있음을 나타낸다.
결과로부터, 스페이서 탄소수가 아미노프로판올보다 하나 적은 아미노에탄올을 이용한 아미노에탄올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨 용액도 높은 진통 효과를 보였지만, 디클로페낙이 아미드 결합에 의해 도입된 디아미노프로판-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨 용액은, 본 실시예의 실험계에서는 전혀 효과를 보이지 않았다. 또한, 분자량 65 kDa의 히알루론산을 이용한 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체는 분자량 80만인 것에 비하여, 진통 효과는 저감했다.
이들로부터 디클로페낙과의 결합 양식 혹은, 히알루론산의 분자량에 진통 효과는 의존하는 것이 분명하게 되었다.
(실시예 48) COX-2에 대한 디클로페낙나트륨 단제 및 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체의 작용(in vitro)
Chemiluminescent COX Inhibitor Screening Assay kit(Cayman)(양 유래의 COX-2에 의한 Peroxidase 활성을 지표로 억제제를 스크리닝하는 키트)를 이용하여 하기 피험 물질에 관해서 COX-2 억제 작용을 평가했다.
피험 물질 :
(ⅰ) 실시예 19에서 얻어진 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨 수용액(Dic-C3-HA)(200 μg/ml HA 상당, 80 μm Diclofenac 상당)
(ⅱ) 실시예 39와 같은 순서로 얻어진 아미노에탄올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨 수용액(Dic-C2-HA, DS 18.5%)(200 μg/ml HA 상당, 80 μm Diclofenac 상당)
(ⅲ) 80 μM 디클로페낙나트륨 수용액
(ⅳ) 200 μg/ml 히알루론산나트륨(HA) 수용액
상기 각 피험 물질의 원액 및 증류수로 10배, 100배, 1000배 희석한 피험 물질을 제작하여, COX Inhibitor Screening Assay kit로 COX-2 억제 활성을 측정(무처리군 n=6, 피험 물질군 n=3)했다. 결과는, 무처리군의 COX-2 효소 활성을 100%로 하여, 각 처리군의 효소 활성치를 하기식에 의해 상대%로 표기했다. 결과는 도 9(a) 및 도 9(b)에 나타낸다. 도 9(a)에 있어서, 「Diclofenac Na」는 상기 디클로페낙나트륨 수용액에, 「Dic-C3-HA」는 상기 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨 수용액에, 「Dic-C2-HA」는 상기 아미노에탄올-디클로페낙 도입 히알루론산나트륨 수용액에 대응한다. 도 9(b)에 있어서, 「HA」는 상기 200 μg/ml 히알루론산나트륨 수용액에 대응한다.
효소 활성치(%)=피험 물질처리군÷무처리군×100
결과, 디클로페낙나트륨 단제가 분명한 COX-2 억제 활성을 보인 농도에 있어서, 상당 농도의 디클로페낙을 포함하는 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체(Dic-C3-HA 및 Dic-C2-HA)는 COX-2 억제 활성을 보이지 않았다. HA 단제도, COX-2 억제 활성은 보이지 않았다. 이 결과로부터, in vivo에서의 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체의 효과는 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체 그자 체의 작용이 아니라, HA로부터 유리되는 디클로페낙에 기인할 가능성이 시사되었다.
in vivo(실시예 46, 47)에서의 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체의 효과가, 디클로페낙 단체보다도 우수한 이유의 하나로서, HA가, 그 세포에의 친화성에 의해, 보다 많은 양의 디클로페낙을 표적 세포 내의 COX-2까지 운반하기 때문이라는 것을 생각할 수 있다.
(실시예 49) 래트 아쥬반트 관절염(AIA) 모델에 대한 디클로페낙 도입 히알루론산 유도체의 작용
1) 아쥬반트의 야기
Mycobacterium butyricum(Lot No. 2115687, Difco) 6 mg/mL을 오토크레이브로 121℃, 20분 열 처리한 후, 29 G 인슐린용 바늘이 달린 시린지(데루모)를 이용하여 50 μL/joint의 용량으로 우후지 발바닥 피하에 주사했다.
2) 시험 물질의 투여
피험 물질 :
(ⅰ) 실시예 19에서 얻어진 1% 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산(DS 18%)나트륨의 PBS 용액(Diclofenac-HA)
(ⅱ) PBS
상기 피험 물질은 아쥬반트 주사시와 마찬가지로 무마취 하에서 29G 인슐린용 바늘이 달린 시린지(데루모)를 이용하여 50 μL/joint의 용량으로 양발의 경골-족근골 관절강 내에 아쥬반트 주사 직후, 주사후 1, 2, 3주에 투여한(합계 4회)(n=14).
