WO2016111356A1 - コンドロイチン硫酸誘導体及び膀胱疾患処置剤 - Google Patents

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compound
spacer
steroid
chondroitin sulfate
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宗外 成田
貴弘 畠中
裕子 吉田
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生化学工業株式会社
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a chondroitin sulfate derivative and a bladder disease treatment agent containing the same.
  • IC interstitial cystitis
  • IC interstitial cystitis
  • chondroitin sulfate see, for example, US Pat. No.
  • steroids have few side effects causing problems and low evidence of effectiveness, and there is no evidence to recommend them (for example, interstitial cystitis diagnostic guidelines (Japanese interstitial (See Cystitis Study Group / Guidelines Committee, January 10, 2007)).
  • a compound chondroitin sulfate-glycyl-prednisolone in which a group derived from prednisolone, which is a kind of steroid, is bonded to a group derived from chondroitin sulfate via a glycine residue has anti-arthritic activity.
  • the present invention provides a chondroitin sulfate derivative, a pharmaceutical composition containing the compound and a bladder disease treatment agent that can reduce systemic side effects of a steroid single agent and exhibit a higher effect than chondroitin sulfate and steroid single agent. The issue is to provide.
  • the present inventors have covalently bonded a group derived from steroid via a spacer having a specific structure to a group derived from chondroitin sulfate (hereinafter also referred to as “CS”).
  • CS chondroitin sulfate
  • the present invention has been reached.
  • the covalent bond between a group derived from CS and a group derived from steroid by selecting and interposing a spacer having a specific property between these groups, systemic side effects of a single steroid agent can be reduced.
  • the inventors have found that it can be reduced, and have reached the present invention.
  • R 1 represents a group selected from the group consisting of an electron donating group and a sterically hindered group
  • R 1 represents a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an electron donating group and a sterically hindered group
  • the electron donating group and the sterically hindering group in R 1 are a linear alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, a branched alkyl group having 3 to 12 carbon atoms, a cyclic alkyl group having 3 to 12 carbon atoms, and a carbon number.
  • the compound according to ⁇ 1> which is a group selected from the group consisting of an aryl group having 6 to 10 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 12 carbon atoms, an alkynyl group having 2 to 12 carbon atoms, and an aralkyl group having 7 to 12 carbon atoms. is there.
  • a pharmaceutical composition comprising the compound according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • ⁇ 6> A therapeutic agent for bladder disease comprising the compound according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • a method for treating a bladder disease comprising administering the agent for treating a bladder disease according to ⁇ 6> to a subject.
  • a urinary function improving agent comprising the compound according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • a urinary function improving method comprising administering the urinary function improving agent according to ⁇ 9> to a subject.
  • ⁇ 13> The compound according to ⁇ 12>, wherein the spacer has the same or lower release rate of the steroid from the compound than when a ⁇ -alanine residue is used as a spacer in the compound.
  • a method for producing a compound in which a group derived from CS and a group derived from steroid are covalently bonded via a spacer including at least the following steps 1 and 2; Step 1: Select a spacer that reduces the release rate of the steroid from this compound as compared to selecting a glycine residue as the spacer in the compound, and Step 2: via the spacer selected in Step 1. Then, covalently bonding a group derived from CS and a group derived from steroid.
  • the spacer selected in Step 1 has the same or smaller release rate of the steroid from this compound than when a ⁇ -alanine residue is selected as a spacer in the compound. It is the method as described in ⁇ 14>.
  • the above ⁇ 14> and ⁇ 15> may be a method for producing a pharmaceutical composition, a method for producing a bladder disease treatment agent, or a method for producing a urinary function improving agent containing the compound. Such ideas are also included. In this case, it may further include a step of blending pharmaceutically acceptable ingredients in accordance with the object of manufacture (pharmaceutical composition, bladder disease treatment agent, or urination function improving agent).
  • chondroitin sulfate derivative a pharmaceutical composition containing the compound and a bladder disease treatment agent that can reduce systemic side effects of a single steroid and exhibit higher effects than CS or a single steroid Can be provided.
  • 2 is a graph showing the effect of CS- ⁇ -alanyl-prednisolone, CS- ⁇ -alanyl-betamethasone and CS- ⁇ -alanyl-triamcinolone acetonide on the urination interval in a rat hydrochloric acid-induced frequent urination model.
  • 2 is a graph showing the effect of CS- ⁇ -alanyl-triamcinolone acetonide, CS-glycyl-triamcinolone acetonide and CS-isoleucil-triamcinolone acetonide on the urination interval in a rat hydrochloric acid-induced frequent urination model.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of CS- ⁇ -alanyl-triamcinolone acetonide, CS-glycyl-triamcinolone acetonide and CS-isoleucil-triamcinolone acetonide on thymus wet weight in a rat hydrochloric acid-induced frequent urination model. It is a graph which shows the effect
  • the term “step” is not limited to an independent step, and is included in the term if the intended purpose of the step is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other steps.
  • a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the content of each component in the composition means the total amount of the plurality of substances present in the composition unless there is a specific notice when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition.
  • chondroitin sulfate derivative which is a compound according to the present invention
  • a CS-derived group and a steroid-derived group are covalently bonded via a spacer represented by the following general formula (I). . —HN— (CH 2 ) m —CHR 1 —CO— (I)
  • m represents an integer of 0 or 1.
  • R 1 represents a group selected from the group consisting of an electron donating group and a sterically hindered group.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an electron donating group, and a sterically hindered group.
  • a chondroitin sulfate derivative in which a group derived from CS and a group derived from steroid are covalently bonded via a spacer having a specific structure reduces systemic side effects of a single steroid, and has anti-inflammatory effects or immunity The inhibitory action can be sustained for a long time.
  • the chondroitin sulfate derivative can achieve an excellent effect particularly as a therapeutic agent for bladder diseases.
  • systemic side effects caused by steroids can be reduced due to the specific structure of the spacer, and the effect is excellent particularly as a treatment for bladder disease by maintaining local drug efficacy. Can be played.
  • the chondroitin sulfate derivative contains at least one group derived from CS.
  • the group derived from CS is a group formed by removing a hydroxy group from a carboxy group of CS.
  • the CS constituting the chondroitin sulfate derivative has a sulfate chain in the sugar chain skeleton formed by repeating disaccharides of D-glucuronic acid (or D-iduronic acid) and N-acetyl-D-galactosamine in disaccharide units. There is no particular limitation as long as it has a retained structure.
  • the acidic functional group containing a carboxy group and a sulfate group possessed by CS may be in a free state where no salt is formed or in a state where a pharmaceutically acceptable salt is formed.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt include salts with alkali metal ions such as sodium salt and potassium salt, salts with alkaline earth metal ions such as magnesium salt and calcium salt, and the like.
  • CS is preferably a pharmaceutically acceptable salt with an alkali metal ion, and more preferably a sodium salt, from the viewpoint of applicability to living bodies and affinity.
  • the CS constituting the chondroitin sulfate derivative can be produced by a known method depending on the type of CS.
  • Examples of the CS production method include extraction and purification from animal-derived materials, culture and purification from chondroitin-producing bacteria, sugar chain modification, sugar chain synthesis, and the like.
  • the weight average molecular weight of CS is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the weight average molecular weight is preferably 500 to 120,000, more preferably 2,500 to 60,000, and still more preferably 10,000 to 40,000.
  • the weight average molecular weight of CS can be measured by a light scattering method.
  • the chondroitin sulfate derivative contains at least one group derived from a steroid.
  • the group derived from a steroid is a group formed by removing a hydrogen atom from a hydroxy group of a steroid molecule.
  • the position where the hydrogen atom is removed is not particularly limited.
  • the kind of steroid which comprises a chondroitin sulfate derivative is not specifically limited, According to the objective etc., it can select suitably.
  • Specific examples of the steroid include prednisolone, betamethasone, triamcinolone, triamcinolone acetonide, budesonide, fluticasone and the like, and at least one selected from the group consisting of these is preferably used.
  • Steroids may be used alone or in combination of two or more.
  • the covalent bond between the steroid-derived group and the spacer is a covalent bond that can be decomposed in the living body and formed by a condensation reaction from the viewpoint of controlling the release rate of the steroid from the chondroitin sulfate derivative. Is preferable, and an ester bond is more preferable.
  • the steroid is liberated by the decomposition (preferably solvolysis) of the covalent bond between the steroid-derived group and the spacer. After the covalent bond between the CS-derived group and the spacer is decomposed, the covalent bond between the steroid-derived group and the spacer may be decomposed to release the steroid.
  • Chondroitin sulfate derivatives are derived from steroids, from the viewpoint of controlling the release rate of steroids, a group derived from CS and a spacer (—HN— (CH 2 ) m —CHR 1 —CO—) are covalently bonded via an amide bond.
  • the group and the spacer are preferably covalently bonded by an ester bond. That is, the compound that forms a spacer (hereinafter also referred to as a spacer-forming molecule) is preferably a compound (for example, an amino acid) having a structure containing a carboxy group and an amino group in the molecular structure.
  • a chondroitin sulfate derivative formed by an amide bond between the carboxy group of CS and the amino group of the spacer forming molecule and an ester bond between the hydroxy group of the steroid and the carboxy group of the spacer forming molecule is preferable.
  • the spacer is a divalent linking group represented by the general formula (I).
  • M in the general formula (I) represents an integer of 0 or 1.
  • R 1 represents an electron donating group or a sterically hindered group.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an electron donating group or a sterically hindered group.
  • the number of m and the presence or absence of the electron donating group or sterically hindering group of R 1 affect the decomposition rate of the ester bond between the steroid-derived group and the spacer.
  • sterically hindered group means a bulky group that causes steric hindrance to chemical reactions such as solvolysis.
  • R 1 of the spacer is substituted with an electron donating group or a sterically hindered group
  • the covalent bond between the group derived from the steroid and the spacer is less likely to be decomposed than when R 1 is a hydrogen atom, The release rate decreases. The decrease in the release rate can be appropriately measured by the method described later.
  • the electron donating group or sterically hindered group is not particularly limited as long as it can be introduced into R 1 , and can be appropriately selected from commonly used electron donating groups or sterically hindered groups.
  • a linear alkyl group having 1 to 12 carbon atoms such as methyl group, ethyl group, propyl group and butyl group; 3 carbon atoms such as isopropyl group, isobutyl group, sec-butyl group and tert-butyl group
  • amino acids such as ⁇ -alanine, isoleucine, alanine, valine, leucine, and phenylalanine can be used as the spacer-forming molecule, and at least one selected from the group consisting of these is preferable.
  • ⁇ -alanine, isoleucine , Valine, and leucine are more preferable.
  • other amino acids having substituents other than those described above can be used as the spacer-forming molecule.
  • arginine As other amino acids, arginine, asparagine, serine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, proline, tyrosine, tryptophan, lysine, methionine, threonine, histidine and the like can be used.
  • One spacer-forming molecule may be used alone, or two or more spacer-forming molecules may be used in combination.
  • the spacer represented by the general formula (I) includes —HN— (CH 2 ) 2 —CO—, —HN—CH (CH (CH 3 ) CH from the viewpoint of an effect as a bladder disease treatment agent and suppression of side effects.
