CN107108761A - 硫酸软骨素衍生物和膀胱疾病处置剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供来自硫酸软骨素的基团和来自类固醇的基团介由下述通式(I)所示的间隔基共价结合而成的化合物。式中，m表示0或1的整数。其中，m＝0时，R1表示选自由供电子基团和空间位阻性基团组成的组中的基团，m＝1时，R1表示选自由氢原子、供电子基团和空间位阻性基团组成的组中的基团。－HN－(CH2)m－CHR1－CO－ (I)。

Description

硫酸软骨素衍生物和膀胱疾病处置剂
技术领域
本发明涉及硫酸软骨素衍生物和含有其的膀胱疾病处置剂。
背景技术
膀胱疾病、例如间质性膀胱炎(Interstitial cystitis：IC)是可见慢性尿频、尿急感等症状的难治性疾病。但是，由于间质性膀胱炎的病因不明，因此其治疗依赖于对症的、经验方法，虽然进行了各种尝试，但仍未建立起确定性治疗方法。
关于治疗方法，有报道指出，硫酸软骨素(例如参照美国专利第6,083,933号说明书、或International Journal of Pharmaceutics(大西等、456卷、113页－120、2013年))、类固醇(例如，参照间质性膀胱炎诊察指南(日本间质性膀胱炎研究会·指南作成委员会编、2007年1月10日)或American Urological Association(AUA)Guideline,DIAGNOSISAND TREATMENT OF INTERSTITIAL CYSTITIS/BLADDER PAIN SYNDROME(2014年9月))可以作为膀胱疾病中的间质性膀胱炎的治疗剂使用。然而，关于硫酸软骨素，虽然可以期待缺损糖胺聚糖层的修复效果，但有效性的证据少，原则上建议不要进行。此外，关于类固醇，成为问题的副作用不少，有效性的证据也少，并不存在建议进行程度的证据(例如、间质性膀胱炎诊察指南(参照日本间质性膀胱炎研究会·指南作成委员会编、2007年1月10日))。
另一方面，已知在来自硫酸软骨素的基团上介由甘氨酸残基结合有来自作为类固醇的一种的强的松龙的基团的化合物(硫酸软骨素－甘氨酰基－强的松龙)具有抗关节炎活性(参照例如International Journal of Pharmaceutics(大西等、456卷、113页－120、2013年))。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第6,083,933号说明书
非专利文献
非专利文献1：大西等、International Journal of Pharmaceutics、456卷、113页－120、2013年
非专利文献2：间质性膀胱炎诊察指南、日本间质性膀胱炎研究会·指南作成委员会编(2007年1月10日)
非专利文献3：American Urological Association(AUA)Guideline,DIAGNOSISAND TREATMENT OF INTERSTITIAL CYSTITIS/BLADDER PAIN SYNDROME(2014年9月)
发明内容
发明要解决的问题
但是，International Journal of Pharmaceutics(大西等、456卷、113页－120、2013年)中，对于膀胱疾病既没有记载也没有启示，此外对于后述的特定结构的硫酸软骨素衍生物既没有公开也没有启示。
本发明的课题在于，提供能降低类固醇单剂所具有的全身性副作用、此外发挥比硫酸软骨素和类固醇单剂更高的效果的硫酸软骨素衍生物，以及含有该化合物的药物组合物和膀胱疾病处置剂。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现一种在来自硫酸软骨素(以下也称为“CS”。)的基团上介由具有特定结构的间隔基共价结合有来自类固醇的基团的化合物，发现该化合物通过降低起因于类固醇的全身性副作用且使药效长期持续，从而发挥与CS和类固醇单剂相比更有效地改变膀胱疾病的效果，从而完成了本发明。此外发现，在来自CS的基团和来自类固醇的基团的共价结合中，通过选择这些基团间并使之夹持具有特定性质的间隔基，能降低类固醇单剂所具有的全身性副作用，从而完成了本发明。
即，用于解决前述课题的具体手段如下，本发明包含以下方案。
＜1＞一种化合物，其为来自CS的基团和来自类固醇的基团介由下述通式(I)所示的间隔基共价结合而成的。
－HN－(CH2)m－CHR1－CO－ (I)
(式中，m表示0或1的整数。其中，m＝0时，R1表示选自由供电子基团和空间位阻性基团组成的组中的基团，m＝1时，R1表示选自由氢原子、供电子基团和空间位阻性基团组成的组中的基团)
＜2＞根据＜1＞所述的化合物，其中，R1中的供电子基团和空间位阻性基团为选自由碳数1～12的直链烷基、碳数3～12的支链烷基、碳数3～12的环状烷基、碳数6～10的芳基、碳数2～12的烯基、碳数2～12的炔基和碳数7～12的芳烷基组成的组中的基团。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的化合物，其中，通式(I)中，m＝1且R1为氢原子，或者，m＝0且R1为甲基、碳数3～4的支链烷基或苄基。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的化合物，其中，通式(I)中，m＝1且R1为氢原子，或者，m＝0且R1为仲丁基。
＜5＞一种药物组合物，其含有＜1＞～＜4＞中任一项所述的化合物。
＜6＞一种膀胱疾病处置剂，其含有＜1＞～＜4＞中任一项所述的化合物。
＜7＞＜1＞～＜4＞中任一项所述的化合物在膀胱疾病的处置中的应用。
＜8＞一种膀胱疾病的处置方法，其包含向对象给予＜6＞所述的膀胱疾病处置剂的步骤。
＜9＞一种排尿功能改善剂，其含有＜1＞～＜4＞中任一项所述的化合物。
＜10＞＜1＞～＜4＞中任一项所述的化合物在排尿功能改善中的应用。
＜11＞一种排尿功能的改善方法，其包含向对象给予＜9＞所述的排尿功能改善剂的步骤。
＜12＞一种化合物，其为来自CS的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物，该间隔基使前述类固醇从该化合物游离的速度比在该化合物中使用甘氨酸残基作为间隔基时小。
＜13＞根据＜12＞所述的化合物，其中，前述间隔基使前述类固醇从该化合物游离的速度与在前述化合物中使用β－丙氨酸残基作为间隔基时相比相同或小。
＜14＞一种来自CS的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物的制造方法，所述方法至少包含以下的步骤1和步骤2，
步骤1：选择间隔基，该间隔基使前述类固醇从该化合物游离的速度与选择甘氨酸残基作为前述化合物中的间隔基时相比变小；以及
步骤2：介由步骤1中选择的间隔基使来自CS的基团和来自类固醇的基团共价结合。
