KR20210142146A - 멸균시에 불안정한 약제의 안정화 및 제어-방출 시스템 - Google Patents

멸균시에 불안정한 약제의 안정화 및 제어-방출 시스템 Download PDF

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KR20210142146A
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KR1020217033471A
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크리스티안 구아리세
카를로 피초카로
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피디아 파마슈티치 에스.피.에이.
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Abstract

본원에는 황산화 히알루론산의 알케닐아미드, 및 국소 및/또는 국소영역으로, 특히 관절내로 투여될 수 있는 미셀 현탁액 형태의 약제의 안정화 및 방출을 위한 이의 용도가 개시되어 있다.

Description

멸균시에 불안정한 약제의 안정화 및 제어-방출 시스템
본 발명은 황산화 히알루론산의 알케닐아미드, 및 국소 (locally) 및/또는 국소영역으로 (locoregionally), 특히 관절내로 투여될 수 있는 미셀 현탁액 (micellar suspensions) 형태의 약제의 안정화 및 방출을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
약제의 전신 독성 또는 약동학과 관련된 문제를 극복하기 위해, 국소 또는 국소영역 투여에 대한 연구가 증가하고 있으며; 수술 부위에 약제를 이용 가능하게 하면 투여되는 용량이 감소되어, 부작용의 가능성을 추가로 감소시킬 수 있다. 이러한 이점은 지속적인 투여를 필요로 하는 만성 장애, 또는 병인학적 및 생화학적으로 복잡한 장애의 치료에서 특히 중요하다. 상기 장애들의 가장 중요한 예들 중 하나는 골관절염 (osteoarthrosis: OA)으로, 이는 기계적 및 생화학적 상호작용의 복잡한 시스템으로부터 기인하여, 최종적으로 관절 조직의 악화를 초래한다. 초기 손상 기전은 대부분 알려져 있지 않지만, 관절 연골내 아그레칸 (aggrecan) 및 프로테오글리칸 (proteoglycan) 함량의 감소, 타입 II (유리질 연골 (hyaline cartilage)에 존재)에 비해 타입 I (연골하) 콜라겐의 증가, 연골세포의 대사 및 이화 활성의 불균형, 및 (특히) 메탈로프로테이나제, 사이토카인 및 염증 효소의 과발현과 함께, 관절내 효소 활성의 막대한 불균형과 같은, 연골에 후속하여 연골하골에서 변형이 발생하는 것으로 알려져 있다. 이들 모두는 처음에는 표면에서 관절내 연골의 균열을 초래하고, 그 다음에는 연골의 전체 두께에 영향을 미치며, 가장 심각한 경우에는 연골하골의 미란 (erosion)으로 이어지고, 잘 알려진 임상 증상이 나타난다. 최신 발견에 따르면, 효과적인 치료 전략의 확인을 위한 초점은 연골 및 연골하골 사이의 체액 누화 (humoral crosstalk)에서 찾을 수 있다.
그러므로 골관절염 치료의 새로운 영역은 상기 장애의 복잡성을 고려한 다인자적 접근법 (multifactorial approach)을 채택해야 한다.
수많은 약제가 서술되었으며, 이 중 일부는 또한 다양한 OA 모델에서 인 비트로 활성을 나타내어 임상 목적에 잠재적으로 유용하므로 다른 장애에도 사용된다. 그러나, 인간 사용을 위한 전신용 제제의 개발은 종종 독성 및 약동학 문제로 인해 크게 제한된다.
이러한 측면을 다루기 위한 전략으로는 전신 약동학 및 독성 문제를 제거하는, 국소 또는 국소영역, 특히 관절내 투여가 있다. 관절내 투여는 비-수성 용매에서 흔히 발생하는 국소 염증 이벤트를 발생시키지 않고, 활액으로 분산 및 통합될 수 있는 수성 용매의 제제를 필요로 한다. 상기 제제의 pH는 진행 중인 장애로 인해 이미 변경된 관절에서 불균형이 형성되지 않도록 하기 위해, 생리학적 pH와 동일하거나 또는 매우 유사해야 한다. 상기 제제는 또한 활성 성분이 국소적으로, 장기간 점진적으로 방출되어, 투여 부위에 국한되어야 한다. 마지막으로, 운반되는 활성 성분은 표준 방법에 따라 멸균 조건하에 안정해야 한다.
이러한 요건은 관절 구획 외부의 국소영역 적용에도 적용된다.
그러나, 상기 기재된 분야에서 가장 큰 관심을 받고 있는 많은 약제들은 일반적으로 pH 변화에 다소 민감하고, 가열 멸균에 불안정하며, 주로 소수성 특성을 갖는다. 친수성인 경우, 이들은 수용액에서 매우 빠르게 침전되는 경향이 있으므로, 투여 후에 약리학적 효과가 나타나기 위한 충분한 체류 시간을 제공하지 않는다.