  • 2 CH 3) -CO -, - HN-CH (CH (CH 3) 2) -CO-, or -HN-CHCH 2 (CH (CH 3) 2) amino acid residues is preferably represented by -CO- , —HN— (CH 2 ) 2 —CO—, or —HN—CH (CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 ) —CO— is more preferable. That is, the spacer-forming molecule is preferably ⁇ -alanine, isoleucine, valine, or leucine, and more preferably ⁇ -alanine or isoleucine.
  • the chondroitin sulfate derivative can have various structures depending on the structure of CS and the like.
  • a structure containing at least one structural unit represented by the following chemical formula (II) can be exemplified.
  • each R 11 independently represents a hydrogen atom or a sodium salt of a sulfate group, but the cation moiety of the sulfate group salt is not limited to the exemplified sodium.
  • the number of sulfate group salts in R 11 is, for example, 0 to 4, preferably 0 to 3.
  • R 13 represents a group selected from the group consisting of a sterically hindered group and an electron donating group
  • R 14 represents a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a sterically hindered group and an electron donating group.
  • the chondroitin sulfate derivative may contain only one type of structural unit represented by the above chemical formula, or may contain two or more types in any proportion and in any positional relationship. It is preferable that the chondroitin sulfate derivative further includes a structural unit usually contained in CS in addition to the structural unit represented by the above chemical formula. Examples of the structural unit usually contained in CS include a structural unit in which R 12 in the formula (II) is represented by ONa or OH. However, the cation portion of the salt is not limited to the exemplified sodium.
  • the content ratio (weight ratio) of the steroid molecule covalently bound to CS via the spacer with respect to the chondroitin sulfate derivative is preferably 3 w / w% or more, more preferably 10 w / w% or more, and 30 w / More preferably, it is w% or more.
  • the content ratio of the steroid molecule can be appropriately selected according to the type of steroid molecule, the strength of the effect, the properties such as solubility in water, the type of spacer, and the like.
  • the rate of steroid release from the chondroitin sulfate derivative can be appropriately selected depending on the purpose and the like.
  • the rate of steroid release is, for example, preferably 0.1 to 4% / day, more preferably 0.1 to 3% / day in a 10 mM phosphate buffer at pH 7.4 and 36 ° C. More preferably, it is 0.5 to 1% / day.
  • the release rate of steroid is the amount of change per day in the release rate (%), with the horizontal axis representing time and the vertical axis representing the total number of moles of groups derived from steroids contained in the chondroitin sulfate derivative (100 %) Is defined as the slope of the graph when the release rate (%), which is the ratio of the steroid release amount (mole) to (%), is taken.
  • the graph is a monotonically increasing straight line. In this case, for example, when all the steroids contained in the chondroitin sulfate derivative are released in 10 mM phosphate buffer at pH 7.4 and 36 ° C. for 10 days, the release rate is expressed as 10% / day.
  • the release rate decreases with time without taking a constant value (the graph shows a gentle curve that is convex upward and monotonously increases)
  • the change in the release rate during the initial rise period for example, 3 days
  • the liberation rate is calculated by linear approximation.
  • the amount of steroid released is measured by a method appropriately selected according to the type of steroid.
  • the chondroitin sulfate derivative is composed of a functional group (for example, a carboxy group) possessed by a CS molecule and a functional group (for example, a hydroxy group) possessed by a steroid via a spacer having a specific structure. It can be obtained by covalent bonding.
  • a functional group for example, a carboxy group
  • a functional group for example, a hydroxy group
  • a chondroitin sulfate derivative obtained by covalently bonding a group derived from CS and a group derived from steroid via a spacer can be produced, for example, by a production method including the following steps. (A) condensing the hydroxy group of the steroid with the carboxy group of the spacer-forming molecule to form a covalent bond (ester bond); (B) A production method comprising: condensing a carboxy group of CS with an amino group of a spacer-forming molecule to form a covalent bond (amide bond).
  • step (A) the hydroxy group of the steroid and the carboxy group of the spacer-forming molecule are condensed and covalently bonded. At this time, the amino group to be reacted with CS of the spacer-forming molecule may be protected by a commonly used method as necessary.
  • step (B) the carboxy group of CS and the amino group of the spacer-forming molecule are condensed and covalently bonded. At this time, the carboxy group that is to react with the steroid of the spacer-forming molecule may be protected by a commonly used method if necessary.
  • the manufacturing method of a chondroitin sulfate derivative should just contain the step of (A) and the step of (B), and the order in which each step is performed is not limited.
  • the condensation (esterification, amidation) method may be appropriately selected from commonly used methods.
  • Examples of the condensation method include water-soluble carbodiimide (eg 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride), 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl ) -4-methylmorpholinium chloride hydrate (DMT-MM), a method using a condensing agent such as dicyclohexylcarbodiimide, a symmetric acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, and an active ester method. it can.
  • the condensation reaction conditions are appropriately selected according to the condensation reaction to be applied.
  • the spacer-forming molecule is preferably selected so that the desired rate of steroid release is obtained.
  • the spacer-forming molecule has a carboxy group that forms an ester bond with a steroid, an amino group that forms an amide bond with CS, and a linking group that links two reactive functional groups.
  • the linking group is preferably selected to control the rate of degradation of the ester bond with the steroid.
  • the method for selecting the spacer-forming molecule may be selected so that a desired decomposition rate can be achieved by appropriately combining m and R 1 .
  • the pharmaceutical composition contains at least one chondroitin sulfate derivative, and may further contain other components such as a pharmaceutically acceptable excipient as necessary.
  • other components include pharmaceutically acceptable excipients, surfactants, physiologically active substances, stabilizers, liquid media, and the like.
  • the physiologically active substance may be the same as or different from the steroid released from the chondroitin sulfate derivative.
  • the use of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and for example, it is preferably used for the treatment of bladder diseases.
  • a bladder disease treatment agent is a pharmaceutical composition containing at least one chondroitin sulfate derivative, and is used for the treatment of bladder disease.
  • the “treatment” used in the present specification may be any treatment given for a disease, and examples thereof include treatment of a disease, improvement, and suppression of progression (prevention of deterioration).
  • the form of the treatment agent is not particularly limited as long as it is a preparation or pharmaceutical form that can be administered to the human urethra / bladder, but the form at the time of administration is preferably a liquid, for example, a solution or suspension form. Is mentioned. Solutions and suspensions can also be administered by preparing a powder of chondroitin sulfate derivative at the time of use.
  • the agent for treating bladder disease is preferably used for intravesical administration.
  • the dose of the agent for treating bladder disease may be an amount sufficient to cover the entire mucous membrane in the bladder.
  • the concentration of the chondroitin sulfate derivative in the agent for treating bladder disease when administered as a liquid may be a concentration that allows passage through the catheter, for example, when administered using a urinary catheter, and can be adjusted as appropriate by those skilled in the art. .
  • Examples of the method for administering the therapeutic agent for bladder disease include a method in which a urinary catheter is inserted into the bladder under aseptic conditions and residual urine is discharged, and then injected through the catheter.
  • the therapeutic agent for bladder disease injected into the bladder reaches and adheres to the bladder wall while CS and steroid are covalently bonded via the spacer, and then the covalent bond between the spacer and steroid is gradually degraded.
  • the steroid is gradually released over a long period of time (for example, one week or more).
  • a bladder disease treatment agent can gradually release steroids in the bladder.
  • the time for which the steroid continues to be released in the bladder is preferably 168 hours (7 days) or more, and more preferably 336 hours (14 days) or more.
  • the frequency of intravesical administration of a bladder disease treatment agent can be determined from the kinetics of chondroitin sulfate derivatives and steroids released from chondroitin sulfate derivatives. For example, it can be given from once / weekly administration to once / monthly administration, but is not limited thereto.
  • bladder disease means a disease or some other abnormality occurring in the bladder, such as acute cystitis, chronic cystitis, interstitial cystitis, hemorrhagic cystitis, radiation cystitis, Includes overactive bladder.
  • the bladder disease treatment agent is preferably used particularly for interstitial cystitis among bladder diseases.
  • the concept of interstitial cystitis may include what is called bladder pain syndrome (Painful bladder syndrome: PBS / Bladder pain syndrome: BPS) and hypersensitive bladder syndrome (Hypersensitive bladder syndrome: HBS) .
  • the method for treating bladder disease includes a step of intravesically administering a bladder disease treatment agent.
  • the method for treating a bladder disease may further include other steps as necessary.
  • the method for treating bladder disease can be carried out in the same manner according to the explanation of “(4) Agent for treating bladder disease”, and preferable conditions and administration frequency of the treatment agent are the same as described above.
  • Urinating function improving agent “Improvement of urinary function” as used herein refers to improving some abnormality related to frequent urination and other urinary functions. That is, the urination function improving agent is an urinary function improving agent by administering the pharmaceutical composition into the urinary bladder and includes the concept of a frequent urination improving agent. As can be seen from the examples described later, the pharmaceutical composition can improve the urination function, for example, can significantly extend the urination interval or increase the amount of urination once, which is characteristic for interstitial cystitis, for example. Can also be used to improve chronic frequent urination.
  • the urination function improving agent can be implemented in the same manner according to the description of the above-mentioned method for treating bladder diseases, and the preferable condition and administration frequency of the improving agent are the same as described above.
  • the method for improving urination function includes a step of intravesically administering an agent for improving urination function.
  • the urination function improving method may further include other steps as necessary.
  • the method for improving urination function can be carried out in the same manner as described above in “(6) Urinary function improving agent”, and preferable conditions and administration frequency of the urinary function improving agent are the same as described above.
  • the present invention relates to a compound in which a group derived from CS and a group derived from steroid are covalently bonded via a spacer, a spacer having a predetermined property between these groups (a specific amino acid residue in this compound).
  • the chondroitin sulfate derivative of another embodiment of the present invention is a compound in which a group derived from CS and a group derived from steroid are covalently bonded via a spacer, Compared to the case where a glycine residue is used as a spacer in this compound, the release rate of the steroid from this compound is small. In particular, it is preferable to employ a spacer in which the release rate of the steroid from the compound is the same or smaller than when a ⁇ -alanine residue is used as a spacer in the compound.
  • the spacer molecule in another aspect of the chondroitin sulfate derivative may be a divalent linking group that links both a group derived from CS and a group derived from steroid, and in this compound, a glycine residue, preferably Is not particularly limited as long as the release rate of the steroid from this compound is smaller than when a ⁇ -alanine residue is used as a spacer.
  • Specific examples of the spacer include a divalent linking group represented by the general formula (I) described in the above (1) chondroitin sulfate derivative.
  • the release rate of the steroid of the above compound can be measured by the method described in the above (1) chondroitin sulfate derivative and the method of Test Example A2.
  • a compound having a specific structure is dissolved in a 10 mM phosphate buffer solution at pH 7.4 and 36 ° C., and the steroid release rate (%) after 1 week.
  • the steroid release rate (%) after 1 week can be determined by selecting a compound having a low steroid release rate from this compound as compared to a specific amino acid residue spacer.
  • Another aspect of the manufacturing method of a chondroitin sulfate derivative includes the other aspect of the manufacturing method of the chondroitin sulfate derivative shown below.
  • Another aspect of the method for producing a chondroitin sulfate derivative is a method for producing a compound in which a group derived from CS and a group derived from steroid are covalently bonded via a spacer, and (C) a glycine residue as a spacer in this compound Selecting a spacer that reduces the rate of release of the steroid from the compound as compared to selecting.
  • the production method can include a step of covalently bonding a group derived from CS and a group derived from steroid through the spacer selected as described above.