＜15＞根据＜14＞所述的方法，其中，前述步骤1中选择的间隔基使前述类固醇从该化合物游离的速度与选择β－丙氨酸残基作为前述化合物中的间隔基时相比相同或变小。
需要说明的是，上述＜14＞和＜15＞也可以作为含有该化合物的、药物组合物的制造方法、膀胱疾病处置剂的制造方法、排尿功能改善剂的制造方法，本发明也包含了这种思想。此时，可以进一步包含如下步骤：配合与制造目标物(药物组合物、膀胱疾病处置剂、或排尿功能改善剂)相应的、药学上允许的成分。
发明的效果
根据本发明，可以提供一种能降低类固醇单剂所具有的全身性副作用、此外发挥比CS和类固醇单剂更高效果的硫酸软骨素衍生物，以及，含有该化合物的药物组合物和膀胱疾病处置剂。
附图说明
图1为示出在盐酸引发尿频大鼠模型中CS－β－丙氨酰基－强的松龙、CS－β－丙氨酰基－倍他米松和CS－β－丙氨酰基－丙炎松对排尿间隔的作用的图表。
图2为示出在盐酸引发尿频大鼠模型中CS－β－丙氨酰基－丙炎松、CS－甘氨酰基－丙炎松和CS－异亮氨酰基－丙炎松对排尿间隔的作用的图表。
图3为示出在盐酸引发尿频大鼠模型中CS－β－丙氨酰基－丙炎松、CS－甘氨酰基－丙炎松和CS－异亮氨酰基－丙炎松对胸腺湿重量的影响的图表。
图4为示出在盐酸引发尿频大鼠模型中CS－β－丙氨酰基－倍他米松以及CS与倍他米松混合液对排尿间隔的作用的图表。
具体实施方式
在本说明书中，“步骤”这一术语不仅是指独立的步骤，在与其它步骤无法明确区分时，只要达到了该步骤的预期目的则也包含在本术语中。此外，使用“～”而示出的数值范围表示包含分别将记载在“～”的前后的数值作为最小值和最大值的范围。进而，关于组合物中的各成分的含量，在组合物中存在多种相当于各成分的物质时，只要没有特别声明则指存在于组合物中的该多种物质的合计量。
以下通过具体实施方式来详细说明本发明。
(1)硫酸软骨素衍生物
作为本发明化合物的硫酸软骨素衍生物是来自CS的基团和来自类固醇的基团介由下述通式(I)所示的间隔基共价结合而成的。
－HN－(CH2)m－CHR1－CO－ (I)
式中，m表示0或1的整数。其中，m＝0时，R1表示选自由供电子基团和空间位阻性基团组成的组中的基团；m＝1时，R1表示选自由氢原子、供电子基团和空间位阻性基团组成的组中的基团。
来自CS的基团和来自类固醇的基团介由具有特定结构的间隔基共价结合而成的硫酸软骨素衍生物能降低类固醇单剂所具有的全身性副作用、使抗炎症效果或免疫抑制作用长期持续。硫酸软骨素衍生物特别是作为膀胱疾病处置剂能达到优异的效果。在硫酸软骨素衍生物中，间隔基为特定结构，从而能降低起因于类固醇的全身性副作用，且通过使药效在局部持续，从而能特别是作为膀胱疾病处置剂发挥优异的效果。
硫酸软骨素衍生物含有至少1种来自CS的基团。这里，来自CS的基团是指从CS所具有的羧基中除去羟基而形成的基团。
构成硫酸软骨素衍生物的CS只要具有如下结构就没有特别限定，所述结构为在D－葡萄糖醛酸(或D－艾杜糖醛酸)和N－乙酰基－D－半乳糖胺的二糖反复以二糖单元形成的糖链骨架上保持有硫酸基的结构。此外，CS所具有的包括羧基和硫酸基在内的酸性官能团可以为未形成盐的游离状态，也可以为形成了药学上可允许的盐的状态。
作为药学上可允许的盐，可以列举：钠盐、钾盐等与碱金属离子的盐；镁盐、钙盐等与碱土金属离子的盐等。从对生物体的适用性和亲和性的观点出发，CS优选为药学上允许的与碱金属离子的盐，更优选为钠盐。
构成硫酸软骨素衍生物的CS可以根据其种类通过公知的方法来制造。作为CS的制造方法，可以列举例如：从来自动物的原料提取纯化、从产软骨素菌等培养纯化、糖链修饰、糖链合成等。
对CS的重均分子量没有特别限定，可以根据目的等适当选择。重均分子量优选为500～120000，更优选为2500～60000，进一步优选为10000～40000。CS的重均分子量可以通过光散射法来测定。
硫酸软骨素衍生物含有至少一种来自类固醇的基团。这里，来自类固醇的基团是指从类固醇分子所具有的羟基除去氢原子而形成的基团。对除去氢原子的位置没有特别限定。
对构成硫酸软骨素衍生物的类固醇的种类没有特别限定，可以根据目的等适当选择。作为类固醇，具体可以例示出：强的松龙、倍他米松、去炎松、丙炎松、布地奈德、氟地松等，优选使用选自由这些组成的组中的至少1种。
类固醇可以单独使用1种，也可以将2种以上组合使用。
从控制类固醇从硫酸软骨素衍生物游离的速度的观点出发，来自类固醇的基团与间隔基的共价结合为生物体中可降解的共价结合，优选为通过缩合反应形成的共价结合，更优选为酯键。通过来自类固醇的基团与间隔基的共价结合的分解(优选加溶剂分解)，类固醇游离。也可以是来自CS的基团和间隔基的共价结合分解后，来自类固醇的基团和间隔基的共价结合分解、类固醇游离。
从控制类固醇的游离速度的观点出发，优选硫酸软骨素衍生物与来自CS的基团和间隔基(－HN－(CH2)m－CHR1－CO－)通过酰胺键进行共价结合、来自类固醇的基团和间隔基通过酯键进行共价结合。即，形成间隔基的化合物(以下也称为间隔基形成分子)优选为分子结构中具有含羧基和氨基的结构的化合物(例如氨基酸)。优选CS的羧基和间隔基形成分子的氨基形成酰胺键、类固醇的羟基和间隔基形成分子的羧基形成酯键的硫酸软骨素衍生物。
间隔基为通式(I)所示的2价的连接基团。通式(I)中的m表示0或1的整数。其中，m＝0时，R1表示供电子基团或空间位阻性基团。m＝1时，R1表示氢原子、供电子基团或空间位阻性基团。m的个数和R1有无供电子基团或空间位阻性基团会影响来自类固醇的基团和间隔基之间的酯键的分解速度。与m＝1时相比，m＝0时，有酯键的分解更容易受影响、类固醇从硫酸软骨素衍生物游离的速度加快的倾向。
本说明书中使用的“空间位阻性基团”是指：对加溶剂分解等化学反应引起空间位阻的体积大的基团。一般来说，间隔基的R1被供电子基团或空间位阻性基团取代时，与R1为氢原子时相比，来自类固醇的基团和间隔基的共价结合的分解变困难，类固醇的游离速度下降。游离速度的下降可以通过后述方法适当测定。
供电子基团或空间位阻性基团只要能导入到R1中则没有特别限定，可以从通常使用的供电子基团或空间位阻性基团中适当选择。具体而言，可以列举：甲基、乙基、丙基、丁基等碳数1～12的直链状烷基；异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基等碳数3～12的支链烷基；环己基等碳数3～6的环状烷基；苯基、甲苯基等碳数6～10的芳基；乙烯基、烯丙基等碳数2～12的烯基；碳数2～12的炔基；苄基等碳数7～12的芳烷基等。这些中，优选选自由甲基、碳数3～4的支链烷基、苄基等组成的组中的基团。作为间隔基形成分子，具体而言，可以使用β－丙氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸，优选为选自由这些组成的组中的至少1种，更优选为选自由β－丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸组成的组中的至少1种。
