CN108524948B - 一种透明质酸衍生化的非甾体抗炎抗癌药物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种透明质酸衍生化的非甾体抗炎抗癌药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种透明质酸衍生化的抗炎抗癌药物，对于炎症和癌症的治疗具有非常重要和长远的意义，包括透明质酸主链和非甾体抗炎抗癌药物侧链，所述的透明质酸和非甾体抗炎抗癌药物通过酰胺键连接。本发明具有很高的载药量，修饰度为30％‑70％，避免了现有技术中的非甾体抗炎抗癌药物的无选择则性杀伤正常细胞的毒副作用，物理化性质稳定，避免小分子透明质酸杂质促进炎性疾病恶化的风险，生物相容性和生物降解性远远高于非甾体抗炎抗癌药物分子本身，有效降低TNF‑α，IL‑1β和IL‑6促炎因子的细胞浓度，有效抑制多种癌细胞的增殖。

Description

一种透明质酸衍生化的非甾体抗炎抗癌药物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种非甾体抗炎抗癌药物，具体涉及一种透明质酸衍生化的非甾体抗炎抗癌药物及其制备方法和在炎症和癌症的治疗应用。
背景技术
非甾体类抗炎药(NSAIDs)是指药物分子中不含有甾体结构，临床上非甾体类药物主要用来治疗结缔组织疾病，如风湿、类风湿性、关节炎、风湿热、骨关节炎、红斑狼疮和强直性脊椎炎等疾病。大多数非甾体类抗炎药作为环氧合酶(COX)的非选择性抑制剂发挥抗炎和镇痛作用，相对于皮质激素类抗炎药物不易产生依赖性，大部分非甾体抗炎药除了具有抗炎作用外，还具有解热镇痛作用。对于一些反复发作和用药周期长的炎症(例如封闭性炎症)，长期使用。非甾体类抗炎药可能引发心脏衰竭、胃肠道损伤、溃疡和肾功能衰竭。非甾体类抗炎药还可导致严重的过敏反应，使药物过敏人群无法使用，对年轻人群也有特殊的危害，有时甚至对儿童和青少年造成致命的肝脏损伤和永久性的脑损伤。此外，长期慢性的炎症反应会在病灶处形成屏障，构成炎症治疗的障碍，使非甾体类抗炎药无法发挥应有的治疗效果。
NSAIDs也具有抗癌细胞活性。非甾体类抗炎药主要作用于(COX-1，COX-2)(Boodram J.N.et al,2016,Angew.Chem.Int.Ed.55:2845)和脂氧合酶(LOX)(Feng J.etal,2014,Dalton Trans.43:10930)。肿瘤中的COX-1，COX-2和LOX通常表达上调，特别是COX-2在多种肿瘤中呈现过表达的表型(Markworth J.F.et al,2013,Am J Physiol RegulIntegr Comp Physiol.,305:R1281)。COX-1和COX-2主要参与前列腺素的合成(ViegasA.et al,2011,J.Med.Chem.54:8555)，LOX参与合成顺式/反式的羟基二十烷酸(HETEs)(Luci D.K.et al,2014，J.Med.Chem.57:495,Czapski G.A.et al,2016,Neurochem.Res.41:243)。COX-1在肾血流量的调控、胃粘膜微循环和维持正常血小板功能中起到重要作用(Vitale P.et al,2013,J.Med.Chem.56:4277)。COX-2的生物功能已被明确指出与细胞有丝分裂相关(Mont F.J.et al,2004,J.Med.Chem.47:6749)。LOX在血管生成中起重要作用的(Kim T.Y.et al,2016,Biochem.Biophys.Res.Commun.478:1117)。因此，COX和LOX是NSAIDs目前已知的抗癌活性的主要作用机理靶点。