  • a step of covalent bonding a group derived from CS and a group derived from steroid through the spacer selected as described above.
  • this intermediate may be condensed with CS by a known method.
  • the steps (A) and (B) described in the method for producing a chondroitin sulfate derivative described above (2) can be included.
  • the selection of the spacer in the step (C) does not necessarily have to be performed continuously with other steps.
  • the spacer may be selected in advance, and the subsequent other steps may be performed at a later date. Good.
  • a method for producing a compound comprising a CS-derived group and a steroid-derived group covalently bonded via a spacer comprising at least the following steps 1 and 2; Step 1: selecting a spacer that reduces the release rate of the steroid from the compound as compared to selecting a glycine residue (more preferably a ⁇ -alanine residue) as the spacer in the compound; and 2: Covalently bond a group derived from CS and a group derived from steroid through the spacer selected in Step 1.
  • the production method may be a production method of the above-mentioned (3), (4) and (6) “pharmaceutical composition”, “bladder disease treatment agent”, “urination function improving agent” and the like.
  • a step of blending a pharmaceutically acceptable ingredient may be further included depending on the object of manufacture (pharmaceutical composition, bladder disease treatment agent, or urination function improving agent).
  • the steroid derived from this compound is compared with the case where a specific amino acid residue is used as a spacer in this compound.
  • Example 1 Preparation of 21- ⁇ -alanyl-prednisolone-introduced CS (1-1) Preparation of 21- (Boc- ⁇ -alanyl) -prednisolone Boc- ⁇ -alanine (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) 1.58 g Is dissolved in 60 mL of dichloromethane and 20 mL of dimethylformamide, prednisolone (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; hereinafter also abbreviated as “PRED”), 3.00 g, and 4-dimethylaminopyridine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 305 mg was added and dissolved.
  • PRED 4-dimethylaminopyridine
  • the precipitate was washed successively with 90% ethanol / distilled water and 95% ethanol / distilled water.
  • the resulting precipitate was dried overnight under reduced pressure to obtain 787 mg of the target 21- ⁇ -alanyl-prednisolone-introduced CS.
  • the prednisolone content (w / w%) introduced into CS by measuring absorbance at 248 nm, it was 35 w / w%.
  • Example 3 Preparation of 21- ⁇ -alanyl-triamcinolone acetonide-introduced CS (3-1) Preparation of 21- (Boc- ⁇ -alanyl) -triamcinolone acetonide 2.63 g of Boc- ⁇ -alanine in 40 mL of dichloromethane, And 5.01 g of triamcinolone acetonide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; hereinafter also abbreviated as “TA”) was added. Thereafter, 426 mg of 4-dimethylaminopyridine and 3.32 g of water-soluble carbodiimide were added under ice cooling, followed by stirring at room temperature overnight.
  • TA triamcinolone acetonide
  • Example 4 Preparation of 21-glycyl-triamcinolone acetonide-introduced CS (4-1) Preparation of 21- (Boc-glycyl) -triamcinolone acetonide Boc-glycine (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) 1.71 g of dichloromethane Dissolved in 30 mL and 10 mL of dimethylformamide, 4.01 g of triamcinolone acetonide was added. Thereafter, 338 mg of 4-dimethylaminopyridine and 2.65 g of water-soluble carbodiimide were added under ice cooling, followed by stirring at room temperature overnight.
  • Boc-glycine manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.
  • Example 5 Preparation of 21-Isoleucil-Triamcinolone Acetonide-Introduced CS (5-1) Preparation of 21- (Boc-Isoleucil) -Triamcinolone Acetonide Boc-Isoleucine (Watanabe Chemical Co., Ltd.) 2.24 g of dichloromethane Dissolved in 30 mL and 10 mL of dimethylformamide, 4.00 g of triamcinolone acetonide was added. Thereafter, 338 mg of 4-dimethylaminopyridine and 2.65 g of water-soluble carbodiimide were added under ice cooling, followed by stirring at room temperature overnight.
  • the molar extinction coefficient was calculated from compounds 2, 4, 6, 8, and 10 synthesized according to the method described in Examples 1 to 5. Table 1 below shows the molar extinction coefficient ( ⁇ ) of each compound and the molecular weight (MwST) of the steroid used.
  • borate buffer solution 0.62 g (10 mmol) of boric acid and 0.75 g (10 mmol) of potassium chloride were weighed and dissolved in 500 mL of distilled water to obtain a first solution. Separately, a 0.1M sodium hydroxide solution was diluted 10 times with distilled water to obtain a second solution. 50 mL of the first solution and 7 mL of the second solution were added to a 100 mL volumetric flask and made up to 100 mL with distilled water to prepare a pH 8.0 borate buffer solution.
  • CS- ⁇ Ala-PRED Change in release characteristics due to difference in drug type
  • CS- ⁇ Ala-BTM prepared according to the methods of Examples 1, 2, and 3, 36 ° C.
  • the drug release rate (%) in 1 week was evaluated by HPLC.
  • the drug release rate was evaluated every 24 hours. The results are shown below.
  • the release rate in CS- ⁇ Ala-PRED, CS- ⁇ Ala-BTM, and CS- ⁇ Ala-TA was the highest in CS- ⁇ Ala-PRED and CS- ⁇ Ala-PRED at both pH 7.4 and pH 8.0.
  • the release rates of -BTM and CS- ⁇ Ala-TA were approximately the same.
  • CS- ⁇ Ala-TA, CS-Gly-TA and CS-Ile-TA prepared according to the methods of Examples 3, 4 and 5, The weekly drug release rate (%) was evaluated by HPLC. The drug release rate was evaluated every 24 hours. The results are shown below.
  • the release rates in CS- ⁇ Ala-TA, CS-Gly-TA, and CS-Ile-TA were CS-Gly-TA> CS- ⁇ Ala-TA> CS- both at pH 7.4 and at pH 8.0. It was fast in the order of Ile-TA.
  • Test substance (1) Saline (Control) (2) 1.5% (w / v%) CS- ⁇ Ala-PRED (PRED content 35 w / w%) (3) 1.5% (w / v%) CS- ⁇ Ala-BTM (BTM content 40 w / w%) (4) 1.5% (w / v%) CS- ⁇ Ala-TA (TA content 38 w / w%)
  • Rats SD system (SPF), female, 11-13 weeks old were laparotomized under general anesthesia with pentobarbital (40 mg / kg, ip), the top of the bladder was incised, and a catheter (PE50) was inserted. Surgery for cystostomy was performed. 0.4M hydrochloric acid was used to induce cystitis. Seven days after the production of the bladder fistula, the rat was held in a Ballman cage under anesthesia, and a bladder catheter, a pressure transducer, and a syringe installed on a syringe pump were connected in parallel. The normal bladder pressure was measured while continuously injecting physiological saline (3 mL / h). 0.4 M hydrochloric acid was continuously infused into the bladder for 15 minutes (3 mL / h) to induce frequent urination.
  • the CS- ⁇ Ala-PRED administration group, the CS- ⁇ Ala-BTM administration group, and the CS- ⁇ Ala-TA administration group all showed a significant urination interval extending action as compared with the Control group.
  • the amount of urination once was significantly increased in the CS- ⁇ Ala-PRED administration group, the CS- ⁇ Ala-BTM administration group and the CS- ⁇ Ala-TA administration group as compared to the Control group. I let you.
  • Example B2 Evaluation of urinary function of CS-steroid compound using rat hydrochloric acid-induced frequent urination model (spacer comparison) Objective To evaluate the effect of chondroitin sulfate derivatives with different spacers (CS- ⁇ Ala-TA, CS-Gly-TA and CS-Ile-TA) on urinary function after single administration into the rat hydrochloric acid-induced frequent urination model Aimed at that.
  • Test substance (1) Saline (Control) (2) 1.5% (w / v%) CS- ⁇ Ala-TA (TA content 37 w / w%) (3) 1.5% (w / v%) CS-Gly-TA (TA content 37 w / w%) (4) 1.5% (w / v%) CS-Ile-TA (TA content 35 w / w%)
  • Body weight changes were measured four times before surgery, immediately after surgery and immediately before inducing hydrochloric acid, immediately before test substance administration (before drug administration), and immediately before intravesical pressure measurement (Cystometry). In the individual, it was shown as a relative value with 100% before surgery.
  • the thymus wet weight was measured by collecting the thymus from euthanized rats after measuring intravesical pressure (Cytomometry). Changes in body weight are shown in Table 5 below, and thymic wet weight is shown in FIG.
  • the CS- ⁇ Ala-TA administration group, the CS-Gly-TA administration group, and the CS-Ile-TA administration group all showed a significant urination interval extending action as compared with the Control group.
  • the amount of urination once was increased in the CS- ⁇ Ala-TA administration group, the CS-Gly-TA administration group and the CS-Ile-TA administration group as compared with the Control group. . From this result, it was found that even if Ile was used as a spacer-forming molecule, it showed medicinal effects. It was found that CS- ⁇ Ala-TA also shows a medicinal effect with good reproducibility. From FIG.
  • the CS- ⁇ Ala-TA administration group and the CS-Ile-TA administration group did not show any significant decrease in thymus wet weight compared to the Control group, but only the CS-Gly-TA administration group. A significant decrease in thymic wet weight was observed.
  • weight loss was not observed in the CS- ⁇ Ala-TA administration group and the CS-Ile-TA administration group, but only in the CS-Gly-TA administration group. Weight loss was observed.
  • Example B3 Evaluation of urinary function of CS-steroid compound using rat hydrochloric acid-induced frequent urination model (comparison between conjugate and mixed solution) Objective The purpose of this study was to evaluate the effect on the urination function when a single solution of CS- ⁇ Ala-BTM and a mixture of CS and betamethasone (hereinafter referred to as BTM) was administered into the bladder of a rat hydrochloric acid-induced frequent urination model.
  • BTM a mixture of CS and betamethasone
  • Test substance (1) Saline (Control) (2) 3% (w / v%) CS- ⁇ Ala-BTM (BTM content 34 w / w%) (3) 3% CS + 0.86% BTM mixed solution
  • Rats SD system (SPF), female, 10-13 weeks old were laparotomized under general anesthesia with pentobarbital (40 mg / kg, ip), the top of the bladder was opened, and a catheter (PE50) was inserted. Surgery for cystostomy was performed. 0.4M hydrochloric acid was used to induce cystitis. Seven days after the production of the bladder fistula, the rat was held in a Ballman cage under anesthesia, and a bladder catheter, a pressure transducer, and a syringe installed on a syringe pump were connected in parallel. The normal bladder pressure was measured while continuously injecting physiological saline (3 mL / h). 0.4 M hydrochloric acid was continuously infused into the bladder for 15 minutes (3 mL / h) to induce frequent urination.
  • the CS- ⁇ Ala-BTM administration group significantly extended the urination interval compared to the Control group.
  • the CS / BTM mixed solution administration group did not show the effect of extending the urination interval.
  • the urine output was significantly increased in the CS- ⁇ Ala-BTM administration group compared to the Control group, but in the CS / BTM mixed solution administration group, the urination output was increased once. There was no effect.
  • the CS and BTM mixed solution administration group showed significant weight loss compared to the Control group. On the other hand, weight loss was not observed in the CS- ⁇ Ala-BTM administration group as compared to the Control group.
  • the compound of the present invention is useful as a compound for improving bladder disease and can be used industrially.

