ES2943884T3 - Sistemas de estabilización y liberación controlada para medicamentos inestables en esterilización - Google Patents

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Abstract

Se describen alquenilamidas de ácido hialurónico sulfatado y su uso para la estabilización y liberación de medicamentos en forma de suspensiones micelares que pueden administrarse localmente y/o locorregionalmente, en particular intraarticularmente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas de estabilización y liberación controlada para medicamentos inestables en esterilización
La presente invención se refiere a las alquenilamidas de ácido hialurónico sulfatado y su uso para la estabilización y liberación de medicamentos en forma de suspensiones micelares que pueden administrarse local y/o locorregionalmente, en particular intraarticularmente.
Estado de la técnica
La administración local o locorregional se estudia cada vez más para superar los problemas asociados con la toxicidad sistémica o la farmacocinética de los medicamentos; la posibilidad de hacer que un medicamento esté disponible en su sitio de aplicación reduciría las dosis administradas, lo que disminuye aún más la probabilidad de efectos secundarios. Esta ventaja es particularmente importante en el tratamiento de trastornos crónicos que requieren una administración continua o trastornos que son etiológica y bioquímicamente complejos. Uno de los ejemplos más significativos de dichos trastornos es la osteoartrosis (OA), que resulta de un complejo sistema de interacciones mecánicas y bioquímicas, cuyo resultado final es el deterioro del tejido articular. Aunque se desconoce en gran medida el mecanismo de daño inicial, se conocen las modificaciones provocadas en el cartílago, y posteriormente en el hueso subcondral, tales como la reducción del contenido de agrecanos y proteoglicanos en el cartílago articular, el aumento del colágeno tipo I (subcondral) en comparación con tipo II (presente en el cartílago hialino), desequilibrios de la actividad metabólica y catabólica de los condrocitos y desequilibrios masivos de la actividad enzimática intraarticular, con sobreexpresión de (entre otros) metaloproteinasas, citocinas y enzimas inflamatorias. Todo ello conduce a la fisuración del cartílago intraarticular, inicialmente superficial y que luego afecta a todo el espesor del cartílago hasta que, en los casos más graves, provoca la erosión del hueso subcondral, y la aparición de los conocidos síntomas clínicos. De acuerdo con los últimos descubrimientos, el punto focal para la identificación de estrategias de tratamientos efectivos se encuentra en la diafonía humoral entre el cartílago y el hueso subcondral.
Por lo tanto, es claro que las nuevas fronteras del tratamiento de la osteoartrosis deben tener un enfoque multifactorial, que tenga en cuenta la complejidad del trastorno.
Se han descrito numerosos medicamentos, algunos de ellos usados también para otros trastornos, que presentan actividad in vitro en varios modelos de OA y, por lo tanto, son potencialmente útiles para fines clínicos. Sin embargo, su desarrollo en formulaciones sistémicas para uso humano a menudo está muy limitado por problemas de toxicidad y farmacocinética.
Una estrategia para tratar estos aspectos es la administración local o locorregional, en particular intraarticular, que elimina los problemas de farmacocinética y toxicidad sistémica. La administración intraarticular requiere formulaciones en solvente acuoso que puedan dispersarse e integrarse en el líquido sinovial sin generar eventos inflamatorios locales, como suele ocurrir con los solventes no acuosos. El pH de la formulación debe ser igual o muy similar al pH fisiológico, para garantizar que no se cree un desequilibrio en una articulación ya alterada por el trastorno en curso. La formulación también debe garantizar la liberación gradual, prolongada y localizada del ingrediente activo que se limita al sitio de administración. Finalmente, el ingrediente activo transportado debe ser estable en condiciones de esterilización de acuerdo con los métodos estándares.
Estos requisitos también se aplican a las aplicaciones locorregionales, fuera del compartimento articular.
Sin embargo, muchos de los medicamentos de mayor interés en el campo descrito anteriormente son generalmente bastante sensibles a las variaciones de pH, inestables a la esterilización por calor y tienen una naturaleza principalmente hidrófoba. Cuando son hidrófilos, tienden a precipitar muy rápidamente en solución acuosa y, por lo tanto, no proporcionan un tiempo de residencia suficiente después de su administración para que se produzca el efecto farmacológico.
Los ejemplos de medicamentos estudiados para administración locorregional incluyen rapamicina (sirolimus), estatinas, calcitonina, everolimus, paclitaxel y compuestos esteroideos.
La rapamicina es un antibiótico macrólido, completamente insoluble en solventes acuosos, que se usa ampliamente para prevenir el rechazo después de trasplantes de órganos y como recubrimiento para endoprótesis usadas para prevenir la reestenosis. También se ha estudiado por sus efectos sobre las articulaciones (Artritis Res Ther, 2014, 16, 482), dada su capacidad para activar la autofagia en condrocitos humanos y su acción inhibitoria sobre mTOR, para evitar así el desarrollo de OA. mTOR (diana de rapamicina en mamífero) es una proteína quinasa responsable de la fosforilación de serina y treonina que regula el crecimiento, la proliferación, la motilidad y la supervivencia celular; también está fuertemente implicada en el proceso de degeneración del cartílago que se produce en los pacientes que padecen osteoartrosis. Por lo tanto, la inhibición de mTOR por la rapamicina puede representar actualmente una estrategia interesante para contrarrestar la osteoartrosis articular.
La simvastatina y las estatinas en general, además de sus conocidos efectos reductores del colesterol, se han investigado durante algún tiempo por sus efectos antiinflamatorios (inhibición de las MMP) y su capacidad para regular el equilibrio osteoblastos/osteoclastos. Las estatinas en general son insolubles en agua, inestables a pH ácido y básico, y no esterilizables por calor.
La triamcinolona y las cortisonas en general se usan ampliamente en el tratamiento intraarticular de la OA, pero son insolubles en agua.
La calcitonina se usa por sus efectos sobre el anabolismo del cartílago; no es totalmente insoluble en un portador acuoso, pero tiende a precipitar muy rápidamente, lo que impide por lo tanto un perfil de liberación adecuado. También es inestable en la esterilización por calor.
Otros medicamentos aún en desarrollo incluyen RN-1747, 4a-forbol 12,13-didecanoato (4aPDD) y ácido araquidónico, que actúan en canales iónicos particulares, tales como TRPV4. Este es un canal expresado en una amplia gama de tejidos involucrados en la generación de señales mediadas por calcio, que contribuyen a funciones importantes como el mantenimiento del volumen celular y la homeostasis. También se ha demostrado que TRPV4 juega un papel crucial en el desarrollo y mantenimiento del tejido musculoesquelético, cartilaginoso y óseo; un mal funcionamiento de TRPV4 está estrechamente asociado con la aparición de problemas articulares inflamatorios y osteoartríticos (McNaughty, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2015, 388, 437-450). Por lo tanto, ser capaz de regular la activación correcta de TRPV4 representa un objetivo importante para el tratamiento de enfermedades osteoartríticas. Los medicamentos descritos anteriormente son agonistas del canal TRPV4, capaces de regular su activación y, por lo tanto, potencialmente se pueden usar para los fines descritos anteriormente, pero el hecho de que sean poco solubles o incluso insolubles en agua (como en el caso de RN-1747) descarta su uso clínico.
En consecuencia, existe una necesidad evidente de sistemas que permitan estabilizar las moléculas descritas tanto en la etapa de formulación como en la de esterilización, y que al mismo tiempo permitan una liberación controlada en el sitio de administración.