此外，作为上述间隔基形成分子，还可以利用上述以外的具有取代基的其它氨基酸。作为其它氨基酸，可以利用精氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、组氨酸等。
间隔基形成分子可以单独使用1种，也可以将2种以上组合使用。
作为通式(I)所示的间隔基，从作为膀胱疾病处置剂的效果和抑制副作用的观点出发，优选－HN－(CH2)2－CO－、－HN－CH(CH(CH3)CH2CH3)－CO－、－HN－CH(CH(CH3)2)－CO－、或－HN－CHCH2(CH(CH3)2)－CO－所示的氨基酸残基，更优选－HN－(CH2)2－CO－或－HN－CH(CH(CH3)CH2CH3)－CO－。即，作为间隔基形成分子，优选为β－丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸，更优选为β－丙氨酸或异亮氨酸。
硫酸软骨素衍生物可根据CS的结构等而取各种结构。作为硫酸软骨素衍生物的结构的具体例子，可以例示例如包含下述化学式(II)所示的结构单元中的至少1种的结构。
式(II)中，R11分别独立地表示氢原子或硫酸基的钠盐，硫酸基的盐的阳离子部分并非仅限于所例示的钠。此外，R11中的硫酸基的盐的个数为例如0～4，优选为0～3。R13表示选自由空间位阻性基团和供电子基团组成的组中的基团，R14表示选自由氢原子、空间位阻性基团和供电子基团组成的组中的基团。
硫酸软骨素衍生物可以仅含有1种上述化学式所示的结构单元，也可以以任意比例、任意位置关系含有2种以上。硫酸软骨素衍生物优选除了上述化学式所示的结构单元以外进一步包含CS中通常含有的结构单元。作为CS中通常含有的结构单元，可以列举式(II)中的R12用ONa或OH来表示的结构单元等。其中，盐的阳离子部分并非仅限于所例示的钠。
介由间隔基共价结合于CS的类固醇分子相对于硫酸软骨素衍生物的含有比率(重量比例)优选为3w/w％以上，更优选为10w/w％以上，进一步优选为30w/w％以上。需要说明的是，类固醇分子的含有比率可以根据类固醇分子的种类、效果的强弱和对水的溶解性等性质以及间隔基的种类等来适当选择。
类固醇从硫酸软骨素衍生物游离的速度可以根据目的等适当选择。例如，在pH7.4、36℃的10mM磷酸盐缓冲液中，类固醇的游离速度优选为0.1～4％/天，更优选为0.1～3％/天，进一步优选为0.5～1％/天。在这里，类固醇的游离速度是指游离率(％)的每一天的变化量，在横轴作为时间、纵轴作为类固醇的游离量(摩尔)相对于硫酸软骨素衍生物中所含的来自类固醇的基团的总摩尔数(100％)的比例、即游离率(％)时，定义为图表的斜率。
因此，当测定期内游离速度维持恒定值时，图表为单调增加的直线。这种情况下，例如，在pH7.4、36℃的10mM磷酸盐缓冲液中，10天内硫酸软骨素衍生物所含的全部类固醇游离时，游离速度表述为10％/天。
另一方面，游离速度并非恒定值、而是经时下降的情况下(图表中显示为上凸、单调增加的平缓曲线)，将初始上升期(例如3天)的游离率变化近似为直线而算出游离速度。
需要说明的是，类固醇的游离量(游离的类固醇的量)可以通过根据类固醇种类而适当选择的方法来测定。
(2)硫酸软骨素衍生物的制造方法
硫酸软骨素衍生物可以通过使CS分子所具有的官能团(例如羧基)和类固醇所具有的官能团(例如羟基)介由具有特定结构的间隔基进行共价结合来得到。
以下对硫酸软骨素衍生物的制造方法的一例进行说明，但并不限于以下的方法。
来自CS的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的硫酸软骨素衍生物例如可以通过包含以下步骤的制造方法来制造。
一种制造方法，其包含如下步骤：
(A)使类固醇所具有的羟基与间隔基形成分子的羧基缩合而形成共价结合(酯键)；以及，
(B)使CS所具有的羧基与间隔基形成分子的氨基缩合而形成共价结合(酰胺键)。
(A)的步骤中，使类固醇所具有的羟基与间隔基形成分子的羧基缩合而形成共价结合。此时，间隔基形成分子的预定与CS反应的氨基可以根据需要预先用通常使用的方法进行保护。
(B)的步骤中，使CS所具有的羧基与间隔基形成分子的氨基缩合而形成共价结合。此时，间隔基形成分子的预定与类固醇反应的羧基可以根据需要预先用通常使用的方法进行保护。
硫酸软骨素衍生物的制造方法只要包含(A)的步骤和(B)的步骤即可，对进行各步骤的顺序没有限定。
缩合(酯化、酰胺化)方法从通常使用的方法中适当选择即可。作为缩合方法，可以列举例如：使用水溶性碳二亚胺(例如1－(3－二甲基氨基丙基)－3－乙基碳二亚胺盐酸盐)、4－(4,6－二甲氧基－1,3,5－三嗪－2－基)－4－甲基吗啉氯化物含水合物(DMT－MM)、二环己基碳二亚胺等缩合剂的方法；对称酸酐法；混合酸酐法；活性酯法等方法。缩合反应条件可以根据所应用的缩合反应来适当选择。
间隔基形成分子优选按照可得到所期望的类固醇的游离速度的方式来选择。间隔基形成分子具有与类固醇形成酯键的羧基、与CS形成酰胺键的氨基以及连接2个反应性官能团的连接基团。连接基团优选按照可控制与类固醇的酯键的分解速度的方式来选择。间隔基形成分子的选择方法如前述那样按照将m和R1适当组合从而可实现期望的分解速度的方式来选择即可。
(3)药物组合物
药物组合物含有硫酸软骨素衍生物中的至少1种，根据需要可以进一步含有药学上允许的赋形剂等其它成分。作为其它成分，除了药学上允许的赋形剂以外，还可以列举：表面活性剂、生理活性物质、稳定化剂、液态介质等。生理活性物质与从硫酸软骨素衍生物游离的类固醇可以相同，也可以不同。
对药物组合物的用途没有特别限定，优选例如用于膀胱疾病处置。
(4)膀胱疾病处置剂
膀胱疾病处置剂为含有硫酸软骨素衍生物中的至少1种的药物组合物，用于膀胱疾病的处置。
本说明书中所使用的“处置”是指：可以是对于疾病实施的任何处置，可以列举例如：疾病的治疗、改善和进展抑制(防止恶化)。
处置剂的形态只要为能对人的尿道·膀胱进行给予的制剂或药物的形态则没有特别限定，给予时的形态优选为液体，可以列举例如：溶液或悬浮液等形态。溶液或悬浮液还可以通过将硫酸软骨素衍生物的粉体在用时溶解而制备，从而进行给予。膀胱疾病处置剂优选用于膀胱内给予。
作为膀胱疾病处置剂的给予量，只要为足以覆盖膀胱内的粘膜整体的量即可，例如，在为人的情况下，可以例示5mL～200mL左右。
关于以液体形式给予时的、膀胱疾病处置剂中的硫酸软骨素衍生物的浓度，例如用尿道导管给予时，为能在该导管内通过的浓度即可，本领域技术人员可以适当调整。
关于膀胱疾病处置剂的给予方法，可以列举例如如下方法：将尿道导管在无菌条件下插入膀胱内，排出残尿后，通过同一导管注入的方法等。
注入膀胱内的膀胱疾病处置剂以CS和类固醇介由间隔基共价结合的状态到达并附着在膀胱壁上，然后间隔基和类固醇之间的共价结合逐渐分解，从而类固醇长时间(例如1周以上)地缓慢释放。