除此之外，NSAIDs的作用还包括促进p53介导的肿瘤细胞凋亡，通过降低表皮生长因子(EGF)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)在肿瘤细胞中的表达抑制肿瘤生长，以及促进肿瘤抑制基因的表达(IshiharaA.T.et al,2007，Biochem.Biophys.Res.Commun.356:711,Zhang Y.et al,2015,ACSMed.Chem.Lett.6:1086，Kim M.S.et al,2014,Cancer Prev.Res.7(2):236)。甲氨蝶呤为抗癌和抗炎的双效药物，已被应用于急性白血病、恶性淋巴瘤、头颈部癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌的临床治疗，当炎症患者不能得益于其他非甾体类抗炎药时，可以考虑使用甲氨蝶呤。但由于甲氨蝶呤本身的毒副作用，其剂量的使用需严格监控，过于频繁的服用甲氨蝶呤，会抑制骨髓造血并侵害免疫系统加重感染甚至存在致命的危险。
透明质酸(HA)是在动物组织中分布广泛的高分子量多糖。透明质酸在动物细胞表面合成，由N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸的单糖单元交替组成，是细胞外基质(Extracellular matrix)的主要成分。HA中的葡萄糖醛酸在生理条件成去质子化形式，带负电荷，具有极强的吸水性，平均1g HA可以吸附1L水，其独特的物理、化学性质性，使HA具有保护软骨表面所需的粘弹性和润滑作用。
HA可与细胞表面受体结合，激活细胞内信号转导，在生物系统中发挥各种生理和病理作用。细胞表面有几种同源的透明质酸结合蛋白。这些透明质酸受体同属于hyaluronan and proteoglycan link proteins(HAPLN)的亚家族，在许多组织中广泛表达。包括：CD44，LYVE-1(淋巴管内皮透明质酸受体)，HARE/STABILIN-2(肝透明质酸清除受体)和STABILIN-1。STABILIN-1在活化的巨噬细胞上大量表达(
Figure BDA0001729224610000021
K.et al,2014，Int J Clin Exp Pathol.7(4):1625)。CD44在多种癌细胞表面均呈现表达量的上调(Bukowska B.et al,2015,Ginekol Pol.86(5):388)。据报道CD44在某些类型的炎性关节炎如类风湿性关节炎中上调，小分子量透明质酸可与CD44相互作用参与活化TLR介导的炎症反应，影响细胞基质分子，促进炎性疾病的恶化，许多细胞因子cytokines被诱导并且在慢性炎症条件下具有较高的水平。Toll样受体或TLR介导的人体先天性免疫。TLR4突变体可以诱导NF-κB活化并因此增加促炎细胞因子的产生(Medzhitov，R.et al,1997，Nature388：394)。通过先天性免疫系统识别细菌脂多糖(LPS)可导致以TNF，IL-1，IL-6和IL-8等细胞因子的产生为特征的炎症反应；以及ICAM-1的基因激活(Lu Y.C.et al.Cytokine.2008；42：145-51)。同时许多细胞表达CD44的变体，即RHAMM受体，它参与细胞运动和细胞转化与炎症和多种肿瘤、癌症的转移性扩散密切相关(Misra S.et al,2015,Front Immunol.6:201)。
发明内容
本发明的目的是提供一种透明质酸衍生化的抗炎抗癌药物，对于炎症和癌症的治疗具有非常重要和长远的意义，包括透明质酸主链和非甾体抗炎抗癌药物侧链，所述的透明质酸和非甾体抗炎抗癌药物通过酰胺键连接。
透明质酸衍生化的抗炎抗癌药物的化学结构式如下：
Figure BDA0001729224610000031
其中：A-COOH为非甾体抗炎抗癌药物。