4) 평가
아쥬반트 야기하기 전, 야기한 후 3, 5, 7, 10, 12, 14, 21, 28일에 평가.
·체중
·양 후지 족용적(래트·마우스 후지 발바닥 부종 용적 측정 장치(TK-101CMP, (유)유니콤사 제조))
5) 결과
아쥬반트 투여 발 및 비투여 발의 팽창율을 하기 화학식에 의해 측정했다. 아쥬반트 투여 발의 팽창율의 결과는 도 10(a)에, 아쥬반트 비투여 발의 팽창율의 결과는 도 10(b)에 나타낸다. 도 10에 있어서, 「Diclofenac-Ha」는 상기 (ⅰ) 1% 아미노프로판올-디클로페낙 도입 히알루론산(DS18%)나트륨의 PBS 용액을, 「normal」은 아쥬반트 및 피험 물질 비투여군을 나타낸다. 도 10에 있어서, Δ는 위험율0.05<p<0.1로 PBS에 대하여 유의차가 있고, *는 위험율0.01<p<0.05로 PBS에 대하여 유의차가 있고, **는 위험율 p<0.01로 PBS에 대하여 유의차가 있음을 나타낸다.
팽창율(%)=(측정일의 발 용적-아쥬반트 야기 전의 발 용적)
/아쥬반트 야기하기 전의 용적×100
아쥬반트 야기한 후 3일부터 투여 발(R)에서 부종이 인정되기 시작하여, Diclofenac-HA는 야기한 후 3, 5, 21일에 PBS군과 비교하여 통계학적으로 유의하고, 7, 26, 28일에서는 유의하지 않지만 발 부종 용적을 억제하는 작용을 보였다. 그 밖의 시점에서도 유의하진 않지만 어느 시점에서도 Diclofenac-HA군이 낮은 값을 도시했다.
비투여 발(L)은 야기한 후 14일부터 분명한 종창(이차 염증)이 인정되었다. 이 부종을 Diclofenac-HA는 야기한 후 14, 26일에 통계학적으로 의미 있게 억제했다. 또한, 21, 28일에 의미 있지는 않지만 억제 경향을 보였다.
한편, 이 래트 아쥬반트 관절염(AIA) 모델은 자기 면역 질환에 의한 관절염인 류머티스성 관절염의 모델로서 일반적으로 이용되고 있으며, 상기 결과로부터 본 발명 물질은 류머티스성 관절염에의 효과도 기대된다.
본 발명을 상세하게 또 특정한 실시형태를 참조하여 설명했지만, 본 발명의 정신과 범위를 일탈하지 않고서 여러 가지 변경이나 수정을 가할 수 있음은 당업자에게 있어서 분명하다.
본 출원은, 2004년 1월 7일 출원의 일본 특허 출원(특원 2004-2478)에 기초하는 것으로, 그 내용은 여기에 참조로서 받아들여진다. 여기에 인용되는 모든 참조는 전체적으로 받아들여진다.
본 발명에 의해, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통하여 히알루론산에 NSAIDs가 공유 결합으로 결합하고 있는 NSAIDs 도입 히알루론산 유도체, 마찬가지로 DMARD가 공유 결합으로 결합하고 있는 DMARD 도입 히알루론산 유도체 및 이들 유도체를 유효 성분으로서 함유하는 약제가 제공된다. NSAIDs 도입 히알루론산 유도체 및 DMARD 도입 히알루론산 유도체는, 주사제 등의 용매로서 사용되는 완충액에 잘 용해되기 때문에, 환부에 직접 투여 가능한 주사제로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명 약제는, 관절증의 치료, 염증의 억제나 동통의 억제에 이용할 수 있으며, 주입제로서 비경구 투여 또는 국소 투여(예컨대, 관절내 투여)도 가능하다.

Claims (35)

  1. 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통하여, 히알루론산에 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 히알루론산 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 항염증 화합물이 비스테로이드성 항염증 화합물 및 질환 수식성 항류머티스 화합물에서 선택되는 것인 히알루론산 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항염증 화합물이 카르복실기를 갖고 있는 것인 히알루론산 유도체.