膀胱疾病处置剂可以在膀胱内使类固醇逐渐游离。类固醇在膀胱内持续游离的时间(效果的持续性)优选为168小时(7天)以上，进一步优选336小时(14天)以上。
膀胱疾病处置剂的膀胱内给予频度可以由硫酸软骨素衍生物和从硫酸软骨素衍生物游离的类固醇的动态来决定。例如，可以列举1次/1周给予至1次/1个月给予，但并非仅限于此。
膀胱疾病处置剂以用于膀胱疾病的处置为目的。本说明书中的“膀胱疾病”是指：膀胱中发生的疾病以及任何异常，包括例如急性膀胱炎、慢性膀胱炎、间质性膀胱炎、出血性膀胱炎、放射线性膀胱炎、膀胱过动症等。在膀胱疾病中，膀胱疾病处置剂特别优选针对间质性膀胱炎来使用。间质性膀胱炎的概念中也可以包括称为疼痛性膀胱综合症(Painfulbladder syndrome：PBS/Bladder pain syndrome：BPS)的疾病、称为过敏性膀胱综合症(Hypersensitive bladder syndrome：HBS)的疾病。
(5)膀胱疾病的处置方法
膀胱疾病的处置方法包含将膀胱疾病处置剂给予膀胱内的步骤。膀胱疾病的处置方法可以根据需要进一步包含其它步骤。膀胱疾病处置方法可以按照前述“(4)膀胱疾病处置剂”的说明同样地实施，优选的处置剂的条件·给予频度等也与前述相同。
(6)排尿功能改善剂
本说明书中所使用的“排尿功能改善”是指：改善尿频、其它与排尿功能相关的异常。即，排尿功能改善剂是基于将前述药物组合物进行膀胱内给予的排尿功能的改善剂，包括尿频改善剂的概念。由后述实施例可知，前述药物组合物可以改善排尿功能，例如可以显著延长排尿间隔、增加一次排尿量，因此例如还可以用于改善间质性膀胱炎所特有的慢性尿频。排尿功能改善剂可以按照前述膀胱疾病的处置方法等的说明同样实施，此外，优选的改善剂的条件·给予频度等也与前述相同。
(7)排尿功能改善方法
排尿功能的改善方法包含将排尿功能改善剂给予膀胱内的步骤。排尿功能改善方法可以根据需要进一步包含其它步骤。排尿功能改善方法可以按照前述“(6)排尿功能改善剂”的说明同样实施，优选的排尿功能改善剂的条件·给予频度等也与前述相同。
此外，本发明还包含基于如下新见解的如下方式，所述新见解为：在来自CS的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物中，通过选择具有规定特性的间隔基(使类固醇从该化合物游离的速度与在该化合物中以特定氨基酸残基为间隔基时相比变小的间隔基)并使其夹在这些基团间，从而可以降低起因于类固醇的全身性副作用。
(8)硫酸软骨素衍生物的另一方式
本发明的另一方式的硫酸软骨素衍生物为来自CS的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物，该间隔基使前述类固醇从该化合物游离的速度比在该化合物中使用甘氨酸残基作为间隔基时小。其中，优选采用如下间隔基：前述类固醇从前述化合物游离的速度与在前述化合物中使用β－丙氨酸残基作为间隔基时相比相同或变小的间隔基。
这里，硫酸软骨素衍生物的另一方式中的间隔基分子只要为将来自CS的基团和来自类固醇的基团两者连接的2价的连接基团、并且与在该化合物中采用甘氨酸残基、优选采用β－丙氨酸残基作为间隔基时相比、该类固醇从该化合物游离的速度变小，则没有特别限定。作为具体的间隔基，可以列示上述的(1)硫酸软骨素衍生物中记载的通式(I)所示的2价连接基团等。
这里，上述化合物的类固醇的游离速度可以通过前述(1)硫酸软骨素衍生物中记载的方法、试验例A2的方法来测定。
此外，为了选择前述具有规定特性的间隔基，可以在pH7.4、36℃的10mM磷酸盐缓冲液中溶解特定结构的化合物，将1周后的类固醇游离率(％)除以7，对所得的值的大小进行比较，从而选择与特定氨基残基间隔基相比类固醇从该化合物游离的速度小的化合物，由此来确定。
通过对如此确定的游离速度进行比较，从而可以选择出与间隔基为甘氨酸残基、优选为β－丙氨酸残基时相比类固醇的游离速度变小的间隔基。
关于构成硫酸软骨素衍生物的另一方式的CS、类固醇、间隔基、共价结合等的说明以及关于硫酸软骨素衍生物的另一方式的制造的说明等，只要不与该硫酸软骨素衍生物的另一方式中说明的事项抵触则与上述的(1)和(3)～(7)的“硫酸软骨素衍生物”、“药物组合物”、“膀胱疾病处置剂”、“膀胱疾病的处置方法”、“排尿功能改善剂”和“排尿功能改善方法”的记载相同。
(9)硫酸软骨素衍生物的制造方法的另一方式
本发明包含以下所示的硫酸软骨素衍生物的制造方法的另一方式。硫酸软骨素衍生物的制造方法的另一方式为来自CS的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物的制造方法，包含(C)选择间隔基的步骤，所述间隔基使该类固醇从该化合物游离的速度与选择甘氨酸残基作为该化合物中的间隔基时相比变小。
并且，制造方法可以包含如下工序：使来自CS的基团和来自类固醇的基团介由上述所选择的间隔基进行共价结合。对该共价结合的方法没有特别限定，例如可以使所选择的间隔基和类固醇通过公知的方法缩合而得到中间体，然后使该中间体与CS通过公知的方法缩合。
例如，在上述(C)的步骤后，可以包含前述(2)硫酸软骨素衍生物的制造方法中记载的(A)和(B)的步骤。此外，上述(C)的步骤中的间隔基的选择并非必须与其它步骤连续进行，例如，可以预先进行间隔基的选择，日后再进行后续的其它步骤。
以下对制造方法的更具体的方式进行说明，但不受以下的方法的限定。
a)一种来自CS的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物的制造方法，其至少包含以下的步骤1和2，
步骤1：选择间隔基，所述间隔基使前述类固醇从该化合物游离的速度与选择甘氨酸残基(更优选β－丙氨酸残基)作为前述化合物中的间隔基时相比变小；以及，
步骤2：介由步骤1中选择的间隔基使来自CS的基团和来自类固醇的基团进行共价结合。
b)一种来自CS的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物的制造方法，其至少包含以下的步骤1～3，
步骤1：选择间隔基，所述间隔基使与选择甘氨酸残基(更优选β－丙氨酸残基)时相比、该化合物中的该类固醇的游离速度变小，
步骤2：使步骤1中选择的间隔基和类固醇进行共价结合(例如酯键)，得到中间体；以及，
步骤3：使步骤2中得到的中间体和CS进行共价结合(例如酰胺键)。
此外，制造方法也可以作为前述(3)、(4)和(6)的“药物组合物”、“膀胱疾病处置剂”和“排尿功能改善剂”等的制造方法。这种情况下，还可以根据所制造的目标物(药物组合物、膀胱疾病处置剂、或排尿功能改善剂)而进一步包含配合药学上允许的成分的步骤。
对于制造方法中的CS、类固醇、间隔基、共价结合等的说明、关于制造的其它说明等而言，只要不与该本发明制造方法中说明的事项抵触，则与前述(2)硫酸软骨素衍生物的制造方法中的说明相同。