El documento US20160279108 describe la conjugación de rapamicina con ácido hialurónico de bajo peso molecular mediante un enlazador que contiene grupos aromáticos para obtener un derivado hidrosoluble capaz de pasar al sistema linfático y acumularse en los ganglios linfáticos. El documento WO2017044135 describe formulaciones que comprenden rapamicina encapsulada en liposomas de fosfolípidos que, aunque llevan el medicamento, son relativamente grandes (hasta 2 pm), y pueden crear problemas de formulación debido a su sensibilidad al pH, fuerza iónica, gradiente de portador, etc. También se han descrito sistemas de encapsulación de medicamentos poco solubles en partículas poliméricas (ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc.). Finalmente, los sistemas de liberación controlada conocidos incluyen hidrogeles basados en polímeros altamente hidratables (ácido hialurónico de alto peso molecular, colágeno, ácido algínico y alginatos, etc.), que retienen el medicamento en la malla de hidrogel o lo liberan gradualmente a medida que la estructura del hidrogel se rompe (documento WO2013179258).
El ácido hialurónico sulfatado (HAS), descrito en los documentos EP0702699 y WO2017085622, atraviesa fácilmente la barrera cutánea, para facilitar así el paso de sustancias farmacológicamente activas. Más recientemente, se ha descubierto que HAS posee propiedades antiinflamatorias mediadas por la modulación de la actividad de numerosas citocinas, tanto proinflamatorias como antiinflamatorias. Por lo tanto, el HAS puede usarse en el tratamiento de trastornos mediados por la alteración de los niveles de citocinas (artritis reumatoide, asma, enfermedades autoinmunitarias sistémicas y cutáneas, infecciones virales, dermatitis atópica, eczema, vitíligo y linfomas, como se informa en los documentos WO2010130468 y WO2010130466).
Descripción de la invención
Ahora se ha encontrado un sistema de estabilización y liberación controlada de medicamentos que son inestables a la esterilización por métodos estándares y/o difíciles de formular, que comprende mezclar un medicamento con una alquenilamida de ácido hialurónico sulfatado (HAS), y posterior sonicación. Los grupos sulfato hacen que el ácido hialurónico sea soluble en agua sin la formación de un hidrogel y lo hacen esterilizable por filtración, mientras que la amidación con una alquenilamina C4-C20 le da al HAS la naturaleza parcialmente hidrófoba, necesaria para que sea miscible con compuestos que no son solubles en agua.
La sonicación da lugar a la formación de estructuras micelares, homogéneamente suspendidas en el portador acuoso (HAS); dichas suspensiones son esterilizables por filtración o calor, mediante el uso de técnicas conocidas como la autoclave.
Las suspensiones resultantes también pueden liofilizarse, almacenarse a temperatura ambiente y reconstituirse en el momento de su uso con un portador acuoso estéril sin ninguna pérdida en el título del ingrediente activo y, sobre todo, pueden liberar el ingrediente activo de forma controlada después de la administración en el sitio deseado. Las amidas de ácido hialurónico sulfatado con alquenilaminas C4-C20 son novedosas y constituyen el primer objeto de la invención.
El segundo objeto de la invención son las suspensiones acuosas micelares de una amida de ácido hialurónico sulfatado con alquenilaminas C4-C20 y de un medicamento hidrófobo o hidrófilo.
El tercer objeto de la invención es un proceso para la preparación de suspensiones micelares que comprende: - hacer reaccionar una alquenilamina C4-C20 con una sal de benzalconio o tetrabutilamonio de ácido hialurónico sulfatado en un solvente apolar aprótico en presencia de agentes de condensación;
- mezclar la amida de ácido hialurónico sulfatado obtenida en la etapa anterior con una suspensión o solución acuosa del medicamento;
- sonicación de la mezcla y filtración estéril.
La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas suspensiones micelares y excipientes opcionales, y su uso para la administración inyectable local, locorregional, intraarticular o intraósea, en particular la inyección intraarticular, para el tratamiento de la osteoartrosis.
Descripción detallada de la invención
El ácido hialurónico de partida usado en la invención y destinado a sufrir sulfatación y posterior amidación se puede obtener y purificar por métodos conocidos, por ejemplo, por extracción de crestas de gallo (EP138572), fermentación de Streptococcus (WO2018020458; WO2019016699), o biosíntesis de Bacillus (WO2012032154). El HA preferido se produce y purifica a partir de Streptococcus, con un MW promedio en peso en el intervalo de 100000 a 250000 Da, en particular de 180000 a 230000 Da, en lo sucesivo denominado "MW 200 kDa", o HA con un peso MW promedio en peso en el intervalo de 500000 a 730000 Da. Se prefiere particularmente HA con MW200 kDa. “Peso molecular promedio” (MW) aquí significa el MW promedio en peso, calculado por el método de “viscosidad intrínseca” (Terbojevich etal., Carbohydr. Res., 1986, 363-377).
Las fracciones de HA descritas anteriormente se sulfatan por procedimientos conocidos, con especial referencia a los procesos descritos en los documentos EP702699 y WO2017085622.
El número de grupos sulfato por unidad de disacárido (grado de sulfatación) en las amidas de acuerdo con la invención oscila entre 0,5 y 3,5. Se pueden usar convenientemente grados de sulfatación que oscilan entre 0,5 y 1,5 (HAS-1), 1,5 y 2,5 (HAS-2) o 2,5 y 3,5 (HAS-3). Se usa preferentemente HAS con un grado de sulfatación que oscila entre 0,5 y 1,5 (HAS-1).
Los grupos carboxilo HAS se hacen reaccionar de acuerdo con la invención con las alquenilaminas C4-C20, para formar un enlace amida. En general, las funciones que no intervienen en la derivatización se salifican con un ion alcalino o alcalinotérreo, preferentemente con Na+. La amidación se realiza mediante técnicas conocidas, preferentemente como se describe en el documento EP1095064, con las adaptaciones oportunas.
El % molar de grado de derivatización (amidación) de HAS, expresado como moles de alquenilamina/moles de dímero de HAS, oscila entre 5 y 30 %, preferentemente entre 10-25 % y con mayor preferencia 10-17 %.
La alquenilamina contiene preferentemente una o dos instauraciones, con mayor preferencia una instauración. Ejemplos de aminas preferidas son oleilamina, (2E)-hex-2-en-1-amina y pent-2-en-1-amina. Se prefiere particularmente la oleilamina.
A continuación, se muestra la fórmula de estructuras esquemáticas de las subunidades estructurales de la oleilamida de ácido hialurónico sulfatado de acuerdo con la invención.
Figure imgf000004_0001
Las amidas de acuerdo con la invención son estables al tratamiento térmico y, por lo tanto, pueden esterilizarse en autoclave, ya que el enlace amida es termoestable. También pueden esterilizarse por filtración a 0,2 |jm, son miscibles con medicamentos tanto hidrófobos como hidrófilos, suspendidos o solubilizados en solvente acuoso, con la formación de una suspensión acuosa de partículas micelares que transportan el medicamento y regulan su liberación. La suspensión micelar acuosa puede liofilizarse, almacenarse a temperatura ambiente y reconstituirse con un solvente acuoso, ante cualquier pérdida en el título del ingrediente activo.
El tamaño de las micelas oscila entre 5 y 200 nm, preferentemente entre 10 y 50 nm.
La concentración de la amida en las suspensiones micelares oscila entre 4 y 20 mg/ml.