  4. 제3항에 있어서, 항염증 화합물이, 살리실산, 아스피린, 메페남산, 톨페남산, 플루페남산, 디클로페낙, 설린닥, 펜부펜, 인도메타신, 아세메타신, 암페낙, 에토돌락, 펠비낙, 이부프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 프라노프로펜, 페노프로펜, 티아프로펜산, 옥사프로진, 록소프로펜, 알미노프로펜, 잘토프로펜, 피록시캠, 테녹시캠, 롤녹시캠, 멜록시캠, 티아라미드, 톨메틴, 디플루니살, 아세트아미노펜, 플록타페닌, 티노리딘 및 악타리트로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물의 잔기인 히알루론산 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 스페이서가, 히알루론산과 결 합하는 작용기 및 항염증 화합물과 결합하는 작용기를 각각 적어도 하나 이상 갖고 있는 화합물인 히알루론산 유도체.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 스페이서가, 탄소수 2∼18의 디아미노알칸, 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼12의 아미노알킬알콜 및 아미노산에서 선택되는 것인 히알루론산 유도체.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 히알루론산의 중량 평균 분자량이 500,000∼3,000,000인 히알루론산 유도체.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 항염증 화합물이, 히알루론산의 반복 2당 단위당 5∼50 몰% 도입되어 있는 것인 히알루론산 유도체.
  9. 히알루론산에 비스테로이드성 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 히알루론산 유도체로서, 항염증 화합물이 도입되어 있는 히알루론산 구성 2당 단위당의 부분 구조가 하기 화학식 1로 표시되며, 또한, 상기 히알루론산 유도체에 있어서의 비스테로이드성 항염증 화합물의 도입율은, 히알루론산의 반복 2당 단위당 5∼50 몰%이고, 히알루론산 유도체를 구성하는 히알루론산 잔기 중의 카르보닐기는 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기의 도입율에 따라, 그 스페이서 결합 항염증 화합물 잔기와의 결합에 관여하는 아미드 결합으로서 또는 관여하지 않는 유리된 카 르복실기로서 존재하는 것인 히알루론산 유도체:
    화학식 1
    Y-CO-NH-R1-(O-R2)n
    상기 화학식에서, Y-CO-는 히알루론산의 구성 2당 단위 1 잔기를 나타내고, R2는 Z-CO-으로 나타내어지는 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기 또는 수소 원자를 나타내며(단, 전부가 수소 원자인 경우를 제외함), -HN-R1-(O-)n은 n개의 히드록실기를 갖는 H2N-R1-(OH)n으로 나타내어지는 스페이서 화합물의 스페이서 잔기를 나타내고, R1은 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼12의 직쇄 혹은 분기를 갖는 탄화수소기를 나타내며, -CO-NH-는 히알루론산의 구성당인 글루쿠론산의 카르복실기와 스페이서 화합물이 갖는 아미노기의 아미드 결합을 나타내고, -O-CO-는 스페이서 화합물이 갖는 수산기와 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기가 갖는 카르복실기의 에스테르 결합을 나타내며, n은 1∼3의 정수를 나타낸다.
  10. 제9항에 있어서, 비스테로이드성 항염증 화합물이, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 히알루론산 유도체:
    화학식 2
    Figure 112006056318722-PCT00008
    상기 화학식에서, R3은 저급 알킬기 및 저급 알콕실기에서 선택되는 치환기 또는 수소 원자를 나타내며, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로, 저급 알킬기, 저급 알콕실기 및 히드록실기로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기, 할로겐 원자 또는 수소 원자를 나타내고, X는 각각 독립적으로 동일하거나 상이하며, 저급 알킬기 및 트리플루오로메틸기에서 선택되는 치환기 또는 할로겐 원자를 나타내고, 적어도 X의 어느 하나는 할로겐 원자이다.
  11. 제10항에 있어서, 비스테로이드성 항염증 화합물이 디클로페낙 또는 그 유도체인 히알루론산 유도체.
  12. 제9항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 1에서 R1이, 치환기를 갖고 있더라도 좋은 에틸렌기, 트리메틸렌기 또는 프로필렌기인 히알루론산 유도체.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 히알루론산과 스페이서 결합 항염증 화합물을 반응시키거나 혹은 스페이서 결합 히알루론산과 항염증 화합물을 반응시키고, 이어서 이 반응액을 알카리성 조건으로 하는 공정을 포함하는 방법에 의해서 얻어질 수 있는 히알루론산 유도체.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체를 1.0 중량%로 수성 매체에 용해하여 얻어지는 용액이, 24℃의 온도 조건 하에, 5.0 kg/cm2의 가압 하에서 다공질 필터[구멍 직경(포어 사이즈) 0.45 μm, 직경 25 mm]를 1분 동안에 2 mL 이상 통과 가능한 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
  15. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체를 1.0 중량%로 수성 매체에 용해하여 얻어지는 용액이, 24℃의 온도 조건 하에, 5.0 kg/cm2의 가압 하에서 다공질 필[(구멍 직경(포어 사이즈) 0.22 μm, 직경 25 mm]를 1분 동안에 2 mL 이상 통과 가능한 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 기재한 히알루론산 유도체가 수성 매체에 용해된, 주입구(注入具)에 의해 압출 가능한 히알루론산 유도체 용액.