本发明更优的技术方案：所述的透明质酸的分子量为≥30kDa，此分子量的透明质酸衍生物无促炎性，可与受体蛋白结合，同时分子量小于100kDa具备皮肤渗透性能力。
本发明更优的技术方案：所述的侧链的非甾体抗炎抗癌药物为阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、石胆酸、甲芬那酸、吲哚美辛、吲哚乙酸等。
本发明提供的以非甾体抗炎抗癌药物为侧链的透明质酸衍衍生物是透明质酸去乙酰化后与非兹体抗炎和抗癌药物的羧基反应获得，使用抗炎抗癌活性药物修饰透明质酸得到一系列具有靶向性抗炎抗癌活性的透明质酸衍生化的非甾体抗炎抗癌药物，修饰度为30％-70％，制备方法如下：
A、透明质酸的去乙酰化反应：
将透明质酸与硫酸联氨以质量比2:1溶于一水合肼中，搅拌至完全溶解后，在65℃水浴条件下反应72h后，反应在冰冷水浴中淬灭反应，产物用冷乙醇洗涤两次并在室温下真空干燥，抽滤后冻干后得到的聚合物重新溶解于体积比3:1为5％的乙酸和0.5mol/L的碘酸的混合液中，放置在4℃条件下保持时间为1.5h以上，再加入57％碘甲烷搅拌反应后将深紫色溶液转移到分液漏斗中，使用乙醚萃取紫色混合液，回收含部分脱乙酰透明质酸的水层，并用乙醚重复萃取直至完全褪色，用盐酸和氢氧化钠调节聚合物溶液的pH至7.0-7.5，用冷乙醇使脱乙酰透明质酸沉淀，用冷乙醇洗涤并干燥后溶于蒸馏水中，用8kDa分子透析袋透析样品5天，真空冷冻干燥后得到去乙酰化的透明质酸，去乙酰化的比例为30-40％，分子量约为40kDa；
B、非甾体抗炎抗癌药物修饰的透明质酸衍生物的合成：
将非甾体抗炎抗癌药物溶解于DMSO，搅拌至完全溶解，加入等摩尔的EDCL搅拌至溶解；然后加入等摩尔的HoBt搅拌至溶解，用HCl调节溶液pH约为5，室温下搅拌1小时后，逐滴加入溶解超纯水中的DHA，搅拌至完全溶解，在40度下反应72小时，反应液中滴入NaHCO3调节pH至中性，透析5天，溶液真空冷冻干燥后得到透明质酸衍生化的抗炎抗癌药物。所得非甾体抗炎抗癌药物修饰的透明质酸衍生物中非甾体抗炎抗癌药物含量为30-70％，分子量约为30kDa。
本发明还提供透明质酸衍生化药物的凝胶剂型制备，可用于修复物理屏障，1000克所述的凝胶组成如下：
Figure BDA0001729224610000041
本发明的有益效果如下：
1、靶向性：本发明的透明质酸衍生化的非甾体抗炎抗癌药物具有很高的载药量，修饰度为30％-70％，避免了现有技术中的非甾体抗炎抗癌药物的无选择则性杀伤正常细胞的毒副作用，同时本发明制备的透明质酸类药物理化性质稳定，避免小分子透明质酸杂质促进炎性疾病恶化的风险。
2、生物相容性和生物降解性：本发明公开的透明质酸衍生化的非甾体抗炎抗癌药物在内源性透明质酸生物大分子结构基础上构建，不会产生抗体，降低了药物本身的毒性，其生物相容性和生物降解性远远高于非甾体抗炎抗癌药物分子本身。
3、抗炎性：有效降低TNF-α，IL-1β和IL-6促炎因子的细胞浓度。
4、抗癌细胞生长活性：有效抑制多种癌细胞的增殖。
附图说明
图1为本发明的透明质酸衍生化的抗炎抗癌药物的合成路线图；
图2为透明质酸、去乙酰化透明质酸和本发明的透明质酸衍生化的抗炎抗癌药物的1H NMR谱图；
图3为萘普生和萘普生修饰的透明质酸对乳腺癌细胞增殖的抑制效果对比图，其中灰色：MDA-MB-213细胞，条纹：MCF-7细胞，萘普生的剂量为0-250μg，萘普生修饰的透明质酸的剂量为50和100μg；
图4为萘普生和萘普生修饰的透明质酸对A549细胞中COX的活性抑制效果对比图，条纹：COX-1活性(％)，灰色：COX-2活性(％)；
图5为不同剂量的萘普生修饰的透明质酸的抗炎活性对比图，灰色：TNFα，条纹：IL-1，黑色：IL-6，剂量单位：μg；
