JP4792294B2 - ヒアルロン酸誘導体及びそれを含む薬剤 - Google Patents
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Description
また、DMARDとしては、炎症の原因と考えられている免疫異常等の制御に関する免疫療法薬(免疫調整剤や免疫抑制剤)が挙げられる。
(Rpt−X) を縮合剤として用い、ヒアルロン酸に種々の薬剤を導入した例 (特許文献3) もあるが、調製した誘導体に関する剤形までは言及しておらず、その調製に溶液として使用できるような処理も工程に組み込まれていない。
そこで本発明は、関節症の治療剤であるヒアルロン酸ナトリウムにNSAIDsやDMARDを化学的に導入した新規誘導体を作成し、これを患部に注入することによる、関節症に伴う痛みの緩和、抑制及び関節症の根本治療に大きく寄与できる薬剤の提供、及び、NSAIDsやDMARDの放出をコントロールすることによる持続的効果を有する薬剤の提供を目的とする。
(注射剤) として注入可能な溶液として利用可能な可溶性NSAIDs導入ヒアルロン酸誘導体や可溶性DMARD導入ヒアルロン酸誘導体が得られることを見出し、本発明を完成した。
(1)生体内で分解されうる部位を有するスペーサーを介し、ヒアルロン酸に抗炎症化合物が共有結合にて結合しているヒアルロン酸誘導体。
Y−CO−NH−R1−(O−R2)n (1)
Y−CO−はヒアルロン酸の構成二糖単位1残基を示し、R2はZ−CO−で示される非ステロイド性抗炎症化合物残基又は水素原子を示し(但し、全てが水素原子である場合を除く)、−HN−R1−(O−)nはn個のヒドロキシル基を有するH2N−R1−(OH)nで示されるスペーサー化合物のスペーサー残基を示し、R1は置換基を有していても良い炭素数2〜12の直鎖あるいは分岐を有する炭化水素基を示し、−CO−NH−はヒアルロン酸の構成糖であるグルクロン酸のカルボキシル基とスペーサー化合物が有するアミノ基とのアミド結合を示し、−O−CO−はスペーサー化合物が有する水酸基と非ステロイド性抗炎症化合物残基が有するカルボキシル基とのエステル結合を示す。nは1〜3の整数を示す。また、当該ヒアルロン酸誘導体における非ステロイド性抗炎症化合物の導入率は、ヒアルロン酸の繰り返し二糖単位あたり5〜50モル%であり、ヒアルロン酸誘導体を構成するヒアルロン酸残基中のカルボニル基は、非ステロイド性抗炎症化合物残基の導入率に応じて、該スペーサー結合抗炎症化合物残基との結合に関与するアミド結合として又は関与しない遊離のカルボキシル基として存在するものとする。
H2N−R1−(O−R2)n (3)
R2はZ−CO−で示される非ステロイド性抗炎症化合物残基又は水素原子を示し(但し、全てが水素原子である場合を除く)、H2N−R1−(O−)nはn個のヒドロキシル基を有するH2N−R1−(OH)nで示されるスペーサー化合物のスペーサー残基を示し、R1は置換基を有していても良い炭素数2〜12の直鎖あるいは分岐を有する炭化水素基を示し、−O−CO−はスペーサー化合物が有する水酸基と非ステロイド性抗炎症化合物残基が有するカルボキシル基とのエステル結合を示す。nは1〜3の整数を示す。
が提供される。本発明物質は、注射剤等の溶媒として使用される緩衝液、生理食塩水、注射用水等に良く溶解するため、患部に直接投与可能な注射剤として使用できる。また、本発明薬剤は、関節症の治療、炎症の抑制や疼痛の抑制に用いることができ、注入剤として非経口投与または局所投与(例えば、関節内投与)も可能である。
本発明物質は、生体内で分解されうる部位を有するスペーサーを介し、ヒアルロン酸に抗炎症化合物が共有結合にて結合しているヒアルロン酸誘導体である。本発明においては、抗炎症化合物とは、非ステロイド性抗炎症化合物(NSAID又はNSAIDs)及び疾患修飾性抗リウマチ化合物(DMARD)から選択される。
なお、「NSAIDs」は複数の化合物が分類されている非ステロイド性抗炎症化合物を総称する場合に用い、「NSAID」は各々の非ステロイド性抗炎症化合物を指す場合もあるが、本明細書中では特に厳密に使い分けてはいない。
HA−SP−NSAID (4)
(HAはヒアルロン酸鎖を、SPはスペーサー残基を、NSAIDは非ステロイド性抗炎症化合物残基を、及び、−は共有結合を示す。)
HA−SP−DMARD (5)
(HAはヒアルロン酸鎖を、SPはスペーサー残基を、DMARDは疾患修飾性抗リウマチ化合物残基を、及び、−は共有結合を示す。)
ここで「水性溶媒」とは、水、水を含む緩衝液、薬学的に許容される金属塩、pH調整剤等を含む水溶液、緩衝液等を意味し、具体的には注射用水、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水等が例示される。
中でも、下記式(6)で示される骨格を有する化合物がより好ましく用いられる。
上記式(2)で示される化合物としては、例えば、WO99/11605に記載の化合物が挙げられ、同公報の記載内容は本明細書の記載の引用として取り込まれる。
なお、NSAIDが有するカルボキシル基は遊離型であっても、塩を形成していても構わない。
なお、上述のNSAIDsやDMARDの有している官能基に合わせてスペーサーの官能基を選択することにより、望ましい結合様式にてヒアルロン酸に導入することが可能である。また、本発明物質は、必ずしも1種類のNSAID又はDMARDが導入されている必要は無く、2種類以上のNSAISやDMARDを導入しているヒアルロン酸誘導体も包含される。
の残基である。スペーサーの生体内で分解されうる部位は、該ヒアルロン酸誘導体より遊離されるNSAIDs又はDMARDが効力を有すれば特に限定されるものではないが、NSAIDs又はDMARDとスペーサーとの結合部位で分解されることが望ましい。
この場合、ヒアルロン酸への導入のし易さ及び生体内での安定性よりヒアルロン酸のカルボキシル基にアミド結合で導入できるアミノ基を有するスペーサー化合物が望ましい形態の1つとして挙げられる。
スペーサー化合物は上述の様に、ヒアルロン酸やNSAIDs又はDMARDの特性に従い適宜選択可能であるが、例えば、炭素数2〜18のジアミノアルカン、置換基を有していても良い炭素数2〜12のアミノアルキルアルコール、アミノ酸等が挙げられる。アミノ酸としては、天然、非天然のアミノ酸であってもよく、特に限定されないが、好ましくは、グリシン、β-アラニン、γ-アミノ酪酸が挙げられる。
また、1分子中にNSAIDs又はDMARDと結合するこれら官能基を2個以上有しているスペーサー化合物 (以下、多価スペーサー化合物ともいう) でも構わない。
なお、一般的に、ヒアルロン酸へ化合物を導入したヒアルロン酸誘導体においては、ヒアルロン酸の有するカルボキシル基や水酸基が化合物の結合に関与する為、物質の導入率の上昇に伴い、ヒアルロン酸誘導体の親水性が低下する。
具体的一例としては、スペーサーを導入したNSAIDs誘導体をヒアルロン酸と反応した後、反応液に例えば炭酸水素ナトリウム等の弱アルカリを加え、数時間攪拌処理した後、中和、エタノール沈殿、乾燥等の後処理をすることにより目的とする可溶性のヒアルロン酸誘導体を得ることができる。
上述の方法は、本発明物質2の合成にも適用でき、可溶性の本発明物質2を得ることが出来る。
(EDCI・HCl)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドメチオシド等)の水溶性の縮合剤を使用する方法、N-ヒドロキシこはく酸イミド
(HOSu) やN-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt) 等の縮合補助剤と上記の縮合剤とを使用する方法、活性エステル法、酸無水物法等が挙げられる。これらの中では水性溶媒の存在下の反応として、水溶性の縮合剤を使用する方法、又は縮合補助剤と水溶性の縮合剤とを使用する方法が好ましく、特に副反応の抑制という観点から縮合補助剤と水溶性の縮合剤とを使用する方法がより好ましい。このようなヒアルロン酸のカルボキシル基と、スペーサー結合NSAIDs又はスペーサー結合DMARD、若しくは、スペーサー化合物との結合はエステル結合又はアミド結合でなされることが好ましく、アミド結合でなされることが更に好ましい。
この問題点を解決する手段の1つとして、多価スペーサー化合物を利用することにより、親水性をより維持したまま、多くのNSAIDs又はDMARDの導入が可能になる。例えば、3個の水酸基と1個のアミノ基を有するアミノトリオール誘導体をスペーサー化合物に用いた場合、3個の水酸基全てにNSAIDsを導入すればスペーサー1分子に3分子のNSAIDsが導入されることになる。このアミノトリオール結合NSAIDsがヒアルロン酸のカルボキシル基に対し例えば20%の置換率(ヒアルロン酸二糖単位当たりの置換率)
で導入された場合、NSAIDsの導入率は3倍の60%ということになる。
Y−CO−NH−R1−(O−R2)n (1)
Y−CO−はヒアルロン酸の構成二糖単位1残基を示し、R2はZ−CO−で示されるNSAID残基又は水素原子を示し(但し、全てが水素原子である場合を除く)、−HN−R1−(O−)nはn個のヒドロキシル基を有するH2N−R1−(OH)nで示されるスペーサー化合物のスペーサー残基を示し、R1は、置換基を有していても良い炭素数2〜12の直鎖あるいは分岐を有する炭化水素基を示し、−CO−NH−はヒアルロン酸の構成糖であるグルクロン酸のカルボキシル基とスペーサー化合物が有するアミノ基とのアミド結合を示し、−O−CO−はスペーサー化合物が有する水酸基とNSAIDが有するカルボキシル基とのエステル結合を示す。nは1〜3の整数を示す。なお、ヒアルロン酸誘導体を構成するヒアルロン酸残基中のカルボニル基は、NSAID残基の導入率に応じて、該スペーサー結合抗炎症化合物残基との結合に関与するアミド結合として、または関与しない遊離のカルボキシル基として存在するものとする。
上記式(1)で示されるヒアルロン酸構成二糖単位を合成する最も好適な方法としては、スペーサー化合物とNSAIDを結合させた後、次いで、ヒアルロン酸と反応させる方法が挙げられる。この反応を概念的に表すと以下の通りである。
→ (脱保護) → H2N−R1−(O−R2)n
H2N−R1−(O−R2)n + Y−COOH →
Y−CO−NH−R1−(O−R2)n
但し、上記は反応経路を概念的に示したものであり、当業者であれば考えうる反応を効率的に行う工夫等については省略している。
X1、X2はそれぞれ独立に、低級アルキル基及びトリフルオロメチル基から選択される置換基又はハロゲン原子を示し、少なくともどちらか一つはハロゲン原子である。X1、X2は同一又は異なるハロゲン原子がより好ましく、中でもフッ素原子又は塩素原子から選択されるとより好ましい。
また、R8は、R8が結合しているベンゼン環においてカルボキシメチル基を1位、アミノ残基を2位とした場合に、5位の位置に結合しているのが好ましい。
よって、本発明物質の溶液はフィルター濾過が可能であり、フィルター濾過による除塵、除菌、滅菌が可能となる。すなわち、5μmあるいは、0.45μmのフィルターを通過させることにより除塵、除菌が可能となり、更に望ましくは0.22μmのフィルターを通過させることにより滅菌することも可能となる。
また、本発明物質を1.0重量%で水性媒体に溶解して得られる溶液が、上記と同様の条件にて、多孔質フィルター(孔径(ポアサイズ)0.22μm、直径25mm)を1分間に2mL以上通過可能であることが一層好ましい。
この様に調製された本発明薬剤は、濾過滅菌を適用することができ、かつ、粘弾性をある程度有している状態であるのが好ましい。
(本明細書中においては、「注入」が「注射」を包含する場合もある)。注入により局所投与を行うことにより、消化器系での副作用を回避することが出来る。また、消化器系による代謝も回避できる為、経口投与より投与量を減少させることが可能であり、更には、大量の経口投与による全身性毒性の問題も回避出来る。
なお、本発明薬剤や本発明物質の溶液が薬剤押出用プランジャー等を具備した押出可能な注入具内に充填されたキットも提供可能である。また、該キットは、本発明物質を薬学的に許容されるリン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水または注射用水に溶解した溶液を注射筒に充填し、薬剤押出用プランジャーで摺動可能に密封してなる医療用注射剤キットとすることが可能である。なお、薬剤押出用プランジャーは通常用いられているものを用いることが可能であるが、ゴム又は合成ゴム等の弾性体によって形成され、シリンジに摺動可能に密着状態で挿入される。また、キットには、プランジャーを押込操作し、薬剤を押出する為のプランジャロッドも含まれていても良い。
本発明処置剤は、後述の様にNSAIDs等の抗炎症化合物の徐放作用や薬物送達システム(Drug Delivery System)作用を有するだけで無く、関節症の処置において、抗炎症化合物による治療効果以外にも、現在臨床にて用いられているヒアルロン酸製剤による関節症への効果も同時に期待出来る。
NSAID: 上記式(2)で示される化合物
スペーサー及び結合形態: アミノアルキルアルコールがNSAIDとエステル結合、ヒアルロン酸とアミド結合で結合
ヒアルロン酸の分子量: 重量平均分子量500,000〜3,000,000
NSAIDの導入率: ヒアルロン酸2糖単位当たり5〜50モル%
濃度及び溶媒: 0.3〜3.0重量%濃度のリン酸緩衝生理的食塩水溶液
提供状態: 滅菌状態でシリンジに充填されている。
導入率としては、ヒアルロン酸二糖単位当たり10〜50モル%がより好ましい。
また、5μmあるいは0.45μmのフィルター濾過が可能であり、更には、0.22μmのフィルター濾過が可能であると最も好ましい。
COX Inhibitor Screening Assay Kit(Cayman社製)を用いて本発明物質の評価を行った。その結果、NSAIDs単体が明らかにCOX−2阻害作用を示した投与量とNSAIDs換算で単体投与量に相当する量のNSAIDsを含有する本発明物質1の投与量においても、本発明物質1にはCOX-2阻害作用は確認されなかった。
本発明物質を用いることにより、薬剤の単独投与よりも、投与部位において治療に有効な薬剤量が効率的に保持される為、経口投与よりはるかに微量ではるかに強力な治療効果が期待できる。また、効果の徐放性および持続性のアップも図れる為、臨床において投与回数の減少等も期待出来る。
尚、以下の実施例において、ヒアルロン酸及びヒアルロン酸ナトリウムはすべて生化学工業株式会社製のものを用いた。
以下、特に断りのない限り、以下の実施例ではリン酸緩衝生理食塩水(PBS)として、5mMのPBSを用いた。
1.0重量%で被検物質を溶解したPBSを調製した。24℃条件下、5.0kg/cm2の加圧下で0.45μm多孔質フィルター (直径25mm)
に下記実施例で調製した被検物質の溶液を通過させ、1分間あたりの通過量 (mL) を測定した。2mL以上通過した場合を「A」、2mL未満通過した場合を「B」、通過しない場合を「C」で示す。
