JP6748551B2 - コンドロイチン硫酸誘導体及び膀胱疾患処置剤 - Google Patents
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Description
本発明は、コンドロイチン硫酸誘導体及びそれを含有する膀胱疾患処置剤に関する。
膀胱疾患、例えば間質性膀胱炎（Interstitial cystitis : IC）は、慢性的な頻尿、尿意切迫感等の症状が見られる難治性疾患である。しかし、間質性膀胱炎の病因が明らかになっていないために、その治療は対症的・経験的な方法に頼っており、様々な試みにも拘らず決定的な治療法の確立には至っていない。
これに関連して、コンドロイチン硫酸（例えば、米国特許第６，０８３，９３３号明細書、又はインターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス（大西ら、４５６巻、１１３頁−１２０、２０１３年）参照）、ステロイド（例えば、間質性膀胱炎診察ガイドライン（日本間質性膀胱炎研究会・ガイドライン作成委員会編、２００７年１月１０日）又はAmerican Urological Association (AUA) Guideline, DIAGNOSIS AND TREATMENT OF INTERSTITIAL CYSTITIS/BLADDER PAIN SYNDROME （２０１４年９月）参照）が、膀胱疾患である間質性膀胱炎の治療剤として使用できるとの報告がある。しかしながら、コンドロイチン硫酸については、欠損したグリコサミノグリカン層の修復効果が期待できるものの、有効性の証拠は低く、ガイドライン上では行わないように勧められている。また、ステロイドについては、問題となる副作用が少なくなく、有効性の証拠も低いとして、行うように勧めるだけの根拠がないとされている（例えば、間質性膀胱炎診察ガイドライン（日本間質性膀胱炎研究会・ガイドライン作成委員会編、２００７年１月１０日）参照）。
一方、コンドロイチン硫酸に由来する基にステロイドの一種であるプレドニゾロンに由来する基がグリシン残基を介して結合した化合物（コンドロイチン硫酸−グリシル−プレドニゾロン）が、抗関節炎活性を有することが知られている（例えば、インターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス（大西ら、４５６巻、１１３頁−１２０、２０１３年）参照）。
これに関連して、コンドロイチン硫酸（例えば、米国特許第６，０８３，９３３号明細書、又はインターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス（大西ら、４５６巻、１１３頁−１２０、２０１３年）参照）、ステロイド（例えば、間質性膀胱炎診察ガイドライン（日本間質性膀胱炎研究会・ガイドライン作成委員会編、２００７年１月１０日）又はAmerican Urological Association (AUA) Guideline, DIAGNOSIS AND TREATMENT OF INTERSTITIAL CYSTITIS/BLADDER PAIN SYNDROME （２０１４年９月）参照）が、膀胱疾患である間質性膀胱炎の治療剤として使用できるとの報告がある。しかしながら、コンドロイチン硫酸については、欠損したグリコサミノグリカン層の修復効果が期待できるものの、有効性の証拠は低く、ガイドライン上では行わないように勧められている。また、ステロイドについては、問題となる副作用が少なくなく、有効性の証拠も低いとして、行うように勧めるだけの根拠がないとされている（例えば、間質性膀胱炎診察ガイドライン（日本間質性膀胱炎研究会・ガイドライン作成委員会編、２００７年１月１０日）参照）。
一方、コンドロイチン硫酸に由来する基にステロイドの一種であるプレドニゾロンに由来する基がグリシン残基を介して結合した化合物（コンドロイチン硫酸−グリシル−プレドニゾロン）が、抗関節炎活性を有することが知られている（例えば、インターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス（大西ら、４５６巻、１１３頁−１２０、２０１３年）参照）。
大西ら、インターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス、４５６巻、１１３頁−１２０、２０１３年
間質性膀胱炎診察ガイドライン、日本間質性膀胱炎研究会・ガイドライン作成委員会編（２００７年１月１０日）
American Urological Association (AUA) Guideline, DIAGNOSIS AND TREATMENT OF INTERSTITIAL CYSTITIS/BLADDER PAIN SYNDROME （２０１４年９月）
しかしながら、インターナショナル ジャーナル オブ ファーマシューティクス（大西ら、４５６巻、１１３頁−１２０、２０１３年）には、膀胱疾患についての記載も示唆もなく、また後述する特定構造のコンドロイチン硫酸誘導体についての開示も示唆もない。
本発明は、ステロイド単剤の有する全身性の副作用を低減でき、またコンドロイチン硫酸やステロイド単剤よりも高い効果を発揮する、コンドロイチン硫酸誘導体並びに当該化合物を含有する医薬組成物及び膀胱疾患処置剤を提供することを課題とする。
本発明は、ステロイド単剤の有する全身性の副作用を低減でき、またコンドロイチン硫酸やステロイド単剤よりも高い効果を発揮する、コンドロイチン硫酸誘導体並びに当該化合物を含有する医薬組成物及び膀胱疾患処置剤を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コンドロイチン硫酸（以下「ＣＳ」ともいう。）に由来する基に特定の構造を有するスペーサーを介してステロイドに由来する基が共有結合した化合物を見出し、当該化合物がステロイドに起因する全身性の副作用を低減し、かつ長期に薬効を持続させることにより、ＣＳやステロイド単剤よりも有効に膀胱疾患を改善する効果を発揮することを見出し、本発明に至った。また、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基との共有結合において、これらの基の間に特定の性質をもつスペーサーを選択して介在させることにより、ステロイド単剤の有する全身性の副作用を低減できることを見出し、本発明に至った。
すなわち、前記課題を解決するための具体的な手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。
＜１＞ ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とが下記一般式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して共有結合した化合物である。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１−ＣＯ− （Ｉ）
（式中、ｍは０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示し、ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示す）
＜２＞ Ｒ１における電子供与基及び立体障害性基が、炭素数１〜１２の直鎖アルキル基、炭素数３〜１２の分岐鎖アルキル基、炭素数３〜１２の環状アルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数２〜１２のアルケニル基、炭素数２〜１２のアルキニル基及び炭素数７〜１２のアラルキル基からなる群から選ばれる基である＜１＞に記載の化合物である。
＜３＞ 一般式（Ｉ）において、ｍ＝１且つＲ１が水素原子であるか、又はｍ＝０且つＲ１がメチル基、炭素数３〜４の分岐鎖アルキル基若しくはベンジル基である＜１＞又は＜２＞に記載の化合物である。
＜４＞ 一般式（Ｉ）において、ｍ＝１且つＲ１が水素原子であるか、又はｍ＝０且つＲ１がｓｅｃ-ブチル基である＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の化合物である。
＜５＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物を含有する医薬組成物である。
＜６＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物を含有する膀胱疾患処置剤である。
＜７＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物の膀胱疾患の処置における使用である。
＜８＞ ＜６＞に記載の膀胱疾患処置剤を対象に投与することを含有する膀胱疾患の処置方法である。
＜９＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物を含有する排尿機能改善剤である。
＜１０＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物の排尿機能改善における使用である。
＜１１＞ ＜９＞に記載の排尿機能改善剤を対象に投与することを含む排尿機能の改善方法である。
＜１２＞ ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物であって、該スペーサーは、この化合物においてグリシン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さいものである、化合物である。
＜１３＞ 前記スペーサーが、前記化合物においてβ−アラニン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さいものである、＜１２＞に記載の化合物である。
＜１４＞ 少なくとも以下のステップ１及び２を含む、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法である；
ステップ１：前記化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、及び
ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーを介して、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とを共有結合させること。
＜１５＞ 前記ステップ１において選択されるスペーサーが、前記化合物におけるスペーサーとしてβ−アラニン残基を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さくなるものである、＜１４＞に記載の方法である。
＜１＞ ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とが下記一般式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して共有結合した化合物である。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１−ＣＯ− （Ｉ）
（式中、ｍは０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示し、ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示す）
＜２＞ Ｒ１における電子供与基及び立体障害性基が、炭素数１〜１２の直鎖アルキル基、炭素数３〜１２の分岐鎖アルキル基、炭素数３〜１２の環状アルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数２〜１２のアルケニル基、炭素数２〜１２のアルキニル基及び炭素数７〜１２のアラルキル基からなる群から選ばれる基である＜１＞に記載の化合物である。
＜３＞ 一般式（Ｉ）において、ｍ＝１且つＲ１が水素原子であるか、又はｍ＝０且つＲ１がメチル基、炭素数３〜４の分岐鎖アルキル基若しくはベンジル基である＜１＞又は＜２＞に記載の化合物である。
＜４＞ 一般式（Ｉ）において、ｍ＝１且つＲ１が水素原子であるか、又はｍ＝０且つＲ１がｓｅｃ-ブチル基である＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の化合物である。
＜５＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物を含有する医薬組成物である。
＜６＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物を含有する膀胱疾患処置剤である。
＜７＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物の膀胱疾患の処置における使用である。
＜８＞ ＜６＞に記載の膀胱疾患処置剤を対象に投与することを含有する膀胱疾患の処置方法である。
＜９＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物を含有する排尿機能改善剤である。
＜１０＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化合物の排尿機能改善における使用である。
＜１１＞ ＜９＞に記載の排尿機能改善剤を対象に投与することを含む排尿機能の改善方法である。
＜１２＞ ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物であって、該スペーサーは、この化合物においてグリシン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さいものである、化合物である。
＜１３＞ 前記スペーサーが、前記化合物においてβ−アラニン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さいものである、＜１２＞に記載の化合物である。
＜１４＞ 少なくとも以下のステップ１及び２を含む、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法である；
ステップ１：前記化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、及び
ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーを介して、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とを共有結合させること。
＜１５＞ 前記ステップ１において選択されるスペーサーが、前記化合物におけるスペーサーとしてβ−アラニン残基を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さくなるものである、＜１４＞に記載の方法である。