从而，在来自CS的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物中，通过在该化合物中选择并夹持间隔基、且该间隔基使类固醇从该化合物游离的速度与以特定氨基酸残基为间隔基时相比变小，从而可以制成降低了起因于类固醇的全身性副作用的化合物、药物组合物、膀胱疾病处置剂、或排尿功能改善剂。制造方法对于制造这样的降低了副作用的制品有用。
实施例
以下，更具体地详细说明本发明的实施例和试验例。但是，本发明的技术范围不受这些例子限制。需要说明的是，硫酸软骨素衍生物中所含的类固醇含量(w/w％)通过后述的方法来测定。
(实施例1)21－β－丙氨酰基－强的松龙导入CS的制备
(1－1)21－(Boc－β－丙氨酰基)－强的松龙的制备
将Boc－β－丙氨酸(渡边化学工业株式会社制)1.58g溶解于二氯甲烷60mL和二甲基甲酰胺20mL中，加入强的松龙(和光纯药工业株式会社制；以下也简记为“PRED”)3.00g和4－二甲基氨基吡啶(和光纯药工业株式会社制)305mg并溶解。然后，在冰冷却下加入水溶性碳二亚胺(东京化成工业株式会社制)4.00g，在室温下搅拌一整夜。通过薄层色谱确认原料消失后，在冰冷却下加入饱和氯化铵水溶液而使反应停止。用二氯甲烷、甲苯和水进行分液萃取，将所收集的有机层用饱和氯化铵水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水溶液依次洗涤。然后，用硫酸镁脱水并过滤后，在减压下蒸馏去除溶剂。将浓缩物用氯仿溶解后，再次在减压下蒸馏去除。将该操作重复3次，得到4.73g作为目标的21－(Boc－β－丙氨酰基)－强的松龙(化合物1)(收率107％)。
(1－2)21－β－丙氨酰基－强的松龙盐酸盐的制备
将(1－1)中得到的化合物1 4.73g溶解于二氯甲烷90mL，在冰冷却下加入4M盐酸/乙酸乙酯(渡边化学工业株式会社制)45mL并搅拌3小时。通过薄层色谱确认原料消失后，在减压下蒸馏去除溶剂。将浓缩物用乙醚洗涤后，在减压下蒸馏去除溶剂，得到3.42g作为目标的21－β－丙氨酰基－强的松龙盐酸盐(化合物2)(收率88％)。
(1－3)21－β－丙氨酰基－强的松龙导入CS的制备
将CS(钠盐、生化学工业株式会社制、重均分子量约2万：光散射法)524mg溶解于蒸馏水10mL，加入丙酮10mL并搅拌。将(1－2)中得到的化合物2 395mg和4－(4,6－二甲氧基－1,3,5－三嗪－2－基)－4－甲基吗啉氯化物含水合物(以下记作DMT－MM)(株式会社德山制)838mg一边用总计3mL的50％丙酮/蒸馏水润洗一边加入，并搅拌一整夜。然后，加入氯化钠0.1g和润洗的50％丙酮/蒸馏水，将溶解有氯化钠的反应液逐渐加入到90％乙醇/蒸馏水300mL中而形成沉淀，离心分离后舍弃上清。然后，将沉淀用90％乙醇/蒸馏水、95％乙醇/蒸馏水依次洗涤。将得到的沉淀减压干燥一整夜，从而得到787mg作为目标的21－β－丙氨酰基－强的松龙导入CS。由248nm处的吸光度测定求出导入到CS中的强的松龙含量(w/w％)，结果为35w/w％。
(实施例2)21－β－丙氨酰基－倍他米松导入CS的制备
(2－1)21－(Boc－β－丙氨酰基)－倍他米松的制备
将Boc－β－丙氨酸2.0g溶解于二氯甲烷50mL、和二甲基甲酰胺50mL，加入倍他米松(和光纯药工业株式会社制；以下也简记为“BTM”)4.15g。然后，在冰冷却下加入4－二甲基氨基吡啶389mg、和水溶性碳二亚胺2.64g，在室温下搅拌一整夜。通过薄层色谱确认原料消失后，加入饱和氯化铵水溶液而使反应停止。用甲苯和水进行分液萃取，将所收集的有机层用饱和氯化铵水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水溶液依次洗涤。然后，用硫酸镁脱水并过滤后，在减压下蒸馏去除溶剂，得到5.84g作为目标的21－(Boc－β－丙氨酰基)－倍他米松(化合物3)(收率98％)。
(2－2)21－β－丙氨酰基－倍他米松盐酸盐的制备
将(2－1)中得到的化合物3 5.84g溶解于四氢呋喃120mL，在冰冷却下加入4M盐酸/乙酸乙酯100mL，在室温下搅拌3小时。通过薄层色谱确认原料消失后，在减压下蒸馏去除溶剂。将得到的浓缩物用乙醚洗涤并过滤后，在减压下蒸馏去除溶剂，得到4.60g作为目标的21－β－丙氨酰基－倍他米松盐酸盐(化合物4)(收率96％)。
(2－3)21－β－丙氨酰基－倍他米松导入CS的制备
在CS(钠盐、重均分子量：约2万)524mg中加入蒸馏水10mL而溶解，加入丙酮10mL并搅拌。将(2－2)中得到的化合物4 422mg和DMT－MM 839mg一边用总计3mL的50％丙酮/蒸馏水润洗一边加入，并搅拌一整夜。然后，加入氯化钠0.1g和润洗的50％丙酮/蒸馏水，将溶解有氯化钠的反应液逐渐加入90％乙醇/蒸馏水300mL中而形成沉淀，离心分离后舍弃上清。然后，将沉淀用90％乙醇/蒸馏水、95％乙醇/蒸馏水依次洗涤。将得到的沉淀减压干燥一整夜，得到770mg作为目标的21－β－丙氨酰基－倍他米松导入CS。由242nm处的吸光度测定算出导入到CS中的倍他米松含量(w/w％)，结果为40w/w％。
(实施例3)21－β－丙氨酰基－丙炎松导入CS的制备
(3－1)21－(Boc－β－丙氨酰基)－丙炎松的制备
将Boc－β－丙氨酸2.63g溶解于二氯甲烷40mL、和二甲基甲酰胺10mL中，加入丙炎松(和光纯药工业株式会社制；以下也简记为“TA”)5.01g。然后，在冰冷却下加入4－二甲基氨基吡啶426mg、水溶性碳二亚胺3.32g，在室温下搅拌一整夜。通过薄层色谱确认原料消失后，加入饱和氯化铵水溶液而使反应停止。用甲苯和水进行分液萃取，将所收集的有机层用饱和氯化铵水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水溶液依次洗涤。然后，用硫酸镁干燥并过滤后，在减压下蒸馏去除溶剂，得到6.66g作为目标的21－(Boc－β－丙氨酰基)－丙炎松(化合物5)(收率96％)。
(3－2)21－β－丙氨酰基－丙炎松盐酸盐的制备
将(3－1)中得到的化合物5 6.66g溶解于四氢呋喃90mL中，在冰冷却下加入4M盐酸/乙酸乙酯90mL，在室温下搅拌3小时。通过薄层色谱确认原料消失后，在减压下蒸馏去除溶剂。将浓缩物用乙醚洗涤，在减压下蒸馏去除溶剂，得到5.78g作为目标的21－β－丙氨酰基－丙炎松盐酸盐(化合物6)(收率97％)。
(3－3)21－β－丙氨酰基－丙炎松导入CS的制备
将CS(钠盐、重均分子量：约2万)524mg溶解于蒸馏水10mL，加入丙酮10mL并搅拌。将(3－2)中得到的化合物6 458mg和DMT－MM839mg一边用总计3mL的50％丙酮/蒸馏水润洗一边加入，并搅拌一整夜。然后，加入氯化钠0.1g和润洗的50％丙酮/蒸馏水，将溶解有氯化钠的反应液逐渐加入到90％乙醇/蒸馏水300mL中而形成沉淀，离心分离后舍弃上清。然后，将沉淀用90％乙醇/蒸馏水、95％乙醇/蒸馏水依次洗涤。将得到的沉淀减压干燥一整夜，从而得到819mg作为目标的21－β－丙氨酰基－丙炎松导入CS。由242nm处的吸光度测定求出导入到CS中的丙炎松含量(w/w％)，结果为38w/w％。