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Abstract

　コンドロイチン硫酸に由来する基とステロイドに由来する基とが下記一般式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して共有結合した化合物を提供する。式中、ｍは０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示し、ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示す。　－ＨＮ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＨＲ１－ＣＯ－　（Ｉ）

Description

コンドロイチン硫酸誘導体及び膀胱疾患処置剤
　本発明は、コンドロイチン硫酸誘導体及びそれを含有する膀胱疾患処置剤に関する。
　膀胱疾患、例えば間質性膀胱炎（Interstitial cystitis : IC）は、慢性的な頻尿、尿意切迫感等の症状が見られる難治性疾患である。しかし、間質性膀胱炎の病因が明らかになっていないために、その治療は対症的・経験的な方法に頼っており、様々な試みにも拘らず決定的な治療法の確立には至っていない。
　これに関連して、コンドロイチン硫酸（例えば、米国特許第６，０８３，９３３号明細書、又はインターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス（大西ら、４５６巻、１１３頁－１２０、２０１３年）参照）、ステロイド（例えば、間質性膀胱炎診察ガイドライン（日本間質性膀胱炎研究会・ガイドライン作成委員会編、２００７年１月１０日）又はAmerican Urological Association (AUA) Guideline, DIAGNOSIS AND TREATMENT OF INTERSTITIAL CYSTITIS/BLADDER PAIN SYNDROME （２０１４年９月）参照）が、膀胱疾患である間質性膀胱炎の治療剤として使用できるとの報告がある。しかしながら、コンドロイチン硫酸については、欠損したグリコサミノグリカン層の修復効果が期待できるものの、有効性の証拠は低く、ガイドライン上では行わないように勧められている。また、ステロイドについては、問題となる副作用が少なくなく、有効性の証拠も低いとして、行うように勧めるだけの根拠がないとされている（例えば、間質性膀胱炎診察ガイドライン（日本間質性膀胱炎研究会・ガイドライン作成委員会編、２００７年１月１０日）参照）。
　一方、コンドロイチン硫酸に由来する基にステロイドの一種であるプレドニゾロンに由来する基がグリシン残基を介して結合した化合物（コンドロイチン硫酸－グリシル－プレドニゾロン）が、抗関節炎活性を有することが知られている（例えば、インターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス（大西ら、４５６巻、１１３頁－１２０、２０１３年）参照）。
米国特許第６，０８３，９３３号明細書
大西ら、インターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス、４５６巻、１１３頁－１２０、２０１３年 間質性膀胱炎診察ガイドライン、日本間質性膀胱炎研究会・ガイドライン作成委員会編（２００７年１月１０日） American Urological Association (AUA) Guideline, DIAGNOSIS AND TREATMENT OF INTERSTITIAL CYSTITIS/BLADDER PAIN SYNDROME （２０１４年９月）
　しかしながら、インターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス（大西ら、４５６巻、１１３頁－１２０、２０１３年）には、膀胱疾患についての記載も示唆もなく、また後述する特定構造のコンドロイチン硫酸誘導体についての開示も示唆もない。
　本発明は、ステロイド単剤の有する全身性の副作用を低減でき、またコンドロイチン硫酸やステロイド単剤よりも高い効果を発揮する、コンドロイチン硫酸誘導体並びに当該化合物を含有する医薬組成物及び膀胱疾患処置剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コンドロイチン硫酸（以下「ＣＳ」ともいう。）に由来する基に特定の構造を有するスペーサーを介してステロイドに由来する基が共有結合した化合物を見出し、当該化合物がステロイドに起因する全身性の副作用を低減し、かつ長期に薬効を持続させることにより、ＣＳやステロイド単剤よりも有効に膀胱疾患を改善する効果を発揮することを見出し、本発明に至った。また、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基との共有結合において、これらの基の間に特定の性質をもつスペーサーを選択して介在させることにより、ステロイド単剤の有する全身性の副作用を低減できることを見出し、本発明に至った。
　すなわち、前記課題を解決するための具体的な手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。
＜１＞　ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とが下記一般式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して共有結合した化合物である。
　－ＨＮ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＨＲ１－ＣＯ－　　　（Ｉ）
（式中、ｍは０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示し、ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示す）
＜２＞　Ｒ１における電子供与基及び立体障害性基が、炭素数１～１２の直鎖アルキル基、炭素数３～１２の分岐鎖アルキル基、炭素数３～１２の環状アルキル基、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１２のアルケニル基、炭素数２～１２のアルキニル基及び炭素数７～１２のアラルキル基からなる群から選ばれる基である＜１＞に記載の化合物である。
＜３＞　一般式（Ｉ）において、ｍ＝１且つＲ１が水素原子であるか、又はｍ＝０且つＲ１がメチル基、炭素数３～４の分岐鎖アルキル基若しくはベンジル基である＜１＞又は＜２＞に記載の化合物である。
＜４＞　一般式（Ｉ）において、ｍ＝１且つＲ１が水素原子であるか、又はｍ＝０且つＲ１がｓｅｃ-ブチル基である＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の化合物である。
＜５＞　＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の化合物を含有する医薬組成物である。
＜６＞　＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の化合物を含有する膀胱疾患処置剤である。
＜７＞　＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の化合物の膀胱疾患の処置における使用である。
＜８＞　＜６＞に記載の膀胱疾患処置剤を対象に投与することを含有する膀胱疾患の処置方法である。
＜９＞　＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の化合物を含有する排尿機能改善剤である。
＜１０＞　＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の化合物の排尿機能改善における使用である。
＜１１＞　＜９＞に記載の排尿機能改善剤を対象に投与することを含む排尿機能の改善方法である。
＜１２＞　ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物であって、該スペーサーは、この化合物においてグリシン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さいものである、化合物である。
＜１３＞　前記スペーサーが、前記化合物においてβ－アラニン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さいものである、＜１２＞に記載の化合物である。
＜１４＞　少なくとも以下のステップ１及び２を含む、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法である；
ステップ１：前記化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、及び
　ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーを介して、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とを共有結合させること。
＜１５＞　前記ステップ１において選択されるスペーサーが、前記化合物におけるスペーサーとしてβ－アラニン残基を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さくなるものである、＜１４＞に記載の方法である。
　なお、上記＜１４＞及び＜１５＞は、当該化合物を含有する、医薬組成物の製造方法、膀胱疾患処置剤の製造方法、排尿機能改善剤の製造方法とすることもでき、本発明はこのような思想をも包含する。この場合、製造の目的物（医薬組成物、膀胱疾患処置剤、あるいは排尿機能改善剤）に応じた、薬学的に許容される成分を配合するステップを更に含めることができる。
　本発明によれば、ステロイド単剤の有する全身性の副作用を低減でき、またＣＳやステロイド単剤よりも高い効果を発揮する、コンドロイチン硫酸誘導体並びに当該化合物を含有する医薬組成物及び膀胱疾患処置剤を提供することができる。
ラット塩酸惹起頻尿モデルにおけるＣＳ－β－アラニル－プレドニゾロン、ＣＳ－β－アラニル－ベタメタゾン及びＣＳ－β－アラニル－トリアムシノロンアセトニドの排尿間隔に対する作用を示すグラフである。 ラット塩酸惹起頻尿モデルにおけるＣＳ－β－アラニル－トリアムシノロンアセトニド、ＣＳ－グリシル－トリアムシノロンアセトニド及びＣＳ－イソロイシル－トリアムシノロンアセトニドの排尿間隔に対する作用を示すグラフである。 ラット塩酸惹起頻尿モデルにおけるＣＳ－β－アラニル－トリアムシノロンアセトニド、ＣＳ－グリシル－トリアムシノロンアセトニド及びＣＳ－イソロイシル－トリアムシノロンアセトニドの胸腺湿重量に及ぼす影響を示すグラフである。 ラット塩酸惹起頻尿モデルにおけるＣＳ－β－アラニル－ベタメタゾン及びＣＳとベタメタゾン混合液の排尿間隔に対する作用を示すグラフである。
　本明細書において「ステップ」との語は、独立したステップだけではなく、他のステップと明確に区別できない場合であってもそのステップの所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。さらに組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
　以下、本発明を発明の実施形態により詳説する。
（１）コンドロイチン硫酸誘導体
　本発明に係る化合物であるコンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とが下記一般式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して共有結合している。
　　－ＨＮ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＨＲ１－ＣＯ－　　　（Ｉ）
　式中、ｍは０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示し、ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示す。
　ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とが特定の構造を有するスペーサーを介して共有結合してなるコンドロイチン硫酸誘導体は、ステロイド単剤の有する全身性の副作用を低減し、抗炎症効果又は免疫抑制作用を長期に渡って持続させることができる。コンドロイチン硫酸誘導体は、特に膀胱疾患処置剤として優れた効果を達成することができる。コンドロイチン硫酸誘導体においては、スペーサーが特定の構造であることで、ステロイドに起因する全身性の副作用を低減することができ、且つ局所で薬効を持続させることにより、特に膀胱疾患処置剤として優れた効果を奏することができる。
　コンドロイチン硫酸誘導体はＣＳに由来する基の少なくとも１種を含む。ここでＣＳに由来する基とは、ＣＳが有するカルボキシ基からヒドロキシ基が取り除かれて形成される基である。
　コンドロイチン硫酸誘導体を構成するＣＳは、Ｄ－グルクロン酸（又はＤ－イズロン酸）とＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンの２糖が、２糖単位で反復して形成される糖鎖骨格に硫酸基が保持された構造を有する限りにおいて特に限定されない。また、ＣＳが有するカルボキシ基及び硫酸基を含む酸性官能基は、塩を形成していない遊離状態であっても、薬学的に許容されうる塩を形成している状態であっても構わない。
　薬学的に許容されうる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属イオンとの塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属イオンとの塩などが挙げられる。ＣＳは、生体への適用性及び親和性の観点から、薬学的に許容されるアルカリ金属イオンとの塩であることが好ましく、ナトリウム塩であることがより好ましい。
　コンドロイチン硫酸誘導体を構成するＣＳは、その種類に応じ、公知の方法で製造することができる。ＣＳの製造方法としては例えば、動物由来原料からの抽出精製、コンドロイチン産生菌等からの培養精製、糖鎖修飾、糖鎖合成などを挙げることができる。
　ＣＳの重量平均分子量は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。重量平均分子量は、５００～１２０，０００であることが好ましく、２，５００～６０，０００であることがより好ましく、１０，０００～４０，０００であることが更に好ましい。ＣＳの重量平均分子量は、光散乱法により測定することができる。
　コンドロイチン硫酸誘導体はステロイドに由来する基の少なくとも１種を含む。ここで、ステロイドに由来する基とは、ステロイド分子が有するヒドロキシ基から水素原子が取り除かれて形成される基である。水素原子が取り除かれる位置は特に限定されない。
　コンドロイチン硫酸誘導体を構成するステロイドの種類は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。ステロイドとして具体的には、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ブデソニド、フルチカゾン、等が例示され、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく用いられる。
　ステロイドは１種単独でも２種以上を組合せて用いてもよい。
　ステロイドに由来する基とスペーサーとの共有結合は、コンドロイチン硫酸誘導体からのステロイドの遊離速度制御の観点から、生体中で分解可能な共有結合であって、縮合反応によって形成される共有結合であることが好ましく、エステル結合であることがより好ましい。ステロイドに由来する基とスペーサーとの共有結合が分解（好ましくは加溶媒分解）することで、ステロイドが遊離する。ＣＳに由来する基とスペーサーとの共有結合が分解した後にステロイドに由来する基とスペーサーとの共有結合が分解してステロイドが遊離してもよい。