なお、上記＜１４＞及び＜１５＞は、当該化合物を含有する、医薬組成物の製造方法、膀胱疾患処置剤の製造方法、排尿機能改善剤の製造方法とすることもでき、本発明はこのような思想をも包含する。この場合、製造の目的物（医薬組成物、膀胱疾患処置剤、あるいは排尿機能改善剤）に応じた、薬学的に許容される成分を配合するステップを更に含めることができる。
本発明によれば、ステロイド単剤の有する全身性の副作用を低減でき、またＣＳやステロイド単剤よりも高い効果を発揮する、コンドロイチン硫酸誘導体並びに当該化合物を含有する医薬組成物及び膀胱疾患処置剤を提供することができる。
本明細書において「ステップ」との語は、独立したステップだけではなく、他のステップと明確に区別できない場合であってもそのステップの所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。さらに組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明を発明の実施形態により詳説する。
以下、本発明を発明の実施形態により詳説する。
（１）コンドロイチン硫酸誘導体
本発明に係る化合物であるコンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とが下記一般式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して共有結合している。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１−ＣＯ− （Ｉ）
式中、ｍは０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示し、ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示す。
本発明に係る化合物であるコンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とが下記一般式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して共有結合している。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１−ＣＯ− （Ｉ）
式中、ｍは０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示し、ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基及び立体障害性基からなる群から選ばれる基を示す。
ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とが特定の構造を有するスペーサーを介して共有結合してなるコンドロイチン硫酸誘導体は、ステロイド単剤の有する全身性の副作用を低減し、抗炎症効果又は免疫抑制作用を長期に渡って持続させることができる。コンドロイチン硫酸誘導体は、特に膀胱疾患処置剤として優れた効果を達成することができる。コンドロイチン硫酸誘導体においては、スペーサーが特定の構造であることで、ステロイドに起因する全身性の副作用を低減することができ、且つ局所で薬効を持続させることにより、特に膀胱疾患処置剤として優れた効果を奏することができる。
コンドロイチン硫酸誘導体はＣＳに由来する基の少なくとも１種を含む。ここでＣＳに由来する基とは、ＣＳが有するカルボキシ基からヒドロキシ基が取り除かれて形成される基である。
コンドロイチン硫酸誘導体を構成するＣＳは、Ｄ−グルクロン酸（又はＤ−イズロン酸）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの２糖が、２糖単位で反復して形成される糖鎖骨格に硫酸基が保持された構造を有する限りにおいて特に限定されない。また、ＣＳが有するカルボキシ基及び硫酸基を含む酸性官能基は、塩を形成していない遊離状態であっても、薬学的に許容されうる塩を形成している状態であっても構わない。
コンドロイチン硫酸誘導体を構成するＣＳは、Ｄ−グルクロン酸（又はＤ−イズロン酸）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの２糖が、２糖単位で反復して形成される糖鎖骨格に硫酸基が保持された構造を有する限りにおいて特に限定されない。また、ＣＳが有するカルボキシ基及び硫酸基を含む酸性官能基は、塩を形成していない遊離状態であっても、薬学的に許容されうる塩を形成している状態であっても構わない。
薬学的に許容されうる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属イオンとの塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属イオンとの塩などが挙げられる。ＣＳは、生体への適用性及び親和性の観点から、薬学的に許容されるアルカリ金属イオンとの塩であることが好ましく、ナトリウム塩であることがより好ましい。
コンドロイチン硫酸誘導体を構成するＣＳは、その種類に応じ、公知の方法で製造することができる。ＣＳの製造方法としては例えば、動物由来原料からの抽出精製、コンドロイチン産生菌等からの培養精製、糖鎖修飾、糖鎖合成などを挙げることができる。
ＣＳの重量平均分子量は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。重量平均分子量は、５００〜１２０，０００であることが好ましく、２，５００〜６０，０００であることがより好ましく、１０，０００〜４０，０００であることが更に好ましい。ＣＳの重量平均分子量は、光散乱法により測定することができる。
コンドロイチン硫酸誘導体はステロイドに由来する基の少なくとも１種を含む。ここで、ステロイドに由来する基とは、ステロイド分子が有するヒドロキシ基から水素原子が取り除かれて形成される基である。水素原子が取り除かれる位置は特に限定されない。
コンドロイチン硫酸誘導体を構成するステロイドの種類は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。ステロイドとして具体的には、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ブデソニド、フルチカゾン、等が例示され、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく用いられる。
ステロイドは１種単独でも２種以上を組合せて用いてもよい。
ステロイドは１種単独でも２種以上を組合せて用いてもよい。
ステロイドに由来する基とスペーサーとの共有結合は、コンドロイチン硫酸誘導体からのステロイドの遊離速度制御の観点から、生体中で分解可能な共有結合であって、縮合反応によって形成される共有結合であることが好ましく、エステル結合であることがより好ましい。ステロイドに由来する基とスペーサーとの共有結合が分解（好ましくは加溶媒分解）することで、ステロイドが遊離する。ＣＳに由来する基とスペーサーとの共有結合が分解した後にステロイドに由来する基とスペーサーとの共有結合が分解してステロイドが遊離してもよい。
コンドロイチン硫酸誘導体は、ステロイドの遊離速度制御の観点から、ＣＳに由来する基とスペーサー（−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１−ＣＯ−）とがアミド結合で共有結合し、ステロイドに由来する基とスペーサーとがエステル結合で共有結合していることが好ましい。すなわち、スペーサーを形成する化合物（以下、スペーサー形成分子ともいう）は分子構造中に、カルボキシ基及びアミノ基を含む構造を持つ化合物（例えば、アミノ酸）であることが好ましい。ＣＳのカルボキシ基とスペーサー形成分子のアミノ基とがアミド結合し、ステロイドのヒドロキシ基とスペーサー形成分子のカルボキシ基とがエステル結合して形成されるコンドロイチン硫酸誘導体が好ましい。
スペーサーは一般式（Ｉ）で表される２価の連結基である。一般式（Ｉ）におけるｍは、０又は１の整数を示す。ここで、ｍ＝０の場合、Ｒ１は電子供与基又は立体障害性基を示す。ｍ＝１の場合、Ｒ１は水素原子、電子供与基又は立体障害性基を示す。ｍの数及びＲ１の電子供与基又は立体障害性基の有無は、ステロイドに由来する基とスペーサーの間のエステル結合の分解速度に影響する。ｍ＝０の場合、ｍ＝１よりもエステル結合の分解を受け易くなり、コンドロイチン硫酸誘導体からのステロイドの遊離速度が上昇する傾向がある。
本明細書中で用いられる「立体障害性基」とは、加溶媒分解等の化学反応に対して立体障害を起こす嵩高い基を意味する。一般に、スペーサーのＲ１が電子供与基又は立体障害性基に置換されると、ステロイドに由来する基とスペーサーとの共有結合が、Ｒ１が水素原子の場合よりも分解し難くなり、ステロイドの遊離速度が低下する。遊離速度の低下は、後述する方法により適宜測定することができる。
電子供与基又は立体障害性基は、Ｒ１に導入可能であれば特に制限されず、通常用いられる電子供与基又は立体障害性基から適宜選択することができる。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の炭素数１〜１２の直鎖状アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数３〜１２の分岐鎖アルキル基；シクロヘキシル基等の炭素数３〜６の環状アルキル基；フェニル基、トリル基等の炭素数６〜１０のアリール基；ビニル基、アリル基等の炭素数２〜１２のアルケニル基；炭素数２〜１２のアルキニル基；ベンジル基等の炭素数７〜１２のアラルキル基などを挙げることできる。これらの中でもメチル基、炭素数３〜４の分岐鎖アルキル基、ベンジル基等からなる群から選ばれる基であることが好ましい。スペーサー形成分子として具体的には、β−アラニン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン等のアミノ酸を用いることができ、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、β‐アラニン、イソロイシン、バリン、及びロイシンからなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。
また、上記スペーサー形成分子として、上記以外の置換基を有するその他のアミノ酸を利用することもできる。その他のアミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、チロシン、トリプトファン、リシン、メチオニン、トレオニン、ヒスチジン等を利用することができる。
スペーサー形成分子は、１種単独でも２種以上を組合せて用いてもよい。
また、上記スペーサー形成分子として、上記以外の置換基を有するその他のアミノ酸を利用することもできる。その他のアミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、チロシン、トリプトファン、リシン、メチオニン、トレオニン、ヒスチジン等を利用することができる。
スペーサー形成分子は、１種単独でも２種以上を組合せて用いてもよい。
一般式（Ｉ）で表されるスペーサーとしては、膀胱疾患処置剤としての効果と副作用抑制の観点から、−ＨＮ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−、−ＨＮ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）−ＣＯ−、−ＨＮ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）２）−ＣＯ−、又は−ＨＮ−ＣＨＣＨ２（ＣＨ（ＣＨ３）２）−ＣＯ−で表されるアミノ酸残基が好ましく、−ＨＮ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−、又は−ＨＮ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）−ＣＯ−がより好ましい。つまり、スペーサー形成分子として、β−アラニン、イソロイシン、バリン、又はロイシンであることが好ましく、β−アラニン又はイソロイシンであることがより好ましい。
コンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳの構造等によって種々の構造をとり得る。コンドロイチン硫酸誘導体の構造の具体例としては、例えば、下記化学式（II）で表される構造単位の少なくとも１種を含む構造を例示することができる。
式（II）中、Ｒ１１はそれぞれ独立して、水素原子又は硫酸基のナトリウム塩を表すが、硫酸基の塩のカチオン部分は例示したナトリウムに限定されるわけではない。またＲ１１における硫酸基の塩の数は例えば、０〜４であり、０〜３であることが好ましい。Ｒ１３は立体障害性基及び電子供与基からなる群から選ばれる基を表し、Ｒ１４は水素原子、立体障害性基及び電子供与基からなる群から選ばれる基を表す。
コンドロイチン硫酸誘導体は、上記化学式で表される構造単位を１種のみ含んでいてもよく、２種以上を任意の割合、任意の位置関係で含んでいてもよい。コンドロイチン硫酸誘導体は上記化学式で表される構造単位に加えて、ＣＳに通常含まれる構造単位を更に含むことが好ましい。ＣＳに通常含まれる構造単位としては、式（II）におけるＲ１２がＯＮａ又はＯＨで表される構造単位等を挙げることができる。ただし、塩のカチオン部分は例示したナトリウムに限定されるわけではない。
コンドロイチン硫酸誘導体に対する、スペーサーを介してＣＳに共有結合するステロイド分子の含有比率（重量割合）は、３ｗ／ｗ％以上であることが好ましく、１０ｗ／ｗ％以上であることがより好ましく、３０ｗ／ｗ％以上であることが更に好ましい。なお、ステロイド分子の含有比率は、ステロイド分子の種類、効果の強さ及び水に対する溶解性等の性質並びにスペーサーの種類等に応じて適宜選択することができる。
コンドロイチン硫酸誘導体からのステロイドの遊離速度は、目的等に応じて適宜選択できる。ステロイドの遊離速度は例えば、ｐＨ７．４、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝液中において、０．１〜４％／日であることが好ましく、０．１〜３％／日であることがより好ましく、０．５〜１％／日であることが更に好ましい。ここでステロイドの遊離速度とは、遊離率（％）の一日あたりの変化量であり、横軸に時間を、縦軸にコンドロイチン硫酸誘導体に含まれるステロイドに由来する基の総モル数（１００％）に対するステロイドの遊離量（モル）の割合である遊離率（％）を取った場合、グラフの傾きとして定義される。
したがって、遊離速度が測定期間中に一定値を維持する場合には、グラフは単調増加の直線となる。この場合には、例えば、ｐＨ７．４、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝液中、１０日間で、コンドロイチン硫酸誘導体が含むすべてのステロイドが遊離した場合、遊離速度は１０％／日と表現される。