(实施例4)21－甘氨酰基－丙炎松导入CS的制备
(4－1)21－(Boc－甘氨酰基)－丙炎松的制备
将Boc－甘氨酸(渡边化学工业株式会社制)1.71g溶解于二氯甲烷30mL、和二甲基甲酰胺10mL中，加入丙炎松4.01g。然后，在冰冷却下加入4－二甲基氨基吡啶338mg、水溶性碳二亚胺2.65g，在室温下搅拌一整夜。通过薄层色谱确认原料消失后，加入饱和氯化铵水溶液而使反应停止。用甲苯和水进行分液萃取，将所收集的有机层用饱和氯化铵水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水溶液依次洗涤。然后，用硫酸镁脱水并过滤后，在减压下蒸馏去除溶剂，得到5.21g作为目标的21－(Boc－甘氨酰基)－丙炎松(化合物7)(收率96％)。
(4－2)21－甘氨酰基－丙炎松盐酸盐的制备
将(4－1)中得到的化合物7 5.21g溶解于四氢呋喃90mL中，在冰冷却下加入4M盐酸/乙酸乙酯90mL并搅拌3小时。通过薄层色谱确认原料消失后，在减压下蒸馏去除溶剂。将浓缩物用乙醚洗涤，在减压下蒸馏去除溶剂，得到4.16g作为目标的21－甘氨酰基－丙炎松盐酸盐(化合物8)(收率88％)。
(4－3)21－甘氨酰基－丙炎松导入CS的制备
将CS(钠盐、重均分子量：约2万)1.04g溶解于蒸馏水20mL，加入丙酮20mL并搅拌。将(4－2)中得到的化合物8 806mg和DMT－MM1.46g一边用总计20mL的50％丙酮/蒸馏水润洗一边加入，并搅拌一整夜。然后，加入氯化钠4g和润洗的50％丙酮/蒸馏水，将溶解有氯化钠的反应液加入到乙醇420mL中而形成沉淀，离心分离后舍弃上清。然后，将沉淀用80％乙醇/蒸馏水、90％乙醇/蒸馏水、95％乙醇/蒸馏水、乙醇依次洗涤。将得到的沉淀减压干燥一整夜，从而得到1.34g作为目标的21－甘氨酰基－丙炎松导入CS。由241nm处的吸光度测定求出导入到CS中的丙炎松含量(w/w％)，结果为37w/w％。
(实施例5)21－异亮氨酰基－丙炎松导入CS的制备
(5－1)21－(Boc－异亮氨酰基)－丙炎松的制备
将Boc－异亮氨酸(渡边化学工业株式会社制)2.24g溶解于二氯甲烷30mL、和二甲基甲酰胺10mL中，加入丙炎松4.00g。然后，在冰冷却下加入4－二甲基氨基吡啶338mg、水溶性碳二亚胺2.65g，在室温下搅拌一整夜。通过薄层色谱确认原料消失后，加入饱和氯化铵水溶液而使反应停止。用甲苯和水进行分液萃取，将所收集的有机层用饱和氯化铵水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水溶液依次洗涤。然后，用硫酸镁脱水并过滤后，在减压下蒸馏去除溶剂，得到5.65g作为目标的21－(Boc－异亮氨酰基)－丙炎松(化合物9)(收率95％)。
(5－2)21－异亮氨酰基－丙炎松盐酸盐的制备
将(5－1)中得到的化合物9 5.65g溶解于四氢呋喃90mL中，在冰冷却下加入4M盐酸/乙酸乙酯90mL，在室温下搅拌3小时。通过薄层色谱确认原料消失后，在减压下蒸馏去除溶剂。将浓缩物用乙醚洗涤，在减压下蒸馏去除溶剂，得到3.05g作为目标的21－异亮氨酰基－丙炎松盐酸盐(化合物10)(收率60％)。
(5－3)21－异亮氨酰基－丙炎松导入CS的制备
将CS(钠盐、重均分子量：约2万)1.04g溶解于蒸馏水20mL中，加入丙酮20mL并搅拌。将(5－2)中得到的化合物10 881mg、和DMT－MM 1.46g一边用总计34mL的50％丙酮/蒸馏水润洗一边加入，并搅拌一整夜。然后，加入氯化钠5g和润洗的50％丙酮/蒸馏水，将溶解有氯化钠的反应液逐渐加入到乙醇444mL中而形成沉淀，舍弃上清。用80％乙醇/蒸馏水洗涤，舍弃上清。加入95％乙醇/蒸馏水，用过滤器过滤。将过滤器上的沉淀用95％乙醇/蒸馏水、乙醇依次洗涤，将得到的沉淀减压干燥一整夜，从而得到1.59g作为目标的21－异亮氨酰基－丙炎松导入CS。由241nm处的吸光度测定求出导入到CS中的丙炎松含量(w/w％)，结果为35w/w％。
＜类固醇含量的测定法＞
对于上述得到的各化合物，在吸光度具有直线性的范围内用蒸馏水适当溶解、稀释。用紫外可见分光光度计(岛津制作所)，以蒸馏水为对照，对测定对象的最大吸收波长附近的吸光度进行测定。
导入到各化合物中的类固醇含量(w/w％)通过以下的计算式来算出。
类固醇含量(w/w％)＝(Abs/ε×MwST)/((WT×(100-WD)/100)/(V×Mc))×100
Abs：吸光度
WT：试样称量值(mg)
WD：试样的干燥减量(％)
ε：摩尔吸光系数
MwST：类固醇分子量
V：溶解液量(mL)
Mc：稀释倍率
摩尔吸光系数由基于实施例1～5中记载的方法而合成的化合物2、4、6、8和10来算出。下表1中示出各化合物的摩尔吸光系数(ε)和所使用的类固醇的分子量(MwST)。
[表1]
化合物 ε MwST
21-β-丙氨酰基-强的松龙盐酸盐 13525 360.4
21-β-丙氨酰基-倍他米松盐酸盐 13402 392.5
21-β-丙氨酰基-丙炎松盐酸盐 14478 434.5
21-甘氨酰基-丙炎松盐酸盐 14730 434.5
21-异亮氨酰基-丙炎松盐酸盐 14292 434.5
以后的实施例中，将合成的硫酸软骨素衍生物的名称简记如下。
[表2]
化合物(硫酸软骨素衍生物) 简称
21-β-丙氨酰基-强的松龙导入CS CS-βAla-PRED
21-β-丙氨酰基-倍他米松导入CS CS-βAla-BTM
21-β-丙氨酰基-丙炎松导入CS CS-βAla-TA
21-甘氨酰基-丙炎松导入CS CS-Gly-TA
21-异亮氨酰基-丙炎松导入CS CS-IIe-TA
<药物游离试验>
在药物游离试验所涉及的实施例中，如下评价药物(类固醇)从硫酸软骨素衍生物游离的游离率。
(1)磷酸盐缓冲液的制备
将磷酸二氢钠二水合物780mg(5.0mmol)溶解于蒸馏水500mL，作为A液。另外将磷酸氢二钠十二水合物1.79g(5.0mmol)溶解于蒸馏水500mL，作为B液。将A液和B液以3∶7的比率混合，从而制备pH7.4的磷酸盐缓冲液。
(2)硼酸缓冲液的制备
称取硼酸0.62g(10mmol)和氯化钾0.75g(10mmol)并溶解于500mL的蒸馏水，作为第1液。另外将0.1M氢氧化钠溶液用蒸馏水稀释10倍，作为第2液。将第1液50mL和第2液7mL加入到100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容到100mL，从而制备pH8.0的硼酸缓冲液。
(3)评价方法
对于实施例中得到的硫酸软骨素衍生物，按照浓度达到5mg/10mL的方式溶解于具有各pH的缓冲液中后，在36℃的恒温槽中加温1周，每隔24小时通过液相色谱(HPLC)评价这期间的药物游离率。