국소영역 투여를 위해 연구된 약제의 예는 라파마이신 (시롤리무스), 스타틴, 칼시토닌, 에베롤리무스, 파클리탁셀 및 스테로이드 화합물을 포함한다.
라파마이신 (rapamycin)은 마크로라이드계 항생제 (macrolide antibiotic)로, 수성 용매 중에 완전히 불용성이며, 장기 이식 후에 거부 반응을 예방하고, 재협착을 방지하기 위해 사용되는 스텐트용 코팅제로 널리 사용되고 있다. 이는 또한 인간 연골세포에서 오토파지 (autophagy)를 활성화하는 능력 및 mTOR에 대한 억제 작용을 통해, OA의 발병을 예방하는 측면에서, 관절에 미치는 이의 영향에 대해 연구되었다 ( Arthritis Res Ther , 2014, 16, 482). mTOR (라파마이신의 포유동물 표적)은 세포 성장, 증식, 이동 및 생존을 조절하는 세린 및 트레오닌의 인산화를 담당하는 단백질-키나제 (protein-kinase)이고; 이는 또한 골관절염을 앓고 있는 환자에서 일어나는 연골 퇴행 과정에 크게 관여한다. 그러므로 라파마이신에 의한 mTOR의 억제는 현재 관절 골관절염에 대응하는 흥미로운 전략을 나타낼 수 있다.
심바스타틴 (simvastatin), 일반적으로 스타틴 (statins)은, 잘 알려진 콜레스테롤-감소 효과에 추가하여, 항염증 효과 (MMP의 억제) 및 골모세포/파골세포 균형을 조절하는 능력에 대해 얼마 동안 조사되었다. 일반적으로 스타틴은 물에 불용성이고, 산 및 염기성 pH에서 불안정하며, 가열-멸균이 가능하지 않다.
트리암시놀론 (triamcinolone) 및 코르티손 (cortisones)은 일반적으로 OA의 관절내 치료에 널리 사용되지만, 물에는 불용성이다.
칼시토닌 (calcitonin)은 연골 동화작용에 대한 이의 효과를 위해 사용되며; 이는 수성 담체 중에 완전히 불용성은 아니지만, 매우 빠르게 침전되는 경향이 있어서, 적절한 방출 프로파일을 방해한다. 이는 또한 가열 멸균에 불안정하다.
아직 개발 중인 다른 약제에는 RN-1747, 4α-포르볼 12,13-디데카노에이트 (4αPDD) 및 아라키돈산을 포함하며, 이는 TRPV4와 같은 특정 이온 채널에 작용한다. 이는 칼슘-매개 신호 생성에 관여하는 광범위한 조직에서 발현되는 채널로, 세포 부피의 유지 및 항상성과 같은 중요한 기능에 기여한다. 이는 또한 TRPV4가 근골격 및 연골 조직 및 골 조직의 발달 및 유지에 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었고; TRPV4 기능장애는 염증의 출현 및 골관절염 관절 문제와 밀접한 관련이 있다 (McNaughty, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2015, 388, 437-450). 그러므로 TRPV4의 올바른 활성화를 조절할 수 있다는 것은 골관절염 질환 치료에 중요한 표적이 된다. 상기 설명된 약제는 TRPV4 채널의 효능제이므로, 이의 활성화를 조절할 수 있어서, 상기 설명된 목적에 잠재적으로 사용할 수 있지만, 이들이 (RN-1747의 경우에서와 같이) 물에 잘 녹지 않거나 또는 심지어는 불용성이라는 사실은 이들의 임상 사용을 배제한다.
결과적으로 제제화 및 멸균 단계 모두에서 기재된 분자의 안정화를 허용하고, 동시에 투여 부위에서 제어 방출을 허용하는 시스템에 대한 명백한 필요성이 있다.
US20160279108은 방향족 기를 함유하는 링커를 통해 라파마이신과 저분자량 히알루론산을 접합하여 림프계를 통과하여 림프절에 축적될 수 있는 수용성 유도체를 수득하는 것이 기재되어 있다. WO2017044135는 인지질 리포솜으로 캡슐화된 라파마이신을 포함하는 제제를 기재하고 있으며, 이들은 약제를 운반하지만, 상대적으로 크고 (최대 2μm), pH, 이온 강도, 담체 구배 등에 대한 민감성 때문에 제제화에 문제를 일으킬 수 있다. 폴리머 입자 (폴리락트산, 폴리글리콜산 등)에 난용성인 약제에 대한 캡슐화 시스템 (encapsulation systems)이 또한 기재되어 있다. 마지막으로, 알려진 제어-방출 시스템에는 고도로 수화 가능한 폴리머 (고분자량 히알루론산, 콜라겐, 알긴산 및 알기네이트 등)를 기반으로 하는 하이드로겔을 포함하고, 이는 하이드로겔 메쉬에 약물을 유지하거나 또는 상기 하이드로겔 구조가 분해되면서 이를 서서히 방출한다 (WO2013179258).