一方、遊離速度が一定値を取らずに経時的に低下する場合（グラフは上に凸で単調増加する緩やかなカーブを示す）は、初期の立ち上がり期間（例えば、３日間）の遊離率変化を直線近似して遊離速度を算出する。
なお、ステロイドの遊離量（遊離したステロイドの量）はステロイドの種類に応じて適宜選択される方法によって測定される。
したがって、遊離速度が測定期間中に一定値を維持する場合には、グラフは単調増加の直線となる。この場合には、例えば、ｐＨ７．４、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝液中、１０日間で、コンドロイチン硫酸誘導体が含むすべてのステロイドが遊離した場合、遊離速度は１０％／日と表現される。
一方、遊離速度が一定値を取らずに経時的に低下する場合（グラフは上に凸で単調増加する緩やかなカーブを示す）は、初期の立ち上がり期間（例えば、３日間）の遊離率変化を直線近似して遊離速度を算出する。
なお、ステロイドの遊離量（遊離したステロイドの量）はステロイドの種類に応じて適宜選択される方法によって測定される。
（２）コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法
コンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳ分子が有する官能基（例えば、カルボキシ基）と、ステロイドが有する官能基（例えば、ヒドロキシ基）とを特定の構造を有するスペーサーを介して共有結合させることで得ることができる。
以下、コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の一例について説明するが、以下の方法に限定されるものではない。
コンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳ分子が有する官能基（例えば、カルボキシ基）と、ステロイドが有する官能基（例えば、ヒドロキシ基）とを特定の構造を有するスペーサーを介して共有結合させることで得ることができる。
以下、コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の一例について説明するが、以下の方法に限定されるものではない。
ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とをスペーサーを介して共有結合してなるコンドロイチン硫酸誘導体は、例えば以下のステップを含む製造方法で製造することができる。
（Ａ）ステロイドが有するヒドロキシ基をスペーサー形成分子のカルボキシ基と縮合して共有結合（エステル結合）させることと、
（Ｂ）ＣＳが有するカルボキシ基をスペーサー形成分子のアミノ基と縮合して共有結合（アミド結合）させることと、を含む製造方法。
（Ａ）ステロイドが有するヒドロキシ基をスペーサー形成分子のカルボキシ基と縮合して共有結合（エステル結合）させることと、
（Ｂ）ＣＳが有するカルボキシ基をスペーサー形成分子のアミノ基と縮合して共有結合（アミド結合）させることと、を含む製造方法。
（Ａ）のステップでは、ステロイドが有するヒドロキシ基とスペーサー形成分子のカルボキシ基とを縮合して共有結合させる。このときスペーサー形成分子のＣＳと反応する予定のアミノ基は、必要に応じて通常用いられる方法で保護しておいてもよい。
（Ｂ）のステップでは、ＣＳが有するカルボキシ基とスペーサー形成分子のアミノ基とを縮合して共有結合させる。このときスペーサー形成分子のステロイドと反応する予定のカルボキシ基は、必要に応じて通常用いられる方法で保護しておいてもよい。
コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法は（Ａ）のステップと（Ｂ）のステップとを含んでいればよく、各ステップが実行される順番は限定されない。
（Ｂ）のステップでは、ＣＳが有するカルボキシ基とスペーサー形成分子のアミノ基とを縮合して共有結合させる。このときスペーサー形成分子のステロイドと反応する予定のカルボキシ基は、必要に応じて通常用いられる方法で保護しておいてもよい。
コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法は（Ａ）のステップと（Ｂ）のステップとを含んでいればよく、各ステップが実行される順番は限定されない。
縮合（エステル化、アミド化）方法は、通常用いられる方法から適宜選択すればよい。縮合方法としては例えば、水溶性カルボジイミド（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド含水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を用いる方法、対称酸無水物法、混合酸無水物法、活性エステル法などの方法を挙げることができる。縮合反応条件は適用する縮合反応に応じて適宜選択される。
スペーサー形成分子は、所望のステロイドの遊離速度が得られるように選択されることが好ましい。スペーサー形成分子はステロイドとエステル結合を形成するカルボキシ基と、ＣＳとアミド結合を形成するアミノ基と、２つの反応性官能基を連結する連結基とを有する。連結基はステロイドとのエステル結合の分解速度を制御するように選択されることが好ましい。スペーサー形成分子の選択方法は既述の通り、ｍとＲ１とを適宜組合せて所望の分解速度を達成できるように選択すればよい。
（３）医薬組成物
医薬組成物は、コンドロイチン硫酸誘導体の少なくとも１種を含み、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤等その他の成分を更に含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的に許容される賦形剤の他、界面活性剤、生理活性物質、安定化剤、液状媒体等を挙げることができる。生理活性物質はコンドロイチン硫酸誘導体から遊離するステロイドと同一であっても、異なっていてもよい。
医薬組成物の用途は特に制限されず、例えば、膀胱疾患処置に用いられることが好ましい。
医薬組成物は、コンドロイチン硫酸誘導体の少なくとも１種を含み、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤等その他の成分を更に含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的に許容される賦形剤の他、界面活性剤、生理活性物質、安定化剤、液状媒体等を挙げることができる。生理活性物質はコンドロイチン硫酸誘導体から遊離するステロイドと同一であっても、異なっていてもよい。
医薬組成物の用途は特に制限されず、例えば、膀胱疾患処置に用いられることが好ましい。
（４）膀胱疾患処置剤
膀胱疾患処置剤は、コンドロイチン硫酸誘導体の少なくとも１種を含有する医薬組成物であって、膀胱疾患の処置に用いられる。
本明細書において用いられる「処置」とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善及び進行の抑制（悪化の防止）が挙げられる。
処置剤の形態は、ヒトの尿道・膀胱に投与可能な製剤ないし医薬の形態である限りにおいて特に限定されないが、投与時における形態が液体であることが好ましく、例えば溶液や懸濁液等の形態が挙げられる。溶液や懸濁液は、コンドロイチン硫酸誘導体の粉体を用時溶解して調製することにより、投与することもできる。膀胱疾患処置剤は、膀胱内投与に用いられることが好ましい。
膀胱疾患処置剤の投与量としては、膀胱内の粘膜全体を被覆するのに足る量であればよく、例えばヒトにおいては、５ｍＬ〜２００ｍＬ程度が例示できる。
液体として投与する場合の膀胱疾患処置剤中のコンドロイチン硫酸誘導体の濃度は、例えば尿道カテーテルを用いて投与する場合には、このカテーテル内を通過可能な濃度であればよく、当業者が適宜調整できる。
膀胱疾患処置剤は、コンドロイチン硫酸誘導体の少なくとも１種を含有する医薬組成物であって、膀胱疾患の処置に用いられる。
本明細書において用いられる「処置」とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善及び進行の抑制（悪化の防止）が挙げられる。
処置剤の形態は、ヒトの尿道・膀胱に投与可能な製剤ないし医薬の形態である限りにおいて特に限定されないが、投与時における形態が液体であることが好ましく、例えば溶液や懸濁液等の形態が挙げられる。溶液や懸濁液は、コンドロイチン硫酸誘導体の粉体を用時溶解して調製することにより、投与することもできる。膀胱疾患処置剤は、膀胱内投与に用いられることが好ましい。
膀胱疾患処置剤の投与量としては、膀胱内の粘膜全体を被覆するのに足る量であればよく、例えばヒトにおいては、５ｍＬ〜２００ｍＬ程度が例示できる。
液体として投与する場合の膀胱疾患処置剤中のコンドロイチン硫酸誘導体の濃度は、例えば尿道カテーテルを用いて投与する場合には、このカテーテル内を通過可能な濃度であればよく、当業者が適宜調整できる。
膀胱疾患処置剤の投与方法については、例えば、尿道カテーテルを膀胱内に無菌条件下で挿入し、残尿を排出した後、同カテーテルより注入する方法等を挙げることができる。
膀胱内に注入された膀胱疾患処置剤は、ＣＳとステロイドとがスペーサーを介して共有結合したままで膀胱壁に到達、付着し、その後、スペーサーとステロイドとの間の共有結合が徐々に分解することで、長時間（例えば１週間以上）に渡って、ステロイドが徐放されると考えられる。
膀胱疾患処置剤は、膀胱内においてステロイドを徐々に遊離することができる。ステロイドが膀胱内において遊離し続ける時間（効果の持続性）は、１６８時間（７日間）以上が好ましく、３３６時間（１４日間）以上がさらに好ましい。
膀胱疾患処置剤の膀胱内投与頻度は、コンドロイチン硫酸誘導体及びコンドロイチン硫酸誘導体から遊離したステロイドの動態から定めることができる。例えば、１回／１週間投与から１回／１か月投与を挙げることができるが、限定されるものではない。
膀胱内に注入された膀胱疾患処置剤は、ＣＳとステロイドとがスペーサーを介して共有結合したままで膀胱壁に到達、付着し、その後、スペーサーとステロイドとの間の共有結合が徐々に分解することで、長時間（例えば１週間以上）に渡って、ステロイドが徐放されると考えられる。
膀胱疾患処置剤は、膀胱内においてステロイドを徐々に遊離することができる。ステロイドが膀胱内において遊離し続ける時間（効果の持続性）は、１６８時間（７日間）以上が好ましく、３３６時間（１４日間）以上がさらに好ましい。
膀胱疾患処置剤の膀胱内投与頻度は、コンドロイチン硫酸誘導体及びコンドロイチン硫酸誘導体から遊離したステロイドの動態から定めることができる。例えば、１回／１週間投与から１回／１か月投与を挙げることができるが、限定されるものではない。
膀胱疾患処置剤は、膀胱疾患の処置に適用することを目的とする。本明細書における、「膀胱疾患」とは、膀胱で起こる疾患その他の何らかの異常を意味し、例えば、急性膀胱炎、慢性膀胱炎、間質性膀胱炎、出血性膀胱炎、放射線性膀胱炎、過活動膀胱などが含まれる。膀胱疾患処置剤は膀胱疾患の中でも、特に間質性膀胱炎に対して用いられることが好ましい。間質性膀胱炎の概念には、膀胱痛症候群（Painful bladder syndrome : PBS / Bladder pain syndrome :BPS）と呼ばれるものや過知覚膀胱症候群（Hypersensitive bladder syndrome :HBS）と呼ばれるものを含んでいてもよい。
（５）膀胱疾患の処置方法
膀胱疾患の処置方法は、膀胱疾患処置剤を膀胱内投与するステップを含む。膀胱疾患の処置方法は必要に応じてその他のステップを更に含んでいてもよい。膀胱疾患処置方法は、前記「（４）膀胱疾患処置剤」の説明に従って同様に実施でき、好ましい処置剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
膀胱疾患の処置方法は、膀胱疾患処置剤を膀胱内投与するステップを含む。膀胱疾患の処置方法は必要に応じてその他のステップを更に含んでいてもよい。膀胱疾患処置方法は、前記「（４）膀胱疾患処置剤」の説明に従って同様に実施でき、好ましい処置剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
（６）排尿機能改善剤
本明細書において用いられる「排尿機能改善」とは、頻尿その他の排尿機能に関する何らかの異常を改善することをいう。すなわち排尿機能改善剤とは、前記医薬組成物を膀胱内投与することによる排尿機能の改善剤であり、頻尿改善剤の概念を含む。後述する実施例からわかるとおり、前記医薬組成物は排尿機能の改善ができ、例えば排尿間隔を有意な延長や一回排尿量を増加させることができることから、たとえば、間質性膀胱炎に特徴的な慢性的な頻尿を改善するために用いることもできる。排尿機能改善剤は、前述の膀胱疾患の処置方法等の説明に従って同様に実施でき、また、好ましい改善剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
本明細書において用いられる「排尿機能改善」とは、頻尿その他の排尿機能に関する何らかの異常を改善することをいう。すなわち排尿機能改善剤とは、前記医薬組成物を膀胱内投与することによる排尿機能の改善剤であり、頻尿改善剤の概念を含む。後述する実施例からわかるとおり、前記医薬組成物は排尿機能の改善ができ、例えば排尿間隔を有意な延長や一回排尿量を増加させることができることから、たとえば、間質性膀胱炎に特徴的な慢性的な頻尿を改善するために用いることもできる。排尿機能改善剤は、前述の膀胱疾患の処置方法等の説明に従って同様に実施でき、また、好ましい改善剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
（７）排尿機能改善方法
排尿機能の改善方法は、排尿機能改善剤を膀胱内投与するステップを含む。排尿機能改善方法は必要に応じてその他のステップを更に含んでいてもよい。排尿機能改善方法は、前記「（６）排尿機能改善剤」の説明に従って同様に実施でき、好ましい排尿機能改善剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
排尿機能の改善方法は、排尿機能改善剤を膀胱内投与するステップを含む。排尿機能改善方法は必要に応じてその他のステップを更に含んでいてもよい。排尿機能改善方法は、前記「（６）排尿機能改善剤」の説明に従って同様に実施でき、好ましい排尿機能改善剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
また、本発明は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物において、これらの基の間に所定の特性をもつスペーサー（この化合物において特定のアミノ酸残基をスペーサーとした場合に比して、この化合物からのステロイドの遊離速度が小さくなるようなスペーサー）を選択して介在させることにより、ステロイドに起因する全身性の副作用を低減できるという新たな知見に基づく、以下の態様も含まれる。