图6为甲氨蝶呤和甲氨蝶呤修饰的透明质酸对乳腺癌细胞增殖的抑制效果对比图，白色：MDA-MB-231乳腺癌细胞，灰色：MCF-7乳腺癌细胞，甲氨蝶呤的剂量为0-250μg,氨蝶呤修饰的透明质酸的剂量为100和200μg；
图7为甲氨蝶呤修饰的透明质酸的抗癌细胞增殖活性，圆：MCF-7乳腺癌细胞，方：MDA-MB-231乳腺癌细胞，三角：PC-3前列腺癌细胞。
具体实施方式
本发明涉及一系列以非兹体抗炎和抗癌药物为侧链的透明质酸衍生物，通过透明质酸的去乙酰化反应得到去乙酰化的透明质酸，再与一系列非兹体抗炎和抗癌药物反应，得到一系药物分子修饰的透明质酸衍生物，修饰度为30％-70％，所述的非兹体抗炎抗癌药物例如：阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、石胆酸、甲芬那酸、吲哚美辛、吲哚乙酸等。
实施例1
本发明涉及的透明质酸衍生化的非甾体抗炎抗癌药物以二糖单元为例，合成反应如图1所示，所述的非甾体抗炎抗癌药物为萘普生，具体合成步骤如下：
一、透明质酸的去乙酰化反应。
6g的完整透明质酸与3g的硫酸联氨溶于300ml的一水合肼中，搅拌至完全溶解后，在65℃水浴条件下反应72h后，反应在冰冷水浴中淬灭反应，产物用冷乙醇沉淀。该产物用冷乙醇洗涤两次并在室温下真空干燥，抽滤后冻干。将干燥的聚合物重新溶解于100ml的5％的乙酸和60ml的0.5mol/L的碘酸的混合液中，将混合物放置在4℃条件下保持至少1.5h。向化合物中加入17.5ml的57％碘甲烷，搅拌反应15min。将深紫色溶液转移到分液漏斗中，使用150ml乙醚萃取紫色混合液，回收含部分脱乙酰透明质酸的水层，并用乙醚重复萃取直至完全褪色。用盐酸和氢氧化钠调节聚合物溶液的pH至7.0-7.5，用冷乙醇使脱乙酰透明质酸沉淀，用冷乙醇洗涤并干燥。然后将产物溶于蒸馏水中，用8kDa分子透析袋透析样品5天，冷冻后，真空冷冻干燥。所得去乙酰化的比例为30-40％，分子量约为40kDa。
二、药物修饰的透明质酸衍生物的合成，反应全过程在氩气的保护下进行。
称取将0.4606g(2mmol)萘普生溶解于6mL的DMSO，搅拌至完全溶解。将2mmol质量为0.3834g的EDCL加入至反应瓶中，搅拌至溶解。将2mmol质量为0.2702g的HoBt加入至反应瓶中，搅拌至溶解。用1M HCl调节溶液pH至5左右，室温下搅拌1小时后，将40mg DHA溶解于2ml超纯水中，逐滴加入到反应夜中，搅拌至完全溶解。在40度下反应72小时。反应液中滴入NaHCO3调节pH至中性，透析5天，溶液真空冷冻干燥。
实施例2，本实施例与实施例1的区别在于：所述的非甾体抗炎抗癌药物为布洛芬。
称取将0.4126g(2mmol)布洛芬溶解于6mL的DMSO，搅拌至完全溶解。将2mmol质量为0.3834g的EDCL加入至反应瓶中，搅拌至溶解。将2mmol质量为0.2702g的HoBt加入至反应瓶中，搅拌至溶解。用1M HCl调节溶液pH至5左右，室温下搅拌1小时后，将40mg DHA溶解于2ml超纯水中，逐滴加入到反应夜中，搅拌至完全溶解。在40度下反应72小时。反应液中滴入NaHCO3调节pH至中性，透析5天，溶液真空冷冻干燥。
实施例3，本实施例与实施例1的区别在于：所述的非甾体抗炎抗癌药物为甲氨蝶呤。
称取将0.9088g(2mmol)甲氨蝶呤溶解于6mL的DMSO，搅拌至完全溶解。将2mmol质量为0.3834g的EDCL加入至反应瓶中，搅拌至溶解。将2mmol质量为0.2702g的HoBt加入至反应瓶中，搅拌至溶解。用1M HCl调节溶液pH至5左右，室温下搅拌1小时。1小时后，将40mgDHA溶解于2ml超纯水中，逐滴加入到反应夜中，搅拌至完全溶解。在40度下反应72小时。反应液中滴入NaHCO3调节pH至中性，透析5天，期间有未反应的甲氨蝶呤固体析出，过滤除去固体，取澄清的溶液真空冷冻干燥。