EP0702699 및 WO2017085622에 기재된 황산화 히알루론산 (HAS)은 피부 장벽을 쉽게 통과하여, 약리학적 활성 물질의 통과를 촉진한다. 보다 최근에, HAS는 염증 유발 및 항-염증 모두를 포함하는, 수많은 사이토카인의 활성 조절에 의해 매개되는 항-염증 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 HAS는 사이토카인 수준의 변경에 의해 매개되는 장애 (WO2010130468 및 WO2010130466에 보고된 바와 같은, 류마티스 관절염, 천식, 전신 및 피부 자가면역 질환, 바이러스 감염, 아토피성 피부염, 습진, 백반증 및 림프종)의 치료에 사용될 수 있다.
발명의 설명
표준 방법에 의한 멸균시에 불안정하고 및/또는 제제화하기 어려운 약제의 안정화 및 제어 방출 시스템이 본 발명에서 발견되었고, 이는 약제를 황산화 히알루론산 (HAS)의 알케닐아미드와 혼합하고, 후속하여 초음파 처리하는 단계를 포함한다. 상기 설페이트 기는 하이드로겔의 형성 없이 히알루론산을 수용성으로 만들고, 이를 여과에 의해 멸균 가능하게 하며, C4-C20 알케닐아민과의 아미드화 (amidation)는 수용성이 아닌 화합물과 혼화되는데 필요한 부분적으로 소수성 특성을 HAS에 제공한다.
초음파 처리는 수성 담체 (HAS) 중에 균일하게 현탁된 미셀 구조의 형성을 유발하고; 상기 현탁액은 오토클레이브와 같은 알려진 기술을 사용하여, 가열 또는 여과에 의해 멸균될 수 있다.
수득된 현탁액은 또한 동결-건조되고, 실온에서 보관되며, 활성 성분의 역가 손실 없이 멸균 수성 담체로 사용 시에 재구성될 수 있고, 무엇보다도 상기 활성 성분을 원하는 부위에 투여 후에 제어된 방식으로 방출할 수 있다.
C4-C20 알케닐아민과 황산화 히알루론산의 아미드는 신규하고, 본 발명의 제1 목적을 구성한다.
본 발명의 제2 목적은 C4-C20 알케닐아민을 갖는 황산화 히알루론산 아미드, 및 소수성 또는 친수성 약제의 수성 미셀 현탁액이다.
본 발명의 제3 목적은 하기 단계를 포함하는 미셀 현탁액을 제조하는 방법이다:
- 축합제의 존재하에 비양성자성 무극성 용매 중에서 C4-C20 알케닐아민을 황산화 히알루론산의 벤잘코늄 또는 테트라부틸암모늄 염과 반응시키는 단계;
- 상기 단계로부터 수득된 황산화 히알루론산 아미드를 약제의 수성 현탁액 또는 용액과 혼합하는 단계;
- 상기 혼합물을 초음파 처리 및 멸균 여과하는 단계.
본 발명은 또한 상기 미셀 현탁액 및 선택적 부형제를 포함하는 약학적 조성물, 및 골관절염의 치료를 위해 국소, 국소영역, 관절내 또는 골내 주사 가능한 투여, 특히 관절내 주사를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명에서 사용되고, 황산화 및 후속하는 아미드화를 수행하기 위한 출발 히알루론산은 예를 들어 수탉 벼슬 (rooster combs)로부터의 추출 (EP138572), 스트렙토코커스 (Streptococcus)로부터의 발효 (WO2018020458; WO2019016699), 또는 바실러스 (Bacillus)로부터의 생합성 (WO2012032154)과 같은 알려진 방법에 의해 수득되고 정제될 수 있다. 스트렙토코커스로부터 생성 및 정제되고, 중량 평균 MW가 100,000 내지 250,000 Da, 특히 180,000 내지 230,000 Da의 범위 (이후, "MW 200 kDa"로 지칭됨)인 HA, 또는 중량 평균 MW가 500,000 내지 730,000 Da의 범위인 HA가 바람직하며, MW 200 kDa를 갖는 HA가 특히 바람직하다. 여기서 "평균 분자량 (Average Molecular Weight)" (MW)은 "고유 점도 (intrinsic viscosity)" 방법에 의해 계산되는, 중량-평균 MW (weight-average MW)를 의미한다 (Terbojevich et al., Carbohydr. Res., 1986, 363-377).
상기 기재된 HA 분획은 특히 EP702699 및 WO2017085622에 기재된 방법을 참조하여, 알려진 절차에 의해 황산화된다.