(参考例1)t−ブトキシカルボニル−アミノプロパノール(Boc-NH(CH2)3OH) (Boc−アミノプロパノール)の合成
アミノプロパノール1.542g (20.5mmol) をジクロロメタン10mLに溶解し、氷冷下ジ−t−ブチル−ジカルボナート (Boc2O)
4.484g (20.5mmol)/ジクロロメタン溶液10mLをゆっくり滴下した。その後反応液を室温に戻し、2時間40分攪拌し、原料の消失を薄層クロマトグラフィー
(TLC) で確認した後、ジクロロメタンを減圧留去した。反応は定量的に進行し、収量3.92gでオイル状物質を得た。構造は、1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
(2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.27 (3H,
m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.66 (2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
4.91 (1H, br, CH2 OH)
1) Boc−アミノプロパノール−ケトプロフェンの合成
Boc−アミノプロパノール2.371g (13.5mmol) とケトプロフェン3.441g (13.5mmol) (東京化成工業株式会社製)をジクロロメタン14mLに溶解し、氷冷下で4-ジメチルアミノピリジン
(DMAP) 323mg (2.6mmol)、水溶性カルボジイミド塩酸塩 (WSCI・HCl) 2.833g (14.8mmol)/ジクロロメタン14mLを順次加えた。室温に戻し、一昼夜攪拌した後、ジクロロメタンを減圧留去し、酢酸エチルを加え、5%クエン酸で2回、水、5%重曹で2回、水、飽和食塩水で順次、分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後、酢酸エチルを減圧留去し、標記化合物を5.430g
(収率98%) で得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.77 (2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-),
3.09 (2H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.82 (1H,
q, -OCOCH(CH3)-), 4.15 (2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
4.69 (1H, br, -NHCH2-), 7.42-7.83 (9H, m, Aromatic H)
上記で得たBoc−アミノプロパノール−ケトプロフェン5.330g (12.95mmol) に氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル20mLを加え、氷冷下で15分、室温で2時間攪拌した。Boc−アミノプロパノール−ケトプロフェンの消失をTLCにて確認した後、溶媒を減圧留去し、残渣をジエチルエーテルにて2回デカンテーションした。その後、減圧乾燥し標記物質を定量的に収量4.569gで得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
2.08 (2H, m, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.04 (2H,
br, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.82 (1H, q, -OCOCH(CH3)-),
4.16 (2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 7.36-7.80
(9H, m, Aromatic H), 8.20 (br, H 3 N + CH2-)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸ナトリウム200mg (0.5mmol/二糖単位) を水22.5mL/ジオキサン22.5mLに溶解させた後、2Mヒドロキシこはく酸イミド
(HOSu) 水溶液0.25mL、1mol/L WSCI・HCl水溶液0.25mL、実施例1で得られた0.5Mアミノプロパノール−ケトプロフェン塩酸塩水溶液0.5mLを順次加え、一昼夜攪拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液3mL加え、3時間20分攪拌した。反応液に50%酢酸86μLを加え中和後、塩化ナトリウム800mgを加え攪拌した。エタノール200mLに加え沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで2回洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。198mgの白色固体を得た。HPLCによるケトプロフェンの導入率は15.5%だった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
重量平均分子量90万のヒアルロン酸400mg (1.0mmol/二糖単位) を水45mL/ジオキサン45mLに溶解させた後、HOSu 1.66mmol/水1mL、WSCI・HCl
0.83mmol/水1mL、実施例1で得られたアミノプロパノール−ケトプロフェン塩酸塩0.83mmol/水4mLを順次加え、一昼夜攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム300mg/水1mL加え、3時間10分攪拌した。反応液に酢酸86μLを加え中和後、塩化ナトリウム400mgを加え攪拌した。エタノール300mLを加え沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで2回洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。246mgの白色固体を得た。HPLCによるケトプロフェンの導入率は26.3%だった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1) Boc−アミノプロパノール−ナプロキセンの合成
Boc−アミノプロパノール350mg (2mmol) とナプロキセン462g (2mmol)(和光純薬工業株式会社製)をジクロロメタン2mLに溶解し、氷冷下でDMAP
48mg (0.4mmol)、WSCI・HCl 422g (2.2mmol)/ジクロロメタン2mLを順次加えた。室温に戻し、4時間50分攪拌した後、ジクロロメタンを減圧留去し、酢酸エチルを加え、5%クエン酸で2回、水、5%重曹で2回、水、飽和食塩水で順次、分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後、酢酸エチルを減圧留去し、標記化合物を720mg
(収率93%) の白色結晶で得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.75 (2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-),
3.07 (2H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.85 (1H,
q, -OCOCH(CH3)-), 3.91 (3H, s, -OCH 3 ), 4.13
(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.63 (1H, br,
-NHCH2-), 7.09-7.75 (6H, m, Aromatic H)
上記で得たBoc−アミノプロパノール−ナプロキセン684mg (1.76mmol) をジクロロメタン1mL溶解に氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル2mLを加え、氷冷下で20分間、室温で1時間攪拌した。Boc−アミノプロパノール−ナプロキセンの消失をTLCにて確認した後、ジエチルエーテルを加え、3回デカンテーションした。その後、減圧乾燥し標記物質を定量的に収量564mgで得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 2.02 (2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-),
2.88 (2H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.87 (1H,
q, -OCOCH(CH3)-), 3.90 (3H, s, -OCH 3 ), 4.17
(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 7.08-7.73 (6H,
m, Aromatic H), 8.10 (br, H 3 N + CH2-)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸ナトリウム100mg (0.25mmol/二糖単位) を水11.5mL/ジオキサン11.5mLに溶解させた後、HOSu
(0.2mmol)/水0.1mL、WSCI・HCl (0.1mmol)/水0.1mL、実施例4で得られたアミノプロパノール−ナプロキセン塩酸塩
(0.1mmol)/水0.3mLを順次加え、一昼夜攪拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液1.5mL加え、3時間35分攪拌した。反応液に50%酢酸43μLを加え中和後、塩化ナトリウム500mgを加え攪拌した。エタノール50mLを加え沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。95mgの白色固体を得た。HPLCによるナプロキセンの導入率は13.1%だった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1) Boc−アミノプロパノール−イブプロフェンの合成
Boc−アミノプロパノール352mg (2mmol) とイブプロフェン412g (2mmol) (和光純薬工業株式会社製)をジクロロメタン2mLに溶解し、氷冷下でDMAP
48mg (0.4mmol)、WSCI・HCl 423g (2.2mmol)/ジクロロメタン2mLを順次加えた。室温に戻し、一昼夜攪拌した後、酢酸エチルを加え、5%クエン酸で2回、水、5%重曹で2回、水、飽和食塩水で順次、分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後、酢酸エチルを減圧留去し、標記化合物を665mg
(収率91%) で得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
1.44 (9H, s, Boc), 1.49 (3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.75 (2H, m,
-NHCH2 CH 2 CH2O-), 1.85 (1H, m, -CH2 CH(CH3)2),
2.45 (2H, d, -CH 2 CH(CH3)2), 3.05 (2H,
m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.69 (1H, q, -OCOCH(CH3)-),
4.13 (2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 4.63 (1H,
br, -NHCH2-), 7.07-7.21 (4H, m, Aromatic H)
上記で得たBoc−アミノプロパノール−イブプロフェン636mg (1.75mmol) をジクロロメタンに1mL溶解し、氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル4mLを加え、氷冷下で10分間、室温で3時間攪拌した。Boc−アミノプロパノール−イブプロフェンの消失をTLCにて確認した後、ジエチルエーテルを加え、3回デカンテーションした。その後、減圧乾燥し標記物質を収量406mg
(77%) で得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
1.47 (3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.83 (1H, m, -CH2 CH(CH3)2),
2.08 (2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-),
2.44(2H, d, -CH 2 CH(CH3)2), 3.01 (2H, t,
-NHCH 2 CH2CH2O-), 3.71 (1H, q, -OCOCH(CH3)-),
4.11-4.27 (2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
7.06-7.20 (4H, m, Aromatic H), 8.25 (br, H 3 N + CH2-)
アミノプロパノール−イブプロフェン導入ヒアルロン酸ナトリウムの合成
重量平均分子量90万のヒアルロン酸ナトリウム100mg (0.25mmol/二糖単位) を水11.5mL/ジオキサン11.5mLに溶解させた後、HOSu
(0.2mmol)/水0.1mL、WSCI・HCl (0.1mmol)/水0.1mL、実施例6で得られたアミノプロパノール−イブプロフェン塩酸塩
(0.1mmol)/水0.3mLを順次加え、一昼夜攪拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液1.5mLを加え、3時間35分攪拌した。反応液に50%酢酸43μLを加え中和後、塩化ナトリウム500mgを加え攪拌した。エタノール50mLを加え沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。93mgの白色固体を得た。HPLCによるイブプロフェンの導入率は16.4%だった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1) Boc−アミノプロパノール−フルルビプロフェンの合成
Boc−アミノプロパノール352mg (2mmol) とフルルビプロフェン489g (2mmol)(和光純薬工業株式会社製)をジクロロメタン2mLに溶解し、氷冷下でDMAP
48mg (0.4mmol)、WSCI・HCl 423g (2.2mmol)/ジクロロメタン2mLを順次加えた。室温に戻し、一昼夜攪拌した後、酢酸エチルを加え、5%クエン酸で2回、水、5%重曹で2回、水、飽和食塩水で順次、分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後、酢酸エチルを減圧留去し、標記化合物を753mg