　コンドロイチン硫酸誘導体は、ステロイドの遊離速度制御の観点から、ＣＳに由来する基とスペーサー（－ＨＮ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＨＲ１－ＣＯ－）とがアミド結合で共有結合し、ステロイドに由来する基とスペーサーとがエステル結合で共有結合していることが好ましい。すなわち、スペーサーを形成する化合物（以下、スペーサー形成分子ともいう）は分子構造中に、カルボキシ基及びアミノ基を含む構造を持つ化合物（例えば、アミノ酸）であることが好ましい。ＣＳのカルボキシ基とスペーサー形成分子のアミノ基とがアミド結合し、ステロイドのヒドロキシ基とスペーサー形成分子のカルボキシ基とがエステル結合して形成されるコンドロイチン硫酸誘導体が好ましい。
　スペーサーは一般式（Ｉ）で表される２価の連結基である。一般式（Ｉ）におけるｍは、０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基又は立体障害性基を示す。ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基又は立体障害性基を示す。ｍの数及びＲ１の電子供与基又は立体障害性基の有無は、ステロイドに由来する基とスペーサーの間のエステル結合の分解速度に影響する。ｍ＝０の場合、ｍ＝１よりもエステル結合の分解を受け易くなり、コンドロイチン硫酸誘導体からのステロイドの遊離速度が上昇する傾向がある。
　本明細書中で用いられる「立体障害性基」とは、加溶媒分解等の化学反応に対して立体障害を起こす嵩高い基を意味する。一般に、スペーサーのＲ１が電子供与基又は立体障害性基に置換されると、ステロイドに由来する基とスペーサーとの共有結合が、Ｒ１が水素原子の場合よりも分解し難くなり、ステロイドの遊離速度が低下する。遊離速度の低下は、後述する方法により適宜測定することができる。
　電子供与基又は立体障害性基は、Ｒ１に導入可能であれば特に制限されず、通常用いられる電子供与基又は立体障害性基から適宜選択することができる。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の炭素数１～１２の直鎖状アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等の炭素数３～１２の分岐鎖アルキル基；シクロヘキシル基等の炭素数３～６の環状アルキル基；フェニル基、トリル基等の炭素数６～１０のアリール基；ビニル基、アリル基等の炭素数２～１２のアルケニル基；炭素数２～１２のアルキニル基；ベンジル基等の炭素数７～１２のアラルキル基などを挙げることできる。これらの中でもメチル基、炭素数３～４の分岐鎖アルキル基、ベンジル基等からなる群から選ばれる基であることが好ましい。スペーサー形成分子として具体的には、β－アラニン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン等のアミノ酸を用いることができ、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、β‐アラニン、イソロイシン、バリン、及びロイシンからなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。
　また、上記スペーサー形成分子として、上記以外の置換基を有するその他のアミノ酸を利用することもできる。その他のアミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、チロシン、トリプトファン、リシン、メチオニン、トレオニン、ヒスチジン等を利用することができる。
　スペーサー形成分子は、１種単独でも２種以上を組合せて用いてもよい。
　一般式（Ｉ）で表されるスペーサーとしては、膀胱疾患処置剤としての効果と副作用抑制の観点から、－ＨＮ－（ＣＨ２）２－ＣＯ－、－ＨＮ－ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）－ＣＯ－、－ＨＮ－ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）２）－ＣＯ－、又は－ＨＮ－ＣＨＣＨ２（ＣＨ（ＣＨ３）２）－ＣＯ－で表されるアミノ酸残基が好ましく、－ＨＮ－（ＣＨ２）２－ＣＯ－、又は－ＨＮ－ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）－ＣＯ－がより好ましい。つまり、スペーサー形成分子として、β－アラニン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであることが好ましく、β－アラニン又はイソロイシンであることがより好ましい。
　コンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳの構造等によって種々の構造をとり得る。コンドロイチン硫酸誘導体の構造の具体例としては、例えば、下記化学式（II）で表される構造単位の少なくとも１種を含む構造を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　式（II）中、Ｒ１１はそれぞれ独立して、水素原子又は硫酸基のナトリウム塩を表すが、硫酸基の塩のカチオン部分は例示したナトリウムに限定されるわけではない。またＲ１１における硫酸基の塩の数は例えば、０～４であり、０～３であることが好ましい。Ｒ１３は立体障害性基及び電子供与基からなる群から選ばれる基を表し、Ｒ１４は水素原子、立体障害性基及び電子供与基からなる群から選ばれる基を表す。
　コンドロイチン硫酸誘導体は、上記化学式で表される構造単位を１種のみ含んでいてもよく、２種以上を任意の割合、任意の位置関係で含んでいてもよい。コンドロイチン硫酸誘導体は上記化学式で表される構造単位に加えて、ＣＳに通常含まれる構造単位を更に含むことが好ましい。ＣＳに通常含まれる構造単位としては、式（II）におけるＲ１２がＯＮａ又はＯＨで表される構造単位等を挙げることができる。ただし、塩のカチオン部分は例示したナトリウムに限定されるわけではない。
　コンドロイチン硫酸誘導体に対する、スペーサーを介してＣＳに共有結合するステロイド分子の含有比率（重量割合）は、３ｗ／ｗ％以上であることが好ましく、１０ｗ／ｗ％以上であることがより好ましく、３０ｗ／ｗ％以上であることが更に好ましい。なお、ステロイド分子の含有比率は、ステロイド分子の種類、効果の強さ及び水に対する溶解性等の性質並びにスペーサーの種類等に応じて適宜選択することができる。
　コンドロイチン硫酸誘導体からのステロイドの遊離速度は、目的等に応じて適宜選択できる。ステロイドの遊離速度は例えば、ｐＨ７．４、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝液中において、０．１～４％／日であることが好ましく、０．１～３％／日であることがより好ましく、０．５～１％／日であることが更に好ましい。ここでステロイドの遊離速度とは、遊離率（％）の一日あたりの変化量であり、横軸に時間を、縦軸にコンドロイチン硫酸誘導体に含まれるステロイドに由来する基の総モル数（１００％）に対するステロイドの遊離量（モル）の割合である遊離率（％）を取った場合、グラフの傾きとして定義される。
　したがって、遊離速度が測定期間中に一定値を維持する場合には、グラフは単調増加の直線となる。この場合には、例えば、ｐＨ７．４、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝液中、１０日間で、コンドロイチン硫酸誘導体が含むすべてのステロイドが遊離した場合、遊離速度は１０％／日と表現される。
　一方、遊離速度が一定値を取らずに経時的に低下する場合（グラフは上に凸で単調増加する緩やかなカーブを示す）は、初期の立ち上がり期間（例えば、３日間）の遊離率変化を直線近似して遊離速度を算出する。
　なお、ステロイドの遊離量（遊離したステロイドの量）はステロイドの種類に応じて適宜選択される方法によって測定される。
（２）コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法
　コンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳ分子が有する官能基（例えば、カルボキシ基）と、ステロイドが有する官能基（例えば、ヒドロキシ基）とを特定の構造を有するスペーサーを介して共有結合させることで得ることができる。
　以下、コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の一例について説明するが、以下の方法に限定されるものではない。
　ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とをスペーサーを介して共有結合してなるコンドロイチン硫酸誘導体は、例えば以下のステップを含む製造方法で製造することができる。
（Ａ）ステロイドが有するヒドロキシ基をスペーサー形成分子のカルボキシ基と縮合して共有結合（エステル結合）させることと、
（Ｂ）ＣＳが有するカルボキシ基をスペーサー形成分子のアミノ基と縮合して共有結合（アミド結合）させることと、を含む製造方法。
　（Ａ）のステップでは、ステロイドが有するヒドロキシ基とスペーサー形成分子のカルボキシ基とを縮合して共有結合させる。このときスペーサー形成分子のＣＳと反応する予定のアミノ基は、必要に応じて通常用いられる方法で保護しておいてもよい。
　（Ｂ）のステップでは、ＣＳが有するカルボキシ基とスペーサー形成分子のアミノ基とを縮合して共有結合させる。このときスペーサー形成分子のステロイドと反応する予定のカルボキシ基は、必要に応じて通常用いられる方法で保護しておいてもよい。
　コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法は（Ａ）のステップと（Ｂ）のステップとを含んでいればよく、各ステップが実行される順番は限定されない。
　縮合（エステル化、アミド化）方法は、通常用いられる方法から適宜選択すればよい。縮合方法としては例えば、水溶性カルボジイミド（例えば、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミドハイドロクロライド）、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロライド含水和物（ＤＭＴ－ＭＭ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を用いる方法、対称酸無水物法、混合酸無水物法、活性エステル法などの方法を挙げることができる。縮合反応条件は適用する縮合反応に応じて適宜選択される。
　スペーサー形成分子は、所望のステロイドの遊離速度が得られるように選択されることが好ましい。スペーサー形成分子はステロイドとエステル結合を形成するカルボキシ基と、ＣＳとアミド結合を形成するアミノ基と、２つの反応性官能基を連結する連結基とを有する。連結基はステロイドとのエステル結合の分解速度を制御するように選択されることが好ましい。スペーサー形成分子の選択方法は既述の通り、ｍとＲ１とを適宜組合せて所望の分解速度を達成できるように選択すればよい。
（３）医薬組成物
　医薬組成物は、コンドロイチン硫酸誘導体の少なくとも１種を含み、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤等その他の成分を更に含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的に許容される賦形剤の他、界面活性剤、生理活性物質、安定化剤、液状媒体等を挙げることができる。生理活性物質はコンドロイチン硫酸誘導体から遊離するステロイドと同一であっても、異なっていてもよい。
　医薬組成物の用途は特に制限されず、例えば、膀胱疾患処置に用いられることが好ましい。
（４）膀胱疾患処置剤
　膀胱疾患処置剤は、コンドロイチン硫酸誘導体の少なくとも１種を含有する医薬組成物であって、膀胱疾患の処置に用いられる。
　本明細書において用いられる「処置」とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善及び進行の抑制（悪化の防止）が挙げられる。
　処置剤の形態は、ヒトの尿道・膀胱に投与可能な製剤ないし医薬の形態である限りにおいて特に限定されないが、投与時における形態が液体であることが好ましく、例えば溶液や懸濁液等の形態が挙げられる。溶液や懸濁液は、コンドロイチン硫酸誘導体の粉体を用時溶解して調製することにより、投与することもできる。膀胱疾患処置剤は、膀胱内投与に用いられることが好ましい。
　膀胱疾患処置剤の投与量としては、膀胱内の粘膜全体を被覆するのに足る量であればよく、例えばヒトにおいては、５ｍＬ～２００ｍＬ程度が例示できる。
　液体として投与する場合の膀胱疾患処置剤中のコンドロイチン硫酸誘導体の濃度は、例えば尿道カテーテルを用いて投与する場合には、このカテーテル内を通過可能な濃度であればよく、当業者が適宜調整できる。
　膀胱疾患処置剤の投与方法については、例えば、尿道カテーテルを膀胱内に無菌条件下で挿入し、残尿を排出した後、同カテーテルより注入する方法等を挙げることができる。
　膀胱内に注入された膀胱疾患処置剤は、ＣＳとステロイドとがスペーサーを介して共有結合したままで膀胱壁に到達、付着し、その後、スペーサーとステロイドとの間の共有結合が徐々に分解することで、長時間（例えば１週間以上）に渡って、ステロイドが徐放されると考えられる。
　膀胱疾患処置剤は、膀胱内においてステロイドを徐々に遊離することができる。ステロイドが膀胱内において遊離し続ける時間（効果の持続性）は、１６８時間（７日間）以上が好ましく、３３６時間（１４日間）以上がさらに好ましい。
　膀胱疾患処置剤の膀胱内投与頻度は、コンドロイチン硫酸誘導体及びコンドロイチン硫酸誘導体から遊離したステロイドの動態から定めることができる。例えば、１回／１週間投与から１回／１か月投与を挙げることができるが、限定されるものではない。
　膀胱疾患処置剤は、膀胱疾患の処置に適用することを目的とする。本明細書における、「膀胱疾患」とは、膀胱で起こる疾患その他の何らかの異常を意味し、例えば、急性膀胱炎、慢性膀胱炎、間質性膀胱炎、出血性膀胱炎、放射線性膀胱炎、過活動膀胱などが含まれる。膀胱疾患処置剤は膀胱疾患の中でも、特に間質性膀胱炎に対して用いられることが好ましい。間質性膀胱炎の概念には、膀胱痛症候群（Painful bladder syndrome : PBS / Bladder pain syndrome :BPS）と呼ばれるものや過知覚膀胱症候群（Hypersensitive bladder syndrome :HBS）と呼ばれるものを含んでいてもよい。
（５）膀胱疾患の処置方法
　膀胱疾患の処置方法は、膀胱疾患処置剤を膀胱内投与するステップを含む。膀胱疾患の処置方法は必要に応じてその他のステップを更に含んでいてもよい。膀胱疾患処置方法は、前記「（４）膀胱疾患処置剤」の説明に従って同様に実施でき、好ましい処置剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
（６）排尿機能改善剤
　本明細書において用いられる「排尿機能改善」とは、頻尿その他の排尿機能に関する何らかの異常を改善することをいう。すなわち排尿機能改善剤とは、前記医薬組成物を膀胱内投与することによる排尿機能の改善剤であり、頻尿改善剤の概念を含む。後述する実施例からわかるとおり、前記医薬組成物は排尿機能の改善ができ、例えば排尿間隔を有意な延長や一回排尿量を増加させることができることから、たとえば、間質性膀胱炎に特徴的な慢性的な頻尿を改善するために用いることもできる。排尿機能改善剤は、前述の膀胱疾患の処置方法等の説明に従って同様に実施でき、また、好ましい改善剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
（７）排尿機能改善方法
　排尿機能の改善方法は、排尿機能改善剤を膀胱内投与するステップを含む。排尿機能改善方法は必要に応じてその他のステップを更に含んでいてもよい。排尿機能改善方法は、前記「（６）排尿機能改善剤」の説明に従って同様に実施でき、好ましい排尿機能改善剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
　また、本発明は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物において、これらの基の間に所定の特性をもつスペーサー（この化合物において特定のアミノ酸残基をスペーサーとした場合に比して、この化合物からのステロイドの遊離速度が小さくなるようなスペーサー）を選択して介在させることにより、ステロイドに起因する全身性の副作用を低減できるという新たな知見に基づく、以下の態様も含まれる。