评价通过使用空间排阻色谱柱(TOSOH公司制TSKgelα)测定残留于硫酸软骨素衍生物中的药物量与游离的药物量之比来进行。
液相色谱的条件具体如下。
分析时间：40分钟
流速：0.5mL/分钟
梯度：等度洗脱(isocratic)
洗脱液：乙腈(HPLC用)：生理盐水＝1：2
检测器：紫外线检测器(240nm)
温度：36℃
＜试验例A1＞药物的种类的差异所带来的游离特性变化
对于基于实施例1、2和3的方法制备的CS－βAla－PRED、CS－βAla－BTM和CS－βAla－TA，通过HPLC评价了36℃、1周内的药物游离率(％)。药物游离率的评价每隔24小时而实施。将结果示于以下。
[表3]
就CS－βAla－PRED、CS－βAla－BTM和CS－βAla－TA中的游离速度而言，在pH7.4时和pH8.0时均是CS－βAla－PRED的游离速度最快，CS－βAla－BTM和CS－βAla－TA的游离速度几乎为同等程度。
＜试验例A2＞间隔基的差异所带来的游离特性变化
对于基于实施例3、4和5的方法制备的CS－βAla－TA、CS－Gly－TA和CS－Ile－TA，通过HPLC评价了36℃、1周内的药物游离率(％)。药物游离率的评价每隔24小时而实施。将结果示于以下。
[表4]
就CS－βAla－TA、CS－Gly－TA和CS－Ile－TA中的游离速度而言，在pH7.4时和pH8.0时均按照CS－Gly－TA＞CS－βAla－TA＞CS－Ile－TA的顺序加快。
＜体内评价＞
＜试验例B1＞使用盐酸引发尿频大鼠模型的CS－类固醇的排尿功能评价(类固醇比较)
目的
目的在于，评价在将类固醇不同的硫酸软骨素衍生物(CS－βAla－PRED、CS－βAla－BTM和CS－βAla－TA)单次给予到盐酸引发尿频大鼠模型的膀胱内时的、对排尿功能的作用。
方法
将基于实施例1、2和3的方法制备的硫酸软骨素衍生物溶解于磷酸缓冲食盐液中，从而制备下述的被检物质。
试验物质：
(1)食盐(对照)
(2)1.5％(w/v％)CS－βAla－PRED(PRED含量35w/w％)
(3)1.5％(w/v％)CS－βAla－BTM(BTM含量40w/w％)
(4)1.5％(w/v％)CS－βAla－TA(TA含量38w/w％)
将大鼠(SD系(SPF)、雌性、11－13周龄)在戊巴比妥(40mg/kg、i.p.)全身麻醉下开腹，切开膀胱顶部并插入导管(PE50)，从而进行膀胱造瘘的手术。
为了引发膀胱炎而使用0.4M盐酸。在膀胱造瘘后7天，将大鼠在麻醉下保持在波尔曼保持架上，并列连接膀胱导管、压力转换器和设置在注射器泵上的注射器。一边持续注入生理盐水(3mL/小时)一边测量正常时的膀胱内压。向膀胱内持续注入0.4M盐酸(3mL/小时)15分钟，从而引发尿频。
在膀胱内注入盐酸的2天后，在麻醉下用导管(PE50)经尿道给予各被检物质0.2mL并留置30分钟。
在膀胱内注入盐酸的7天后，将大鼠保持在波尔曼保持架上，并列连接膀胱导管、压力转换器和设置在注射器泵上的注射器。从解除麻醉后的20分钟起，一边持续注入生理盐水(3mL/小时)一边测量膀胱内压变化。测定膀胱内压变化稳定状态下的排尿间隔和1次排尿量，评价排尿功能。
将结果示于图1。
结果
在图1中，结果以平均排尿间隔±标准偏差(各组例数＝3～7)形式示出。此外，**表示在t检验中p＜0.01(vs假手术组(Sham))。##表示在Dunnett多重比较检验中p＜0.01(vs对照)，#表示在Dunnett多重比较检验中p＜0.05(vs对照)。＄表示在t检验中p＜0.05(vs对照)。
由图1可知，CS－βAla－PRED给予组、CS－βAla－BTM给予组和CS－βAla－TA给予组与对照组相比均显示出显著的排尿间隔延长作用。关于1次排尿量，CS－βAla－PRED给予组、CS－βAla－BTM给予组和CS－βAla－TA给予组与对照组相比，1次排尿量也都显著增加。
考察
表明被给予至膀胱内的CS－βAla－PRED、CS－βAla－BTM和CS－βAla－TA均具有排尿功能改善作用，由此可知CS和类固醇介由间隔基共价结合的化合物不论类固醇的种类如何均有效果。
＜试验例B2＞使用了盐酸引发尿频大鼠模型的CS－类固醇的排尿功能评价(间隔基比较)
目的
目的在于，评价在将间隔基不同的硫酸软骨素衍生物(CS－βAla－TA、CS－Gly－TA和CS－Ile－TA)单次给予到盐酸引发尿频大鼠模型的膀胱内时的、对排尿功能的作用。
方法
将基于实施例3、4和5的方法制备的硫酸软骨素衍生物溶解于磷酸缓冲食盐液，从而制备下述的被检物质。
试验物质：
(1)食盐(对照)
(2)1.5％(w/v％)CS－βAla－TA(TA含量37w/w％)
(3)1.5％(w/v％)CS－Gly－TA(TA含量37w/w％)
(4)1.5％(w/v％)CS－Ile－TA(TA含量35w/w％)
将大鼠(SD系(SPF)、雌性、11－14周龄)在三种混合(将美托咪啶盐酸盐、多美康和Vetorphale各0.15、2.0、2.5mg/2.5mL按照0.5mL/大鼠进行给予，i.v.)全身麻醉下开腹，切开膀胱顶部并插入导管(PE50)，从而进行膀胱造瘘的手术。
为了引发膀胱炎而使用0.4M盐酸。在膀胱造瘘的7天后，将大鼠在麻醉下保持在波尔曼保持架上，并列连接膀胱导管、压力转换器和设置在注射器泵上的注射器。一边持续注入生理盐水(3mL/小时)一边测量正常时的膀胱内压。向膀胱内持续注入0.4M盐酸(3mL/小时)15分钟，从而引发尿频。
在膀胱内注入盐酸的2天后，在麻醉下用导管(PE50)经尿道给予各被检物质0.2mL，并留置30分钟。
在膀胱内注入盐酸7天后，将大鼠保持在波尔曼保持架上，并列连接膀胱导管、压力转换器和设置在注射器泵上的注射器。从解除麻醉后的20分钟起，一边持续注入生理盐水(3mL/小时)一边测量膀胱内压变化。测定膀胱内压变化稳定状态下的排尿间隔和1次排尿量。
将结果示于图2。
关于体重变化，在手术前、手术后且即将进行盐酸引发前、即将给予被检物质前(药剂给予前)和即将膀胱内压测定(Cystometry)前进行4次体重测定，对于每个个体，以将手术前设为100％的相对值形式示出。
此外，关于胸腺湿重量，从膀胱内压测定(Cystometry)后进行安乐死的大鼠中摘出胸腺并测定其重量。将体重变化示于下表5，将胸腺湿重量示于图3。
[表5]
平均±标准偏差(各组例数＝4～9)
结果
在图2中，结果以平均排尿间隔±标准偏差(各组例数＝4～9)形式示出。此外，*表示在t检验中p＜0.05(vs假手术组(Sham))。#表示在t检验中p＜0.05(vs对照)。此外，图3中，**表示在t检验中p＜0.01(vs对照)。
由图2可知，CS－βAla－TA给予组、CS－Gly－TA给予组和CS－Ile－TA给予组与对照组相比均显示出显著的排尿间隔延长作用。关于1次排尿量，同样地，CS－βAla－TA给予组、CS－Gly－TA给予组和CS－Ile－TA给予组与对照组相比，1次排尿量均增加。