（８）コンドロイチン硫酸誘導体の別態様
本発明の別の態様のコンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物であって、該スペーサーは、この化合物においてグリシン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さいものである。なかでも、前記化合物においてβ−アラニン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、前記化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さくなるスペーサーを採用することが好ましい。
ここで、コンドロイチン硫酸誘導体の別態様におけるスペーサー分子は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基の双方を連結する２価の連結基であればよく、かつ、この化合物においてグリシン残基、好ましくはβ−アラニン残基をスペーサーとして採用した場合と比べて、この化合物からの該ステロイドの遊離速度が小さくなるようなものであれば特に限定されない。具体的なスペーサーとしては、上述の（１）コンドロイチン硫酸誘導体に記載した一般式（Ｉ）で表される２価連結基などが例示できる。
本発明の別の態様のコンドロイチン硫酸誘導体は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物であって、該スペーサーは、この化合物においてグリシン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さいものである。なかでも、前記化合物においてβ−アラニン残基をスペーサーとして用いた場合に比して、前記化合物からの前記ステロイドの遊離速度が同じ又は小さくなるスペーサーを採用することが好ましい。
ここで、コンドロイチン硫酸誘導体の別態様におけるスペーサー分子は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基の双方を連結する２価の連結基であればよく、かつ、この化合物においてグリシン残基、好ましくはβ−アラニン残基をスペーサーとして採用した場合と比べて、この化合物からの該ステロイドの遊離速度が小さくなるようなものであれば特に限定されない。具体的なスペーサーとしては、上述の（１）コンドロイチン硫酸誘導体に記載した一般式（Ｉ）で表される２価連結基などが例示できる。
ここで上記化合物のステロイドの遊離速度は、前述の（１）コンドロイチン硫酸誘導体に記載した方法や試験例Ａ２の方法で測定できる。
また、前述の所定の特性をもつスペーサーを選択するためには、ｐＨ７．４、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝液中に特定の構造の化合物を溶解し、１週間後のステロイド遊離率（％）を７で割った値の大きさで比較することにより、特定のアミノ残基スペーサーに比して、この化合物からステロイドの遊離速度が小さい化合物を選択することにより決定することができる。
このように決定した遊離速度を比較することにより、スペーサーがグリシン残基、好ましくはβ−アラニン残基である場合と比べて、ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択することができる。
また、前述の所定の特性をもつスペーサーを選択するためには、ｐＨ７．４、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝液中に特定の構造の化合物を溶解し、１週間後のステロイド遊離率（％）を７で割った値の大きさで比較することにより、特定のアミノ残基スペーサーに比して、この化合物からステロイドの遊離速度が小さい化合物を選択することにより決定することができる。
このように決定した遊離速度を比較することにより、スペーサーがグリシン残基、好ましくはβ−アラニン残基である場合と比べて、ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択することができる。
コンドロイチン硫酸誘導体の別態様を構成する、ＣＳ、ステロイド、スペーサー、共有結合等の説明や、コンドロイチン硫酸誘導体の別態様の製造についての説明等は、このコンドロイチン硫酸誘導体の別態様において説明した事項と抵触しない限りにおいて、上述の（１）及び（３）〜（７）の「コンドロイチン硫酸誘導体」、「医薬組成物」、「膀胱疾患処置剤」、「膀胱疾患の処置方法」、「排尿機能改善剤」及び「排尿機能改善方法」の記載と同じである。
（９）コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の別態様
本発明は、以下に示すコンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の別態様を包含する。コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の別態様は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法であって、（Ｃ）この化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基を選択した場合と比べて、この化合物からの該ステロイドの遊離速度が小さくなるようなスペーサーを選択するステップを含んでいる。
本発明は、以下に示すコンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の別態様を包含する。コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法の別態様は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法であって、（Ｃ）この化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基を選択した場合と比べて、この化合物からの該ステロイドの遊離速度が小さくなるようなスペーサーを選択するステップを含んでいる。
そして製造方法は、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とを、上記により選択されたスペーサーを介して共有結合させる工程を含ませることができる。この共有結合させる方法も特に限定されず、例えば、選択したスペーサーとステロイドとを公知の方法で縮合させて中間体を得た後に、この中間体をＣＳと公知の方法で縮合させてもよい。
例えば、上記（Ｃ）のステップの後に、前述した（２）コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法に記載した（Ａ）及び（Ｂ）のステップを含ませることができる。また、上記（Ｃ）のステップにおけるスペーサーの選択は、必ずしも他のステップと連続的に行われる必要はなく、例えば予めスペーサーの選択をしておき、これに続く他のステップを後日行うこととしてもよい。
以下、より具体的な製造方法の態様について説明するが、以下の方法に限定されるものではない。
ア）少なくとも以下のステップ１及び２を含む、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法；
ステップ１：前記化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基（より好ましくはβ−アラニン残基）を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、及び
ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーを介して、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とを共有結合させること。
ア）少なくとも以下のステップ１及び２を含む、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法；
ステップ１：前記化合物におけるスペーサーとしてグリシン残基（より好ましくはβ−アラニン残基）を選択した場合に比して、この化合物からの前記ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、及び
ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーを介して、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とを共有結合させること。
イ）少なくとも以下のステップ１〜３を含む、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物の製造方法；
ステップ１：スペーサーとしてグリシン残基（より好ましくはβ−アラニン残基）を選択した場合と比べて、この化合物における該ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、
ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーとステロイドとを共有結合（例えば、エステル結合）させ、中間体を得ること、及び
ステップ３：ステップ２で得られた中間体とＣＳとを共有結合（例えば、アミド結合）させること。
ステップ１：スペーサーとしてグリシン残基（より好ましくはβ−アラニン残基）を選択した場合と比べて、この化合物における該ステロイドの遊離速度が小さくなるスペーサーを選択すること、
ステップ２：ステップ１で選択したスペーサーとステロイドとを共有結合（例えば、エステル結合）させ、中間体を得ること、及び
ステップ３：ステップ２で得られた中間体とＣＳとを共有結合（例えば、アミド結合）させること。
また製造方法は、前述の（３）、（４）及び（６）の「医薬組成物」、「膀胱疾患処置剤」及び「排尿機能改善剤」等の製造方法としてもよい。この場合には、製造の目的物（医薬組成物、膀胱疾患処置剤、あるいは排尿機能改善剤）に応じて、薬学的に許容される成分を配合するステップを更に含めてもよい。
製造方法における、ＣＳ、ステロイド、スペーサー、共有結合等の説明、製造に関するその他の説明等については、この本発明製造方法において説明した事項と抵触しない限りにおいて、前記の（２）コンドロイチン硫酸誘導体の製造方法における説明と同じである。
このように、ＣＳに由来する基とステロイドに由来する基とがスペーサーを介して共有結合した化合物において、この化合物において特定のアミノ酸残基をスペーサーとした場合に比して、この化合物からのステロイドの遊離速度が小さくなるようなスペーサーを選択して介在させることで、ステロイドに起因する全身性の副作用が低減された化合物、医薬組成物、膀胱疾患処置剤、ないし排尿機能改善剤とすることができる。製造方法は、このような副作用が低減された製品の製造に有用である。
以下、本発明の実施例及び試験例をより具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が制限されるものではない。なお、コンドロイチン硫酸誘導体中に含まれるステロイド含量（ｗ／ｗ％）は、後述の方法により測定した。
（実施例１）２１−β−アラニル−プレドニゾロン導入ＣＳの調製
（１−１） ２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−プレドニゾロンの調製
Ｂｏｃ−β−アラニン（渡辺化学工業株式会社製） １．５８ｇをジクロロメタン ６０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド ２０ｍＬに溶解し、プレドニゾロン（和光純薬工業株式会社製；以下、「ＰＲＥＤ」とも略記する） ３．００ｇ、及び４−ジメチルアミノピリジン（和光純薬工業株式会社製） ３０５ｍｇを加え、溶解した。その後、氷冷下で水溶性カルボジイミド（東京化成工業株式会社製）４．００ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、氷冷下で飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。ジクロロメタン、トルエン及び水を用いて分液抽出し、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をクロロホルムで溶解した後、再度減圧下留去した。本操作を３回繰り返し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−プレドニゾロン（化合物１）を４．７３ｇ得た（収率１０７％）。
（１−１） ２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−プレドニゾロンの調製
Ｂｏｃ−β−アラニン（渡辺化学工業株式会社製） １．５８ｇをジクロロメタン ６０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド ２０ｍＬに溶解し、プレドニゾロン（和光純薬工業株式会社製；以下、「ＰＲＥＤ」とも略記する） ３．００ｇ、及び４−ジメチルアミノピリジン（和光純薬工業株式会社製） ３０５ｍｇを加え、溶解した。その後、氷冷下で水溶性カルボジイミド（東京化成工業株式会社製）４．００ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、氷冷下で飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。ジクロロメタン、トルエン及び水を用いて分液抽出し、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をクロロホルムで溶解した後、再度減圧下留去した。本操作を３回繰り返し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−プレドニゾロン（化合物１）を４．７３ｇ得た（収率１０７％）。
（１−２） ２１−β−アラニル−プレドニゾロン塩酸塩の調製
（１−１）で得た化合物１ ４．７３ｇをジクロロメタン ９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ 塩酸／酢酸エチル（渡辺化学工業株式会社製） ４５ｍＬを加えて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−β−アラニル−プレドニゾロン塩酸塩（化合物２）を３．４２ｇ得た（収率８８％）。
（１−１）で得た化合物１ ４．７３ｇをジクロロメタン ９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ 塩酸／酢酸エチル（渡辺化学工業株式会社製） ４５ｍＬを加えて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−β−アラニル−プレドニゾロン塩酸塩（化合物２）を３．４２ｇ得た（収率８８％）。