（８）コンドロイチン硫酸誘導体の別態様
　本発明の別の態様のコンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物であって、該スペーサーは、この化合物においてグリシン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さいものである。なかでも、前記化合物においてβ－アラニン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、前記化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さくなるスペーサーを採用することが好ましい。
　ここで、コンドロイチン硫酸誘導体の別態様におけるスペーサー分子は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基の双方を連結する２価の連結基であればよく、かつ、この化合物においてグリシン残基、好ましくはβ－アラニン残基をスペーサーとして採用した場合と比べて、この化合物からの該ステロイドの遊離速度が小さくなるようなものであれば特に限定されない。具体的なスペーサーとしては、上述の（１）コンドロイチン硫酸誘導体に記載した一般式（Ｉ）で表される２価連結基などが例示できる。
　ここで上記化合物のステロイドの遊離速度は、前述の（１）コンドロイチン硫酸誘導体に記載した方法や試験例Ａ２の方法で測定できる。
　また、前述の所定の特性をもつスペーサーを選択するためには、ｐＨ７．４、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝液中に特定の構造の化合物を溶解し、１週間後のステロイド遊離率（％）を７で割った値の大きさで比較することにより、特定のアミノ残基スペーサーに比して、この化合物からステロイドの遊離速度が小さい化合物を選択することにより決定することができる。
　このように決定した遊離速度を比較することにより、スペーサーがグリシン残基、好ましくはβ－アラニン残基である場合と比べて、ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択することができる。
　コンドロイチン硫酸誘導体の別態様を構成する、ＣＳ、ステロイド、スペーサー、共有結合等の説明や、コンドロイチン硫酸誘導体の別態様の製造についての説明等は、このコンドロイチン硫酸誘導体の別態様において説明した事項と抵触しない限りにおいて、上述の（１）及び（３）～（７）の「コンドロイチン硫酸誘導体」、「医薬組成物」、「膀胱疾患処置剤」、「膀胱疾患の処置方法」、「排尿機能改善剤」及び「排尿機能改善方法」の記載と同じである。
（９）コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の別態様
　本発明は、以下に示すコンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の別態様を包含する。コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の別態様は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法であって、（Ｃ）この化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基を選択した場合と比べて、この化合物からの該ステロイドの遊離速度が小さくなるようなスペーサーを選択するステップを含んでいる。
　そして製造方法は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とを、上記により選択されたスペーサーを介して共有結合させる工程を含ませることができる。この共有結合させる方法も特に限定されず、例えば、選択したスペーサーとステロイドとを公知の方法で縮合させて中間体を得た後に、この中間体をＣＳと公知の方法で縮合させてもよい。
　例えば、上記（Ｃ）のステップの後に、前述した（２）コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法に記載した（Ａ）及び（Ｂ）のステップを含ませることができる。また、上記（Ｃ）のステップにおけるスペーサーの選択は、必ずしも他のステップと連続的に行われる必要はなく、例えば予めスペーサーの選択をしておき、これに続く他のステップを後日行うこととしてもよい。
　以下、より具体的な製造方法の態様について説明するが、以下の方法に限定されるものではない。
　ア）少なくとも以下のステップ１及び２を含む、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法；
　ステップ１：前記化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基（より好ましくはβ－アラニン残基）を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、及び
　ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーを介して、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とを共有結合させること。
　イ）少なくとも以下のステップ１～３を含む、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法；
　ステップ１：スペーサーとしてグリシン残基（より好ましくはβ－アラニン残基）を選択した場合と比べて、この化合物における該ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、
　ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーとステロイドとを共有結合（例えば、エステル結合）させ、中間体を得ること、及び
　ステップ３：ステップ２で得られた中間体とＣＳとを共有結合（例えば、アミド結合）させること。
　また製造方法は、前述の（３）、（４）及び（６）の「医薬組成物」、「膀胱疾患処置剤」及び「排尿機能改善剤」等の製造方法としてもよい。この場合には、製造の目的物（医薬組成物、膀胱疾患処置剤、あるいは排尿機能改善剤）に応じて、薬学的に許容される成分を配合するステップを更に含めてもよい。
　製造方法における、ＣＳ、ステロイド、スペーサー、共有結合等の説明、製造に関するその他の説明等については、この本発明製造方法において説明した事項と抵触しない限りにおいて、前記の（２）コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法における説明と同じである。
　このように、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物において、この化合物において特定のアミノ酸残基をスペーサーとした場合に比して、この化合物からのステロイドの遊離速度が小さくなるようなスペーサーを選択して介在させることで、ステロイドに起因する全身性の副作用が低減された化合物、医薬組成物、膀胱疾患処置剤、ないし排尿機能改善剤とすることができる。製造方法は、このような副作用が低減された製品の製造に有用である。
　以下、本発明の実施例及び試験例をより具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が制限されるものではない。なお、コンドロイチン硫酸誘導体中に含まれるステロイド含量（ｗ／ｗ％）は、後述の方法により測定した。
（実施例１）２１－β－アラニル－プレドニゾロン導入ＣＳの調製
（１－１）　２１－（Ｂｏｃ－β－アラニル）－プレドニゾロンの調製
　Ｂｏｃ－β－アラニン（渡辺化学工業株式会社製）　１．５８ｇをジクロロメタン　６０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド　２０ｍＬに溶解し、プレドニゾロン（和光純薬工業株式会社製；以下、「ＰＲＥＤ」とも略記する）　３．００ｇ、及び４－ジメチルアミノピリジン（和光純薬工業株式会社製）　３０５ｍｇを加え、溶解した。その後、氷冷下で水溶性カルボジイミド（東京化成工業株式会社製）４．００ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、氷冷下で飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。ジクロロメタン、トルエン及び水を用いて分液抽出し、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をクロロホルムで溶解した後、再度減圧下留去した。本操作を３回繰り返し、目的とする２１－（Ｂｏｃ－β－アラニル）－プレドニゾロン（化合物１）を４．７３ｇ得た（収率１０７％）。
（１－２）　２１－β－アラニル－プレドニゾロン塩酸塩の調製
　（１－１）で得た化合物１　４．７３ｇをジクロロメタン　９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ　塩酸／酢酸エチル（渡辺化学工業株式会社製）　４５ｍＬを加えて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１－β－アラニル－プレドニゾロン塩酸塩（化合物２）を３．４２ｇ得た（収率８８％）。
（１－３）　２１－β－アラニル－プレドニゾロン導入ＣＳの調製
　ＣＳ（ナトリウム塩、生化学工業株式会社製、重量平均分子量約２万：光散乱法）　５２４ｍｇを蒸留水　１０ｍＬに溶解し、アセトン　１０ｍＬを加えて撹拌した。（１－２）で得た化合物２　３９５ｍｇ　及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロライド含水和物（以下、ＤＭＴ－ＭＭ）（株式会社トクヤマ製）　８３８ｍｇを５０％アセトン／蒸留水　計３ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム　０．１ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液を９０％エタノール／蒸留水　３００ｍＬに順次加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水で順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１－β－アラニル－プレドニゾロン導入ＣＳが７８７ｍｇ得られた。２４８ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたプレドニゾロン含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３５ｗ／ｗ％であった。
（実施例２）２１－β－アラニル－ベタメタゾン導入ＣＳの調製
（２－１）　２１－（Ｂｏｃ－β－アラニル）－ベタメタゾンの調製
　Ｂｏｃ－β－アラニン　２．０ｇをジクロロメタン　５０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド　５０ｍＬに溶解し、ベタメタゾン（和光純薬工業株式会社製；以下、「ＢＴＭ」とも略記する）　４．１５ｇを加えた。その後、氷冷下で４－ジメチルアミノピリジン　３８９ｍｇ、及び水溶性カルボジイミド　２．６４ｇを加え、室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出し、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１－（Ｂｏｃ－β－アラニル）－ベタメタゾン（化合物３）を５．８４ｇ得た（収率９８％）。
（２－２）　２１－β－アラニル－ベタメタゾン塩酸塩の調製
　（２－１）で得た化合物３　５．８４ｇをテトラヒドロフラン　１２０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ　塩酸／酢酸エチル　１００ｍＬを加えて、室温で３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。得られた濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１－β－アラニル－ベタメタゾン塩酸塩（化合物４）を４．６０ｇ得た（収率９６％）。
（２－３）　２１－β－アラニル－ベタメタゾン導入ＣＳの調製
　ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万）　５２４ｍｇに蒸留水　１０ｍＬを加え溶解し、アセトン　１０ｍＬを加えて撹拌した。（２－２）で得た化合物４　４２２ｍｇ　及びＤＭＴ－ＭＭ　８３９ｍｇを５０％アセトン／蒸留水　計３ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム　０．１ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液を９０％エタノール／蒸留水　３００ｍＬに順次加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水で順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥して、目的とする２１－β－アラニル－ベタメタゾン導入ＣＳが７７０ｍｇ得られた。２４２ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたベタメタゾン含量（ｗ／ｗ％）を算出した結果、４０ｗ／ｗ％であった。
（実施例３）２１－β－アラニル－トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
（３－１）　２１－（Ｂｏｃ－β－アラニル）－トリアムシノロンアセトニドの調製
　Ｂｏｃ－β－アラニン　２．６３ｇをジクロロメタン　４０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド　１０ｍＬに溶解し、トリアムシノロンアセトニド（和光純薬工業株式会社製；以下、「ＴＡ」とも略記する）　５．０１ｇを加えた。その後、氷冷下で４－ジメチルアミノピリジン　４２６ｍｇ、水溶性カルボジイミド　３．３２ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出をし、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１－（Ｂｏｃ－β－アラニル）－トリアムシノロンアセトニド（化合物５）を６．６６ｇ得た（収率９６％）。
（３－２）　２１－β－アラニル－トリアムシノロンアセトニド塩酸塩の調製
　（３－１）で得た化合物５　６．６６ｇをテトラヒドロフラン　９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ　塩酸／酢酸エチル　９０ｍＬを加え、室温にて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１－β－アラニル－トリアムシノロンアセトニド塩酸塩（化合物６）を５．７８ｇ得た（収率９７％）。
（３－３）　２１－β－アラニル－トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
　ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万）　５２４ｍｇを蒸留水　１０ｍＬに溶解し、アセトン　１０ｍＬを加えて撹拌した。（３－２）で得た化合物６　４５８ｍｇ　及びＤＭＴ－ＭＭ　８３９ｍｇを５０％アセトン／蒸留水　計３ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム　０．１ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液を９０％エタノール／蒸留水　３００ｍＬに順次加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水で順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１－β－アラニル－トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳが８１９ｍｇ得られた。２４２ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたトリアムシノロンアセトニド含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３８ｗ／ｗ％であった。