(収率94%) で得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
(3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 1.80 (2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-),
3.13 (2H, m, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.76 (1H,
q, -OCOCH(CH3)-), 4.15 (2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
4.66 (1H, br, -NHCH2-), 7.10-7.55 (9H, m, Aromatic H)
上記で得たBoc−アミノプロパノール−フルルビプロフェン720mg (1.79mmol) をジクロロメタン1mLに溶解し、氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル4mLを加え、氷冷下で3分間、室温で3時間10分攪拌した。Boc−アミノプロパノール−フルルビプロフェンの消失をTLCにて確認した後、ジエチルエーテルを加え、2回デカンテーションした。その後、減圧乾燥し標記物質を収量352mg
(94%) で得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
2.10 (2H, quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.05
(2H, t, -NHCH 2 CH2CH2O-), 3.76 (1H, q,
-OCOCH(CH3)-), 4.13-4.29 (2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
7.07-7.53 (9H, m, Aromatic H), 8.27 (br, H 3 N + CH2-)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸ナトリウム100mg (0.25mmol/二糖単位) を水11.5mL/ジオキサン11.5mLに溶解させた後、HOSu
(0.2mmol)/水0.1mL、WSCI・HCl (0.1mmol)/水0.1mL、上記実施例8で得られたアミノプロパノール−フルルビプロフェン塩酸塩
(0.1mmol)/水0.3mLを順次加え、一昼夜攪拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液1.5mLを加え、3時間35分攪拌した。反応液に50%酢酸43μLを加え中和後、塩化ナトリウム500mgを加え攪拌した。エタノール50mLを加え沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。94mgの白色固体を得た。HPLCによるフルルビプロフェンの導入率は21.1%だった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1) Boc−アミノプロパノール−アセチルサリチル酸の合成
Boc−アミノプロパノール (2.11mmol)、アセチルサリチル酸 (2.11mmol)(和光純薬工業株式会社製)、DMAP (0.42mmol) をジクロロメタン−ジオキサン
(2:1、6ml) に溶解し、氷冷下でWSCI・HCl (2.35mmol) を加えた。室温に戻し、一昼夜撹拌した後、酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次、分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後、酢酸エチルを減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
(ヘキサン:酢酸エチル=3:1、0.5%トリエチルアミン) にて精製し、標記化合物 (298.0mg、収率48%) を得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
1.90-1.96 (2H, m, BocHNCH2 CH 2 CH2O-),
2.35 (3H, s, -COCH 3 ), 3.24-3.28 (2H, m, BocHNCH 2 CH2CH2O-),
4.35 (2H, t, BocHNCH2CH2 CH 2 O-), 4.78
(1H, s, NH), 7.11 (1H, dd, Aromatic), 7.32 (1H, td, Aromatic), 7.55-7.59 (1H,
m, Aromatic), 8.01 (1H, dd, Aromatic)
上記で得たBoc−アミノプロパノール−アセチルサリチル酸 (0.814mmol) をジクロロメタン (1ml) に溶解し、氷冷下で4N塩酸/酢酸エチル
(3ml) を加えて2時間撹拌した。Boc−アミノプロパノール−アセチルサリチル酸の消失をTLCにて確認した後、ジエチルエーテルを加えた。生じた沈殿を遠心分離し、上清をデカンテーションした。得られた沈殿を減圧乾燥し、標記化合物213.9mg
(収率96%) を得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
2.35 (3H, s, -COCH 3 ), 3.13 (2H, t, H2NCH 2 CH2CH2O-),
4.41 (2H, t, H2NCH2CH2 CH 2 O-),
7.09 (1H, dd, Aromatic), 7.31 (1H, dt, Aromatic), 7.56 (1H, dt, Aromatic), 7.99
(1H, dd, Aromatic)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸 (100mg)0.25 mmol/二糖単位を水−ジオキサン (1:1) に溶解し、2mol/L HOSu (0.1ml)、1mol/L
WSCI・HCl (0.1ml)、上記実施例10で得られたアミノプロパノール−アセチルサリチル酸塩酸塩 (0.10mmol) の水−ジオキサン (1:1) 溶液
(2ml) を順次加え、一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液 (1.5ml) を加えて3時間撹拌した。50%酢酸水溶液 (43μl) を加えて中和後、塩化ナトリウム
(0.4g) を加えて撹拌した。エタノール (100ml) を加え沈殿させ、沈殿物を80%エタノール水溶液、エタノール、ジエチルエーテルにて各2回順次洗浄した。その後減圧乾燥し、標記化合物
(97.7mg) を得た。吸光光度法によるアセチルサリチル酸の導入率は、13.5%であった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1) Boc−アミノプロパノール−フェルビナクの合成
Boc−アミノプロパノール (2.04mmol)、フェルビナク (2.04mmol)(Aldrich Chem. Co.製)、DMAP (0.41mmol)
をジオキサン (7ml) に溶解させた後、氷冷下でWSCI・HCl (2.35mmol) のジオキサン−ジクロロメタン (3:4) 溶液 (7ml) を加えた。反応液にジメチルホルムアミド
(DMF) (3ml) を加え澄明とした後、室温に戻し、一昼夜撹拌した。酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次、分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
(ヘキサン:酢酸エチル=3:1、0.5%トリエチルアミン) にて精製し、標記化合物 (623.0mg、収率83%) を得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
1.80-1.85 (2H, m, BocHNCH2 CH 2 CH2O-),
3.15-3.19 (2H, m, BocHNCH 2 CH2CH2O-),
3.67 (2H, s, PhCH 2 -), 4.18 (2H, t, BocHNCH2CH2 CH 2 O-),
4.67 (1H, s, NH), 7.34-7.59 (9H, m, Aromatic)
上記で得たBoc−アミノプロパノール−フェルビナク (1.69mmol) をジクロロメタン (1ml) に溶解し、氷冷下で4N塩酸/酢酸エチル (3ml) を加えた。室温に戻して2時間撹拌した。Boc−アミノプロパノール−フェルビナクの消失をTLCにて確認した後、ジエチルエーテルを加え、生じた沈殿を遠心分離した。得られた沈殿をジエチルエーテルにて3回デカンテーションした後減圧乾燥し、標記化合物
(511.7mg、収率99%) を得た。構造は1H-NMR (CDCl3:CD3OD=1:1)
にて同定した。
1.98-2.04 (2H, m, H2NCH2 CH 2 CH2O-),
2.95 (2H, t, H2NCH 2 CH2CH2O-),
3.73 (2H, s, -PhCH 2 -), 4.23 (2H, t, H2NCH2CH2 CH 2 O-),
7.33-7.59 (9H, m, Aromatic)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸 (200mg) 0.5 mmol/二糖単位を水−ジオキサン (1:1、45ml) に溶解し、2mol/L HOSu
(0.25ml)、1mol/L WSCI・HCl (0.25ml)、実施例12で得られた0.5Mフェルビナク−プロパノールアミン塩酸塩水溶液 (0.5ml) を順次加えて一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液
(3ml) を加えて3時間撹拌した。反応液に50%酢酸水溶液 (86μl) を加え中和後、塩化ナトリウム (0.8g) を加えて撹拌した。エタノール
(200ml) を加えて撹拌した。生じた沈殿を遠心分離し、得られた沈殿を80%エタノール水溶液、エタノール、ジエチルエーテルにて各2回順次洗浄した。これを室温にて一晩減圧乾燥し、標記化合物
(205.1mg) を得た。HPLCによるフェルビナクの導入率は27.8%だった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1) Boc−アミノプロパノール−フェンブフェンの合成
Boc−アミノプロパノール (2.18mmol)、フェンブフェン (2.18mmol)(ICN Biochemicals. Inc.製)、DMAP
(0.44mmol) をDMF−ジクロロメタン (5:3、8ml) に溶解し、氷冷下でWSCI・HCl (2.48mmol) のジクロロメタン溶液 (5ml)
を加えた。徐々に反応温度を室温とし、一昼夜撹拌した。酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次、分液洗浄した。硫酸ナトリウムにて脱水乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
(クロロホルム:酢酸エチル=40:1、0.5%トリエチルアミン) にて精製し、標記化合物 (747.8mg、収率83%) を得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
1.82-1.87 (2H, m, BocHNCH2 CH 2 CH2O-),
2.79 (2H, t, -COC 2 H 4 CO-), 3.20-3.24 (2H, m, BocHNCH 2 CH2CH2O-),
3.36 (2H, t, -COC 2 H 4 CO-) 4.19 (2H, t, BocHNCH2CH2 CH 2 O-),
4.76 (1H, s, NH), 7.39-7.64 (5H, m, Aromatic), 7.70 (2H, td, Aromatic), 8.06
(2H, td, Aromatic)
上記で得たBoc−アミノプロパノール−フェンブフェン (1.82mmol) をジクロロメタン (4ml) に溶解し、氷冷下、4N塩酸・酢酸エチル溶液
(4ml) を加え、その後徐々に室温として90分間撹拌した。反応開始直後に、白色沈殿の析出が見られた。Boc−アミノプロパノール−フェンブフェンの消失をTLCにて確認した後、反応液にジエチルエーテルを加え、白色沈殿を遠心分離した。沈殿をジエチルエーテルで3回洗浄した後減圧乾燥し、標記化合物
(621.4mg、収率98%) を得た。構造は1H-NMR (CDCl3:CD3OD=1:1)
にて同定した。
2.01-2.07 (2H, m, H2NCH2 CH 2 CH2O-),
2.79 (2H, t, -COC 2 H 4 CO-), 3.05 (2H, t, H2NCH 2 CH2CH2O-),
3.44 (2H, t, -COC 2 H 4 CO-), 4.26 (2H, t, H2NCH2CH2 CH 2 O-),
7.41-7.50 (3H, m, Aromatic), 7.66 (dd, 2H, Aromatic), 7.75 (d, 2H, Aromatic),
8.08 (d, 2H, Aromatic)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸 (200mg) 0.5mmol/二糖単位の水−ジオキサン (1:1、45ml) に溶解させた後、2mol/L HOSu
(0.25ml)、1mol/L WSCI・HCl (0.25ml)、実施例14で得られたアミノプロパノール−フェンブフェン塩酸塩 (0.25mmol) の水−ジオキサン
(25:8) 溶液 (0.66ml) を加えて一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液 (3ml) を加えて3時間撹拌した。50%酢酸水溶液
(86μl) を加えて中和後、塩化ナトリウム (0.8g) を加えて撹拌した。エタノール (200ml) を加えて撹拌した。生じた沈殿を遠心分離し、得られた沈殿を80%エタノール水溶液、エタノール、ジエチルエーテルにて各2回洗浄した。減圧乾燥し、標記化合物
(214.1mg) を得た。HPLCによるフェンブフェンの導入率は23.8%だった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1) Boc−アミノプロパノール−メフェナム酸
Boc−アミノプロパノール (0.616mmol)、メフェナム酸 (0.620mmol)(和光純薬工業株式会社製)、DMAP (0.126mmol) をジクロロメタン