본 발명에 따른 아미드에서 디사카라이드 단위 (disaccharide unit) 당 설페이트 기의 수 (황산화도 (degree of sulfation))는 0.5 내지 3.5의 범위이다. 0.5 내지 1.5 (HAS-1), 1.5 내지 2.5 (HAS-2) 또는 2.5 내지 3.5 (HAS-3) 범위의 황산화도가 편리하게 사용될 수 있다. 0.5 내지 1.5 범위의 황산화도를 갖는 HAS (HAS-1)가 바람직하게 사용된다.
HAS 카복실기는 본 발명에 따라 C4-C20 알케닐아민과 반응하여 아미드 결합을 형성한다. 일반적으로, 유도체화에 관여하지 않는 기능은 알칼리 또는 알칼리 토금속 이온, 바람직하게는 Na+로 염화된다. 상기 아미드화는 알려진 기술, 바람직하게는 EP1095064에 기재된 바와 같이 적절하게 수정하여 수행된다.
알케닐아민의 몰/HAS 이량체의 몰로 표시되는, HAS의 몰% 유도체화도 (아미드화)는 5 내지 30%, 바람직하게는 10 내지 25%, 더 바람직하게는 10 내지 17%의 범위이다.
상기 알케닐아민은 바람직하게는 1개 또는 2개의 불포화도, 더 바람직하게는 1개의 불포화도를 함유한다. 바람직한 아민의 예는 올레일아민, (2E)-헥스-2-엔-1-아민 및 펜트-2-엔-1-아민이다. 올레일아민이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 황산화 히알루론산 올레일아미드의 구조적 서브유닛의 도식적 구조식을 하기에 나타낸다:
Figure pct00001
본 발명에 따른 아미드는 열 처리에 안정하고, 그러므로 아미드 결합이 열에 안정하기 때문에 오토클레이브에서 멸균될 수 있다. 이들은 또한 0.2 μm에서 여과에 의해 멸균될 수 있고, 소수성 및 친수성 약제 모두와 혼화성이 있고, 수성 용매 중에 현탁되거나 또는 가용화되며, 상기 약제를 운반하고 이의 방출을 조절하는 미셀 입자의 수성 현탁액을 형성한다. 상기 수성 미셀 현탁액은 동결-건조되고, 실온에서 보관되며, 활성 성분의 역가 손실이 있는 수성 용매로 재구성될 수 있다.
상기 미셀의 크기는 5 내지 200 nm, 바람직하게는 10 내지 50 nm의 범위이다.
상기 미셀 현탁액 중 아미드 농도는 4 내지 20 mg/mL의 범위이다.
상기 올레일아미드의 바람직한 농도는 13 mg/mL이다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 약제의 예는 라파마이신, 트리암시놀론, 스타틴 (특히 심바스타틴), 칼시토닌, RN-1747, 4α-포르볼 12,13-디데카노에이트 (4αPDD), 에베롤리무스, 파클리탁셀 및 아라키돈산이다. 라파마이신이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 미셀 현탁액에 로딩될 수 있는 약제의 농도는 약제 자체의 소수성 및 HAS의 원하는 아미드화도에 의존하므로, 상기 특성들의 균형을 맞추어 조절될 수 있다.
그러므로, 본 발명에 따른 미셀 현탁액은 180,000 내지 230,000 Da 범위의 중량 평균 MW 또는 500,000 내지 730,000 Da 범위의 중량 평균 MW를 갖는 HA로부터 제조되는, 0.5 내지 1.5 (HAS-1), 1.5 내지 2.5 (HAS-2) 또는 2.5 내지 3.5 (HAS-3) 범위의 황산화도를 갖는 황산화 히알루론산 (HAS)의 아미드로 구성되고; 아미드화는 C4-C20 알킬아민, 바람직하게는 올레일아민, (2E)-헥스-2-엔-1-아민 및 펜트-2-엔-1-아민으로 수득되며; 알케닐아민의 몰/HAS 이량체의 몰로 표시되는, HAS의 몰 유도체화도 (아미드화)는 5 내지 30%의 범위이고; 상기 미셀 현탁액 중 아미드 농도는 4 내지 20 mg/mL의 범위이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 미셀 현탁액은 180,000 내지 230,000 Da 범위의 중량 평균 MW를 갖는 HA로부터 제조되는, 0.5 내지 1.5 (HAS-1) 범위의 황산화도를 갖는 황산화 히알루론산 (HAS) 아미드로 구성되고; 아미드화는 올레일아민으로 수득되며; 알케닐아민의 몰/HAS 이량체의 몰로 표시되는, HAS의 몰 유도체화도 (아미드화)는 10 내지 17%의 범위이고; 상기 미셀 현탁액 중 아미드 농도는 바람직하게는 13 mg/mL이다. 본 발명에 따른 미셀 현탁액은 소수성 약제를 아미드를 함유하는 버퍼 용액 중에 분산시킨 다음에, 초음파 배스에서 초음파 처리하고, 후속하여 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 생성물을 멸균함으로써 수득된다. 상기 버퍼는 바람직하게는 pH=7의 PBS 포스페이트 버퍼, pH 5 내지 8 범위의 2-N-모르폴리노 메탄설폰산, pH 5 내지 8 범위의 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에틸설폰산이고, 더 바람직하게는 pH=7의 PBS이다. 사용하는 약제가 수용성인 경우, 버퍼 용액 중에 분산되지 않고, 용해된다.