（１−３） ２１−β−アラニル−プレドニゾロン導入ＣＳの調製
ＣＳ（ナトリウム塩、生化学工業株式会社製、重量平均分子量約２万：光散乱法） ５２４ｍｇを蒸留水 １０ｍＬに溶解し、アセトン １０ｍＬを加えて撹拌した。（１−２）で得た化合物２ ３９５ｍｇ 及び４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド含水和物（以下、ＤＭＴ−ＭＭ）（株式会社トクヤマ製） ８３８ｍｇを５０％アセトン／蒸留水 計３ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ０．１ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液を９０％エタノール／蒸留水 ３００ｍＬに順次加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水で順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１−β−アラニル−プレドニゾロン導入ＣＳが７８７ｍｇ得られた。２４８ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたプレドニゾロン含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３５ｗ／ｗ％であった。
ＣＳ（ナトリウム塩、生化学工業株式会社製、重量平均分子量約２万：光散乱法） ５２４ｍｇを蒸留水 １０ｍＬに溶解し、アセトン １０ｍＬを加えて撹拌した。（１−２）で得た化合物２ ３９５ｍｇ 及び４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド含水和物（以下、ＤＭＴ−ＭＭ）（株式会社トクヤマ製） ８３８ｍｇを５０％アセトン／蒸留水 計３ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ０．１ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液を９０％エタノール／蒸留水 ３００ｍＬに順次加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水で順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１−β−アラニル−プレドニゾロン導入ＣＳが７８７ｍｇ得られた。２４８ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたプレドニゾロン含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３５ｗ／ｗ％であった。
（実施例２）２１−β−アラニル−ベタメタゾン導入ＣＳの調製
（２−１） ２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−ベタメタゾンの調製
Ｂｏｃ−β−アラニン ２．０ｇをジクロロメタン ５０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド ５０ｍＬに溶解し、ベタメタゾン（和光純薬工業株式会社製；以下、「ＢＴＭ」とも略記する） ４．１５ｇを加えた。その後、氷冷下で４−ジメチルアミノピリジン ３８９ｍｇ、及び水溶性カルボジイミド ２．６４ｇを加え、室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出し、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−ベタメタゾン（化合物３）を５．８４ｇ得た（収率９８％）。
（２−１） ２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−ベタメタゾンの調製
Ｂｏｃ−β−アラニン ２．０ｇをジクロロメタン ５０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド ５０ｍＬに溶解し、ベタメタゾン（和光純薬工業株式会社製；以下、「ＢＴＭ」とも略記する） ４．１５ｇを加えた。その後、氷冷下で４−ジメチルアミノピリジン ３８９ｍｇ、及び水溶性カルボジイミド ２．６４ｇを加え、室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出し、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−ベタメタゾン（化合物３）を５．８４ｇ得た（収率９８％）。
（２−２） ２１−β−アラニル−ベタメタゾン塩酸塩の調製
（２−１）で得た化合物３ ５．８４ｇをテトラヒドロフラン １２０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ 塩酸／酢酸エチル １００ｍＬを加えて、室温で３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。得られた濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−β−アラニル−ベタメタゾン塩酸塩（化合物４）を４．６０ｇ得た（収率９６％）。
（２−１）で得た化合物３ ５．８４ｇをテトラヒドロフラン １２０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ 塩酸／酢酸エチル １００ｍＬを加えて、室温で３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。得られた濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−β−アラニル−ベタメタゾン塩酸塩（化合物４）を４．６０ｇ得た（収率９６％）。
（２−３） ２１−β−アラニル−ベタメタゾン導入ＣＳの調製
ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万） ５２４ｍｇに蒸留水 １０ｍＬを加え溶解し、アセトン １０ｍＬを加えて撹拌した。（２−２）で得た化合物４ ４２２ｍｇ 及びＤＭＴ−ＭＭ ８３９ｍｇを５０％アセトン／蒸留水 計３ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ０．１ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液を９０％エタノール／蒸留水 ３００ｍＬに順次加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水で順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥して、目的とする２１−β−アラニル−ベタメタゾン導入ＣＳが７７０ｍｇ得られた。２４２ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたベタメタゾン含量（ｗ／ｗ％）を算出した結果、４０ｗ／ｗ％であった。
ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万） ５２４ｍｇに蒸留水 １０ｍＬを加え溶解し、アセトン １０ｍＬを加えて撹拌した。（２−２）で得た化合物４ ４２２ｍｇ 及びＤＭＴ−ＭＭ ８３９ｍｇを５０％アセトン／蒸留水 計３ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ０．１ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液を９０％エタノール／蒸留水 ３００ｍＬに順次加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水で順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥して、目的とする２１−β−アラニル−ベタメタゾン導入ＣＳが７７０ｍｇ得られた。２４２ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたベタメタゾン含量（ｗ／ｗ％）を算出した結果、４０ｗ／ｗ％であった。
（実施例３）２１−β−アラニル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
（３−１） ２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−トリアムシノロンアセトニドの調製
Ｂｏｃ−β−アラニン ２．６３ｇをジクロロメタン ４０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド １０ｍＬに溶解し、トリアムシノロンアセトニド（和光純薬工業株式会社製；以下、「ＴＡ」とも略記する） ５．０１ｇを加えた。その後、氷冷下で４−ジメチルアミノピリジン ４２６ｍｇ、水溶性カルボジイミド ３．３２ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出をし、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−トリアムシノロンアセトニド（化合物５）を６．６６ｇ得た（収率９６％）。
（３−１） ２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−トリアムシノロンアセトニドの調製
Ｂｏｃ−β−アラニン ２．６３ｇをジクロロメタン ４０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド １０ｍＬに溶解し、トリアムシノロンアセトニド（和光純薬工業株式会社製；以下、「ＴＡ」とも略記する） ５．０１ｇを加えた。その後、氷冷下で４−ジメチルアミノピリジン ４２６ｍｇ、水溶性カルボジイミド ３．３２ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出をし、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−β−アラニル）−トリアムシノロンアセトニド（化合物５）を６．６６ｇ得た（収率９６％）。
（３−２） ２１−β−アラニル−トリアムシノロンアセトニド塩酸塩の調製
（３−１）で得た化合物５ ６．６６ｇをテトラヒドロフラン ９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ 塩酸／酢酸エチル ９０ｍＬを加え、室温にて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−β−アラニル−トリアムシノロンアセトニド塩酸塩（化合物６）を５．７８ｇ得た（収率９７％）。
（３−１）で得た化合物５ ６．６６ｇをテトラヒドロフラン ９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ 塩酸／酢酸エチル ９０ｍＬを加え、室温にて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−β−アラニル−トリアムシノロンアセトニド塩酸塩（化合物６）を５．７８ｇ得た（収率９７％）。
（３−３） ２１−β−アラニル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万） ５２４ｍｇを蒸留水 １０ｍＬに溶解し、アセトン １０ｍＬを加えて撹拌した。（３−２）で得た化合物６ ４５８ｍｇ 及びＤＭＴ−ＭＭ ８３９ｍｇを５０％アセトン／蒸留水 計３ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ０．１ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液を９０％エタノール／蒸留水 ３００ｍＬに順次加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水で順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１−β−アラニル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳが８１９ｍｇ得られた。２４２ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたトリアムシノロンアセトニド含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３８ｗ／ｗ％であった。
ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万） ５２４ｍｇを蒸留水 １０ｍＬに溶解し、アセトン １０ｍＬを加えて撹拌した。（３−２）で得た化合物６ ４５８ｍｇ 及びＤＭＴ−ＭＭ ８３９ｍｇを５０％アセトン／蒸留水 計３ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ０．１ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液を９０％エタノール／蒸留水 ３００ｍＬに順次加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水で順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１−β−アラニル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳが８１９ｍｇ得られた。２４２ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたトリアムシノロンアセトニド含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３８ｗ／ｗ％であった。
（実施例４）２１−グリシル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
（４−１） ２１−（Ｂｏｃ−グリシル）−トリアムシノロンアセトニドの調製
Ｂｏｃ−グリシン（渡辺化学工業株式会社製） １．７１ｇをジクロロメタン ３０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド １０ｍＬに溶解し、トリアムシノロンアセトニド ４．０１ｇを加えた。その後、氷冷下で４−ジメチルアミノピリジン ３３８ｍｇ、水溶性カルボジイミド ２．６５ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出をし、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−グリシル）−トリアムシノロンアセトニド（化合物７）を５．２１ｇ得た（収率９６％）。