Una concentración preferida de oleilamida es de 13 mg/ml.
Ejemplos de medicamentos que pueden usarse de acuerdo con la invención son rapamicina, triamcinolona, estatinas (en particular la simvastatina), calcitonina, RN-1747, 4a-forbol 12,13-didecanoato (4aPDD), everolimus, paclitaxel y ácido araquidónico. Se prefiere particularmente la rapamicina.
La concentración de medicamento que se puede cargar en las suspensiones micelares de acuerdo con la invención depende de la hidrofobicidad del propio medicamento y del grado deseado de amidación de HAS, y por lo tanto puede modularse mediante el equilibrio de dichas características.
Las suspensiones micelares de acuerdo con la invención están constituidas por tanto por amidas de ácido hialurónico sulfatado (HAS) con un grado de sulfatación que oscila entre 0,5 y 1,5 (HAS-1), 1,5 y 2,5 (HAS-2) o 2,5 y 3,5 (HAS-3 ), preparado a partir de HA con un MW promedio en peso que oscila entre 180000 y 230000 Da o un MW promedio en peso que oscila entre 500 000 y 730 000 Da; la amidación se obtiene con alquilaminas C4-C20, preferentemente oleilamina, (2E)-hex-2-en-1-amina y pent-2-en-1-amina; el grado de derivatización molar (amidación) de HAS, expresado en moles de alquenilamina/moles de dímero de HAS, oscila entre el 5 y el 30 %; la concentración de la amida en suspensiones micelares oscila entre 4 y 20 mg/ml.
Preferentemente, las suspensiones micelares de acuerdo con la invención consisten en amidas de ácido hialurónico sulfatado (HAS) con un grado de sulfatación que oscila entre 0,5 y 1,5 (HAS-1), preparadas a partir de HA con un MW promedio en peso que oscila entre 180000 y 230000 Da; la amidación se obtiene con oleilamina; el grado de derivatización molar (amidación) de HAS, expresado en moles de alquenilamina/moles de dímero de HAS, oscila entre el 10 y el 17 %; la concentración de la amida en las suspensiones micelares es preferentemente de 13 mg/ml. Las suspensiones micelares de acuerdo con la invención se obtienen al dispersar el medicamento hidrófobo en una solución tampón que contiene la amida, luego sonicar en un baño de ultrasonidos y posteriormente filtrar a través de un filtro de 0,2 jm, lo que hace que el producto sea estéril. El tampón es preferentemente tampón de fosfato PBS a pH=7, ácido 2-N-morfolino metanosulfónico a un pH que oscila entre 5 y 8, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetilsulfónico a un pH que oscila entre 5 y 8, y con mayor preferencia es PBS a pH=7. Si el medicamento usado es soluble en agua, se disuelve, en lugar de dispersarse, en la solución tampón.
Esquemáticamente, por tanto, la preparación de los sistemas de estabilización y liberación controlada de acuerdo con la invención implica:
- síntesis del grado deseado de HAS en forma de sal de sodio, a partir de HA-Na o de HA-TBA (sal de tetrabutilamonio);
- preparación de sal de benzalconio de HAS (BA) o sal de TBA a partir de HAS-Na;
- derivatización parcial de los carboxilos de HAS-BA o HAS-TBA con una alquenilamina C4-C20;
- preparación de la formulación HAS-alquenilamida/medicamento en forma de suspensión micelar.
Las suspensiones micelares se pueden administrar "tal cual", previa esterilización, o se pueden añadir excipientes como maltosa, manitol o glucosa en una concentración que va del 1 al 9 % en peso, preferentemente maltosa en una concentración del 4,5 % del peso de la formulación.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención en mayor detalle.
Ejemplo 1: Síntesis de HAS1
1.1 Síntesis de HAS1-Na a partir de sal sódica de HA.
Se dispersó 4,0 g (9,96 * 10'3 mol; 1 eq) de HA-Na (HA MW 200 kDa) en 220 ml de DMSO y se añadieron 3,6 ml de ácido metanosulfónico (5 eq), tras lo cual se dejó la mezcla en agitación durante 24 horas a temperatura ambiente (TA). Cuando se completó la disolución, se añadieron 12,8 g (8 eq) de trióxido de azufre de piridina (Pyr^SOa). Después de reposar durante la noche a temperatura ambiente, el producto se precipitó con etanol (EtOH); el precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch, se lavó dos veces con EtOH y se volvió a disolver en 150 ml de agua desionizada; se añadieron 8 ml de solución saturada de NaCI y 115 ml de DMSO y se ajustó el pH a 3,4 ± 0,1 con NaOH 3 M. El producto se precipitó con 440 ml de EtOH; el precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch, se lavó con una mezcla de EtOH/H2O (80:20) y con EtOH, y finalmente se secó al vacío a 37 °C. Se obtuvieron 7,78 g de HAS1-Na como un polvo de color blanco amarillento. (Rendimiento: 97,6 %).
1.2 Síntesis de HAS1-Na a partir de la sal de HATBA.
Se disolvieron 2,0 g (3,22 * 10-3 mol; 1 eq) de HA-TBA (HA MW 200 kDa) en 200 ml de DMSO. Cuando se completó la disolución, se añadieron 1,28 g (2,5 eq) de trióxido de azufre de piridina (Pyr^SOa). Después de reposar durante la noche a temperatura ambiente, el producto se precipitó con etanol (EtOH); el precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch, se lavó dos veces con EtOH y se volvió a disolver en 150 ml de agua desionizada; se añadieron 8 ml de solución saturada de NaCl y 115 ml de Dm SO y se ajustó el pH a 3,4 ± 0,1 con NaOH 3 M. El producto se precipitó con 430 ml de EtOH; el precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch, se lavó con una mezcla de EtOH/H2O (80:20) y con EtOH, y finalmente se secó al vacío a 37 °C.
Se obtuvieron 1,52 g de HAS1-Na como un polvo de color blanco amarillento. (Rendimiento: 93,8 %).
Ejemplo 2: Síntesis de conjugado de HAS1-oleilamida [10 %] a partir de HAS1-BA (benzalconio)
Se disolvieron 2,5 g (5,0 * 10-3 mol, 1 eq) de HAS1-Na en 100 ml de agua desionizada; se disolvieron 3,0 g de cloruro de benzalconio (BA+cl-) por separado en 100 ml de agua desionizada. Cuando se completó la solubilización, la solución de BA+cl- se añadió a la solución de HAS1, para obtener así un precipitado que se filtró a través de un crisol Gooch, se lavó en H2O, en etanol y luego en acetona, y se secó en rotavapor a alto vacío. El precipitado de HAS1-BA aislado se solubilizó en 160 ml de DMSO; luego se añadieron 0,114 g (0,14 eq) de CDI (carbodiimida) y 0,10 ml de ácido metanosulfónico (0,3 eq). Después de 30 min. de agitación a 40 °C, se añadieron 1,32 ml (0,8 eq) de oleilamina y la reacción continuó durante la noche con agitación lenta a 40 °C. Al día siguiente se añadieron 16 ml de solución saturada de NaCl y el producto se precipitó con etanol. El precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch y se lavó con 2 volúmenes de una mezcla de etanol/H2O (85:15), luego con etanol y finalmente con acetona. El producto resultante se disolvió en 50 ml de H2O desionizado y se dializó (membrana de diálisis Spectra/Por® con límite de corte=12 000-14 000 Da) durante 3 días en tampón PBS pH 7, y 1 día en H2O. Finalmente, el producto dializado se congeló y liofilizó. Se obtuvieron 1,9 g de un polvo de color blanco amarillento. (Rendimiento: 72,2 %).