将以上实施例制备得到的透明质酸、去乙酰化透明质酸和药物修饰的透明质酸的核磁共振检测。HA为透明质酸；DHA为部分去乙酰HA；HA-NP为萘普生修饰的HA；HA-IBU为布洛芬修饰的透明质酸；HA-MTX为甲氨蝶呤修饰的透明质酸；GlcA为D-葡萄糖醛酸；GlcNAc为N-乙酰-D-葡糖胺；GlcN为D-葡糖胺；GlcN-NP为连接萘普生的葡萄糖胺；GlcN-IBU为连接布洛芬的葡萄糖胺；Glc-MTX为连接甲氨蝶呤的葡萄糖胺。将10mg透明质酸(HA)、10mg去乙酰化透明质酸(DHA)、2mg萘普生修饰的透明质酸(HA-NP)和2mg甲氨蝶呤修饰的透明质酸(HA-MTX)分别溶在500μL D2O中制备样品溶液。使用500MHz Bruker核磁共振仪在348K下记录10mg样品在重水中的1H NMR谱，如图2所示。在透明质酸多糖中，每个二糖单元(-N-乙酰葡糖胺-葡萄糖醛酸-,GlcNAc-GlcA)中有两个端基质子，GlcNAc中有三个甲基质子，对应于甲基质子的信号与对应于端基质子的信号的积分比为1.5。在DHA的1H NMR谱中，2.4-2.5ppm处的三个甲基质子对4.9-5.3ppm处GlcNAc和GlcA的两个端基质子在处的积分比为Y(图5)，去乙酰化程度可根据下式计算：去乙酰化(％)＝[1.0-(Y/1.5)]·100％。
如图2所示，透明质酸二糖单位(GlcNAc-GlcA)部分去乙酰化，即部分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)转化为氨基葡萄糖(GlcN)。在5.10-5.09ppm处观察到GlcNAc-GlcA单元中对应于GlcNAc的端基质子作为双重峰。观察到GlcNAc-GlcA单元中GlcA的端基质子也在4.95-4.94ppm处呈双重峰。在5.18-5.31ppm处新近可见的较小峰，对应GlcN-GlcA单元的端基质子。观察到GlcN-GlcA单元中GlcN的端基质子在5.09-5.08ppm，呈双重峰。GlcNAc-GlcA单元中GlcA的端基质子也在4.94-4.93ppm被观察到呈双重峰。而在5.18-5.31ppm处可见新出现的较小峰，对应GlcN-GlcA单元的端基质子。在5.09-5.08ppm观察到GlcN-GlcA单元中GlcN的端基质子呈双重峰。在4.94-4.93ppm观察到，GlcN-GlcA单元中的GlcA的端基质子也呈双峰。在谱图中，三个甲基质子与端基质子的积分比计算为0.918。从这个比例计算出HA的去乙酰化的百分比为35％。NMR数据如下，HA:δ2.50(s,-CH3),δ4.49-3.80(m,other Hs onsugar ring),δ5.10-5.09(d,anomeric H on GlcNAc of HA),δ4.95-4.94(d,anomeric Hon GlcA of HA)。DHA:δ2.50(s,-CH3),δ4.49-3.80(m,other Hs on sugar ring),δ5.10-5.09(d,anomeric H on GlcNAc of HA),δ4.95(d,anomeric H on GlcA of HA),δ5.31(d,anomeric H on GlcNAc of DHA),δ5.18(d,anomeric H on GlcA of DHA)。HA-NP:δ2.50(s,-CH3 of HA),δ4.33-3.83(m,other Hs on sugar ring of HA),δ5.11(d,anomeric Hon GlcNAc of HA),δ4.94(d,anomeric H on GlcA of HA),δ5.32(d,anomeric H onGlcN-NP of HA-NP),δ5.17(d,anomeric H on GlcA of HA-NP)，δ7.72-8.33(aromatic Hon NP),δ4.55(-CH of NP),δ4.43(-OCH3 of NP),δ1.99(-CH3 of NP)。