由该结果可知，即使使用Ile作为间隔基形成分子也显示出药效。可知，CS－βAla－TA也显示出药效且再现性良好。
根据图3，CS－βAla－TA给予组和CS－Ile－TA给予组与对照组相比，均未见胸腺湿重量的显著降低，仅CS－Gly－TA给予组确认到胸腺湿重量的显著降低。
此外，根据表5，CS－βAla－TA给予组和CS－Ile－TA给予组与药剂给予前相比，均未见体重减少，仅CS－Gly－TA给予组确认到显著的体重减少。
考察
表明膀胱内给予的CS－βAla－TA、CS－Gly－TA和CS－Ile－TA均具有排尿功能改善作用。但是，对于药物游离速度快的CS－Gly－TA，确认到胸腺湿重量降低和体重减少的副作用，表明不适合于膀胱内给予。另一方面，可知通过使用βAla、Ile等间隔基形成分子来控制药物游离速度，可以减轻起因于类固醇的全身性副作用。
＜试验例B3＞使用盐酸引发尿频大鼠模型的CS－类固醇化合物的排尿功能评价(结合体与混合液的比较)
目的
目的在于，评价在将CS－βAla－BTM以及CS与倍他米松(以下记作BTM)的混合液单次给予到盐酸引发尿频大鼠模型的膀胱内时的、对排尿功能的作用。
方法
将基于实施例2的方法制备的硫酸软骨素衍生物溶解于磷酸缓冲食盐液中，从而制备下述的被检物质。
试验物质：
(1)食盐(对照)
(2)3％(w/v％)CS－βAla－BTM(BTM含量34w/w％)
(3)3％CS+0.86％BTM混合液
将大鼠(SD系(SPF)、雌性、10－13周龄)在戊巴比妥(40mg/kg、i.p.)全身麻醉下开腹，将膀胱顶部切开并插入导管(PE50)，进行膀胱造瘘的手术。
为了引发膀胱炎而使用了0.4M盐酸。在膀胱造瘘7天后，将大鼠在麻醉下保持在波尔曼保持架上，并列连接膀胱导管、压力转换器和设置在注射器泵上的注射器。一边持续注入生理盐水(3mL/小时)一边测量正常时的膀胱内压。向膀胱内持续注入0.4M盐酸15分钟(3mL/小时)，从而引发尿频。
在膀胱内注入盐酸的2天后，在麻醉下用导管(PE50)经尿道给予各试验物质0.2mL，并留置30分钟。
在膀胱内注入盐酸的7天后，将大鼠保持在波尔曼保持架上，并列连接膀胱导管、压力转换器和设置在注射器泵上的注射器。从解除麻醉后的20分钟起，一边持续注入生理盐水(3mL/小时)一边测量膀胱内压变化。测定膀胱内压变化稳定状态下的排尿间隔和1次排尿量，评价排尿功能。
将结果示于图4。此外，将大鼠的体重变化示于下表6。需要说明的是，体重变化在与试验例B2相同的条件下测定。
[表6]
平均±标准偏差(各组例数＝5～8)
结果
在图4中，结果以平均排尿间隔±标准偏差(各组例数＝5～8)形式示出。此外，**表示在t检验中p＜0.01(vs假手术组(Sham))。##表示在Dunnett多重比较检验中p＜0.01(vs对照)。
根据图4可知，CS－βAla－BTM给予组与对照组相比，使排尿间隔显著延长。另一方面，CS,BTM混合液给予组未显示出排尿间隔延长作用。关于1次排尿量，同样地，CS－βAla－BTM给予组与对照组相比，也使1次排尿量显著增加，但CS,BTM混合液给予组则未显示出1次排尿量增加作用。
根据表6可知，CS,BTM混合液给予组与对照组相比，显示出显著的体重减少。而CS－βAla－BTM给予组与对照组相比，并未确认到体重减少。
考察
表明膀胱内给予的CS－βAla－BTM与CS,BTM混合液相比，显示出较高的排尿功能改善作用且可以减轻起因于类固醇的全身性副作用。
日本专利申请2015-003572号(申请日：2015年1月9日)的公开内容全体通过参照而引入本说明书中。
关于本说明书中记载的全部文献、专利申请、和技术标准，在各文献、专利申请、和技术标准通过参照形式而引入时，与具体且逐个记载时同等程度地通过参照形式引入本说明书中。
产业上的可利用性
本发明化合物作为改善膀胱疾病的化合物有用，产业上可以利用。

Claims (15)

1.一种化合物，其为来自硫酸软骨素的基团和来自类固醇的基团介由下述通式(I)所示的间隔基共价结合而成的，
－HN－(CH2)m－CHR1－CO－ (I)
式(I)中，m表示0或1的整数，其中，m＝0时，R1表示选自由供电子基团和空间位阻性基团组成的组中的基团；m＝1时，R1表示选自由氢原子、供电子基团和空间位阻性基团组成的组中的基团。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，R1中的供电子基团和空间位阻性基团为选自由碳数1～12的直链烷基、碳数3～12的支链烷基、碳数3～12的环状烷基、碳数6～10的芳基、碳数2～12的烯基、碳数2～12的炔基和碳数7～12的芳烷基组成的组中的基团。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，通式(I)中，m＝1且R1为氢原子，或者，m＝0且R1为甲基、碳数3～4的支链烷基或苄基。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物，其中，通式(I)中，m＝1且R1为氢原子，或者m＝0且R1为仲丁基。
5.一种药物组合物，其含有权利要求1～4中任一项所述的化合物。
6.一种膀胱疾病处置剂，其含有权利要求1～4中任一项所述的化合物。
7.权利要求1～4中任一项所述的化合物在膀胱疾病的处置中的应用。
8.一种膀胱疾病的处置方法，其包含向对象给予权利要求6所述的膀胱疾病处置剂的步骤。
9.一种排尿功能改善剂，其含有权利要求1～4中任一项所述的化合物。
10.权利要求1～4中任一项所述的化合物在排尿功能改善中的应用。
11.一种排尿功能的改善方法，其包含向对象给予权利要求9所述的排尿功能改善剂的步骤。
12.一种化合物，其为来自硫酸软骨素的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物，该间隔基使所述类固醇从该化合物游离的速度比在该化合物中使用甘氨酸残基作为间隔基时小。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中，所述间隔基使所述类固醇从该化合物游离的速度与在所述化合物中使用β－丙氨酸残基作为间隔基时相比相同或小。
14.一种来自硫酸软骨素的基团和来自类固醇的基团介由间隔基共价结合而成的化合物的制造方法，所述方法至少包含以下的步骤1和步骤2，
步骤1：选择间隔基，该间隔基使所述类固醇从该化合物游离的速度与选择甘氨酸残基作为所述化合物中的间隔基时相比变小；以及
步骤2：介由步骤1中选择的间隔基使来自硫酸软骨素的基团和来自类固醇的基团共价结合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤1中选择的间隔基使所述类固醇从该化合物游离的速度与选择β－丙氨酸残基作为所述化合物中的间隔基时相比相同或变小。
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