(3ml) に溶解し、氷冷下でWSCI・HCl (0.758mmol) のジクロロメタン溶液 (1.5ml) を加えた。徐々に反応温度を室温とし、一昼夜撹拌した。再度反応液を氷冷し、WSCI・HCl
(0.207mmol) のジクロロメタン溶液 (1ml) を加えて徐々に室温としながら5時間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄した。硫酸ナトリウムにて脱水乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
(ヘキサン:酢酸エチル=6:1、0.5%トリエチルアミン) にて精製し、標記化合物 (190.4mg、収率78%) を得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
1.96-2.01 (2H, m, BocHNCH2 CH 2 CH2O-),
2.18 (3H, s, PhCH 3 ), 2.33 (3H, s, PhCH 3 ),
3.31-3.32 (2H, m, BocHNCH 2 CH2CH2O-),
4.38 (2H, t, BocHNCH2CH2 CH 2 O-), 4.78 (1H,
s, NH), 6.64-6.67 (1H, m, Aromatic), 6.74 (1H, dd, Aromatic), 7.02-7.26 (4H, m,
Aromatic), 7.94 (1H, dd, Aromatic), 9.24 (1H, s, -PhNHPh-)
上記で得たBoc−アミノプロパノール−メフェナム酸 (0.462mmol) をジクロロメタン (0.5ml) に溶解し、氷冷下で4N塩酸/酢酸エチル (1.5ml)
を加えて3時間撹拌した。Boc−アミノプロパノール−メフェナム酸の消失をTLCで確認後、反応液にジエチルエーテルを加え、生じた沈殿を遠心分離した。得られた沈殿をジエチルエーテルにて洗浄した後減圧乾燥し、標記化合物
(154.4mg、qu.) を得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
2.25-2.30 (2H, m, H2NCH2 CH 2 CH2O-),
2.31 (3H, s, PhCH 3 ), 3.20 (2H, t, H2NCH 2 CH2CH2O-),
4.44 (2H, t, H2NCH2CH2 CH 2 O-),
6.63-6.66 (1H, m, Aromatic), 6.70-6.72 (1H, dd, Aromatic), 7.02 (1H, d,
Aromatic), 7.09 (1H, t, Aromatic), 7.14 (1H, d, Aromatic), 7.22-7.25 (1H, m,
Aromatic), 7.92 (1H, dd, Aromatic), 9.17 (1H, s, -PhNHPh-)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸 (100mg) 0.25 mmol/二糖単位を水−ジオキサン (1:1、22.5ml) に溶解し、2mol/L HOSu
(0.1ml)、1mol/L WSCI・HCl (0.1ml)、実施例16で得られたアミノプロパノール−メフェナム酸塩酸塩 (0.10mmol) の水−ジオキサン
(1:1) 溶液 (2ml) を順次加えて一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液 (1.5ml) を加えて4時間撹拌した。50%酢酸水溶液
(43μl) を加えて中和後、塩化ナトリウム (0.4g) を加えて撹拌した。エタノール (100ml) を加えて撹拌し、生じた沈殿を遠心分離した。得られた沈殿を80%エタノール水溶液、エタノール、ジエチルエーテルにて各2回順次洗浄した。減圧乾燥し、標記化合物
(101.7mg) を得た。吸光光度法により算出したメフェナム酸導入率は、17.5%であった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1)Boc-アミノプロパノール-ジクロフェナクの合成
Boc-アミノプロパノール135.8mg (0.775mmol) をジクロロメタン1mLに溶解し、ジクロフェナク229.6mg (0.775mmol)(和光純薬工業株式会社製)のジクロロメタン溶液4mL、DMAP
18.9mg (0.155mmol) のジクロロメタン溶液1mL、DMF 0.5mLを順次加え、氷冷下でWSCI・HCl 191.4mg
(0.998mmol) のジクロロメタン溶液2mLを加えて徐々に室温としながら7時間撹拌した。さらに反応液を氷冷し、追加操作としてジクロフェナク91.9mg
(0.310mmol) のジクロロメタン溶液1mL、DMAP 7.5mg (0.061mmol)、WSCI・HCl 70.9mg (0.370mmol) のジクロロメタン溶液1mLを順次加え徐々に室温としながら撹拌した。この追加操作を計5回行った。酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液で2回、5%重曹水で2回、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標記化合物を280.2mg
(80%) 得た。構造は1H-NMRにて同定した。
1H-NMR (500MHz,CDCl3)δ(ppm)=1.44(9H, s, Boc), 1.85(2H,
quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.16(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2O-),
3.82(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.22(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
4.68(1H, s, NH), 6.54-7.35(8H, m, Aromatic H, NH)
上記で得たBoc-アミノプロパノール-ジクロフェナク1019mgをジクロロメタン2mLに溶解し、氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル8mLを加えて3時間撹拌した。ジエチルエーテル150mLを加えて沈殿させ、沈殿を減圧乾燥した。標記化合物を791mg
(90%) 得た。構造は1H-NMRにて同定した。
3.08(2H, t, -NHCH 2 CH2CH2O-),3.84(2H, s,
Ph-CH 2 -CO), 4.25(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
6.52-7.33(8H, m, Aromatic H, NH)
重量平均分子量80万のヒアルロン酸500mg (1.25mmol/二糖単位)を水56.3mL/ジオキサン56.3mLに溶解させた後、HOSu
(1mmol)/水0.5mL、WSCI・HCl (0.5mmol)/水0.5mL、上記実施例18で得られたアミノプロパノール−ジクロフェナク塩酸塩
(0.5mmol)/(水:ジオキサン=1:1、5mL)を順次加え、一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液7.5mLを加え、3時間40分撹拌した。反応液に50%酢酸215μLを加え中和後、塩化ナトリウム2.5gを加えて撹拌した。エタノール400mlを加えて沈殿させ、沈殿物を85%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで2回洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。541mgの白色固体を得た。分光光度計によるジクロフェナクの導入率は18.2%だった。
1)Boc-アミノプロパノール-エトドラクの合成
Boc-アミノプロパノール178.8mg (1.02mmol)、エトドラク293.8mg (1.02mmol)(和光純薬工業株式会社製)、DMAP
23.8mg (0.20mmol) をジクロロメタン4mLに溶解し、氷冷下でWSCI・HCl 233.8mg (1.22mmol)のジクロロメタン溶液2mLを加えて徐々に室温としながら一昼夜撹拌した。さらに氷冷下でWSCI・HCl
68.8mg (0.36mmol) のジクロロメタン溶液2mLを加えて徐々に室温としながら80分間撹拌した。酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液で2回、5%重曹水で2回、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標記化合物を436.3mg
(96%)得た。構造は1H-NMRにて同定した。
1.37(3H, t, -CH2 CH 3 ), 1.43(9H, s, Boc), 1.79(2H,
quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 3.14(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2O-),
4.10-4.22(2H, m, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
4.63(1H, s, NH), 7.00-7.37(3H, m, Aromatic H), 8.97(1H, s, NH)
上記で得たBoc-アミノプロパノール-エトドラク421.5mg (0.948mmol) をジクロロメタン1mLに溶解し、氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル3mLを加えて3時間撹拌した。ジエチルエーテル、ヘキサンを加えて沈殿させ、沈殿を減圧乾燥した。沈殿をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標記化合物を197.6mg
(55%)得た。構造は1H-NMRにて同定した。
1.35(3H, t, -CH2 CH 3 ), 1.92-2.17(4H, m, -CH 2 CH3,
-NHCH2 CH 2 CH2O-), 4.12(1H, quant, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
4.20(1H, quant, -NHCH2CH2 CH 2 O-), 6.99-7.35(3H,
m, Aromatic H), 8.99(1H, s, NH)
重量平均分子量80万のヒアルロン酸114mg (0.285mmol/二糖単位)を水12.8mL/ジオキサン12.8mLに溶解させた後、HOSu
(0.228mmol)/水0.1mL、WSCI・HCl (0.114mmol)/水0.1mL、実施例20で得られたアミノプロパノール−エトドラク塩酸塩
(0.114mmol)/(水:ジオキサン=1:1、2mL)を順次加え、一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液1.71mLを加え、4時間半撹拌した。反応液に50%酢酸49μLを加え中和後、塩化ナトリウム456mgを加えて撹拌した。エタノール110mlを加えて沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで2回洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。111mgの白色固体を得た。HPLCによるエトドラクの導入率は14.4%だった。
1)Boc-アミノプロパノール-アクタリットの合成
参考例1で得られたBoc-アミノプロパノール123.1mg (0.703mmol)、をジクロロメタン2mLに溶解し、アクタリット136.0mg
(0.704mmol) のDMF溶液(1mL)を加え、氷冷下でDMAP 17.1mg (0.140mmol)、WSCI・HCl 175.4mg
(0.915mmol) を順次加えて徐々に室温としながら一昼夜撹拌した。酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、5%重曹水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標記化合物を203.1mg
(83%) 得た。構造は1H-NMRにて同定した。
quant, -NHCH2 CH 2 CH2O-), 2.18(3H, s,
NAc), 3.14(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2O-),
3.59(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.15(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
4.66(1H, s, NH), 7.13(1H, s, NH), 7.23(2H, d, Aromatic H), 7.46(2H, d, Aromatic
H)
p-アミノフェニル酢酸(和光純薬工業株式会社製)(1.02mmol)をジクロロメタン−メタノール−水(1:3:1、50ml)に溶解し、氷冷下で無水酢酸(2.12mmol)を加えて徐々に室温としながら一昼夜撹拌した。溶媒を減圧留去し、標記化合物(196.4mg、収率99%)を得た。構造は1H-NMRにて同定した。
1H-NMR (500MHz,CD3OD) d(ppm)=2.11(3H, s, Ac), 3.55(2H, s,
Ph-CH 2 -), 7.21-7.49 (4H, m, Aromatic H)
上記で得たBoc-アミノプロパノール-アクタリット201.3mg (0.574mmol) をジクロロメタン2mLに溶解し、氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル3mLを加えて3時間撹拌した。ジエチルエーテルを加えて沈殿させ、沈殿をジエチルエーテルで2回洗浄後、減圧乾燥し、標記化合物を161.3mg
(98%) 得た。構造は1H-NMRにて同定した。
2.11(3H, s, NAc), 2.94(2H, t, -NHCH 2 CH2CH2O-),
3.63(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.19(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
7.22-7.51(4H, m, Aromatic H)
重量平均分子量80万のヒアルロン酸100mg (0.25mmol/二糖単位)を水11.25mL/ジオキサン11.25mLに溶解させた後、HOSu