HA-MTX:δ2.50(s,-CH3 of HA),δ4.39-3.84(m,other Hs on sugar ring of HA),δ5.11(d,anomeric H onGlcNAc of HA),δ4.96(d,anomeric H on GlcA of HA),δ5.33(d,anomeric H on GlcN-MTX of HA-MTX),δ5.18(d,anomeric H on GlcA of HA-MTX)，δ9.20(-C(H)＝N-of MTX)，δ7.43-7.41,8.22-8.21(benzene H of MTX),δ5.41(-N-CH2 of MTX),δ4.43(-OCH3 ofMTX),δ4.13-4.12(-CH of MTX)，δ3.69(-CH3-N-of MTX)，δ2.94(-CH2-COOH of MTX)，δ2.72-2.71(-CH2-CH2-COOH of MTX)。
分析实施例1：对萘普生和甲氨蝶呤修饰的透明质酸的质谱分析。
使用配备有以扫描模式操作的电喷雾离子源的Triple-TOF 5600质谱仪(SCIEX，Concord，Canada)对样品进行分析。注射泵优化的MS参数如下：源温度＝550℃；离子喷雾电压＝-4500V；喷雾器气体(N 2)压力＝25psi，加热器气体(N 2)压力＝50psi，帘式气体压力＝25psi，DP＝-100V和CE＝-35eV。通过注射泵将浓度为10μg/ml的样品注射到质谱仪中，以TOF-MS扫描模式扫描HA及其衍生物的特定片段，HA和药物修饰的HA衍生物的的分子离子种类以及理论和实测的质荷比和相对强度如表1所示。数据采集由Analyst 1.6.1软件控制。在通过注射泵输注到Q-TOF MS系统后，以TOF-MS模式扫描样品溶液。从中可以观察到，质子数/电荷数的比值(m/z)值与预测的m/z非常相似，如表1所示。在HA样品的质谱中观察到GlcNAc和GlcA的m/z为396.1160，GlcNAc和GlcA的四糖观察到单电荷的m/z为(775.2257,797.2076)，双电荷的m/z为387.1089。通过TOF-MS光谱观察到的GlcN和GlcA另外的单电荷二糖(m/z 354.1053)，显示DHA样品由部分脱乙酰HA组成。在HA-NP的TOF-MS谱中观察到的另外的单电荷四糖GlcN-NP和GlcA(557.1825m/z),在HA-MTX的TOF-MS谱中观察到的另外的单电荷二糖GlcN-MTX和GlcA(790.2677m/z)根据目标峰计算其他相关峰的相对强度。得出萘普生修饰的透明质酸的百分比为66％，甲氨蝶呤修饰的透明质酸的百分比为37％。
表1
Figure BDA0001729224610000091
对萘普生修饰的透明质酸的抗癌活性评价：通过MTT实验检测萘普生修饰的HA衍生物对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-213细胞增殖的影响。如图3所示，萘普生修饰的HA衍生物抑制乳腺癌细胞生长的效果优于萘普生。
对萘普生修饰的透明质酸的抗炎活性评价：COX活性测定，通过监测氧化的N，N，N'，N'-四甲基对苯二胺(TMPD)在590nm处的吸光值测定测量细胞裂解液中COX活性(COX-1和COX-2)，使用COX-1和COX-2特异性抑制剂来区分COX-1和COX-2的活性。如图4所示，萘普生和萘普生修饰的透明质酸对A549细胞中COX-1和COX-2的活性抑制效果与药物剂量成正相关趋势，萘普生修饰的透明质酸中萘普生的含量为66％，其抑制效果优于同等计量的萘普生，可见透明质酸的修饰提高了萘普生抗癌能力，可有效降低萘普生使用剂量，减少副作用的产生。检测萘普生修饰的HA衍生物对脂多糖激发的RAW246.7巨噬细胞促炎因子表达的影响。使用酶联免疫吸附试剂盒测定TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8促炎因子的浓度。如图5所示，萘普生修饰的透明质酸有效降低TNF-α，IL-1β和IL-6促炎因子的细胞浓度。