그러므로 개략적으로, 본 발명에 따른 안정화 및 제어 방출 시스템의 제조는 하기를 포함한다:
- HA-Na 또는 HA-TBA (테트라부틸암모늄 염)로부터의 나트륨 염 형태의 원하는 등급의 HAS의 합성;
- HAS-Na로부터 HAS 벤잘코늄 염 (BA) 또는 TBA 염의 제조;
- 상기 HAS-BA 또는 HAS-TBA 카복실의 C4-C20 알케닐아민에 의한 부분 유도체화;
- 미셀 현탁액 형태의 HAS-알케닐아미드/약제 제제의 제조.
상기 미셀 현탁액은 멸균 후에 "그대로 (as is)" 투여될 수 있거나, 또는 말토스, 만니톨 또는 글루코스와 같은 부형제를 상기 제제 중량의 1 내지 9 중량% 범위의 농도로 부가할 수 있고, 바람직하게는 말토스를 4.5 중량%의 농도로 부가할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 예시한다.
실시예 1: HAS1의 합성
1.1 HA 나트륨 염으로부터 HAS1-Na의 합성.
4.0 g (9.96×10-3 mol; 1 eq)의 HA-Na (HA MW 200 kDa)를 220 mL의 DMSO 중에 분산시키고, 3.6 mL의 메탄설폰산 (5 eq)을 부가한 후에, 상기 혼합물을 실온 (RT)에서 24시간 동안 교반하에 두었다. 용해가 완료되면, 12.8 g (8 eq)의 피리딘 삼산화황 (Pyr
Figure pct00002
SO3)을 부가하였다. 실온에서 밤새 정치한 후에, 생성물을 에탄올 (EtOH)로 침전시키고; 수득된 침전물을 Gooch 도가니 (crucible)를 통해 여과하고, EtOH로 2회 세척하고, 150 mL의 탈이온수 중에 재용해시키고; 8 mL의 NaCl 포화 용액 및 115 mL의 DMSO를 부가하고, pH를 3M NaOH를 사용하여 3.4 ± 0.1로 조정하였다. 생성물을 440 mL의 EtOH로 침전시키고; 수득된 침전물을 Gooch 도가니를 통해 여과하고, EtOH/H2O (80:20)의 혼합물 및 EtOH로 세척하고, 마지막으로 37℃에서 진공 건조시켰다.
HAS1-Na 7.78 g을 황백색 분말로 수득하였다. (수율: 97.6%).
1.2 HA TBA 염으로부터 HAS1-Na의 합성.
2.0 g (3.22×10-3 mol; 1 eq)의 HA-TBA (HA MW 200 kDa)를 200 mL의 DMSO 중에 용해시켰다. 용해가 완료되면, 1.28 g (2.5 eq)의 피리딘 삼산화황 (Pyr
Figure pct00003
SO3)을 부가하였다. RT에서 밤새 정치한 후에, 생성물을 에탄올 (EtOH)로 침전시키고; 수득된 침전물을 Gooch 도가니를 통해 여과하고, EtOH로 2회 세척하고, 150 mL의 탈이온수 중에 재용해시키고; 8 mL의 NaCl 포화 용액 및 115 mL의 DMSO를 부가하고, pH를 3M NaOH를 사용하여 3.4 ± 0.1로 조정하였다. 생성물을 430 mL의 EtOH로 침전시키고; 수득된 침전물을 Gooch 도가니를 통해 여과하고, EtOH/H2O (80:20)의 혼합물 및 EtOH로 세척하고, 마지막으로 37℃에서 진공 건조시켰다.
HAS1-Na 1.52 g을 황백색 분말로 수득하였다. (수율: 93.8%).