(0.2mmol)/水0.1mL、WSCI・HCl (0.1mmol)/水0.1mL、実施例22で得られたアミノプロパノール−アクタリト塩酸塩
(0.1mmol)/(水:ジオキサン=1:1、2mL)を順次加え、一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液1.5mLを加え、3時間撹拌した。反応液に50%酢酸43μLを加え中和後、塩化ナトリウム400mgを加えて撹拌した。エタノール100mlを加えて沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。97mgの白色固体を得た。HPLCによるアクタリトの導入率は13.2%だった。
重量平均分子量90万のヒアルロン酸ナトリウム200mg (0.5mmol/二糖単位) を水23mL/ジオキサン23mLに溶解させた後、HOSu水溶液0.3mmol/2mL、WSCl・HCl水溶液0.15mmol/2mL、実施例1で得られたアミノプロパノール−ケトプロフェン塩酸塩水溶液1.5mmol/2mLを順次加え、一昼夜攪拌した。反応液を11.5mL採取し、塩化ナトリウム100mgを加え攪拌した。エタノール50mLを加え沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで2回洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。35mgの白色個体を得た。HPLCによるケトプロフェンの導入率は7.2%であった。
得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「C」であった。
セリノール (10.1mmol) (Aldrich Chem. Co.製)を水−ジオキサン (1:1、20ml) に溶解し、氷冷下でBoc2O
(10.8mmol) のジオキサン溶液 (15ml) を加え、室温に戻して一昼夜撹拌した。溶媒を減圧留去した。残渣をヘキサンにて洗浄後減圧乾燥し、標記化合物
(1847mg、収率95%) を得た。構造は1H-NMRにて同定した。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ(ppm) = 1.44 (9H, s, Boc),
3.57-3.58 (5H, m, Serinol)
1) Boc−セリノール−ケトプロフェンの合成
ケトプロフェン (1.11mmol) (東京化成工業株式会社製)をジクロロメタン (3ml) に溶解し、トリエチルアミン (1.11mmol)、塩化ジメチルホスフィノチオイル
(Mpt-Cl) (1.11mmol) のジクロロメタン溶液 (2ml) を順次加えて25分間撹拌した。さらにトリエチルアミン (0.36mmol) を加えて20分間撹拌した。反応液を氷冷し、トリエチルアミン
(1.11mmol)、DMAP (0.19mmol)、参考例2で得たBoc−セリノール (0.50mmol) を順次加え、室温に戻して一昼夜撹拌した。反応液を再び氷冷し、25%アンモニア水
(2ml)、ジオキサン (10ml) を順次加えて20分間撹拌した。反応液を5mlに濃縮し、酢酸エチルを加えた。水、5%クエン酸水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次、分液洗浄し、硫酸ナトリウムにて脱水乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
(ヘキサン:酢酸エチル=2:1、0.5%トリエチルアミン) にて精製し、標記化合物 (287.3mg、収率87%) を得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
1.51-1.53 (6H, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.76-3.81 (2H, m, -OCOCH(CH3)-),
3.96-4.11 (4H, m, -CH 2 CH(NHBoc)CH 2 -), 4.61
(1H, btd, -CH2 CH(NHBoc)CH2-), 7.40-7.80 (18H, m,
Aromatic)
Boc−セリノール−ケトプロフェン (0.428mmol) をジクロロメタン (1ml) に溶解し、氷冷下で4N塩酸/酢酸エチル (4ml) を加え、その後徐々に室温として2時間撹拌した。Boc−セリノール−ケトプロフェンの消失をTLCで確認した後、ジエチルエーテル、ヘキサンを加え、析出した沈殿を遠心分離した。得られた沈殿を減圧乾燥し、標記化合物
(243.6mg、qu.) を得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
3.79 (1H, m, -CH2 CH(NHBoc)CH2-), 4.00-4.53 (6H, m,
Serinol, Ketoprofen), 7.31-7.80 (18H, m, Aromatic)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸 (100mg)0.25mmol/二糖単位を水−ジオキサン (1:1、22.5ml) に溶解し、2mol/L HOSu
(0.1ml)、1mol/L WSCI・HCl (0.1ml)、実施例25で得られたセリノール−ケトプロフェン塩酸塩 (0.10mmol) のジオキサン溶液
(2ml) を加えて一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液 (1.5ml) を加えて4時間撹拌した。50%酢酸水溶液 (43μl) を加えて中和し、塩化ナトリウム
(0.4g) を加えて撹拌した。エタノール (100ml) を加えて撹拌し、生じた沈殿を遠心分離した。得られた沈殿を80%エタノール水溶液、エタノール、ジエチルエーテルにて各2回順次洗浄した。減圧乾燥し、標記化合物
(92.3mg) を得た。HPLCによるケトプロフェンの導入率は11.2%であった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1) Boc−アミノ−1,5−ペンタンジオール−ケトプロフェンの合成
Boc−アミノ−1,5−ペンタンジオール (Boc-NHCH(CH2OH)CH2CH2CH2OH、Aldrich
Chem. Co.製) (1.98mmol) をジクロロメタン (2ml) に溶解し、ケトプロフェン (3.96mmol) (東京化成工業株式会社製)のジクロロメタン溶液
(4ml)、DMAP (0.791mmol) のジクロロメタン溶液 (1ml) を順次加え撹拌した。反応液を氷冷し、WSCI・HCl (4.93mmol) のジクロロメタン溶液
(5ml) を加えて徐々に室温としながら一昼夜撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸ナトリウムにて脱水乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
(ヘキサン:酢酸エチル=5:2、0.5%トリエチルアミン) にて精製し、標記化合物 (1.361g、収率99%) を得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
1.51-1.55 (6H, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.75-4.55 (8H, m,
Ketoprofen, 2-amino-1,5-pentanediol), 7.40-7.80 (18H, m, Aromatic)
上記で得たBoc−アミノ−1,5−ペンタンジオール−ケトプロフェン (1.95mmol) をジクロロメタン (1ml) に溶解し、氷冷下で4N塩酸/酢酸エチル
(4ml) を加え、その後徐々に室温として3時間撹拌した。反応液にヘキサンを加え、析出した白色沈殿を遠心分離した。得られた沈殿を減圧乾燥し、標記化合物
(1.20g、収率98%) を得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
1.51 (3H, d, -OCOCH(CH 3 )-), 3.47 (1H, bd,
2-amino-1,5-pentanediol), 3.44-4.48 (6H, m, Ketoprofen, 2-amino-1,5-pentanediol),
7.33-7.84 (18H, m, Aromatic)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸 (137mg) 0.34mmol/二糖単位を水−ジオキサン (1:1、30.8ml) に溶解させた後、2mol/L
HOSu (0.137ml)、1mol/L WSCI・HCl (0.137ml)、実施例27で得られた2-アミノ−1,5−ペンタンジオール−ケトプロフェン塩酸塩
(0.137mmol) の水−ジオキサン (1:1) 溶液 (4ml) を順次加えて一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液 (2.1ml) を加えて5時間撹拌した。50%酢酸水溶液
(59μl) を加えて中和後、塩化ナトリウム (0.548g) を加えて撹拌した。エタノール (140ml) を加えて撹拌し、生じた沈殿を遠心分離した。
得られた沈殿を80%エタノール水溶液、エタノール、ジエチルエーテルにて洗浄した。減圧乾燥し、標記化合物 (135.1mg) を得た。HPLCによるケトプロフェンの導入率は18.5%であった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
1) Boc−アミノ−1, 2−プロパンジオール−ケトプロフェンの合成
Boc−アミノ−1, 2−プロパンジオール (Boc-NHCH2CH(OH)CH2OH、Aldrich
Chem. Co.製) (2.05mmol) をジクロロメタン (2ml) に溶解し、ケトプロフェン (4.11mmol)(東京化成工業株式会社製)のジクロロメタン溶液
(4ml)、DMAP (0.803mmol) のジクロロメタン溶液 (1ml) を順次加え撹拌した。反応液を氷冷し、WSCI・HCl (4.94mmol) のジクロロメタン溶液
(5ml) を加えて徐々に室温としながら一昼夜撹拌した。反応液を氷冷し、WSCI・HCl (1.24mmol) のジクロロメタン溶液 (1ml) を加えて室温にて1時間、35℃にて2時間撹拌した。酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄した。硫酸ナトリウムにて脱水乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
(ヘキサン:酢酸エチル=2:1、0.5%トリエチルアミン) にて精製し、標記化合物 (1.175g、収率87%) を得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
1.42-1.53 (6H, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.10-3.30 (2H, m, BocNHCH 2 -),
3.65-3.82 (2H, m, -OCOCH(CH3)-), 3.99-4.36 (2H, m, BocNHCH2(CHO-)CH 2 O-),
4.49-4.76 (1H, m, BocNH-), 5.04-5.09 (1H, m, BocNHCH2(CHO-)CH2O-),
7.38-7.80 (18H, m, Aromatic)
上記で得たBoc−アミノ−1, 2−プロパンジオール−ケトプロフェン (1.76mmol) をジクロロメタン (1ml) に溶解し、氷冷下で4N塩酸/酢酸エチル
(4ml) を加え、3時間撹拌した。反応液にヘキサンを加え、析出した白色沈殿を減圧乾燥し、標記化合物 (1.029g、収率97%) を得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1.33-1.49 (6H, m,
-OCOCH(CH 3 )-), 3.02-3.20 (m, 2H, H2NCH 2 (CHO-)CH2O-),
3.56-3.82 (1H, m, -OCOCH(CH3)-), 3.90-4.15 (2H, m, H2NCH2(CHO-)CH 2 O-,
-OCOCH(CH3)-), 4.18-4.50 (1H, m, H2NCH2CH(O-)CH 2 O-),
5.35-5.37 (1H, m, H2NCH2 CH(O-)CH2O-),
7.30-7.80 (18H, m, Aromatic)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸 (200mg)0.5mmol/二糖単位を水−ジオキサン (1:1、45ml) に溶解し、2mol/L HOSu
(0.25ml)、1mol/L WSCI (0.25ml)、実施例29で得られた3−アミノ−1, 2−プロパンジオール−ケトプロフェン塩酸塩
(0.20mmol) の水−ジオキサン (1:1) 溶液 (4ml) を順次加えて一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液 (3ml) を加えて4時間撹拌した。50%酢酸水溶液
(86μl) を加えて中和し、塩化ナトリウム (0.8g) を加えて撹拌した。エタノール (200ml) を加えて撹拌し、生じた沈殿を遠心分離した。得られた沈殿を80%エタノール水溶液、エタノール、ジエチルエーテルにて洗浄した。沈殿を減圧乾燥し、標記化合物
(217.4mg) を得た。HPLCによるケトプロフェンの導入率は40.3%であった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(10.1mmol)を水−ジオキサン(1:2、30ml)に溶解し、Boc2O(10.8mmol)の水−ジオキサン溶液(1:9、10ml)を加え、室温で45分間、40℃で70分間撹拌した。Boc2O(5.41mmol)のジオキサン溶液(3ml)を加え徐々に室温としながら一昼夜撹拌した。溶媒を減圧留去した。残渣をヘキサンにて洗浄後減圧乾燥し、標記化合物(2.21g、収率99%)を得た。構造は1H-NMRにて同定した。
1H-NMR (500MHz,CD3OD)d(ppm)=1.44(9H,s,Boc),3.68(6H,s,-C(CH 2 OH)3)
1) Boc−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ケトプロフェンの合成
ケトプロフェン419mg (1.65mmol) (東京化成工業株式会社製)をジクロロメタン3mLを溶解し、氷冷下でトリエチルアミン230μL
(1.65mmol)、Mpt-Cl 213mg (1.65mmol)/ジクロロメタン2mLを順次加え、10分間攪拌した。トリエチルアミン230μL