（４−１） ２１−（Ｂｏｃ−グリシル）−トリアムシノロンアセトニドの調製
Ｂｏｃ−グリシン（渡辺化学工業株式会社製） １．７１ｇをジクロロメタン ３０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド １０ｍＬに溶解し、トリアムシノロンアセトニド ４．０１ｇを加えた。その後、氷冷下で４−ジメチルアミノピリジン ３３８ｍｇ、水溶性カルボジイミド ２．６５ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出をし、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−グリシル）−トリアムシノロンアセトニド（化合物７）を５．２１ｇ得た（収率９６％）。
（４−２） ２１−グリシル−トリアムシノロンアセトニド塩酸塩の調製
（４−１）で得た化合物７ ５．２１ｇをテトラヒドロフラン ９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４ Ｍ 塩酸／酢酸エチル ９０ｍＬを加えて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−グリシル−トリアムシノロンアセトニド塩酸塩（化合物８）を４．１６ｇ得た（収率８８％）。
（４−１）で得た化合物７ ５．２１ｇをテトラヒドロフラン ９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４ Ｍ 塩酸／酢酸エチル ９０ｍＬを加えて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−グリシル−トリアムシノロンアセトニド塩酸塩（化合物８）を４．１６ｇ得た（収率８８％）。
（４−３） ２１−グリシル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万） １．０４ｇを蒸留水 ２０ｍＬに溶解し、アセトン ２０ｍＬを加えて撹拌した。（４−２）で得た化合物８ ８０６ｍｇ 及びＤＭＴ−ＭＭ １．４６ｇを５０％アセトン／蒸留水 計２０ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ４ｇ 及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液をエタノール ４２０ｍＬに加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を８０％エタノール／蒸留水、９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水、エタノールで順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１−グリシル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳが１．３４ｇ得られた。２４１ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたトリアムシノロンアセトニド含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３７ｗ／ｗ％であった。
ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万） １．０４ｇを蒸留水 ２０ｍＬに溶解し、アセトン ２０ｍＬを加えて撹拌した。（４−２）で得た化合物８ ８０６ｍｇ 及びＤＭＴ−ＭＭ １．４６ｇを５０％アセトン／蒸留水 計２０ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ４ｇ 及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液をエタノール ４２０ｍＬに加えて沈殿形成し、遠心分離後に上清を捨てた。その後、沈殿を８０％エタノール／蒸留水、９０％エタノール／蒸留水、９５％エタノール／蒸留水、エタノールで順次洗浄した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１−グリシル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳが１．３４ｇ得られた。２４１ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたトリアムシノロンアセトニド含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３７ｗ／ｗ％であった。
（実施例５）２１−イソロイシル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
（５−１）２１−（Ｂｏｃ−イソロイシル）−トリアムシノロンアセトニドの調製
Ｂｏｃ−イソロイシン（渡辺化学工業株式会社製） ２．２４ｇをジクロロメタン ３０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド １０ｍＬに溶解し、トリアムシノロンアセトニド ４．００ｇを加えた。その後、氷冷下で４−ジメチルアミノピリジン ３３８ｍｇ、水溶性カルボジイミド ２．６５ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出をし、集めた有機層は飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−イソロイシル）−トリアムシノロンアセトニド（化合物９）を５．６５ｇ得た（収率９５％）。
（５−１）２１−（Ｂｏｃ−イソロイシル）−トリアムシノロンアセトニドの調製
Ｂｏｃ−イソロイシン（渡辺化学工業株式会社製） ２．２４ｇをジクロロメタン ３０ｍＬ、及びジメチルホルムアミド １０ｍＬに溶解し、トリアムシノロンアセトニド ４．００ｇを加えた。その後、氷冷下で４−ジメチルアミノピリジン ３３８ｍｇ、水溶性カルボジイミド ２．６５ｇを加えて室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出をし、集めた有機層は飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−（Ｂｏｃ−イソロイシル）−トリアムシノロンアセトニド（化合物９）を５．６５ｇ得た（収率９５％）。
（５−２） ２１−イソロイシル−トリアムシノロンアセトニド塩酸塩の調製
（５−１）で得た化合物９ ５．６５ｇをテトラヒドロフラン ９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ 塩酸／酢酸エチル ９０ｍＬを加えて室温にて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−イソロイシル−トリアムシノロンアセトニド塩酸塩（化合物１０）を３．０５ｇ得た（収率６０％）。
（５−１）で得た化合物９ ５．６５ｇをテトラヒドロフラン ９０ｍＬに溶解し、氷冷下で４Ｍ 塩酸／酢酸エチル ９０ｍＬを加えて室温にて３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去した。濃縮物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧下留去し、目的とする２１−イソロイシル−トリアムシノロンアセトニド塩酸塩（化合物１０）を３．０５ｇ得た（収率６０％）。
（５−３） ２１−イソロイシル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳの調製
ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万） １．０４ｇを蒸留水 ２０ｍＬに溶解し、アセトン ２０ｍＬを加えて撹拌した。（５−２）で得た化合物１０ ８８１ｍｇ、及びＤＭＴ−ＭＭ １．４６ｇを５０％アセトン／蒸留水 計３４ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ５ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液をエタノール ４４４ｍＬに順次加えて沈殿形成し、上清を捨てた。８０％エタノール／蒸留水で洗浄し、上清を捨てた。９５％エタノール／蒸留水を加え、フィルターでろ過した。フィルター上の沈殿を９５％エタノール／蒸留水、エタノールで順次洗浄し、得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１−イソロイシル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳが１．５９ｇ得られた。２４１ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたトリアムシノロンアセトニド含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３５ｗ／ｗ％であった。
ＣＳ（ナトリウム塩、重量平均分子量：約２万） １．０４ｇを蒸留水 ２０ｍＬに溶解し、アセトン ２０ｍＬを加えて撹拌した。（５−２）で得た化合物１０ ８８１ｍｇ、及びＤＭＴ−ＭＭ １．４６ｇを５０％アセトン／蒸留水 計３４ｍＬで共洗いしながら加え、終夜撹拌した。その後、塩化ナトリウム ５ｇ及び共洗いの５０％アセトン／蒸留水を加え、塩化ナトリウムを溶解した反応液をエタノール ４４４ｍＬに順次加えて沈殿形成し、上清を捨てた。８０％エタノール／蒸留水で洗浄し、上清を捨てた。９５％エタノール／蒸留水を加え、フィルターでろ過した。フィルター上の沈殿を９５％エタノール／蒸留水、エタノールで順次洗浄し、得られた沈殿を終夜減圧乾燥することで、目的とする２１−イソロイシル−トリアムシノロンアセトニド導入ＣＳが１．５９ｇ得られた。２４１ｎｍでの吸光度測定より、ＣＳに導入されたトリアムシノロンアセトニド含量（ｗ／ｗ％）を求めた結果、３５ｗ／ｗ％であった。
＜ステロイド含量の測定法＞
上記で得られた各化合物について、吸光度が直線性を有する範囲内で、蒸留水を用いて適切に溶解、希釈した。紫外線可視分光光度計（島津製作所）にて蒸留水を対象とし、測定対象の最大吸収波長付近の吸光度を測定した。
各化合物に導入されたステロイド含量（ｗ／ｗ％）は、以下の計算式により算出した。
上記で得られた各化合物について、吸光度が直線性を有する範囲内で、蒸留水を用いて適切に溶解、希釈した。紫外線可視分光光度計（島津製作所）にて蒸留水を対象とし、測定対象の最大吸収波長付近の吸光度を測定した。
各化合物に導入されたステロイド含量（ｗ／ｗ％）は、以下の計算式により算出した。
ステロイド含量(w/w%)＝(Abs/ε×MwST)/（(WT×(100-WD)/100)/(V×Mc))×100
Ａｂｓ：吸光度
ＷＴ：試料秤量値（ｍｇ）
ＷＤ：試料の乾燥減量（％）
ε：モル吸光係数
ＭｗＳＴ：ステロイド分子量
Ｖ：溶解液量（ｍＬ）
Ｍｃ：希釈倍率
Ａｂｓ：吸光度
ＷＴ：試料秤量値（ｍｇ）
ＷＤ：試料の乾燥減量（％）
ε：モル吸光係数
ＭｗＳＴ：ステロイド分子量
Ｖ：溶解液量（ｍＬ）
Ｍｃ：希釈倍率
モル吸光係数は、実施例１〜５に記載した方法に準じて合成した化合物２、４、６、８及び１０より算出した。下表１に各化合物のモル吸光係数（ε）及び用いたステロイドの分子量（ＭｗＳＴ）を示す。
以降の実施例では、合成したコンドロイチン硫酸誘導体の名称を以下の通り略す。
＜薬物遊離試験＞
薬物遊離試験にかかる実施例では、以下のようにしてコンドロイチン硫酸誘導体からの薬物（ステロイド）遊離率を評価した。
（１）リン酸緩衝液の調製
リン酸二水素ナトリウム・二水和物 ７８０ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）を蒸留水 ５００ｍＬに溶解し、Ａ液とした。別途、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物 １．７９ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を蒸留水 ５００ｍＬに溶解し、Ｂ液とした。Ａ液とＢ液を３：７の比率で混合し、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を調製した。
薬物遊離試験にかかる実施例では、以下のようにしてコンドロイチン硫酸誘導体からの薬物（ステロイド）遊離率を評価した。
（１）リン酸緩衝液の調製
リン酸二水素ナトリウム・二水和物 ７８０ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）を蒸留水 ５００ｍＬに溶解し、Ａ液とした。別途、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物 １．７９ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を蒸留水 ５００ｍＬに溶解し、Ｂ液とした。Ａ液とＢ液を３：７の比率で混合し、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を調製した。
（２）ホウ酸緩衝液の調製
ホウ酸 ０．６２ｇ（１０ｍｍｏｌ）と塩化カリウム ０．７５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を秤り取り、５００ｍＬの蒸留水に溶解して第１液とした。別途、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を蒸留水で１０倍希釈して第２液とした。第１液 ５０ｍＬと第２液 ７ｍＬを１００ｍＬのメスフラスコに加え、蒸留水で１００ｍＬにメスアップして、ｐＨ８．０のホウ酸緩衝液を調製した。
ホウ酸 ０．６２ｇ（１０ｍｍｏｌ）と塩化カリウム ０．７５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を秤り取り、５００ｍＬの蒸留水に溶解して第１液とした。別途、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を蒸留水で１０倍希釈して第２液とした。第１液 ５０ｍＬと第２液 ７ｍＬを１００ｍＬのメスフラスコに加え、蒸留水で１００ｍＬにメスアップして、ｐＨ８．０のホウ酸緩衝液を調製した。
（３）評価方法
実施例で得られたコンドロイチン硫酸誘導体について、濃度が５ｍｇ／１０ｍＬとなるようそれぞれのｐＨを有する緩衝液に溶解したのち、３６℃の恒温槽中で１週間加温し、その間の薬物の遊離率を２４時間ごとに液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で評価した。