실시예 2: HAS1-BA (벤잘코늄)로부터 HAS1-올레일아미드 [10%] 접합체의 합성
2.5 g (5.0×10-3 mol, 1 eq)의 HAS1-Na를 100 mL의 탈이온수 중에 용해시키고; 3.0 g의 벤잘코늄 클로라이드 (BA+Cl-)를 100 mL의 탈이온수 중에 별도로 용해시켰다. 가용화가 완료되면, 상기 BA+Cl- 용액을 상기 HAS1 용액에 부가하여, 침전물을 수득하고, 이를 Gooch 도가니를 통해 여과하고, H2O, 에탄올, 그 다음에 아세톤으로 세척하고, 고진공하에 회전 증발기 (rotavapor)에서 건조시켰다. 분리된 HAS1-BA 침전물을 160 mL의 DMSO 중에 용해시키고; 그 다음에 0.114 g (0.14 eq)의 CDI (카보디이미드) 및 0.10 mL의 메탄설폰산 (0.3 eq)을 부가하였다. 30분 후에, 40℃에서 교반하면서, 1.32 mL (0.8 eq)의 올레일아민을 부가하고, 상기 반응을 40℃에서 밤새 천천히 교반하면서 지속하였다. 다음날, 16 mL의 NaCl 포화 용액을 부가하고, 생성물을 에탄올로 침전시켰다. 수득된 침전물을 Gooch 도가니를 통해 여과하고, 2 부피의 에탄올/H2O 혼합물 (85:15)로 세척한 다음에, 에탄올로 세척하고, 마지막으로 아세톤으로 세척하였다. 수득된 생성물을 50 mL의 탈이온화된 H2O 중에 용해시키고, PBS 버퍼 pH 7에서 3일 동안, H2O에서 1일 동안 투석하였다 (컷-오프 (cut-off) = 12,000-14,000 Da의 Spectra/Por® 투석막). 마지막으로, 투석된 생성물을 동결 및 동결-건조하였다. 황백색 분말 1.9 g을 수득하였다. (수율: 72.2%).
특성 규명: 유도체화도는 1H-NMR 분석에 의해 계산되었다: 20 mg의 HAS1-올레일아미드를 1 mL의 D2O 중에 용해시키고, Bruker Advance 분광계 (300 MHz)로 분석하였다. 유도체화도를 결정하는데 사용된 신호는 하기와 같았다: δ 0.6-0.9 (t, 3H, HAS1-CONH-(CH2)8-CH=CH-(CH2)7-CH 3 ), δ 1.9-1.7 (s, 3H, HAS1-NHCO·CH 3 ) (올레일아미드의 몰 대 HAS1 반복 단위의 몰).
실시예 3: HAS1-TBA로부터 HAS1-올레일아미드 [10%] 접합체의 합성
a) 약 10 g의 Amberlyst 설폰산 수지를 재킷형 컬럼 (jacketed column)에서 MilliQ H2O로 5회 세척하였다 (상기 수지는 컬럼 부피의 약 절반을 차지함). 20 mL의 55% TBA-OH 용액을 부가하고, 진탕하고, 실온에서 2시간 동안 상기 수지와 접촉시킨 상태로 두었다. 상기 수지를 약 0.5 L의 MilliQ H2O로, 상기 용출액의 pH가 10.5 미만 (pH=10.48)으로 떨어질 때까지 세척하였다.
30 mL의 H2O 중에 용해된 2.5 g (5.0×10-3 mol, 1 eq)의 HAS1Na를 로딩하고, 5 mL/분으로 삼출시키고, 추가 60 mL로 세척하였다. 용출액을 수집하고, 동결 및 동결-건조하고; 3.9 g의 HAS1-TBA를 연황색 동결건조물의 형태로 수득하였다.
b) 분리된 HAS1-TBA 유도체를 160 mL의 DMSO 중에 용해시키고; 그 다음에 0.114 g (0.14 eq)의 CDI (카보디이미드) 및 0.10 mL의 메탄설폰산 (0.3 eq)을 부가하였다. 30분 후에, 40℃에서 교반하면서, 1.32 mL (0.8 eq)의 올레일아민을 부가하고, 상기 반응을 40℃에서 밤새 천천히 교반하면서 지속하였다. 다음날 16 mL의 NaCl 포화 용액을 부가하고, 생성물을 에탄올로 침전시켰다. 수득된 침전물을 Gooch 도가니를 통해 여과하고, 2 부피의 에탄올/H2O의 혼합물 (85:15)로 세척한 다음에, 에탄올로 세척하고, 마지막으로 아세톤으로 세척하였다.
황백색 분말 2.5 g을 수득하였다. (수율: 94.1%).
실시예 2에 기재된 바와 같이 1H-NMR 분석에 의한 특성규명 후에, 유도체화도는 10.6 ± 0.8% mol/mol (올레일아미드의 몰 대 HAS1 반복 단위의 몰)로 결정되었다.
실시예 4: HAS1-TBA로부터 HAS1-올레일아미드 [17%]의 합성
실시예 3의 단락 a)에 기재된 바와 같이 HAS1-TBA 유도체를 제조한 후에, 합성을 하기와 같이 진행하였다:
2.5 g (5.0×10-3 mol, 1 eq)의 분리된 HAS1-TBA 유도체를 160 mL의 DMSO 중에 용해시키고; 그 다음에 0.163 g (0.2 eq)의 CDI (카보디이미드) 및 0.10 mL의 메탄설폰산 (0.3 eq)을 부가하였다. 30분 후에, 40℃에서 교반하면서, 1.32 mL (0.8 eq)의 올레일아민을 부가하고, 상기 반응을 40℃에서 밤새 천천히 교반하면서 지속하였다. 다음날 16 mL의 NaCl 포화 용액을 부가하고, 생성물을 에탄올로 침전시켰다. 수득된 침전물을 Gooch 도가니를 통해 여과하고, 2 부피의 에탄올/H2O 혼합물 (85:15)로 세척한 다음에, 에탄올로 세척하고, 마지막으로 아세톤으로 세척하였다. 스펀지형 백색 생성물 2.6 g을 수득하였다. (수율: 96.1%).