(1.65mmol)、DMAP 33mg (0.27mmol)、参考例3で得たBoc−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (Boc-NHC(CH2OH)3)
110mg (0.5mmol) を順次加え、室温に戻し、一昼夜攪拌した。アンモニア水2mLを加え、ジクロロメタンとアンモニア水が均一になるまでジオキサンを加え40分間攪拌した。ジクロロメタンを減圧留去し、酢酸エチルを加え、5%クエン酸で2回、水、5%重曹で2回、水、飽和食塩水で順次、分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後、酢酸エチルを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー
(ジクロロメタン:メタノール=100:1→75:1) に精製した。標記化合物を定量的に467mg得た。構造は1H-NMR (CDCl3)
にて同定し、Boc−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン1分子に対しケトプロフェン3分子が導入されていることを確認した。
1.44-1.54 (3H×3, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.76 (1H×3, q, -OCOCH(CH3)-),
4.04-4.27 (6H, m, -NHC(CH 2 O-KP)3), 4.81 (1H, br, -NH-),
7.37-7.85 (9H×3, m, Aromatic H)
上記で得たBoc−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ケトプロフェン453mg (0.49mmol) をジクロロメタン1mL溶解に氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル3mLを加え、氷冷下で30分間、室温で1時間30分攪拌した。Boc−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ケトプロフェンの消失をTLCにて確認した後、ジエチルエーテル、ヘキサンを加え、デカンテーションした。その後、減圧乾燥し標記物質を収量411mg
(97%) で得た。構造は1H-NMR (CDCl3) にて同定した。
-OCOCH(CH 3 )-), 3.96 (1H×3, q, -OCOCH(CH3)-),
4.09-4.46 (6H, m, -NHC(CH 2 O-KP)3), 7.25-7.80
(9H×3, m, Aromatic H), 9.31 (br, H 3 N + CH2-)
1) Boc−グリシン−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ケトプロフェンの合成
Boc−グリシン133mg (0.76mmol) をクロロホルム1mLに溶解し、氷冷下でトリエチルアミン106μL (0.76mmol)、Mpt-Cl
98mg (0.76mmol)/クロロホルム1mLを加え10分間攪拌した。その後、実施例31で得られたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ケトプロフェン塩酸塩433mg
(0.5mmol)/トリエチルアミン70μL (0.5mmol)/クロロホルム2mL、トリエチルアミン106μL (0.76mmol) を4回に分け徐々に加えた。室温で1時間攪拌後、更に氷冷下でトリエチルアミン106μL
(0.76mmol) を加え、Boc−グリシン131mg (0.75mmol) をクロロホルム1mLで溶解し、氷冷下でトリエチルアミン105μL
(0.75mmol)、Mpt-Cl 95mg (0.75mmol)/クロロホルム1mLを加え活性化したBoc−グリシンの混合酸無水物を加え、室温で一昼夜攪拌した。酢酸エチルを加え、5%クエン酸で2回、水、5%重曹で2回、水、飽和食塩水で順次、分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後、酢酸エチルを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー
(ヘキサン:酢酸エチル=3:2) に精製した。標記化合物を411mg (収率55%) 得た。構造は1H-NMR (CDCl3)
にて同定した。
1.45-1.52 (3H×3, m, -OCOCH(CH 3 )-), 3.56 (2H, br, -NHCH 2 CO-),
3.76 (1H×3, q, -OCOCH(CH3)-), 3.98-4.28 (6H, m, -NHC(CH 2 O-KP)3),
5.51 (1H, br, -NHCH2CO-), 6.63 (1H, br, -NHC(CH2O-KP)3),
7.34-7.83 (9H×3, m, Aromatic H)
上記で得たBoc−グリシン−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ケトプロフェン361mg (0.37mmol) に氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル2mLを加え、室温で2時間攪拌した。Boc−グリシン−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ケトプロフェンの消失をTLCにて確認した後、ジエチルエーテル、ヘキサンを加え、デカンテーションした。その後、減圧乾燥し標記物質を定量的に収量336mgで得た。構造は1H-NMR
(CDCl3) にて同定した。
3.68-4.24 (11H, m, 2H; -NHCH 2 CO-, 1H×3; -OCOCH(CH3)-,
6H; -NHC(CH 2 O-KP)3), 7.27-7.82 (9H×3, m, Aromatic
H), 8.31 (br, H 3 N + CH2-)
重量平均分子量90万のヒアルロン酸ナトリウム100mg (0.25mmol/二糖単位) を水11.5mL/ジオキサン11.5mLに溶解させた後、2mol/L
HOSu/水0.1mL、1mol/L WSCI・HCl/水0.1mL、実施例32で得られたグリシン−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−ケトプロフェン塩酸塩93mg
(0.1mmol)/ジオキサン3mLを順次加え、一昼夜攪拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液1.5mLを加え、4時間45分攪拌した。反応液に50%酢酸43μLを加え中和後、塩化ナトリウム400mgを加え攪拌した。エタノール100mLを加え沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。95mgの白色固体を得た。HPLCによるケトプロフェンの導入率は39%だった。得られた物質を濃度1.0重量%となるようにPBSに溶解し、溶液を作製した。当該溶液は無色透明な液であり、フィルター通過性試験は「A」であった。
3−ブロモプロピルアミン臭化水素酸塩1.222g(5.58mmol)をジクロロメタン20mLに溶解し、氷冷下でトリエチルアミン0.778mL(5.58mmol)を加え、さらにBoc2O
1.214g (5.56mmol) のジクロロメタン溶液50mLを10分間で滴下し撹拌した。室温で50分間撹拌した後、酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を減圧留去した。標記化合物1.304(98%)を得た。構造は1H-NMRにて同定した。
quant, -NHCH2 CH 2 CH2Br), 3.28(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2Br),
3.44(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 Br), 4.64(1H,
s, NH)
(1)Boc-アミノプロパノール-ジクロフェナク
ジクロフェナクナトリウム1.476g (4.64mmol) をDMF3mLに溶解し、氷冷下で参考例6で得られたBoc−アミノプロピルブロマイド1.105g
(4.64mmol) のDMF溶液7mLを滴下した。室温で一晩撹拌後、60℃で10時間撹拌した。室温で一晩撹拌後、60℃で9時間、さらに室温で3日間撹拌した。酢酸エチルを加え、5%重曹水、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=7:1、0.5%トリエチルアミン)で精製し、標記化合物を1.702g
(81%) 得た。
上記で得たBoc-アミノプロパノール-ジクロフェナク1019mg (2.25mmol) をジクロロメタン2mLに溶解し、氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル8mLを加えて3時間撹拌した。ジエチルエーテル150mLを加えて沈殿させ、沈殿を減圧乾燥した。標記化合物を791mg
(90%) 得た。構造は1H-NMRにて同定した。
3.08(2H, t, -NHCH 2 CH2CH2O-),3.84(2H, s,
Ph-CH 2 -CO), 4.25(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 O-),
6.52-7.33(8H, m, Aromatic H, NH)
重量平均分子量80万のヒアルロン酸500mg (1.25mmol/二糖単位)を水57.5mL/ジオキサン57.5mLに溶解させた後、0.33M・HOSu/水0.75mL、0.16M・WSCI・HCl/水0.75mL、上記実施例34で得られた0.16Mアミノプロパノール−ジクロフェナク塩酸塩/水0.75mLを順次加え、一昼夜撹拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム375mg/水3mLを加え、4時間撹拌した。反応液に酢酸108μLを加え中和後、塩化ナトリウム3.0gを加えて撹拌した。エタノール200mlを加えて沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで2回洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。505mgの白色固体を得た。分光光度計によるジクロフェナクの導入率は4.3%だった。
重量平均分子量80万のヒアルロン酸500mg (1.25mmol/二糖単位)を水57.5mL/ジオキサン57.5mLに溶解させた後、0.5M・HOSu/(水:ジオキサン=1:1)1.0mL、0.25M・WSCI・HCl/(水:ジオキサン=1:1)1.0mL、上記実施例34で得られた0.25Mアミノプロパノール−ジクロフェナク塩酸塩/(水:ジオキサン=1:1)1.0mLを順次加え、一昼夜撹拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム380mg/水5mLを加え、4時間撹拌した。反応液に酢酸108μLを加え中和後、塩化ナトリウム3.0gを加えて撹拌した。エタノール200mlを加えて沈殿させ、沈殿物を80%エタノールで3回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで2回洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。503mgの白色固体を得た。分光光度計によるジクロフェナクの導入率は9.7%だった。
平均分子量65kDaのヒアルロン酸200.8mg (0.50mmol/二糖単位)を水22.5mL/ジオキサン22.5mLに溶解させた後、1M・HOSu
0.4mL、0.5M・WSCI・HCl 0.4mL、上記実施例34で得られた0.1Mアミノプロパノール−ジクロフェナク塩酸塩 /(水:ジオキサン=1:1)2.0mLを順次加え、一昼夜撹拌した。反応液に5%炭酸水素ナトリウム水溶液3mLを加え、3時間撹拌した。反応液に50%酢酸86μLを加え中和後、塩化ナトリウム1.0gを加えて撹拌した。エタノール200mlを加えて沈殿させ、沈殿物を85%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。190.5mgの白色固体を得た。分光光度計によるジクロフェナクの導入率は17.1%だった。
3−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩2.155g(10.5mmol)をジクロロメタン20mLに溶解し、氷冷下でトリエチルアミン1.463mL(10.5mmol)を加え、さらにBoc2O
2.299g (10.5mmol) のジクロロメタン溶液5mLを加え撹拌した。室温で90分間撹拌した後、酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を減圧留去した。標記化合物2.287g(97%)を得た。構造は1H-NMRにて同定した。
3.45-3.55(4H, m, -NHCH 2 CH 2 Br), 4.93(1H, s, NH)
(1)Boc-アミノエタノール-ジクロフェナク
参考例5で得られたBoc−アミノエチルブロマイド2.287g (10.2mmol) のDMF溶液 5mLを氷冷し、ジクロフェナクナトリウム3.255g
(10.2mmol) のDMF溶液 6mLを加え、室温で一晩撹拌した。60℃で11時間撹拌し、室温で一晩撹拌した。酢酸エチルを加え、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン:酢酸エチル=20:1、0.5%トリエチルアミン)で精製し、標記化合物を2.675g
(60%) 得た。構造は1H-NMRにて同定した。
-NHCH 2 CH2O-), 3.83(2H, s, Ph-CH 2 -CO),
4.21(2H, t, -NHCH2 CH 2 O-), 4.72(1H, s, NH),
6.54-7.47(8H, m, Aromatic H, NH)
上記で得られたBoc-アミノエタノール-ジクロフェナク2.108g (4.80mmol) をジクロロメタン5mLに溶解し、氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル20mLを加えて2.5時間撹拌した。ジエチルエーテル、ヘキサンを加えて沈殿させ、沈殿を減圧乾燥した。標記化合物を1.775g
(98%) 得た。構造は1H-NMRにて同定した。
3.94(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.37(2H, t, NH2CH2 CH 2 O-),