評価はサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＴＯＳＯＨ社製ＴＳＫｇｅｌ α）を用い、コンドロイチン硫酸誘導体に残存する薬物量と、遊離した薬物量の比を測定することで行った。
液体クロマトグラフィーの条件の詳細は以下の通りである。
分析時間：４０分
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
グラジェント：ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
溶出液：アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）：生理食塩液＝１：２
検出器：紫外線検出器（２４０ｎｍ）
温度：３６℃
実施例で得られたコンドロイチン硫酸誘導体について、濃度が５ｍｇ／１０ｍＬとなるようそれぞれのｐＨを有する緩衝液に溶解したのち、３６℃の恒温槽中で１週間加温し、その間の薬物の遊離率を２４時間ごとに液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で評価した。
評価はサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＴＯＳＯＨ社製ＴＳＫｇｅｌ α）を用い、コンドロイチン硫酸誘導体に残存する薬物量と、遊離した薬物量の比を測定することで行った。
液体クロマトグラフィーの条件の詳細は以下の通りである。
分析時間：４０分
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
グラジェント：ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
溶出液：アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）：生理食塩液＝１：２
検出器：紫外線検出器（２４０ｎｍ）
温度：３６℃
＜試験例Ａ１＞ 薬物の種類の違いによる遊離特性の変化
実施例１、２及び３の方法に準じて調製したＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡについて、３６℃、１週間における薬物遊離率（％）をＨＰＬＣで評価した。薬物遊離率の評価は、２４時間ごとに実施した。結果を以下に示す。
実施例１、２及び３の方法に準じて調製したＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡについて、３６℃、１週間における薬物遊離率（％）をＨＰＬＣで評価した。薬物遊離率の評価は、２４時間ごとに実施した。結果を以下に示す。
ＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡにおける遊離速度は、ｐＨ７．４の場合及びｐＨ８．０の場合の共にＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤが最も遊離速度が速く、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡの遊離速度は、ほぼ同程度であった。
＜試験例Ａ２＞ スペーサーの違いによる遊離特性の変化
実施例３、４及び５の方法に準じて調製したＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡについて、３６℃、１週間における薬物遊離率（％）をＨＰＬＣで評価した。薬物遊離率の評価は、２４時間ごとに実施した。結果を以下に示す。
実施例３、４及び５の方法に準じて調製したＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡについて、３６℃、１週間における薬物遊離率（％）をＨＰＬＣで評価した。薬物遊離率の評価は、２４時間ごとに実施した。結果を以下に示す。
ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡにおける遊離速度は、ｐＨ７．４の場合及びｐＨ８．０の場合の共に、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ＞ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ＞ＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡの順に速かった。
＜ｉｎ ｖｉｖｏ評価＞
＜試験例Ｂ１＞ ラット塩酸惹起頻尿モデルを用いたＣＳ−ステロイド化合物の排尿機能評価（ステロイド比較）
目的
ステロイドの異なるコンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ）をラット塩酸惹起頻尿モデルの膀胱内に単回投与した際の排尿機能に対する作用を評価することを目的とした。
＜試験例Ｂ１＞ ラット塩酸惹起頻尿モデルを用いたＣＳ−ステロイド化合物の排尿機能評価（ステロイド比較）
目的
ステロイドの異なるコンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ）をラット塩酸惹起頻尿モデルの膀胱内に単回投与した際の排尿機能に対する作用を評価することを目的とした。
方法
実施例１、２及び３の方法に準じて調製したコンドロイチン硫酸誘導体をリン酸緩衝食塩液に溶解し、下記の被験物質を調製した。
試験物質：
（１）Ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ（ＰＲＥＤ含量３５ｗ／ｗ％）
（３）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ（ＢＴＭ含量４０ｗ／ｗ％）
（４）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ（ＴＡ含量３８ｗ／ｗ％）
実施例１、２及び３の方法に準じて調製したコンドロイチン硫酸誘導体をリン酸緩衝食塩液に溶解し、下記の被験物質を調製した。
試験物質：
（１）Ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ（ＰＲＥＤ含量３５ｗ／ｗ％）
（３）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ（ＢＴＭ含量４０ｗ／ｗ％）
（４）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ（ＴＡ含量３８ｗ／ｗ％）
ラット（ＳＤ系（ＳＰＦ）、雌性、１１−１３週齢）をペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）全身麻酔下で開腹し、膀胱頂部を切開してカテーテル（ＰＥ５０）を挿入し、膀胱瘻作製の手術を行った。
膀胱炎惹起には０．４Ｍ塩酸を用いた。膀胱瘻作製後７日に、ラットを麻酔下でボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら正常時膀胱内圧を計測した。０．４Ｍ塩酸を膀胱内へ１５分間持続注入（３ｍＬ／ｈ）し、頻尿を惹起した。
膀胱炎惹起には０．４Ｍ塩酸を用いた。膀胱瘻作製後７日に、ラットを麻酔下でボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら正常時膀胱内圧を計測した。０．４Ｍ塩酸を膀胱内へ１５分間持続注入（３ｍＬ／ｈ）し、頻尿を惹起した。
塩酸の膀胱内注入後２日に、麻酔下でカテーテル（ＰＥ５０）を用いて各被験物質を経尿道的に０．２ｍＬ投与し、３０分間留置した。
塩酸の膀胱内注入後７日に、ラットをボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。麻酔離脱後２０分から、生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら膀胱内圧変化を計測した。膀胱内圧変化が安定した時の排尿間隔及び１回排尿量を測定し、排尿機能を評価した。
結果を図１に示す。
塩酸の膀胱内注入後７日に、ラットをボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。麻酔離脱後２０分から、生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら膀胱内圧変化を計測した。膀胱内圧変化が安定した時の排尿間隔及び１回排尿量を測定し、排尿機能を評価した。
結果を図１に示す。
結果
図１において、結果は、平均排尿間隔±標準誤差（各群例数＝３〜７）によって示した。また、＊＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｓｈａｍ）を示す。＃＃は、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を、＃は、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定において、ｐ＜０．０５（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。＄は、ｔ検定において、ｐ＜０．０５（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
図１において、結果は、平均排尿間隔±標準誤差（各群例数＝３〜７）によって示した。また、＊＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｓｈａｍ）を示す。＃＃は、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を、＃は、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定において、ｐ＜０．０５（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。＄は、ｔ検定において、ｐ＜０．０５（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
図１より、ＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ投与群、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ投与群及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意な排尿間隔の延長作用を示した。1回排尿量についても同様に、ＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ投与群、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ投与群及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に１回排尿量を増加させた。
考察
膀胱内投与されたＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡは、いずれも排尿機能改善作用を有することが明らかとなったことから、ＣＳとステロイドとがスペーサーを介して共有結合された化合物は、ステロイドの種類に依らず効果があることが解った。
膀胱内投与されたＣＳ−βＡｌａ−ＰＲＥＤ、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳ−βＡｌａ−ＴＡは、いずれも排尿機能改善作用を有することが明らかとなったことから、ＣＳとステロイドとがスペーサーを介して共有結合された化合物は、ステロイドの種類に依らず効果があることが解った。
＜試験例Ｂ２＞ ラット塩酸惹起頻尿モデルを用いたＣＳ−ステロイド化合物の排尿機能評価（スペーサー比較）
目的
スペーサーの異なるコンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ）をラット塩酸惹起頻尿モデルの膀胱内に単回投与した際の排尿機能に対する作用を評価することを目的とした。
目的
スペーサーの異なるコンドロイチン硫酸誘導体（ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ）をラット塩酸惹起頻尿モデルの膀胱内に単回投与した際の排尿機能に対する作用を評価することを目的とした。
方法
実施例３、４及び５の方法に準じて調製したコンドロイチン硫酸誘導体をリン酸緩衝食塩液に溶解し、下記の被験物質を調製した。
試験物質：
（１）Ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ（ＴＡ含量３７ｗ/ｗ％）
（３）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ（ＴＡ含量３７ｗ/ｗ％）
（４）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ（ＴＡ含量３５ｗ/ｗ％）
実施例３、４及び５の方法に準じて調製したコンドロイチン硫酸誘導体をリン酸緩衝食塩液に溶解し、下記の被験物質を調製した。
試験物質：
（１）Ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ（ＴＡ含量３７ｗ/ｗ％）
（３）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ（ＴＡ含量３７ｗ/ｗ％）
（４）１．５％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ（ＴＡ含量３５ｗ/ｗ％）
ラット（ＳＤ系（ＳＰＦ）、雌性、１１−１４週齢）を三種混合（ドミトール、ドルミカム及びベトルファール、各々、０．１５、２．０、２．５ｍｇ／２．５ｍＬを０．５ｍＬ／rat、ｉ．ｖ．）全身麻酔下で開腹し、膀胱頂部を切開してカテーテル（ＰＥ５０）を挿入し、膀胱瘻作製の手術を行った。
膀胱炎惹起には０．４Ｍ塩酸を用いた。膀胱瘻作製後７日に、ラットを麻酔下でボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら正常時膀胱内圧を計測した。０．４Ｍ塩酸を膀胱内へ１５分間持続注入（３ｍＬ／ｈ）し、頻尿を惹起した。
膀胱炎惹起には０．４Ｍ塩酸を用いた。膀胱瘻作製後７日に、ラットを麻酔下でボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら正常時膀胱内圧を計測した。０．４Ｍ塩酸を膀胱内へ１５分間持続注入（３ｍＬ／ｈ）し、頻尿を惹起した。
塩酸の膀胱内注入後２日に、麻酔下でカテーテル（ＰＥ５０）を用いて各被験物質を経尿道的に０．２ｍＬ投与し、３０分間留置した。