  17. 제16항에 있어서, 수성 매체가, 인산 완충 생리식염수, 생리식염수 및 주사용수에서 선택되는 수성 매체인 히알루론산 유도체 용액.
  18. 제17항에 있어서, 여과 멸균된 히알루론산 유도체 용액.
  19. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 기재한 히알루론산 유도체를 유효 성분으로서 함유하는 약제.
  20. 제19항에 있어서, 관절증 처치제, 항염증제 또는 진통제인 약제.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 비경구 투여용인 약제.
  22. 제21항에 있어서, 국소 투여용의 주입제인 약제.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 관절 투여용의 주입제인 약제.
  24. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 기재한 히알루론산 유도체를 유효 성분으로서 함유하고, 또한 이 히알루론산 유도체를 수성 매체에 용해한 용액으로 이루어지는, 주입구에 의해 압출할 수 있는 약제.
  25. 제16항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 기재한 히알루론산 유도체 용액이, 이 용액을 압출하는 것이 가능한 주입구에 충전된 히알루론산 유도체 주입용 키트.
  26. 제25항에 있어서, 충전된 용액이 제19항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 기재한 약제인 키트.
  27. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 기재한 히알루론산 유도체를 약학적으로 허용되는 인산 완충 생리식염수, 생리식염수 또는 주사용수에 용해한 용액을 주사통에 충전하고, 약제 압출용 플런저로 미끄럼 이동 가능하게 밀봉하여 이루어지는 의료용 주사제 키트.
  28. 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서와 항염증 화합물이 공유 결합한 유도체.
  29. 제28항에 있어서, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서가, 디아미노알칸, 아미노알킬알콜 또는 아미노산의 잔기인 유도체.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서가, 이 스페이서 1 분자에 대하여 2개 이상의 항염증 화합물을 결합할 수 있는 화합물의 잔기인 유도체.
  31. 제28항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 항염증 화합물이, 살리실산, 아스피린, 메페남산, 톨페남산, 플루페남산, 디클로페낙, 설린닥, 펜부펜, 인도메타신, 아세메타신, 암페낙, 에토돌락, 펠비낙, 이부프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 프라노프로펜, 페노프로펜, 티아프로펜산, 옥사프로진, 록소프로펜, 알미노프로펜, 잘토프로펜, 피록시캠, 테녹시캠, 롤녹시캠, 멜록시캠, 티아라미드, 톨메틴, 디플루니살, 아세트아미노펜, 플록타페닌, 티노리딘 및 악타리트로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물의 잔기인 유도체.
  32. 제28항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 공유 결합이 에스테르 결합 또는 아미드 결합인 유도체.
  33. 제32항에 있어서, 하기 화학식 3으로 나타내어지는 유도체.
    화학식 3
    H2N-R1-(O-R2)n
    상기 화학식에서, R2는 Z-CO-로 나타내어지는 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기 또는 수소 원자를 나타내고(단, 전부가 수소 원자인 경우를 제외함), H2N-R1-(O-)n은 n개의 히드록실기를 갖는 H2N-R1-(OH)n으로 나타내어지는 스페이서 화합물의 스페이서 잔기를 나타내며, R1은 치환기를 갖고 있더라도 좋은 탄소수 2∼12의 직쇄 혹은 분기를 갖는 탄화수소기를 나타내고, -O-CO-는 스페이서 화합물이 갖는 수산기와 비스테로이드성 항염증 화합물 잔기가 갖는 카르복실기의 에스테르 결합을 나타내며, n은 1∼3의 정수를 나타낸다.
  34. 히알루론산과 스페이서 결합 항염증 화합물을 반응시키거나 혹은 스페이서 결합 히알루론산과 항염증 화합물을 반응시키는 것을 특징으로 하는, 생체 내에서 분해될 수 있는 부위를 갖는 스페이서를 통하여 히알루론산에 항염증 화합물이 공유 결합으로 결합하고 있는 히알루론산 유도체의 제조 방법.
  35. 제34항에 있어서, 히알루론산과 스페이서 결합 항염증 화합물의 반응 생성물 혹은 스페이서 결합 히알루론산과 항염증 화합물의 반응 생성물의 용액을, 알카리성 조건 하에서 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 제조 방법.
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