6.47-7.31(8H, m, Aromatic H, NH)
重量平均分子量80万のヒアルロン酸500mg (1.25mmol/二糖単位)を水57.5mL/ジオキサン57.5mLに溶解させた後、2M・HOSu
0.5mL、1M・WSCI・HCl 0.5mL、実施例38で得られたアミノエタノール−ジクロフェナク塩酸塩 188.6mg (0.5mmol) の溶液(水:ジオキサン=1:1)3mLを順次加え、一昼夜撹拌した。5%炭酸水素ナトリウム水溶液7.5mLを加え、4時間撹拌した。反応液に50%酢酸215μLを加え中和後、塩化ナトリウム2.5gを加えて撹拌した。エタノール500mlを加えて沈殿させ、沈殿物を85%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで2回洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。473.7mgの白色固体を得た。分光光度計によるジクロフェナクの導入率は14.7%だった。
(1)Boc-プロピルアミド-ジクロフェナク
N-(2-アミノプロピル)カルバミン酸tert-ブチル 338.4mg (1.94mmol、東京化成工業株式会社製)、ジクロフェナク694.4mg
(2.34mmol) をジクロロメタン3mLに溶解し、氷冷下でDMAP 59.0mg (0.483mmol)、WSCI・HCl 505.3mg
(2.64mmol) を加えて70分間撹拌し、室温としながら90分間撹拌した。酢酸エチルを加え、5%クエン酸水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=2:1)で精製し、標記化合物を835.5g
(95%) 得た。構造は1H-NMRにて同定した。
quant, -NHCH2 CH 2 CH2NHBoc), 3.14(2H, q,
-NHCH2CH2 CH 2 NHBoc), 3.31(2H, q, -NHCH 2 CH2CH2NHBoc),
3.69(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 4.93(1H, s, NH),6.50-7.60(9H, m,
Aromatic H, NH)
上記で得られたBoc-プロピルアミド-ジクロフェナク825.0mg (1.82mmol) のジクロロメタン溶液1mLに氷冷下で4M塩酸/酢酸エチル20mLを加えて2時間撹拌した。ジエチルエーテルを加えて沈殿させ、沈殿を減圧乾燥した。標記化合物を714.5mg
(101%) 得た。構造は1H-NMRにて同定した。
2.99(2H, t, -NHCH2CH2 CH 2 NH2),
3.26(2H, d, -NHCH 2 CH2CH2NH2),
3.71(2H, s, Ph-CH 2 -CO), 6.40-7.49(8H, m, Aromatic H, NH)
重量平均分子量80万のヒアルロン酸200mg (0.5mmol/二糖単位)を水22.5mL/ジオキサン22.5mLに溶解させた後、2M・HOSu 0.2mL、1M・WSCI・HCl
0.2mL、実施例40で得られたジアミノプロパン−ジクロフェナク塩酸塩 78.4mg (0.2mmol) の溶液(水:ジオキサン=1:1)1mLを順次加え、一昼夜撹拌した。5%炭酸水素ナトリウム水溶液3mLを加え、4時間撹拌した。反応液に50%酢酸86μLを加え中和後、塩化ナトリウム1gを加えて撹拌した。エタノール200mlを加えて沈殿させ、沈殿物を85%エタノールで2回、エタノールで2回、ジエチルエーテルで洗浄し、室温にて一晩減圧乾燥した。206.2mgの白色固体を得た。分光光度計によるジクロフェナクの導入率は18.1%だった。
実施例3で得られたアミノプロパノール−ケトプロフェン導入ヒアルロン酸ナトリウム (導入率26.3%) 22mgに総量2.19gとなるように5mMリン酸緩衝生理的食塩水を加え、一晩攪拌し、1%溶液を調製した。溶液を0.45μmフィルターで濾過し、標記溶液とした。この溶液のエンドトキシン含量を日本薬局方掲載の一般試験法であるエンドトキシン試験法(比色法)で測定したところ、エンドトキシン値0.0073EU/Mlであった。
(実施例43)
ラットブラジキニン惹起疼痛モデルに対するアミノプロパノール−ケトプロフェン導入ヒアルロン酸ナトリウムの効果
1) 被験物質の投与
全身麻酔剤として小動物用麻酔器 (TK-4、バイオマシナリー製) に充填したイソフルラン (フォーレン (登録商標)、大日本製薬株式会社製) の吸入麻酔 (濃度3.0%、流量2.0L/min)
を用いた。
PBS、1%のヒアルロン酸ナトリウム溶液 (HA)、PBSにケトプロフェンを溶解した3.7mg/mLのケトプロフェンナトリウム溶液 (KP)、及び、実施例42で調製した1%のアミノプロパノール-ケトプロフェン導入ヒアルロン酸ナトリウムのPBS溶液
(KP-HA) を被験物質として用いた。
ラット (Crj:SD系 (SPF)、雄性、7週齢) をエーテル麻酔下で背位固定し、左後肢膝関節周辺を広くバリカンで剃毛した。関節周囲を70%アルコールで噴霧消毒し、29Gインシュリン用針付きシリンジ
(テルモ製) を用いて上記各被験物質を20μL/jointの用量で左後肢膝関節腔内に投与した。各被験物質群毎5例 (n=5) にて実施した。
各被験物質投与1日後に、無麻酔下にて、ラットを背位固定し、関節周囲を70%アルコールで噴霧消毒した後、29Gインシュリン用針付きシリンジ (テルモ製、注射針の太さは0.33mm)
を用いて、左後肢膝関節腔内に発痛物質であるブラジキニン (BK) とプロスタグランジンE2 (PGE2) の混合溶液を50μL/関節の用量で投与した。なお、この発痛物質溶液は、BK及びPGE2各々終濃度4μg/mL、2μg/mLと成るように調製した。発痛物質投与直後より疼痛反応を肉眼観察した。
発痛物質投与直後より、約2分間、歩行状態を足上げの有無、三足歩行、跛行程度を肉眼で観察し、スコア化した。疼痛スコアは、足上げ:1点加算、跛行あるいは三足歩行:1点加算とし、0〜2点の段階に評価した。なお、評価はブラインド下で実施した。各個体の疼痛反応をスコア化したグラフを図1に示す。
図1において、結果は、平均疼痛スコア±標準偏差によって示される。
結果、PBS投与群と比し、KP-HA>KP>HAの順で疼痛抑制効果が認められた。
ラット1%硝酸銀惹起疼痛モデルに対するアミノプロパノール−ケトプロフェン導入ヒアルロン酸ナトリウムの関節腔内投与による効果
1) 疼痛惹起物質の投与
全身麻酔剤として小動物用麻酔器 (TK-4、バイオマシナリー製) に充填したイソフルラン(フォーレン (登録商標)、大日本製薬株式会社製) の吸入麻酔 (濃度3.0%、流量2.0L/min)
を用いた。
ラット (Crj:SD系 (SPF)、雄性、6週齢) をエーテル麻酔下で背位固定し、左後肢膝関節周辺を広くバリカンで剃毛した。関節周囲を70%アルコールで噴霧消毒し、29Gインシュリン用針付きシリンジ
(テルモ製) を用いて、1%硝酸銀溶液を50μL/関節の用量で左後肢膝関節腔内に投与した。
各々PBSを溶媒とする、1%ヒアルロン酸ナトリウム溶液 (HA) および実施例42で調製した1%アミノプロパノール−ケトプロフェン導入ヒアルロン酸ナトリウム溶液
(KP-HA) を被験物質として作製した。1%硝酸銀溶液投与後24時間に、ラットを5匹ずつ2群に分け、各群に被験物質を投与した。投与方法は、疼痛惹起物質と同様、イソフルランによる吸入麻酔下、関節周囲を70%アルコールで噴霧消毒し、29Gインシュリン用針付きシリンジを用いて40μL/関節の用量で左後肢膝関節腔内に投与した(n=5)。
歩行状態をブラインド下でスコア化した下記疼痛スコア表を用いて、各群の歩行状態を肉眼観察した。結果は図2に示す。
図2において、結果は、平均疼痛スコア±標準偏差によって示される。
スコア0:正常 (ほぼ正常を含む)
1:軽度の跛行
2:重度の跛行
3:三足歩行
図2よりHA投与群、KP-HA投与群共に疼痛スコアは徐々に軽減するが、KP-HA投与群は、HA投与群より疼痛軽減の度合い (疼痛よりの回復度) が速かった。また、荷重負荷率測定では通常疼痛から回復するほど荷重負荷率が高くなるが、図3の結果より、KP-HA投与群はHA投与群より荷重負荷率の値がより短い時間で有意に高くなった。図2と図3の結果におけるKP-HA群とHA群の相関関係は同じであった。
1)被験物質の投与方法
実施例42で得た1%アミノプロパノール−ケトプロフェン導入ヒアルロン酸ナトリウム溶液(KP−HA)、1.42mgのケトプロフェンを1mLのPBSに溶解したケトプロフェン溶液(KP)及び1.41mgのケトプロフェンを1mLの1%
HA溶液に溶解したケトプロフェンとHAの混合溶液(KP+HA)を被験物質として用いた。
Lシリンジにてウサギ膝外側から関節腔内に上記被験物質を各々300μL投与した。
被験物質投与から6時間、12時間、24時間、2日、4日後に剖検を実施した。
ウサギをケタミン全身麻酔下で放血屠殺し、関節液を全量回収した後、分離した膝関節部の関節腔に25G注射針を用いて生理的食塩液2mL注入して関節腔内を洗浄し、この洗浄液も回収した。この洗浄は2回行った。回収した洗浄液を合わせた関節液中のKP量及びHA−KP量を下記手順にて測定した。
関節液(4 ml vol.)に1N HCl (0.2ml) を加えて塩酸酸性を確認した後、溶液と同体積の酢酸エチルを加えて激しく撹拌し、上部の有機層を回収した。この抽出操作を計3回行った。回収した有機層にアセトニトリル溶液を添加してアセトニトリル溶液とし、HPLCを用いて、遊離KP量を測定した。(関節液中の遊離型KP量)
上記(2)の関節液を回収した後の膝関節から滑膜組織を分離、採取した。採取した滑膜組織は生理的食塩液100mLで念入りに洗浄し、付着する関節液を完全に除去した。滑膜組織は膝蓋骨を取り除いた後、チューブに入れ、10mM酢酸ナトリウム溶液
(pH7.5) で2mg/mL濃度に調製したプロテアーゼK(Lot No.102K8633、SIGMA製)5mLを添加し、適宜ボルテックスで攪拌しながら、55℃で41時間酵素消化を行った。消化後、100℃、5分間で酵素を失活させ、得られた消化液中のKP量を下記手順にて測定した。
HClを加えて撹拌し、塩酸酸性を確認した後、溶液と同体積の酢酸エチルを加えて激しく撹拌し、上部有機層を回収した。この抽出操作を計3回行った。回収した有機層にアセトニトリル溶液を添加してアセトニトリル溶液とし、HPLCを用いて、遊離KP量を測定した。
関節液中、滑膜組織消化液中の継時的なKP及びHA−KPの残存率を算出した。(表1、図4)
関節で起こる疼痛は無神経組織である軟骨ではなく、滑膜組織を介し発生すると推測されており、また、NSAIDsを関節腔内に投与すると、NSAIDsは滑膜へ速やかに移行し、滑膜に移行して作用を示すと考えられている。その為、滑膜中のNSAIDs濃度の維持は疼痛抑制の持続的効果や徐放的効果に大きく関与すると考られる。上記表より、KP(単剤)の投与では、6時間後には滑膜の通過や代謝により滑膜組織から消失しているが、KP−HA(結合体)を投与した場合には、滑膜組織にも持続的にKPが保持されており、NSAIDsの徐放性製剤として、より有効であることが示唆される。
上記実施例44の実験手順に準じ実験を行い、下記被験物質関する関節腔内投与について評価を行った。
被験物質:
(i) 実施例19で得られた1%アミノプロパノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム (DS18.2%) のPBS溶液
(ii) 実施例36で得られた1%アミノプロパノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム (DS9.7%) のPBS溶液
(iii) 実施例35で得られた1%アミノプロパノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム (DS4.3%) のPBS溶液
(iv) PBS
結果より、被験物質であるDS18.2%、DS9.7%及びDS4.3%のジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム誘導体はいずれも、鎮痛効果を示した。中でもDS18.2%及びDS9.7%の被験物質はPBSと比して劇的に鎮痛効果を示した。
また、鎮痛効果は、ジクロフェナクの導入率(DS)の増加に依存的に向上した。
上記実施例44に準じ実験を行い、被験物質の投与方法に関しては下記被験物質の経口投与を行い評価した。但し、被験物質の投与はラット用経口ゾンデ(フチガミ器械店)を用いて1mL/headの用量で経口投与した。
(i) 1% ジクロフェナクナトリウム懸濁液(10%アラビアゴム)
(ii) 0.02% ジクロフェナクナトリウム懸濁液(10%アラビアゴム)
なお、(i)(高用量群)はジクロフェナクナトリウムとして50mg/kgの投与に値してており、(ii)(低用量群)はジクロフェナクナトリウムとして、ほぼ臨床投与量と同量である1mg/kgの投与に値している。
Na(p.o.) 50mg/kg」は上記(i)(高用量群)に、「Diclofenac Na(p.o.) 1mg/kg」は上記(ii)(低用量群)に対応する。なお、図6には、参考として上記実施例46で測定されたジクロフェナク導入ヒアルロン酸誘導体
(DS18.2%) 及びPBSの関節腔内注入による疼痛スコアの結果もあわせて、それぞれ「Diclofenac-HA」、「PBS」として、記載した。
一方、ジクロフェナク導入ヒアルロン酸誘導体の関節腔内投与では、投与後から疼痛抑制が見られており、また、ジクロフェナクナトリウムの高用量群(50mg/kg)の経口投与の様な副作用と思われる症状も観察されず、高い有用性が確認された。
上記実施例44に準じ実験を行い、被験物質の投与方法に関しては下記被験物質に関する関節腔内投与を行い評価した。
(i) 0.1%ジクロフェナク溶液
(ii) 0.1%ジクロフェナク/1%ヒアルロン酸混合溶液
(iii) PBS
Naは上記(i)0.1%ジクロフェナク溶液に、「0.1%Diclo+HA」は上記(ii)0.1%ジクロフェナク/1%ヒアルロン酸混合溶液に対応する。なお、図7には、参考として上記実施例46で測定されたジクロフェナク導入ヒアルロン酸誘導体(DS18.2%)の結果もあわせて、「Dic-HA(結合体)」として記載した。
結果より、ジクロフェナク単剤及びジクロフェナクとヒアルロン酸との混合物は、対照群であるPBSと比べ有意な効果は示さなかった。
上記実施例44に準じ実施を行い、下記被験物質に関する関節腔内投与について評価した。
(i) 実施例37で得られた1%アミノプロパノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸(65kDa)ナトリウムのPBS溶液
(ii) 実施例41で得られた1%ジアミノプロパン−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウムのPBS溶液