Caracterización: El grado de derivatización se calculó mediante análisis de 1H-NMR: Se disolvieron 20 mg de HAS1-oleilamida en 1 ml de D2O y se analizó con un espectrómetro Bruker Advance (300 MHz). Las señales usadas para determinar el grado de derivatización fueron las siguientes: 8 0,6-0,9 (t, 3H, HAS1-CONH-(CH2)s-CH=CH-(CH2)7-CH3), 81,9-1,7 (s, 3H, HAS1-NHCO CH3) (moles de oleilamida frente a moles de unidad de repetición de HAS1). Ejemplo 3: Síntesis de conjugado de HAS1-oleilamida [10 %] a partir de HAS1-TBA
a) Aproximadamente 10 g de resina sulfónica Amberlyst se lavaron 5 veces con MilliQ H2O en una columna encamisada (la resina ocupaba aproximadamente la mitad del volumen de la columna). Se añadieron 20 ml de solución de TBA-OH al 55 %, se agitó y se dejó en contacto con la resina durante 2 h a TA. La resina se lavó con aproximadamente 0,5 l de H2O MilliQ hasta que el pH del eluato cayó por debajo de 10,5 (pH=10,48). Se cargaron 2,5 g (5,0 * 10-3 mol, 1 eq) de HAS1Na disuelto en 30 ml de H2O, se percoló a 5 ml/min y se lavó con unos 60 ml adicionales. El eluato se recogió, se congeló y se secó por congelación; se obtuvieron 3,9 g de HAS1-TBA en forma de un liofilizado de color amarillo pálido.
b) El derivado de HAS1-TBA aislado se solubilizó en 160 ml de DMSO; luego se añadieron 0,114 g (0,14 eq) de CDI (carbodiimida) y 0,10 ml de ácido metanosulfónico (0,3 eq). Después de 30 min. de agitación a 40 °C, se añadieron 1,32 ml (0,8 eq) de oleilamina y la reacción continuó durante la noche con agitación lenta a 40 °C. Al día siguiente se añadieron 16 ml de solución saturada de NaCl y el producto se precipitó con etanol. El precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch y se lavó con 2 volúmenes de una mezcla de etanol/H2O (85:15), luego con etanol y finalmente con acetona.
Se obtuvieron 2,5 g de un polvo de color blanco amarillento. (Rendimiento: 94,1 %).
Después de la caracterización por análisis de 1H-NMR como se describió en el Ejemplo 2, se determinó un grado de derivatización de 10,6 ± 0,8 % en mol/mol (moles de oleilamida frente a moles de unidad de repetición de HAS 1). Ejemplo 4: Síntesis de HAS1-oleilamida [17 %] a partir de HAS1-TBA
Después de la preparación del derivado de HAS1-TBA como se describió en el Ejemplo 3, párrafo a), la síntesis se llevó a cabo de la siguiente manera:
Se solubilizaron 2,5 g (5,0 * 10-3 mol, 1 eq) de derivado de HAS1-TBA aislado en 160 ml de DMSO; luego se añadieron 0,163 g (0,2 eq) de CDI (carbodiimida) y 0,10 ml de ácido metanosulfónico (0,3 eq). Después de 30 min.
de agitación a 40 °C, se añadieron 1,32 ml (0,8 eq) de oleilamina y la reacción continuó durante la noche con agitación lenta a 40 °C. Al día siguiente se añadieron 16 ml de solución saturada de NaCl y el producto se precipitó con etanol. El precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch y se lavó con 2 volúmenes de una mezcla de etanol/H2O (85:15), luego con etanol y finalmente con acetona. Se obtuvieron 2,6 g de un producto blanco esponjoso. (Rendimiento: 96,1 %).
Después de la caracterización por análisis de 1H-NMR como se describió en el Ejemplo 2, se determinó un grado de derivatización de 17,3 ± 1,2 % en mol/mol (moles de oleilamida frente a moles de unidad de repetición de HAS 1). Ejemplo 5: Síntesis de HAS1-oleilamida [25 %] a partir de HAS1-TBA
Después de la preparación del derivado de HAS1-TBA como se describió en el Ejemplo 3, párrafo a), la síntesis se llevó a cabo de la siguiente manera:
Se solubilizaron 2,5 g (5,0 * 10-3 mol, 1 eq) de derivado de HAS1-TBA aislado en 160 ml de DMSO; luego se añadieron 0,285 g (0,35 eq) de CDI (carbodiimida) y 0,15 ml de ácido metanosulfónico (0,45 eq). Después de 30 min. de agitación a 40 °C, se añadieron 1,32 ml (0,8 eq) de oleilamina y la reacción continuó durante la noche con agitación lenta a 40 °C. Al día siguiente se añadieron 16 ml de solución saturada de NaCl y el producto se precipitó con etanol. El precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch y se lavó con 2 volúmenes de una mezcla de etanol/H2O (85:15), luego con etanol y finalmente con acetona. Se obtuvieron 2,6 g de un producto blanco esponjoso. (Rendimiento: 94,5%).
Después de la caracterización por análisis de 1H-NMR como se describió en el Ejemplo 2, se determinó un grado de derivatización de 24,5 ± 1,5 % en mol/mol (moles de oleilamida frente a moles de unidad de repetición de HAS1). Ejemplo 6: Síntesis de HAS2-oleilamida [10 %] a partir de HAS2-TBA
El HAS2 se preparó por el procedimiento descrito en el ejemplo 1.1, con variación únicamente de la cantidad de trióxido de azufre de piridina (Pyr^SOa) usada (16 g).
Después de la preparación del derivado de HAS2-TBA como se describió en el Ejemplo 3, párrafo a), la síntesis se llevó a cabo de la siguiente manera:
Se solubilizaron 2 g (3,3 * 10-3mol, 1 eq) de HAS2-TBA en 160 ml de DMSO; luego se añadieron 0,074 g (0,14 eq) de CDI (carbodiimida) y 0,06 ml de ácido metanosulfónico (0,3 eq). Después de 30 min. de agitación a 40 °C, se añadieron 1,08 ml (0,8 eq) de oleilamina y la reacción continuó durante la noche con agitación lenta a 40 °C. Al día siguiente se añadieron 16 ml de solución saturada de NaCl y el producto se precipitó con etanol. El precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch y se lavó con 2 volúmenes de una mezcla de etanol/H2O (85:15), luego con etanol y finalmente con acetona.
Se obtuvieron 2,0 g de un producto blanco amarillo pálido esponjoso. (Rendimiento: 94,5 %).
Después de la caracterización por análisis de 1H-NMR como se describió en el Ejemplo 2, se determinó un grado de derivatización de 9,8 ± 0,6 % en mol/mol (moles de oleilamida frente a moles de unidad de repetición de HAS2). Ejemplo 7: Síntesis de HAS3-oleilamida [11 %] a partir de HAS1-TBA
El HAS3 se preparó por el procedimiento descrito en el ejemplo 1.1, con variación únicamente de la cantidad de trióxido de azufre de piridina (Pyr^SOa) usada (20,8 g).