对甲氨蝶呤修饰的透明质酸的抗癌活性评价：如图6所示，甲氨蝶呤抗癌药对乳腺癌细胞增殖的抑制效果与抗癌药呈浓度呈正相关趋势。甲氨蝶呤修饰的透明质酸中甲氨蝶灵的含量为37％，对癌细胞增殖的抑制效果优于等量的甲氨蝶灵单体。同时甲氨蝶呤修饰的透明质酸对MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖抑制效果明显，原因可能是MDA-MB-231细胞表面高表达的透明质酸受体，促进甲氨蝶呤修饰的透明质酸的细胞摄取，可减少化疗药物对正常细胞的伤害。甲氨蝶呤修饰的透明质酸对多种癌细胞的增殖抑制效果。使用MTT检测细胞增殖，甲氨蝶呤修饰的透明质酸的抗癌活性，有效抑制乳腺癌细胞的增殖。甲氨蝶呤修饰的透明质酸的抗癌细胞增殖活性如图7所示，抗癌细胞增殖的效果与甲氨蝶呤修饰的透明质酸的浓度成正相关趋势，且对透明质酸受体高表达的癌细胞MDA-MB-231乳腺癌细胞和PC-3前列腺癌细胞的抗增殖效果明显，对透明质酸受体低表达的MCF-7抗增殖效果较弱，说明甲氨蝶呤修饰的透明质酸对癌细胞增殖的抑制作用是结合癌细胞表面高表达的透明质酸受体CD44，通过细胞内吞机制实现的。

Claims (3)

1.一种透明质酸衍生化的抗炎或抗癌药物，其特征在于：由透明质酸主链和非甾体抗炎药物或抗癌药物侧链组成，所述的透明质酸和非甾体抗炎药物或抗癌药物通过酰胺键连接；化学结构式为，
Figure FDA0002339477970000011
其中：A-COOH为非甾体抗炎药物或抗癌药物；所述的侧链非甾体抗炎药物或抗癌药物为萘普生、甲氨蝶呤。
2.如权利要求1所述的一种透明质酸衍生化的抗炎或抗癌药物的制备方法，其特征在于：具体步骤如下，
A、透明质酸的去乙酰化反应：
将透明质酸与硫酸联氨以质量比2:1溶于一水合肼中，搅拌至完全溶解后，在65℃水浴条件下反应72h后，反应在冰冷水浴中淬灭反应，产物用冷乙醇洗涤两次并在室温下真空干燥，抽滤后冻干后得到的聚合物重新溶解于体积比3:1为5％的乙酸和0.5mol/L的碘酸的混合液中，放置在4℃条件下保持时间为1.5h以上，再加入57％碘甲烷搅拌反应后将深紫色溶液转移到分液漏斗中，使用乙醚萃取紫色混合液，回收含部分脱乙酰透明质酸的水层，并用乙醚重复萃取直至完全褪色，用盐酸和氢氧化钠调节聚合物溶液的pH至7.0-7.5，用冷乙醇使脱乙酰透明质酸沉淀，用冷乙醇洗涤并干燥后溶于蒸馏水中，用8kDa分子透析袋透析样品5天，真空冷冻干燥后得到去乙酰化的透明质酸；
B、非甾体抗炎或抗癌药物修饰的透明质酸衍生物的合成：
将非甾体抗炎或抗癌药物溶解于DMSO，搅拌至完全溶解，加入等摩尔的EDCL搅拌至溶解；然后加入等摩尔的HoBt搅拌至溶解，用HCl调节溶液pH为5，室温下搅拌1小时后，逐滴加入溶解超纯水中的部分去乙酰透明质酸，搅拌至完全溶解，在40度下反应72小时，反应液中滴入NaHCO3调节pH至中性，透析5天，溶液真空冷冻干燥后得到透明质酸衍生化的抗炎或抗癌药物。
3.利用如权利要求1所述的一种透明质酸衍生化的抗炎或抗癌药物制备得到的凝胶剂，其特征在于：1000克所述的凝胶组成如下：
卡波姆基质1-3g、尼泊金甲酯0.15-0.2g、对羟基苯酸丙酯0.015-0.02g、丙二醇5-10g、聚乙二醇1-2g、透明质酸衍生化的抗炎或抗癌药物0.1-5g、超纯水余量。
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