실시예 2에 기재된 바와 같이 1H-NMR 분석에 의한 특성 규명 후에, 유도체화도는 17.3 ± 1.2% mol/mol (올레일아미드의 몰 대 HAS1 반복 단위의 몰)로 결정되었다.
실시예 5: HAS1-TBA로부터 HAS1-올레일아미드 [25%]의 합성
실시예 3의 단락 a)에 기재된 바와 같이 HAS1-TBA 유도체를 제조한 후에, 합성을 하기와 같이 진행하였다:
2.5 g (5.0×10-3 mol, 1 eq)의 분리된 HAS1-TBA 유도체를 160 mL의 DMSO 중에 용해시키고; 그 다음에 0.285 g (0.35 eq)의 CDI (카보디이미드) 및 0.15 mL의 메탄설폰산 (0.45 eq)을 부가하였다. 30분 후에, 40℃에서 교반하면서, 1.32 mL (0.8 eq)의 올레일아민을 부가하고, 상기 반응을 40℃에서 밤새 천천히 교반하면서 지속하였다. 다음날 16 mL의 NaCl 포화 용액을 부가하고, 생성물을 에탄올로 침전시켰다. 수득된 침전물을 Gooch 도가니를 통해 여과하고, 2 부피의 에탄올/H2O 혼합물 (85:15)로 세척한 다음에, 에탄올로 세척하고, 마지막으로 아세톤으로 세척하였다. 스펀지형 백색 생성물 2.6 g을 수득하였다. (수율: 94.5%).
실시예 2에 기재된 바와 같이 1H-NMR 분석에 의한 특성 규명 후에, 유도체화도는 24.5 ± 1.5% mol/mol (올레일아미드의 몰 대 HAS1 반복 단위의 몰)로 결정되었다.
실시예 6: HAS2-TBA로부터 HAS2-올레일아미드 [10%]의 합성
사용되는 피리딘 삼산화황 (Pyr
Figure pct00004
SO3)의 양 (16 g)만 변경하여, 실시예 1.1에 기재된 절차에 의해 HAS2를 제조하였다.
실시예 3의 단락 a)에 기재된 바와 같이 HAS2-TBA 유도체를 제조한 후에, 합성을 하기와 같이 진행하였다:
2 g (3.3×10-3 mol, 1 eq)의 HAS2-TBA를 160 mL의 DMSO 중에 용해시키고; 그 다음에 0.074 g (0.14 eq)의 CDI (카보디이미드) 및 0.06 mL의 메탄설폰산 (0.3 eq)을 부가하였다. 30분 후에, 40℃에서 교반하면서, 1.08 mL (0.8 eq)의 올레일아민을 부가하고, 상기 반응을 40℃에서 밤새 천천히 교반하면서 지속하였다. 다음날 16 mL의 NaCl 포화 용액을 부가하고, 생성물을 에탄올로 침전시켰다. 수득된 침전물을 Gooch 도가니를 통해 여과하고, 2 부피의 에탄올/H2O 혼합물 (85:15)로 세척한 다음에, 에탄올로 세척하고, 마지막으로 아세톤으로 세척하였다.
스펀지형 연황백색 생성물 2.0 g을 수득하였다. (수율: 94.5%).
실시예 2에 기재된 바와 같이 1H-NMR 분석에 의한 특성 규명 후에, 유도체화도는 9.8 ± 0.6% mol/mol (올레일아미드의 몰 대 HAS2 반복 단위의 몰)로 결정되었다.
실시예 7: HAS1-TBA로부터 HAS3-올레일아미드 [11%]의 합성
사용되는 피리딘 삼산화황 (Pyr
Figure pct00005
SO3)의 양 (20.8 g)만 변경하여, 실시예 1.1에 기재된 절차에 의해 HAS3을 제조하였다.