Después de la preparación del derivado HAS3-TBA como se describió en el Ejemplo 3, párrafo a), la síntesis se realizó de la siguiente manera:
Se solubilizaron 2 g (2,8 * 10-3 mol, 1 eq) de HAS3-TBA en 160 ml de DMSO; luego se añadieron 0,063 g (0,14 eq) de CDI (carbodiimida) y 0,05 ml de ácido metanosulfónico (0,3 eq). Después de 30 min. de agitación a 40 °C, se añadieron 0,73 ml (0,8 eq) de oleilamina y la reacción continuó durante la noche con agitación lenta a 40 °C. Al día siguiente se añadieron 16 ml de solución saturada de NaCl y el producto se precipitó con etanol. El precipitado resultante se filtró a través de un crisol Gooch y se lavó con 2 volúmenes de una mezcla de etanol/H2O (85:15), luego con etanol y finalmente con acetona.
Se obtuvieron 1,7 g de un producto blanco amarillo pálido esponjoso. (Rendimiento: 93,9 %).
Después de la caracterización por análisis 1H-NMR como se describió en el Ejemplo 2, se determinó un grado de derivatización de 11,1 ±0,6 % en mol/mol (moles de oleilamida frente a moles de unidad de repetición de HAS3). Ejemplo 8: Preparación de la formulación HAS1-oleilamida (13 mg/ml)/rapamicina
Se pesaron 65 mg de HAS1-oleilamida preparada como en el Ejemplo 3(derivatización 10 % en mol) en un tubo de ensayo de 50 ml y se le añadieron 20 mg de rapamicina (1CHEM LP) y 5,0 ml de PBS pH7. La suspensión se dejó en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente y se sonicó durante 10 min. (sonicador Sonifer 250), luego se filtró a 0,2 |jM con un filtro de acetato de celulosa Sartorius.
Análisis del contenido de rapamicina en la formulación:
Sistema HPLC-MS Agilent 1260: Columna Kinetex C8; régimen de flujo: 0,35 ml/min.; detector UV a 216 nm; Fase Móvil (MP): acetato de amonio (2 g/l) (A); acetonitrilo (B); Gradiente: 40 % de la fase móvil (B) durante 3 min y luego gradiente del 40 % al 97 % de (B) en 4 min.
El sistema se calibró mediante la inyección de un patrón de rapamicina a 0,14 mg/ml (la rapamicina se disolvió a 1.4 mg/ml en acetonitrilo (ACN) y se diluyó 1/10 con MP (40 % (B)/60 % (A)). Tiempo de retención: 7,6 min.
La formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina se diluyó 1/3 en MP (40 % (B)/60 % (A) y se inyectó directamente en HPLC. Tiempo de retención de rapamicina: 7,6 min. El análisis cuantitativo se realizó con referencia al área del patrón de rapamicina. El análisis MS confirma la estructura de la rapamicina y la ausencia de productos de degradación (MS teórica 914,2; medida 914,3+Na+). Contenido de rapamicina detectado en la formulación: 0,16 mg/ml.
Ejemplo 9: Preparación de la formulación HAS1-oleilamida (9 mg/ml)/rapamicina
Se pesaron 65 mg de HAS1-oleilamida preparada como en el Ejemplo 3(derivatización 10 % en mol) en un tubo de ensayo de 50 ml y se le añadieron 20 mg de rapamicina (1CHEM LP) y 5,0 ml de PBS pH7. La suspensión se dejó en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente y se sonicó durante 10 min. (sonicador Sonifer 250), luego se filtró a 0,2 j M con un filtro de acetato de celulosa Sartorius.
Contenido de rapamicina en la formulación, analizado como en el Ejemplo 8: 0,15 mg/ml.
Ejemplo 10: Preparación de la formulación HAS1-oleilamida (13 mg/ml)/rapamicina
Se pesaron 65 mg de HAS1-oleilamida preparada como en el Ejemplo 4 (derivatización 17 % en mol) en un tubo de ensayo de 50 ml, y se le añadieron 20 mg de rapamicina (1CHEm Lp ) y 5,0 ml de PBS pH7. La suspensión se dejó en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente y se sonicó durante 10 min. (sonicador Sonifer 250), luego se filtró a 0,2 j M con un filtro de acetato de celulosa Sartorius.
Contenido de rapamicina en la formulación, analizado como en el Ejemplo 8: 0,21 mg/ml.
Ejemplo 11 (comparativo): Preparación de una formulación de rapamicina en PBS
Se pesaron 20 mg de rapamicina en un tubo de ensayo de 50 ml, y se añadieron 5,0 ml de PBS pH7; la suspensión se dejó en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente y se sonicó durante 10 min (sonicador Sonifer 250), luego se filtró a 0,2 j M con un filtro de acetato de celulosa Sartorius. Contenido de rapamicina en la formulación, analizado como en el Ejemplo 8: 0,00 mg/ml.
Ejemplo 12: Preparación de la formulación HAS1-oleilamida (13 mg/ml)/RN-1747
Se pesaron 65 mg de HAS1-oleilamida preparada como en el Ejemplo 3(derivatización 10 % en mol), en un tubo de ensayo de 50 ml, y se le añadieron 21,5 mg de RN-1747 (Key Organics), 4,0 ml de PBS pH7 y 0,5 ml de HCl 1 M; la suspensión se dejó en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente y se sonicó durante 10 min. (sonicador Sonifer 250), se ajustó a pH 7 con 0,5 ml de NaOH 1 M y luego se filtró a 0,2 j M con un filtro de acetato de celulosa Sartorius.
Análisis del contenido de RN-1747 en la formulación:
Sistema HPLC-MS Agilent 1260: Columna Kinetex C8; régimen de flujo: 0,35 ml/min.; detector UV a 216 nm; Fase Móvil (MP): acetato de amonio (2 g/l) (A); acetonitrilo (B); Gradiente: 20 % de la fase móvil (B) durante 3 min, luego gradiente del 20 % al 97 % de (B) en 4 min.
El sistema se calibró mediante la inyección de un patrón de RN-1747 a 0,15 mg/ml (el RN-1747 se disolvió a 1.5 mg/ml en ACN y se diluyó 1/10 con MP ((20 % (B)/80 % (A)). Tiempo de retención: 8,4 min.
La formulación de HAS1-oleilamida/RN-1747 se diluyó 1/3 en MP (20 % (B)/80 % (A)) y se inyectó directamente en HPLC. Tiempo de retención de RN-1747: 8,4 min. El análisis cuantitativo se realizó con referencia al área del patrón de RN-1747. El análisis MS confirma la estructura de RN-1747 y la ausencia de productos de degradación (MS teórica 395,9; medida 395,5+Na+). Contenido de RN-1747 encontrado en la formulación: 0,44 mg/ml.
Ejemplo 13: Preparación de la formulación HASI-oleilamida (13 mg/ml)/simvastatina
Se pesaron 65 mg de HAS1-oleilamida preparada como en el Ejemplo 3 (derivatización 10 % en mol) en un tubo de ensayo de 50 ml, y se le añadieron 20,5 mg de simvastatina (Fluorochem) y 5,0 ml de PBS pH7; la suspensión se dejó en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente y se sonicó durante 10 min (sonicador Sonifer 250), se ajustó a pH 7 con 0,5 ml de NaOH 1 M y luego se filtró a 0,2 pM con un filtro de acetato de celulosa Sartorius. Análisis del contenido de simvastatina en la formulación:
Sistema HPLC-MS Agilent 1260: Columna Kinetex C8; régimen de flujo: 0,35 ml/min; detector UV a 216 nm; Fase Móvil: acetato de amonio (2 g/l) (A); acetonitrilo (B); Gradiente: 40 % de la fase móvil (B) durante 3 min y luego gradiente del 40 % al 97 % de (B) en 4 min.