（実施例４）２１－グリシル－トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
（４－１）　２１－（Ｂｏｃ－グリシル）－トリアムシノロンアセトニドの調製
　Ｂｏｃ－グリシン（渡辺化学工業株式会社製）　１．７１ｇをジクロロメタン　３０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド　１０ｍＬに溶解し、トリアムシノロンアセトニド　４．０１ｇを加えた。その後、氷冷下で４－ジメチルアミノピリジン　３３８ｍｇ、水溶性カルボジイミド　２．６５ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出をし、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１－（Ｂｏｃ－グリシル）－トリアムシノロンアセトニド（化合物７）を５．２１ｇ得た（収率９６％）。
（４－２）　２１－グリシル－トリアムシノロンアセトニド塩酸塩の調製
　（４－１）で得た化合物７　５．２１ｇをテトラヒドロフラン　９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４ Ｍ　塩酸／酢酸エチル　９０ｍＬを加えて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１－グリシル－トリアムシノロンアセトニド塩酸塩（化合物８）を４．１６ｇ得た（収率８８％）。
（４－３）　２１－グリシル－トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
　ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万）　１．０４ｇを蒸留水　２０ｍＬに溶解し、アセトン　２０ｍＬを加えて撹拌した。（４－２）で得た化合物８　８０６ｍｇ　及びＤＭＴ－ＭＭ　１．４６ｇを５０％アセトン／蒸留水 計２０ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム　４ｇ　及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液をエタノール　４２０ｍＬに加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を８０％エタノール／蒸留水、９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水、エタノールで順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１－グリシル－トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳが１．３４ｇ得られた。２４１ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたトリアムシノロンアセトニド含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３７ｗ／ｗ％であった。
（実施例５）２１－イソロイシル－トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
（５－１）２１－（Ｂｏｃ－イソロイシル）－トリアムシノロンアセトニドの調製
　Ｂｏｃ－イソロイシン（渡辺化学工業株式会社製）　２．２４ｇをジクロロメタン　３０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド　１０ｍＬに溶解し、トリアムシノロンアセトニド　４．００ｇを加えた。その後、氷冷下で４－ジメチルアミノピリジン　３３８ｍｇ、水溶性カルボジイミド　２．６５ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出をし、集めた有機層は飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１－（Ｂｏｃ－イソロイシル）－トリアムシノロンアセトニド（化合物９）を５．６５ｇ得た（収率９５％）。
（５－２）　２１－イソロイシル－トリアムシノロンアセトニド塩酸塩の調製
　（５－１）で得た化合物９　５．６５ｇをテトラヒドロフラン　９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ　塩酸／酢酸エチル　９０ｍＬを加えて室温にて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１－イソロイシル－トリアムシノロンアセトニド塩酸塩（化合物１０）を３．０５ｇ得た（収率６０％）。
（５－３）　２１－イソロイシル－トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
　ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万）　１．０４ｇを蒸留水　２０ｍＬに溶解し、アセトン　２０ｍＬを加えて撹拌した。（５－２）で得た化合物１０　８８１ｍｇ、及びＤＭＴ－ＭＭ　１．４６ｇを５０％アセトン／蒸留水 計３４ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム　５ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液をエタノール　４４４ｍＬに順次加えて沈殿形成し、上清を捨てた。８０％エタノール／蒸留水で洗浄し、上清を捨てた。９５％エタノール／蒸留水を加え、フィルターでろ過した。フィルター上の沈殿を９５％エタノール／蒸留水、エタノールで順次洗浄し、得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１－イソロイシル－トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳが１．５９ｇ得られた。２４１ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたトリアムシノロンアセトニド含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３５ｗ／ｗ％であった。
＜ステロイド含量の測定法＞
　上記で得られた各化合物について、吸光度が直線性を有する範囲内で、蒸留水を用いて適切に溶解、希釈した。紫外線可視分光光度計（島津製作所）にて蒸留水を対象とし、測定対象の最大吸収波長付近の吸光度を測定した。
　各化合物に導入されたステロイド含量（ｗ／ｗ％）は、以下の計算式により算出した。
　ステロイド含量(w/w%)＝(Abs/ε×MwST)/（(WT×(100-WD)/100)/(V×Mc))×100
　　Ａｂｓ：吸光度
　　ＷＴ：試料秤量値（ｍｇ）
　　ＷＤ：試料の乾燥減量（％）
　　ε：モル吸光係数
　　ＭｗＳＴ：ステロイド分子量
　　Ｖ：溶解液量（ｍＬ）
　　Ｍｃ：希釈倍率
　モル吸光係数は、実施例１～５に記載した方法に準じて合成した化合物２、４、６、８及び１０より算出した。下表１に各化合物のモル吸光係数（ε）及び用いたステロイドの分子量（ＭｗＳＴ）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以降の実施例では、合成したコンドロイチン硫酸誘導体の名称を以下の通り略す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜薬物遊離試験＞
　薬物遊離試験にかかる実施例では、以下のようにしてコンドロイチン硫酸誘導体からの薬物（ステロイド）遊離率を評価した。
（１）リン酸緩衝液の調製
　リン酸二水素ナトリウム・二水和物　７８０ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）を蒸留水　５００ｍＬに溶解し、Ａ液とした。別途、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物　１．７９ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を蒸留水　５００ｍＬに溶解し、Ｂ液とした。Ａ液とＢ液を３：７の比率で混合し、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を調製した。
（２）ホウ酸緩衝液の調製
　ホウ酸　０．６２ｇ（１０ｍｍｏｌ）と塩化カリウム　０．７５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を秤り取り、５００ｍＬの蒸留水に溶解して第１液とした。別途、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を蒸留水で１０倍希釈して第２液とした。第１液　５０ｍＬと第２液　７ｍＬを１００ｍＬのメスフラスコに加え、蒸留水で１００ｍＬにメスアップして、ｐＨ８．０のホウ酸緩衝液を調製した。
（３）評価方法
　実施例で得られたコンドロイチン硫酸誘導体について、濃度が５ｍｇ／１０ｍＬとなるようそれぞれのｐＨを有する緩衝液に溶解したのち、３６℃の恒温槽中で１週間加温し、その間の薬物の遊離率を２４時間ごとに液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で評価した。
　評価はサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＴＯＳＯＨ社製ＴＳＫｇｅｌ　α）を用い、コンドロイチン硫酸誘導体に残存する薬物量と、遊離した薬物量の比を測定することで行った。
　液体クロマトグラフィーの条件の詳細は以下の通りである。
　分析時間：４０分
　流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　グラジェント：ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
　溶出液：アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）：生理食塩液＝１：２
　検出器：紫外線検出器（２４０ｎｍ）
　温度：３６℃
＜試験例Ａ１＞　薬物の種類の違いによる遊離特性の変化
　実施例１、２及び３の方法に準じて調製したＣＳ－βＡｌａ－ＰＲＥＤ、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ及びＣＳ－βＡｌａ－ＴＡについて、３６℃、１週間における薬物遊離率（％）をＨＰＬＣで評価した。薬物遊離率の評価は、２４時間ごとに実施した。結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＣＳ－βＡｌａ－ＰＲＥＤ、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ及びＣＳ－βＡｌａ－ＴＡにおける遊離速度は、ｐＨ７．４の場合及びｐＨ８．０の場合の共にＣＳ－βＡｌａ－ＰＲＥＤが最も遊離速度が速く、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ及びＣＳ－βＡｌａ－ＴＡの遊離速度は、ほぼ同程度であった。
＜試験例Ａ２＞　スペーサーの違いによる遊離特性の変化
　実施例３、４及び５の方法に準じて調製したＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ、ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ及びＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡについて、３６℃、１週間における薬物遊離率（％）をＨＰＬＣで評価した。薬物遊離率の評価は、２４時間ごとに実施した。結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ、ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ及びＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡにおける遊離速度は、ｐＨ７．４の場合及びｐＨ８．０の場合の共に、ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ＞ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ＞ＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡの順に速かった。
＜ｉｎ　ｖｉｖｏ評価＞
＜試験例Ｂ１＞　ラット塩酸惹起頻尿モデルを用いたＣＳ－ステロイド化合物の排尿機能評価（ステロイド比較）
目的
　ステロイドの異なるコンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ－βＡｌａ－ＰＲＥＤ、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ及びＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ）をラット塩酸惹起頻尿モデルの膀胱内に単回投与した際の排尿機能に対する作用を評価することを目的とした。
方法
　実施例１、２及び３の方法に準じて調製したコンドロイチン硫酸誘導体をリン酸緩衝食塩液に溶解し、下記の被験物質を調製した。
試験物質：
（１）Ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ－βＡｌａ－ＰＲＥＤ（ＰＲＥＤ含量３５ｗ／ｗ％）
（３）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ（ＢＴＭ含量４０ｗ／ｗ％）
（４）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ（ＴＡ含量３８ｗ／ｗ％）
　ラット（ＳＤ系（ＳＰＦ）、雌性、１１－１３週齢）をペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）全身麻酔下で開腹し、膀胱頂部を切開してカテーテル（ＰＥ５０）を挿入し、膀胱瘻作製の手術を行った。
　膀胱炎惹起には０．４Ｍ塩酸を用いた。膀胱瘻作製後７日に、ラットを麻酔下でボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら正常時膀胱内圧を計測した。０．４Ｍ塩酸を膀胱内へ１５分間持続注入（３ｍＬ／ｈ）し、頻尿を惹起した。
　塩酸の膀胱内注入後２日に、麻酔下でカテーテル（ＰＥ５０）を用いて各被験物質を経尿道的に０．２ｍＬ投与し、３０分間留置した。
　塩酸の膀胱内注入後７日に、ラットをボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。麻酔離脱後２０分から、生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら膀胱内圧変化を計測した。膀胱内圧変化が安定した時の排尿間隔及び１回排尿量を測定し、排尿機能を評価した。
　結果を図１に示す。
結果
　図１において、結果は、平均排尿間隔±標準誤差（各群例数＝３～７）によって示した。また、＊＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ　Ｓｈａｍ）を示す。＃＃は、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）を、＃は、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定において、ｐ＜０．０５（ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。＄は、ｔ検定において、ｐ＜０．０５（ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