(iii) 実施例39で得られた1%アミノエタノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウムのPBS溶液
(iv) PBS
これらよりジクロフェナクとの結合様式あるいは、ヒアルロン酸の分子量に鎮痛効果は依存することが明らかになった。
Chemiluminescent COX Inhibitor Screening Assay kit (Cayman)(羊由来のCOX-2によるPeroxidase活性を指標に阻害剤をスクリーニングするキット)を用いて下記被験物質についてCOX-2阻害作用を評価した。
(i) 実施例19で得られたアミノプロパノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム水溶液(Dic-C3-HA)(200μg/ml HA相当,80μM Diclofenac相当)
(ii) 実施例39と同様の手順で得られたアミノエタノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム水溶液(Dic-C2-HA、DS18.5%)(200μg/ml
HA相当,80μM Diclofenac相当)
(iii) 80μM ジクロフェナクナトリウム水溶液
(iv) 200μg/ml ヒアルロン酸ナトリウム(HA)水溶液
にてCOX-2阻害活性を測定 (無処理群n=6、被験物質群n=3) した。結果は、無処理群のCOX-2酵素活性を100%とし、各処理群の酵素活性値を下記式により相対%で表記した。結果は図9(a)及び図9(b)に示す。図9(a)において、「Diclofenac
Na」は上記ジクロフェナクナトリウム水溶液に、「Dic-C3-HA」は上記アミノプロパノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に、「Dic-C2-HA」は上記アミノエタノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に対応する。図9(b)において、「HA」は上記200μg/mlヒアルロン酸ナトリウム水溶液に対応する。
酵素活性値(%)=被験物質処理群÷無処理群×100
vivoでのジクロフェナク導入ヒアルロン酸誘導体の効果は、ジクロフェナク導入ヒアルロン酸誘導体そのものの作用ではなく、HAより遊離されるジクロフェナクに起因する可能性が示唆された。
in vivo(実施例46,47)でのジクロフェナク導入ヒアルロン酸誘導体の効果が、ジクロフェナク単体よりも優れている理由の一つとして、HAが、その細胞への親和性により、より多くの量のジクロフェナクを標的細胞内のCOX-2まで運ぶためであることが考えられる。
1)アジュバントの惹起
Mycobacterium butyricum (Lot No.2115687、Difco) 6mg/mLをオートクレーブで121℃、20分熱処理した後、29Gインシュリン用針付きシリンジ(テルモ)を用いて50μL/jointの用量で右後肢足蹠皮下に注射した。
被験物質:
(i) 実施例19で得られた1%アミノプロパノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸(DS18%)ナトリウムのPBS溶液(Diclofenac-HA)
(ii) PBS
上記被験物質はアジュバント注射時と同様に無麻酔下で29Gインシュリン用針付きシリンジ(テルモ)を用いて50μL/jointの用量で両足の脛骨−足根骨関節腔内にアジュバント注射直後、注射後1、2、3週に投与した(計4回)(n=14)。
アジュバント惹起前、惹起後3、5、7、10、12、14、21、28日に評価。
・体重
・両後肢足容積(ラット・マウス後肢足蹠浮腫容積測定装置(TK-101CMP、(有)ユニコム社製))
アジュバント投与足及び非投与足の膨張率を下記式により測定した。アジュバント投与足の膨張率の結果は図10(a)に、アジュバント非投与足の膨張率の結果は図10(b)に示す。図10において、「Diclofenac-Ha」は上記(i)1%アミノプロパノール−ジクロフェナク導入ヒアルロン酸(DS18%)ナトリウムのPBS溶液を、「normal」はアジュバント及び被験物質非投与群を示す。図10において、Dは危険率0.05<p<0.1でPBSに対して有意差があり、*は危険率0.01<p<0.05でPBSに対して有意差があり、**は危険率p<0.01でPBSに対して有意差があることを示す。
/アジュバント惹起前容積×100
なお、当該ラットアジュバント関節炎(AIA)モデルは自己免疫疾患による関節炎であるリウマチ性関節炎のモデルとして一般的に用いられおり、上記結果より本発明物質はリウマチ性関節炎への効果も期待される。
本出願は、2004年1月7日出願の日本特許出願 (特願2004-2478) に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
Claims (32)
- ヒアルロン酸に非ステロイド性抗炎症化合物が共有結合にて結合しているヒアルロン酸誘導体であって、非ステロイド性抗炎症化合物が導入されているヒアルロン酸構成二糖単位あたりの構造が、下記式(1)
Y−CO−NH−R1−(O−R2)n (1)
(式中、Y−CO−はヒアルロン酸の構成二糖単位1残基を示し、
R2はZ−CO−で示される非ステロイド性抗炎症化合物の残基又は水素原子を示し(但し、全てが水素原子である場合を除く)、
−HN−R1−(O−)nはn個のヒドロキシル基を有するH2N−R1−(OH)nで示されるスペーサー化合物のスペーサー残基を示し、
R1 は炭素数2〜12の直鎖あるいは分岐を有するアルキル基を示し、
−CO−NH−はヒアルロン酸の構成糖であるグルクロン酸のカルボキシル基とスペーサー化合物が有するアミノ基とのアミド結合を示し、
−O−CO−はスペーサー化合物が有する水酸基と非ステロイド性抗炎症化合物が有するカルボキシル基とのエステル結合を示す。
nは1〜3の整数を示す。)
で示されるヒアルロン酸誘導体。 - 式(7)において、R8が水素原子であり、X1及びX2が塩素原子である請求項3に
記載のヒアルロン酸誘導体。 - 非ステロイド性抗炎症化合物が、サリチル酸、アスピリン、メフェナム酸、トルフェナム酸、フルフェナム酸、ジクロフェナク、スリンダク、フェンブフェン、インドメタシン、アセメタシン、アンフェナク、エトドラク、フェルビナク、イブプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、プラノプロフェン、フェノプロフェン、チアプロフェン酸、オキサプロジン、ロキソプロフェン、アルミノプロフェン、ザルトプロフェン、トルメチン、ジフルニサル及びアクタリトからなる群から選ばれる化合物である、請求項1に記載のヒアルロン酸誘導体。
- ヒアルロン酸の重量平均分子量が、500,000〜3,000,000である請求項1から5のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
- 上記式(1)における、n個のヒドロキシル基を有するH2N−R1−(OH)nで示されるスペーサー化合物が、炭素数2〜12のアミノアルキルアルコールである請求項1から6のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
- 上記式(1)における、n個のヒドロキシル基を有するH2N−R1−(OH)nで示されるスペーサー化合物が、アミノプロピルアルコール、アミノエチルアルコール、セリノール、2−アミノ−1,5−ペンタンジオール、3−アミノ−1,2−プロパンジオール、及びトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンからなる群から選ばれる化合物である、請求項1から6のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
- ヒアルロン酸に非ステロイド性抗炎症化合物が共有結合にて結合して導入されているヒアルロン酸誘導体における非ステロイド性抗炎症化合物の導入率が、ヒアルロン酸の繰り返し二糖単位あたり0.1〜80モル%である請求項1から8のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
- 非ステロイド性抗炎症化合物の導入率が、ヒアルロン酸の繰り返し二糖単位あたり5〜50モル%である請求項9に記載のヒアルロン酸誘導体。
- 上記式(1)におけるR1が、置換基を有していてもよいエチレン基、トリメチレン基又はプロピレン基である請求項1から10のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
- ヒアルロン酸と、スペーサー結合非ステロイド性抗炎症化合物を反応させるか、若しくは、スペーサー結合ヒアルロン酸と、非ステロイド性抗炎症化合物を反応させ、ついで該反応液をアルカリ性条件とする工程を含む方法によって得られうる、請求項1から11のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
- 上記ヒアルロン酸誘導体を1.0重量%で水性媒体に溶解して得られる溶液が、24℃の温度条件下、5.0kg/cm2の加圧下で多孔質フィルター(孔径(ポアサイズ)0.45μm、直径25mm)を1分間に2mL以上通過可能であることを特徴とする、請求項1から12のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
- 上記ヒアルロン酸誘導体を1.0重量%で水性媒体に溶解して得られる溶液が、24℃の温度条件下、5.0kg/cm2の加圧下で多孔質フィルター(孔径(ポアサイズ)0.22μm、直径25mm)を1分間に2mL以上通過可能であることを特徴とする、請求項1から12のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
- 請求項1から14のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体が水性媒体に溶解した、注入具により押し出し可能なヒアルロン酸誘導体溶液。
- 水性媒体が、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水及び注射用水から選択される水性媒体である請求項15に記載のヒアルロン酸誘導体溶液。
- 濾過滅菌された請求項16に記載のヒアルロン酸誘導体溶液。
- 請求項1から14のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を有効成分として含有する薬剤。
- 関節症処置剤、抗炎症剤または鎮痛剤である、請求項18に記載の薬剤。
- 非経口投与用である、請求項18又は19に記載の薬剤。
- 局所投与用の注入剤である、請求項20に記載の薬剤。
- 関節投与用の注入剤である、請求項20又は21に記載の薬剤。
- 請求項1から14のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を有効成分として含有し、かつ該ヒアルロン酸誘導体を水性媒体に溶解した溶液からなる、注入具により押し出し可能な薬剤。
- 請求項15から17のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体溶液が、該溶液を押し出すことが可能な注入具に充填されたヒアルロン酸誘導体注入用キット。
- 充填された溶液が請求項18から23のいずれかに記載の薬剤である、請求項24に記載のキット。
- 請求項1から14のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を薬学的に許容されるリン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水または注射用水に溶解した溶液を注射筒に充填し、薬剤押出用プランジャーで摺動可能に密封してなる医療用注射剤キット。
- 下記式(3)
H2N−R1−(O−R 2 )n (3)
(式中、R2はZ−CO−で示される非ステロイド性抗炎症化合物の残基又は水素原子を示し(但し、全てが水素原子である場合を除く)、
H2N−R1−(O−)nはn個のヒドロキシル基を有するH2N−R1−(OH)nで示されるスペーサー化合物のスペーサー残基を示し、R1 は炭素数2〜12の直鎖あるいは分岐を有するアルキル基を示し、−O−CO−はスペーサー化合物が有する水酸基と非ステロイド性抗炎症化合物が有するカルボキシル基とのエステル結合を示す。nは1〜3の整数を示す。)
で示され、
上記n個のヒドロキシル基を有するH 2 N−R 1 −(OH)nで示されるスペーサー化合物が、アミノプロピルアルコール、アミノエチルアルコール、セリノール、2−アミノ−1,5−ペンタンジオール及び3−アミノ−1,2−プロパンジオールからなる群から選ばれる化合物であり、
上記非ステロイド性抗炎症化合物がケトプロフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、アセチルサリチル酸、フェルビナク、フェンブフェン、メフェナム酸、ジクロフェナク及びエトドラクからなる群から選ばれる化合物である、化合物。 - 上記n個のヒドロキシル基を有するH 2 N−R 1 −(OH)nで示されるスペーサー化合物が、アミノプロピルアルコールである請求項27に記載の化合物。
- 上記n個のヒドロキシル基を有するH 2 N−R 1 −(OH)nで示されるスペーサー化合物が、セリノール、2−アミノ−1,5−ペンタンジオール及び3−アミノ−1,2−プロパンジオールからなる群から選ばれる化合物であり、非ステロイド性抗炎症化合物がケトプロフェンである請求項27に記載の化合物。
- 上記n個のヒドロキシル基を有するH 2 N−R 1 −(OH)nで示されるスペーサー化合物が、アミノエチルアルコールであり、非ステロイド性抗炎症化合物がジクロフェナクである請求項27に記載の化合物。
- ヒアルロン酸と下記式(3)
H 2 N−R 1 −(O−R 2 )n (3)
(式中、R 2 はZ−CO−で示される非ステロイド性抗炎症化合物の残基又は水素原子を示し(但し、全てが水素原子である場合を除く)、
H 2 N−R 1 −(O−)nはn個のヒドロキシル基を有するH 2 N−R 1 −(OH)nで示されるスペーサー化合物のスペーサー残基を示し、R 1 は炭素数2〜12の直鎖あるいは分岐を有するアルキル基を示し、−O−CO−はスペーサー化合物が有する水酸基と非ステロイド性抗炎症化合物が有するカルボキシル基とのエステル結合を示す。nは1〜3の整数を示す。)
で示されるスペーサー結合非ステロイド性抗炎症化合物とを反応させることを特徴とする、請求項1に記載のヒアルロン酸誘導体の製造法。 - ヒアルロン酸とスペーサー結合非ステロイド性抗炎症化合物との反応生成物の溶液を、アルカリ性条件下で処理する工程を含むことを特徴とする、請求項31に記載のヒアルロン酸誘導体の製造法。
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