El sistema se calibró mediante la inyección de un patrón de simvastatina a 0,3 mg/ml (la simvastatina se disolvió a 3,0 mg/ml en ACN y se diluyó 1/10 con MP ((40 % (B)/60 % (A)). Tiempo de retención: 7,1 min.
La formulación de HAS1-oleilamida/simvastatina se diluyó 1/3 en MP (40 % (B)/60 % (A) y se inyectó directamente en HPLC. Tiempo de retención de simvastatina: 7,1 min. El análisis cuantitativo se realizó con referencia al área del patrón de simvastatina. El análisis MS confirma la estructura de la simvastatina y la ausencia de productos de degradación (MS teórica 418,3; medida 418,6+Na+). Contenido de simvastatina encontrado en la formulación: 0,20 mg/ml.
Ejemplo 14: Preparación de la formulación HAS1-oleilamida (13 mg/ml)/acetónido de triamcinolona
Se pesaron 65 mg de HAS1-oleilamida preparada como en el Ejemplo 3 (derivatización10 % en mol) en un tubo de ensayo de 50 ml, y se le añadieron 20,5 mg de acetónido de triamcinolona (Spectrum) y 5,0 ml de PBS pH 7; la suspensión se dejó en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente y se sonicó durante 10 min (sonicador Sonifer 250), se ajustó a pH 7 con 0,5 ml de NaOH 1 M y luego se filtró a 0,2 pM con un filtro de acetato de celulosa Sartorius.
Análisis del contenido de hexacetónido de triamcinolona en la formulación:
Sistema HPLC-MS Agilent 1260: Columna Kinetex C8; régimen de flujo: 0,35 ml/min.; detector UV a 216 nm; Fase Móvil (MP): acetato de amonio (2 g/l) (A); acetonitrilo (B); Gradiente: 20 % de la fase móvil (B) durante 3 min, luego gradiente del 20 % al 97 % de (B) en 4 min.
El sistema se calibró mediante la inyección de un patrón de hexacetónido de triamcinolona a 0,3 mg/ml (la triamcinolona se disolvió a 3,0 mg/ml en ACN y se diluyó 1/10 con MP ((20 % (B)/80 % (A)). Tiempo de retención: 8,6 min.
La formulación de HAS1-oleilamida/triamcinolona se diluyó 1/3 en MP (20 % (B)/80 % (A)) y se inyectó directamente en HPLC. Tiempo de retención de triamcinolona: 8,6 min. El análisis cuantitativo se realizó con referencia al área del patrón de triamcinolona. El análisis MS confirma la estructura del hexacetónido de triamcinolona y la ausencia de productos de degradación (MS teórica 532,6; medida 532,3+Na+).
Contenido de hexacetónido de triamcinolona encontrado en la formulación: 0,02 mg/ml.
Ejemplo 15: Preparación de la formulación HAS1-oleilamida (13 mg/ml)/calcitonina de salmón
Se pesaron 65 mg de HAS1-oleilamida, preparada como en el Ejemplo 3 (derivatización 10 % en mol), en un tubo de ensayo de 10 ml; 16,0 mg de calcitonina de salmón (Bachem) y 5,0 ml de CH3COONH40,2 M pH 5,2, la solución se dejó en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente y se sonicó durante 10 min (sonicador Sonifer 250), luego se filtró a 0,2 pM a través de un filtro de acetato de celulosa Sartorius. Análisis del contenido de calcitonina en la formulación:
Sistema HPLC-MS Agilent 1260: Columna Kinetex C8; régimen de flujo: 0,35 ml/min; detector UV a 254 nm; Fase Móvil (MP): acetato de amonio (2 g/l) (A); acetonitrilo (B); Gradiente: 15 % de la fase móvil (B) durante 3 min, luego gradiente del 15 % al 97 % de (B) en 4 min.
El sistema se calibró mediante la inyección de un patrón de calcitonina de salmón a 0,8 mg/ml (la calcitonina se disolvió a 8,0 mg/ml en ACN y se diluyó 1/10 con MP ((15 % (B)/85 % (A)). Tiempo de retención: 7,4 min.
La formulación de HAS1-oleilamida/calcitonina de salmón se diluyó 1/3 en MP (15 % (B)/85 % (A)) y se inyectó directamente en HPLC. Tiempo de retención de calcitonina: 7,4 min. El análisis cuantitativo se realizó con referencia al área del patrón de calcitonina de salmón. El análisis MS confirma la estructura de la calcitonina de salmón y la ausencia de productos de degradación (MS teórica 3431,9; medida: (1144,4 = 3430,2+3H+)/3).
Contenido de calcitonina de salmón encontrado en la formulación: 3,2 mg/ml.
Cuando se vayan a liofilizar las formulaciones descritas en los Ejemplos 9-17, se aconseja añadir un excipiente seleccionado entre maltosa, manitol y glucosa, preferentemente maltosa, en la cantidad de 4,5 % p/p. La adición debe realizarse después de la sonicación y antes de la filtración a través de un filtro de 0,2 pM.
Ejemplo 16: Preparación de la formulación HASI-oleilamida (13 mg/ml)/paclitaxel
Se pesaron 65 mg de HASI-oleilamida preparada como en el Ejemplo 4 (derivatización 17 % en mol) en un tubo de ensayo de 50 ml; y se le añadieron 20 mg de paclitaxel y 5,0 ml de PBS pH7. La suspensión se dejó en agitación durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente y se sonicó durante 10 min (sonicador Sonifer 250), luego se filtró a 0,2 pM con un filtro de acetato de celulosa Sartorius.
Análisis del contenido de paclitaxel en la formulación:
Sistema HPLC-MS Agilent 1260: Columna Kinetex C18; régimen de flujo: 1,0 ml/min; detector UV a 220 nm; Fase Móvil (MP): acetato de amonio (2 g/l) (A); acetonitrilo (B); Gradiente: 1 % de la fase móvil (B) durante 3 min, luego gradiente del 5 % al 95 % de (B) en 10 min.
El sistema se calibró mediante la inyección de un patrón de paclitaxel (disuelto en acetonitrilo) a 0,46 mg/ml.
La formulación de HAS1-oleilamida/paclitaxel se diluyó 1/3 en acetonitrilo y se inyectó directamente en HPLC. Tiempo de retención de paclitaxel: 11,3 min. El análisis cuantitativo se realizó con referencia al área del patrón de paclitaxel. El análisis MS confirma la estructura de paclitaxel y la ausencia de productos de degradación (MS teórica; medida 853,9+Na+). Contenido de paclitaxel encontrado en la formulación: 0,23 mg/ml.
Ejemplo 17: Prueba de formación de micelas
La formación de micelas capaces de transportar los ingredientes activos hidrófobos se demostró mediante análisis de microscopio TEM.
Se colocaron 25 pl de la formulación del Ejemplo 8, diluidos a 0,2 mg/ml, en una rejilla de malla 400; después de teñir con acetato de uranilo al 1 %, la muestra se observó con un microscopio electrónico de transmisión TecnaiGA2(FEI) que funciona a 100 kV. Las imágenes se adquirieron con una cámara digital Veleta (Olympus Soft Imaging System). Se evidenció la formación de vesículas compatibles con sistemas micelares, con un diámetro medio que oscila entre 10 y 50 nm (Figura 1).