　図１より、ＣＳ－βＡｌａ－ＰＲＥＤ投与群、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ投与群及びＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意な排尿間隔の延長作用を示した。1回排尿量についても同様に、ＣＳ－βＡｌａ－ＰＲＥＤ投与群、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ投与群及びＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に１回排尿量を増加させた。
考察
　膀胱内投与されたＣＳ－βＡｌａ－ＰＲＥＤ、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ及びＣＳ－βＡｌａ－ＴＡは、いずれも排尿機能改善作用を有することが明らかとなったことから、ＣＳとステロイドとがスペーサーを介して共有結合された化合物は、ステロイドの種類に依らず効果があることが解った。
＜試験例Ｂ２＞　ラット塩酸惹起頻尿モデルを用いたＣＳ－ステロイド化合物の排尿機能評価（スペーサー比較）
目的
　スペーサーの異なるコンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ、ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ及びＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡ）をラット塩酸惹起頻尿モデルの膀胱内に単回投与した際の排尿機能に対する作用を評価することを目的とした。
方法
　実施例３、４及び５の方法に準じて調製したコンドロイチン硫酸誘導体をリン酸緩衝食塩液に溶解し、下記の被験物質を調製した。
試験物質：
（１）Ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ（ＴＡ含量３７ｗ/ｗ％）
（３）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ（ＴＡ含量３７ｗ/ｗ％）
（４）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡ（ＴＡ含量３５ｗ/ｗ％）
　ラット（ＳＤ系（ＳＰＦ）、雌性、１１－１４週齢）を三種混合（ドミトール、ドルミカム及びベトルファール、各々、０．１５、２．０、２．５ｍｇ／２．５ｍＬを０．５ｍＬ／rat、ｉ．ｖ．）全身麻酔下で開腹し、膀胱頂部を切開してカテーテル（ＰＥ５０）を挿入し、膀胱瘻作製の手術を行った。
　膀胱炎惹起には０．４Ｍ塩酸を用いた。膀胱瘻作製後７日に、ラットを麻酔下でボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら正常時膀胱内圧を計測した。０．４Ｍ塩酸を膀胱内へ１５分間持続注入（３ｍＬ／ｈ）し、頻尿を惹起した。
　塩酸の膀胱内注入後２日に、麻酔下でカテーテル（ＰＥ５０）を用いて各被験物質を経尿道的に０．２ｍＬ投与し、３０分間留置した。
　塩酸の膀胱内注入後７日に、ラットをボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。麻酔離脱後２０分から、生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら膀胱内圧変化を計測した。膀胱内圧変化が安定した時の排尿間隔及び１回排尿量を測定した。
結果を図２に示す。
　体重変化は、手術前と、手術後であり塩酸惹起する直前と、被験物質投与の直前（薬剤投与前）と、膀胱内圧測定（Ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）の直前との４回の体重測定を行い、それぞれの個体において手術前を１００％とした相対値として示した。
　また、胸腺湿重量は、膀胱内圧測定（Ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）後に、安楽死させたラットから胸腺を採取してその重量を測定した。体重変化を下表５に、胸腺湿重量を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　平均±標準誤差（各群例数＝４～９）
結果
　図２において、結果は、平均排尿間隔±標準誤差（各群例数＝４～９）によって示した。また、＊は、ｔ検定においてｐ＜０．０５（ｖｓ　Ｓｈａｍ）を示す。＃は、ｔ検定において、ｐ＜０．０５（ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。また、図３において、＊＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
　図２より、ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ投与群、ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ投与群及びＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡ投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意な排尿間隔の延長作用を示した。1回排尿量についても同様に、ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ投与群、ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ投与群及びＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡ投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して１回排尿量を増加させた。
　この結果から、スペーサー形成分子としてＩｌｅを用いても薬効を示すことが解った。ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡも再現よく薬効を示すことが解った。
　図３より、ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ投与群及びＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡ投与群では、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群に比べて胸腺湿重量の有意な低下が見られなかったが、ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ投与群のみ胸腺湿重量の有意な低下が認められた。
　また、表５より、ＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ投与群及びＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡ投与群では、いずれも薬剤投与前に比べて体重減少が見られなかったが、ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ投与群のみ顕著な体重減少が認められた。
考察
　膀胱内投与されたＣＳ－βＡｌａ－ＴＡ、ＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡ及びＣＳ－Ｉｌｅ－ＴＡは、いずれも排尿機能改善作用を有することが明らかとなった。しかし、薬物遊離速度の速いＣＳ－Ｇｌｙ－ＴＡにおいては、胸腺湿重量低下及び体重減少の副作用が認められ、膀胱内投与には適さないことが明らかとなった。一方、βＡｌａ、Ｉｌｅなどのスペーサー形成分子を用いて薬物遊離速度をコントロールすることでステロイドに起因する全身性の副作用を軽減できることが明らかとなった。
＜試験例Ｂ３＞　ラット塩酸惹起頻尿モデルを用いたＣＳ－ステロイド化合物の排尿機能評価（結合体と混合液の比較）
目的
　ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ及びＣＳとベタメタゾン（以下、ＢＴＭ）との混合液をラット塩酸惹起頻尿モデルの膀胱内に単回投与した際の排尿機能に対する作用を評価することを目的とした。
方法
　実施例２の方法に準じて調製したコンドロイチン硫酸誘導体をリン酸緩衝食塩液に溶解し、下記の被験物質を調製した。
試験物質：
（１）Ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）３％（ｗ／ｖ％）ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ（ＢＴＭ含量３４ｗ／ｗ％）
（３）３％ＣＳ＋０．８６％ＢＴＭ混合液
　ラット（ＳＤ系（ＳＰＦ）、雌性、１０－１３週齢）をペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）全身麻酔下で開腹し、膀胱頂部を切開してカテーテル（ＰＥ５０）を挿入し、膀胱瘻作製の手術を行った。
　膀胱炎惹起には０．４Ｍ塩酸を用いた。膀胱瘻作製後７日に、ラットを麻酔下でボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら正常時膀胱内圧を計測した。０．４Ｍ塩酸を膀胱内へ１５分間持続注入（３ｍＬ／ｈ）し、頻尿を惹起した。
　塩酸の膀胱内注入後２日に、麻酔下でカテーテル（ＰＥ５０）を用いて各試験物質を経尿道的に０．２ｍＬ投与し、３０分間留置した。
　塩酸の膀胱内注入後７日に、ラットをボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。麻酔離脱後２０分から、生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら膀胱内圧変化を計測した。膀胱内圧変化が安定した時の排尿間隔及び１回排尿量を測定し、排尿機能を評価した。
　結果は図４に示す。また、ラットの体重変化を下表６に示す。なお、体重変化は試験例Ｂ２と同様の条件で測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　平均±標準誤差（各群例数＝５～８）
結果
　図４において、結果は、平均排尿間隔±標準誤差（各群例数＝５～８）によって示した。また、＊＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ　Ｓｈａｍ）を示す。＃＃は、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
　図４より、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に排尿間隔を延長させた。一方、ＣＳ，ＢＴＭ混合液投与群は、排尿間隔の延長作用を示さなかった。1回排尿量も同様に、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に１回排尿量を増加させたが、ＣＳ，ＢＴＭ混合液投与群は、１回排尿量の増加作用を示さなかった。
　表６より、ＣＳ，ＢＴＭ混合液投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して顕著な体重減少を示した。一方、ＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して体重減少は認められなかった。
考察
　膀胱内投与されたＣＳ－βＡｌａ－ＢＴＭは、ＣＳ，ＢＴＭ混合液と比較して、高い排尿機能改善作用を示すとともにステロイドに起因する全身性の副作用を軽減できることが明らかとなった。
　日本国特許出願２０１５－００３５７２号（出願日：２０１５年１月９日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
　本発明化合物は、膀胱疾患を改善する化合物として有用であり、産業上利用することができる。

Claims (15)

  1. 　コンドロイチン硫酸に由来する基とステロイドに由来する基とが下記一般式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して共有結合した化合物。
    　－ＨＮ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＨＲ１－ＣＯ－　　　（Ｉ）
    （式中、ｍは０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示し、ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示す）
  2. 　Ｒ１における電子供与基及び立体障害性基が、炭素数１～１２の直鎖アルキル基、炭素数３～１２の分岐鎖アルキル基、炭素数３～１２の環状アルキル基、炭素数６～１０のアリール基、炭素数２～１２のアルケニル基、炭素数２～１２のアルキニル基及び炭素数７～１２のアラルキル基からなる群から選ばれる基である請求項１に記載の化合物。
  3. 　一般式（Ｉ）において、ｍ＝１且つＲ１が水素原子であるか、又はｍ＝０且つＲ１がメチル基、炭素数３～４の分岐鎖アルキル基若しくはベンジル基である請求項１又は２に記載の化合物。
  4. 　一般式（Ｉ）において、ｍ＝１且つＲ１が水素原子であるか、又はｍ＝０且つＲ１がｓｅｃ－ブチル基である請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物を含有する医薬組成物。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物を含有する膀胱疾患処置剤。
  7. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物の膀胱疾患の処置における使用。
  8. 　請求項６に記載の膀胱疾患処置剤を対象に投与することを含む膀胱疾患の処置方法。
  9. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物を含有する排尿機能改善剤。
  10. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物の排尿機能改善における使用。
  11. 　請求項９に記載の排尿機能改善剤を対象に投与することを含む排尿機能の改善方法。
  12. 　コンドロイチン硫酸に由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物であって、該スペーサーは、この化合物においてグリシン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さいものである、化合物。
  13. 　前記スペーサーが、前記化合物においてβ－アラニン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さいものである、請求項１２に記載の化合物。
  14. 　少なくとも以下のステップ１及び２を含む、コンドロイチン硫酸に由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法；
    　ステップ１：前記化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、及び
    　ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーを介して、コンドロイチン硫酸に由来する基とステロイドに由来する基とを共有結合させること。
  15. 　前記ステップ１において選択されるスペーサーが、前記化合物におけるスペーサーとしてβ－アラニン残基を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さくなるものである、請求項１４に記載の方法。
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