塩酸の膀胱内注入後７日に、ラットをボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。麻酔離脱後２０分から、生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら膀胱内圧変化を計測した。膀胱内圧変化が安定した時の排尿間隔及び１回排尿量を測定した。
結果を図２に示す。
塩酸の膀胱内注入後７日に、ラットをボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。麻酔離脱後２０分から、生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら膀胱内圧変化を計測した。膀胱内圧変化が安定した時の排尿間隔及び１回排尿量を測定した。
結果を図２に示す。
体重変化は、手術前と、手術後であり塩酸惹起する直前と、被験物質投与の直前（薬剤投与前）と、膀胱内圧測定（Ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）の直前との４回の体重測定を行い、それぞれの個体において手術前を１００％とした相対値として示した。
また、胸腺湿重量は、膀胱内圧測定（Ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）後に、安楽死させたラットから胸腺を採取してその重量を測定した。体重変化を下表５に、胸腺湿重量を図３に示す。
また、胸腺湿重量は、膀胱内圧測定（Ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）後に、安楽死させたラットから胸腺を採取してその重量を測定した。体重変化を下表５に、胸腺湿重量を図３に示す。
平均±標準誤差（各群例数＝４〜９）
結果
図２において、結果は、平均排尿間隔±標準誤差（各群例数＝４〜９）によって示した。また、＊は、ｔ検定においてｐ＜０．０５（ｖｓ Ｓｈａｍ）を示す。＃は、ｔ検定において、ｐ＜０．０５（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。また、図３において、＊＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
図２において、結果は、平均排尿間隔±標準誤差（各群例数＝４〜９）によって示した。また、＊は、ｔ検定においてｐ＜０．０５（ｖｓ Ｓｈａｍ）を示す。＃は、ｔ検定において、ｐ＜０．０５（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。また、図３において、＊＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
図２より、ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ投与群、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ投与群及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意な排尿間隔の延長作用を示した。1回排尿量についても同様に、ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ投与群、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ投与群及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して１回排尿量を増加させた。
この結果から、スペーサー形成分子としてＩｌｅを用いても薬効を示すことが解った。ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡも再現よく薬効を示すことが解った。
図３より、ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ投与群及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ投与群では、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群に比べて胸腺湿重量の有意な低下が見られなかったが、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ投与群のみ胸腺湿重量の有意な低下が認められた。
また、表５より、ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ投与群及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ投与群では、いずれも薬剤投与前に比べて体重減少が見られなかったが、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ投与群のみ顕著な体重減少が認められた。
この結果から、スペーサー形成分子としてＩｌｅを用いても薬効を示すことが解った。ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡも再現よく薬効を示すことが解った。
図３より、ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ投与群及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ投与群では、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群に比べて胸腺湿重量の有意な低下が見られなかったが、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ投与群のみ胸腺湿重量の有意な低下が認められた。
また、表５より、ＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ投与群及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡ投与群では、いずれも薬剤投与前に比べて体重減少が見られなかったが、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ投与群のみ顕著な体重減少が認められた。
考察
膀胱内投与されたＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡは、いずれも排尿機能改善作用を有することが明らかとなった。しかし、薬物遊離速度の速いＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡにおいては、胸腺湿重量低下及び体重減少の副作用が認められ、膀胱内投与には適さないことが明らかとなった。一方、βＡｌａ、Ｉｌｅなどのスペーサー形成分子を用いて薬物遊離速度をコントロールすることでステロイドに起因する全身性の副作用を軽減できることが明らかとなった。
膀胱内投与されたＣＳ−βＡｌａ−ＴＡ、ＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡ及びＣＳ−Ｉｌｅ−ＴＡは、いずれも排尿機能改善作用を有することが明らかとなった。しかし、薬物遊離速度の速いＣＳ−Ｇｌｙ−ＴＡにおいては、胸腺湿重量低下及び体重減少の副作用が認められ、膀胱内投与には適さないことが明らかとなった。一方、βＡｌａ、Ｉｌｅなどのスペーサー形成分子を用いて薬物遊離速度をコントロールすることでステロイドに起因する全身性の副作用を軽減できることが明らかとなった。
＜試験例Ｂ３＞ ラット塩酸惹起頻尿モデルを用いたＣＳ−ステロイド化合物の排尿機能評価（結合体と混合液の比較）
目的
ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳとベタメタゾン（以下、ＢＴＭ）との混合液をラット塩酸惹起頻尿モデルの膀胱内に単回投与した際の排尿機能に対する作用を評価することを目的とした。
目的
ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ及びＣＳとベタメタゾン（以下、ＢＴＭ）との混合液をラット塩酸惹起頻尿モデルの膀胱内に単回投与した際の排尿機能に対する作用を評価することを目的とした。
方法
実施例２の方法に準じて調製したコンドロイチン硫酸誘導体をリン酸緩衝食塩液に溶解し、下記の被験物質を調製した。
試験物質：
（１）Ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）３％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ（ＢＴＭ含量３４ｗ／ｗ％）
（３）３％ＣＳ＋０．８６％ＢＴＭ混合液
実施例２の方法に準じて調製したコンドロイチン硫酸誘導体をリン酸緩衝食塩液に溶解し、下記の被験物質を調製した。
試験物質：
（１）Ｓａｌｉｎｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）３％（ｗ／ｖ％）ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ（ＢＴＭ含量３４ｗ／ｗ％）
（３）３％ＣＳ＋０．８６％ＢＴＭ混合液
ラット（ＳＤ系（ＳＰＦ）、雌性、１０−１３週齢）をペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）全身麻酔下で開腹し、膀胱頂部を切開してカテーテル（ＰＥ５０）を挿入し、膀胱瘻作製の手術を行った。
膀胱炎惹起には０．４Ｍ塩酸を用いた。膀胱瘻作製後７日に、ラットを麻酔下でボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら正常時膀胱内圧を計測した。０．４Ｍ塩酸を膀胱内へ１５分間持続注入（３ｍＬ／ｈ）し、頻尿を惹起した。
膀胱炎惹起には０．４Ｍ塩酸を用いた。膀胱瘻作製後７日に、ラットを麻酔下でボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら正常時膀胱内圧を計測した。０．４Ｍ塩酸を膀胱内へ１５分間持続注入（３ｍＬ／ｈ）し、頻尿を惹起した。
塩酸の膀胱内注入後２日に、麻酔下でカテーテル（ＰＥ５０）を用いて各試験物質を経尿道的に０．２ｍＬ投与し、３０分間留置した。
塩酸の膀胱内注入後７日に、ラットをボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。麻酔離脱後２０分から、生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら膀胱内圧変化を計測した。膀胱内圧変化が安定した時の排尿間隔及び１回排尿量を測定し、排尿機能を評価した。
結果は図４に示す。また、ラットの体重変化を下表６に示す。なお、体重変化は試験例Ｂ２と同様の条件で測定した。
塩酸の膀胱内注入後７日に、ラットをボールマンケージに保定し、膀胱カテーテル、圧力トランスデューサー及びシリンジポンプに設置したシリンジを並列して接続した。麻酔離脱後２０分から、生理食塩液を持続注入（３ｍＬ／ｈ）しながら膀胱内圧変化を計測した。膀胱内圧変化が安定した時の排尿間隔及び１回排尿量を測定し、排尿機能を評価した。
結果は図４に示す。また、ラットの体重変化を下表６に示す。なお、体重変化は試験例Ｂ２と同様の条件で測定した。
平均±標準誤差（各群例数＝５〜８）
結果
図４において、結果は、平均排尿間隔±標準誤差（各群例数＝５〜８）によって示した。また、＊＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｓｈａｍ）を示す。＃＃は、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
図４において、結果は、平均排尿間隔±標準誤差（各群例数＝５〜８）によって示した。また、＊＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｓｈａｍ）を示す。＃＃は、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定において、ｐ＜０．０１（ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
図４より、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に排尿間隔を延長させた。一方、ＣＳ，ＢＴＭ混合液投与群は、排尿間隔の延長作用を示さなかった。1回排尿量も同様に、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に１回排尿量を増加させたが、ＣＳ，ＢＴＭ混合液投与群は、１回排尿量の増加作用を示さなかった。
表６より、ＣＳ，ＢＴＭ混合液投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して顕著な体重減少を示した。一方、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して体重減少は認められなかった。
表６より、ＣＳ，ＢＴＭ混合液投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して顕著な体重減少を示した。一方、ＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して体重減少は認められなかった。
考察
膀胱内投与されたＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭは、ＣＳ，ＢＴＭ混合液と比較して、高い排尿機能改善作用を示すとともにステロイドに起因する全身性の副作用を軽減できることが明らかとなった。
膀胱内投与されたＣＳ−βＡｌａ−ＢＴＭは、ＣＳ，ＢＴＭ混合液と比較して、高い排尿機能改善作用を示すとともにステロイドに起因する全身性の副作用を軽減できることが明らかとなった。
日本国特許出願２０１５−００３５７２号（出願日：２０１５年１月９日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
本発明化合物は、膀胱疾患を改善する化合物として有用であり、産業上利用することができる。
Claims (2)
- コンドロイチン硫酸のカルボキシル基とスペーサー形成分子のアミノ基とがアミド結合し、ステロイド薬物のヒドロキシ基と前記スペーサー形成分子のカルボキシ基とがエステル結合してなるコンドロイチン硫酸誘導体を有効成分とする、抗炎症剤であって、
前記スペーサー形成分子がβアラニンまたはイソロイシンである抗炎症剤。 - 前記コンドロイチン硫酸誘導体からの前記ステロイドの遊離速度が、ｐＨ７．４、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝液中において０．１〜４％／日である、請求項１に記載の抗炎症剤。
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