Ejemplo 18: Evaluación de la estabilidad de formulaciones esterilizadas en almacenamiento y liofilización
Se realizaron pruebas experimentales para probar los efectos de la liofilización de las formulaciones de acuerdo con la invención sobre el contenido del ingrediente activo. En particular, se ensayó la formulación del Ejemplo 8, con la adición de 0,23 g de maltosa (4,5 % p/p) antes de la filtración a través de un filtro de 0,2 pM.
La solución filtrada resultante se dividió en condiciones estériles entre viales de 9 * 1 ml (0,5 ml por vial). Los viales se colocaron en el liofilizador (Epsilon 2-6DLS plus); en uno de ellos se colocó la sonda del liofilizador (temperatura de congelación inicial: a 40 °C; congelación de la muestra: -17 °C; temperatura de liofilización: -29 °C). El vacío en la etapa de liofilización se ajustó a 0,08 bares; las muestras liofilizadas aparecieron en forma de una torta no colapsada de color blanco amarillento pálido.
Una muestra se disolvió con 0,58 ml de H2O inmediatamente después de la liofilización, y se analizó el título de rapamicina por el método HPLC-MS ya descrito. Las otras muestras se almacenaron a 40 °C durante 6 meses, y la titulación de rapamicina se realizó después de 3 y 6 meses.
El título de rapamicina detectado fue del 95 %, tanto inmediatamente después de la liofilización como después de 3 o 6 meses a 40 °C, lo que demuestra la eficacia de los sistemas de estabilización y liberación descritos en la presente descripción.
Ejemplo 19: Prueba de inhibición in vitro de la proteasa del líquido sinovial inducida por el derivado HAS1-oleilamida/rapamicina.
La formulación HAS1-oleilamida/rapamicina, preparada como en el Ejemplo 10, es decir, que contenía 13 mg/ml de HAS1-oleilamida y 0,21 mg/ml de rapamicina, se ensayó in vitro para evaluar su efecto inhibitorio sobre las proteasas del líquido sinovial, específicamente sobre:
• 10 metaloproteinasas humanas (MMP) diferentes;
• Elastasa;
• Agrecanasa 1 (ADAMTs4)
mediante el uso de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa como control (como sabe el experto en la técnica, GAPDH es una enzima constitutiva, expresada fisiológicamente en cada célula, cuya inhibición impide la actividad celular, lo que lleva a la muerte celular. La evaluación de su inhibición por las especies probadas mide la especificidad de acción y toxicidad de la especie), y evaluar la tasa de hidrólisis inicial de las diversas proteasas (RFU/s) en presencia de las diferentes concentraciones de la formulación. El CI50, es decir, la concentración del inhibidor capaz de inhibir el 50 % de la actividad enzimática de las MMP, se calculó por interpolación de la actividad de las MMP estandarizadas vs. la concentración de la formulación, y sus valores se muestran en la Figura 2.
Materiales y métodos:
para las MMP: se usó el "Kit de perfilado de inhibidores de MMP fluorimétricos" (BML-AK016); la formulación descrita en el Ejemplo 10 se ensayó a la concentración de HAS1-oleilamida de 0,8 mg/ml; 0,4 mg/ml y 0,1 mg/ml, correspondiente a 0,013; 0,006 y 0,0016 mg/ml de rapamicina respectivamente, y mediante el uso de la misma concentración de sustrato (4,0 j M ) ;
para la elastasa: se usó el “kit fluorimétrico de elastasa Sensolyte Rh110” (AS-72178); la formulación a la que se hace referencia en el Ejemplo 10 se ensayó a la concentración de HAS 1-oleilamida de 0,7 mg/ml; 0,35 mg/ml y
0,1 mg/ml, correspondiente a 0,0112; 0,0056 y 0,0016 mg/ml de rapamicina respectivamente, y mediante el uso de la misma concentración de sustrato (25 j M ) ;
para ADAMT4: se usó el "Kit de ensayo de actividad de agrecanasa" (KA-1497); la formulación a la que se hace referencia en el Ejemplo 10 se ensayó a la concentración de HAS1-oleilamida de 0,6 mg/ml; 0,3 mg/ml y 0,1 mg/ml, correspondiente a 0,0096; 0,0048 y 0,0016 mg/ml de rapamicina respectivamente, y mediante el uso de la misma concentración de sustrato (1 j M ) ;
para GAPDH: se usó el "Kit de ensayo de actividad de GAPDH colorimétrico" (K680-100); la formulación descrita en el Ejemplo 10 se ensayó a la concentración de HAS1-oleilamida de 0,6 mg/ml; 0,3 mg/ml y 0,1 mg/ml, correspondientes a 0,0096, 0,0048 y 0,0016 mg/ml de rapamicina respectivamente, y mediante el uso de la misma concentración de sustrato (1 j M ) .
Los resultados se muestran en la Figura 2.
Es evidente que la formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina inhibe selectivamente las MMP, lo que demuestra una actividad superior en todas las metaloproteinasas excepto MMP2 y MMP9; por el contrario, no tiene efecto sobre las otras proteasas del líquido sinovial analizadas, o sobre la enzima de control (GAPDH).
Esto significa que la formulación de HAS 1-oleilamida/rapamicina actúa específica y selectivamente sobre las MMP, y en particular sobre las MMP que se sobreexpresan en el líquido sinovial de pacientes con OA, y son responsables de la degradación del colágeno.
Ejemplo 20: Ensayos ex vivo sobre la liberación de colágeno de explantes de cartílago inducida por el derivado HAS1-oleilamida/rapamicina
La eficacia de la formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina sobre la liberación de colágeno se evaluó en un modelo ex vivo de inflamación del cartílago descrito en la literatura (Ams, S. y otros, Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20: 2131-2140). La formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina ensayada es la preparada en el Ejemplo 10, a diferentes concentraciones.
Se cosechó cartílago del surco femororrotuliano y se obtuvieron cóndilos femorales de un fémur bovino adulto, y se tomaron biopsias de cartílago (0 = 3 mm) con un sacabocados de acero. Las biopsias se cultivaron en una placa Multiwell de 48 pocillos (BD Falcon, n° de cat. 353078, Italia) a 37 °C, con 5 % de CO2, durante 24 horas en DMEM/F-12 (1:1) (Life Technologies, n° de catálogo 11320074, Italia) que contenía suero bovino fetal al 2 % (Life Technologies, n° de catálogo 10270106, Italia). Después de la incubación, las biopsias se lavaron con PBS y se dividieron en los siguientes grupos:
1) un grupo de control, en donde las células no se trataron ni estimularon;
2) un grupo tratado con las citocinas proinflamatorias OSM (Oncostatina M) e IL-1p (10 ng/ml cada una);
3) un grupo expuesto a OSM e IL-1p y tratado con HAS1-oleilamida (1,3 mg/ml)/rapamicina (0,021 mg/ml); 4) un grupo expuesto a OSM e IL-1p y tratado con HAS1-oleilamida (0,3 mg/ml)/rapamicina (0,005 mg/ml); 5) un grupo expuesto a OSM e IL-1p y tratado con HAS 1-oleilamida (0,1 mg/ml)/rapamicina (0,002 mg/ml).
Después de 0, 7, 14 y 21 días, el medio de cultivo de la biopsia se aspiró y se reemplazó con medio de cultivo fresco que contenía citocinas inflamatorias y la formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina que se iba a analizar. Después de 21 días de incubación, se recogió el medio de biopsia y se midió el colágeno soluble liberado mediante el "kit de ensayo de colágeno Sircol" (Biocolor, n° de catálogo S1000, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como se verá en la Figura 3, las biopsias del grupo tratado con IL-1/OSM liberaron, como era de esperar, una cantidad significativamente mayor de colágeno soluble en el medio de cultivo que el control, lo que indica un daño inflamatorio muy importante. La formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina reduce significativamente la liberación de colágeno inducida por el estímulo inflamatorio, reduciéndolo en la práctica a los niveles de control incluso a la concentración más baja ensayada, y eliminándolo prácticamente a la concentración de 1,3/0,021 mg/ml. Este efecto confirma la capacidad de la formulación para inhibir la liberación de colágeno e indica un marcado efecto antiinflamatorio de la formulación de HAS 1-oleilamida/rapamicina.
Ejemplo 21: Efecto sobre la expresión de MMP13 inducida por el derivado HAS 1-oleilamida/rapamicina
Se determinó la concentración de MMP-13 en los sobrenadantes obtenidos de los ensayos de eficacia de liberación de colágeno (Ejemplo anterior) para cuantificar la presencia en las muestras de la principal enzima responsable de la degradación del cartílago. Para ello se usó un ensayo ELISA (Mybiosource, n° de cat. MBS2880297, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los resultados expuestos en la Figura 4 demuestran que el tratamiento de las muestras con las citocinas inflamatorias OSM e IL-1p aumenta significativamente la concentración de MMP-13 en el sobrenadante, como se esperaba. Por el contrario, los sobrenadantes de las muestras tratadas con la formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina a concentraciones de 0,3 y 0,1 mg/ml, correspondientes a 0,0048 y 0,0016 mg/ml de rapamicina respectivamente, contienen niveles de MMP-13 significativamente más bajos que las muestras de control, incluso a la concentración más baja probada. Esto confirma inequívocamente la eficacia de la formulación probada para reducir la expresión de los factores inflamatorios que subyacen a la degradación del cartílago articular. Ejemplo 22: Ensayo in vitro de inhibición de mTOR inducida por el derivado HAS1-oleilamida/rapamicina
Se determinó la eficacia de la formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina preparada en el Ejemplo 10 para inhibir mTOR in vitro con un ensayo ELISA (kit de actividad de mTOR K-Elisa n° de cat. CBA055; Merck), mediante el uso de una solución tampón libre de rapamicina (TRIS) como control y dos dosis diferentes de rapamicina "tal cual", disuelta en DMSO. Las dosis se muestran en el gráfico de la Figura 5 y por simplicidad, en el caso del derivado, referirse a la concentración de rapamicina. La actividad de mTOR en ausencia de rapamicina se estandarizó al 100%. Como era de esperar, se observó una respuesta dependiente de la concentración a la rapamicina. La formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina demostró ser activa en la inhibición de mTOR en concentraciones mucho más bajas que la rapamicina sola. Específicamente, la inhibición obtenida con una concentración de rapamicina de 125 pM se logra con la formulación de HAS1-oleilamida/rapamicina que contiene 34,7 pM de rapamicina, es decir, un contenido de ingrediente activo mucho más bajo. Ser capaz de administrar cantidades significativamente menores de medicamento con el mismo efecto significaría minimizar o incluso eliminar los efectos secundarios significativos que puede causar la rapamicina.

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Amidas de ácido hialurónico sulfatado (HAS) con alquenilaminas C4-C20, dichas amidas tienen un % molar de grado de derivatización, expresado como moles de alquenilamina/mol de dímero HAS, que oscila entre el 2 y el 20 %, preferentemente 5-15 %, con mayor preferencia 10 %.
2. Amidas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido hialurónico sulfatado tiene un número de grupos sulfato por unidad de disacárido que oscila entre 0,5 y 3,5.
3. Amidas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el ácido hialurónico sulfatado tiene un número de grupos sulfato por unidad de disacárido que oscila entre 0,5 y 1,5.
4. Amidas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el ácido hialurónico sulfatado tiene un número de grupos sulfato por unidad de disacárido que oscila entre 1,5 y 2,5.
5. Amidas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el ácido hialurónico sulfatado tiene un número de grupos sulfato por unidad de disacárido que oscila entre 2,5 y 3,5.
6. Amidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la alquenilamina se selecciona de oleilamina, (2E)-hex-2-en-1-amina y pent-2-en-1-amina.
7. Amidas de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la alquenilamina es oleilamina.
8. Amidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el peso molecular del ácido hialurónico de partida usado para la sulfatación oscila entre 100000 y 250000 Da.
9. Amidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el peso molecular del ácido hialurónico de partida usado para la sulfatación oscila entre 500000 y 730000 Da.
10. Suspensiones acuosas micelares de una amida de las reivindicaciones 1-9 y un medicamento hidrófobo o hidrófilo.
11. Suspensiones micelares de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el tamaño de la micela oscila entre 5 y 200 nm, preferentemente entre 10 y 50 nm.
12. Suspensiones micelares de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en las que la amida es la oleilamida de la reivindicación 7.
13. Suspensiones micelares de acuerdo con la reivindicación 10, 11 o 12, en donde la concentración de amida oscila entre 4 y 20 mg/ml.
14. Suspensiones micelares de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la concentración de oleilamida es de 13 mg/ml.
15. Suspensiones micelares de acuerdo con las reivindicaciones 10-14 en donde el medicamento se selecciona de rapamicina, triamcinolona, estatinas (en particular simvastatina), calcitonina, RN-1747, 4a-forbol 12,13-didacanoato (4aPDD), everolimus, paclitaxel y ácido araquidónico.
16. Suspensiones micelares de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el medicamento es rapamicina.
17. Suspensiones micelares de acuerdo con las reivindicaciones 10-16 en una solución tampón seleccionada de tampón fosfato PBS a pH=7, ácido 2-N-morfolino metanosulfónico a un pH que oscila entre 5 y 8, y ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinetilsulfónico a un pH que oscila entre 5 y 8.
18. Suspensiones micelares de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la solución tampón es PBS a pH=7.
19. Un proceso para la preparación de las suspensiones micelares de las reivindicaciones 10-18, que comprende:
- hacer reaccionar una alquenilamina C4-C20 con una sal de benzalconio o tetrabutilamonio de ácido hialurónico sulfatado en un solvente apolar aprótico en presencia de agentes de condensación;
- mezclar la amida de ácido hialurónico sulfatado obtenida en la etapa anterior con una solución o suspensión acuosa del medicamento;
- sonicación de la mezcla y filtración estéril.
20. Composiciones farmacéuticas que comprenden las suspensiones micelares de las reivindicaciones 10-18 y excipientes opcionales.
21. Composiciones de acuerdo con la reivindicación 20 en donde los excipientes se seleccionan entre maltosa, manitol y glucosa en concentraciones que oscilan entre el 1 y el 9 % en peso.
22. Composiciones de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el excipiente es maltosa en una concentración del 4,5 % en peso.
23. Composiciones de acuerdo con las reivindicaciones 20-22 para administración inyectable local, locorregional, intraarticular o intraósea, en particular intraarticular.
24. Composiciones de acuerdo con las reivindicaciones 20-23 para uso en el tratamiento de la osteoartrosis.
25. Amidas de ácido hialurónico sulfatado de las reivindicaciones 1-9 para uso como agentes para la estabilización y liberación controlada de medicamentos.
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