실시예 3의 단락 a)에 기재된 바와 같이 HAS3-TBA 유도체를 제조한 후에, 합성을 하기와 같이 진행하였다:
2 g (2.8×10-3 mol, 1 eq)의 HAS3-TBA를 160 mL의 DMSO 중에 용해시키고; 그 다음에 0.063 g (0.14 eq)의 CDI (카보디이미드) 및 0.05 mL의 메탄설폰산 (0.3 eq)을 부가하였다. 30분 후에, 40℃에서 교반하면서, 0.73 mL (0.8 eq)의 올레일아민을 부가하고, 상기 반응을 40℃에서 밤새 천천히 교반하면서 지속하였다. 다음날 16 mL의 NaCl 포화 용액을 부가하고, 생성물을 에탄올로 침전시켰다. 수득된 침전물을 Gooch 도가니를 통해 여과하고, 2 부피의 에탄올/H2O 혼합물 (85:15)로 세척한 다음에, 에탄올로 세척하고, 마지막으로 아세톤으로 세척하였다.
스펀지형 연황백색 생성물 1.7 g을 수득하였다. (수율: 93.9%).
실시예 2에 기재된 바와 같이 1H-NMR 분석에 의한 특성 규명 후에, 유도체화도는 11.1 ± 0.6% mol/mol (올레일아미드의 몰 대 HAS3 반복 단위의 몰)로 결정되었다.
실시예 8: 제제 HAS1-올레일아미드 (13 mg/mL)/라파마이신의 제조
실시예 3에서와 같이 제조된 HAS1-올레일아미드 65 mg (유도체화도 10% mol)을 50 mL 시험관에서 칭량하고, 20 mg의 라파마이신 (1CHEM LP) 및 5.0 mL의 PBS pH7을 부가하였다. 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 10분 동안 초음파 처리 (Sonifer 250 sonicator)한 다음에, Sartorius 셀룰로스 아세테이트 필터로 0.2 μM에서 여과하였다.
제제 중 라파마이신 함량 분석:
HPLC-MS Agilent 1260 시스템: Kinetex C8 컬럼; 유속: 0.35 ml/분; 216 nm에서 UV 검출기; 이동상 (MP): 암모늄 아세테이트 (2 g/L) (A); 아세토니트릴 (B); 구배: 3분 동안 이동상 (B)의 40%, 그 다음에 4분 내에 (B)의 40%에서 97% 구배.
0.14 mg/mL의 라파마이신 표준을 주입하여 보정된 시스템 (라파마이신을 아세토니트릴 (ACN) 중에 1.4 mg/mL로 용해시키고, MP (40%(B)/60%(A))를 사용하여 1/10로 희석시킴). 체류 시간: 7.6분
상기 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제를 MP (40% (B)/60% (A))에서 1/3로 희석시키고, HPLC에 직접 주입하였다. 라파마이신 체류 시간: 7.6분. 정량 분석은 라파마이신 표준의 면적을 참조하여 수행하였다. MS 분석으로 라파마이신의 구조 및 분해 산물의 부재를 확인하였다 (이론적 MS 914.2; 측정된 MS 914.3+Na+). 제제에서 검출된 라파마이신 함량: 0.16 mg/mL.
실시예 9: 제제 HAS1-올레일아미드 (9 mg/mL)/라파마이신의 제조
실시예 3에서와 같이 제조된 HAS1-올레일아미드 65 mg (유도체화도 10% mol)을 50 mL 시험관에서 칭량하고, 20 mg의 라파마이신 (1CHEM LP) 및 5.0 mL의 PBS pH7을 부가하였다. 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 10분 동안 초음파 처리 (Sonifer 250 sonicator)한 다음에, Sartorius 셀룰로스 아세테이트 필터로 0.2 μM에서 여과하였다.
실시예 8에서와 같이 분석된 제제 중 라파마이신 함량: 0.15 mg/mL.
실시예 10: 제제 HAS1-올레일아미드 (13 mg/mL)/라파마이신의 제조
실시예 4에서와 같이 제조된 HAS1-올레일아미드 65 mg (유도체화도 17% mol)을 50 mL 시험관에서 칭량하고, 20 mg의 라파마이신 (1CHEM LP) 및 5.0 mL의 PBS pH7을 부가하였다. 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 10분 동안 초음파 처리 (Sonifer 250 sonicator)한 다음에, Sartorius 셀룰로스 아세테이트 필터로 0.2 μM에서 여과하였다.
실시예 8에서와 같이 분석된 제제 중 라파마이신 함량: 0.21 mg/mL.
실시예 11 (비교예): PBS 중 라파마이신 제제의 제조
20 mg의 라파마이신을 50 mL 시험관에서 칭량하고, 5.0 mL의 PBS pH7을 부가하며; 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 10분 동안 초음파 처리 (Sonifer 250 sonicator)한 다음에, Sartorius 셀룰로스 아세테이트 필터로 0.2 μM에서 여과하였다. 실시예 8에서와 같이 분석된 제제 중 라파마이신 함량: 0.00 mg/mL.
실시예 12: 제제 HAS1-올레일아미드 (13 mg/mL)/RN-1747의 제조
실시예 3에서와 같이 제조된 HAS1-올레일아미드 65 mg (유도체화도 10% mol)을 50 mL 시험관에서 칭량하고, 21.5 mg의 RN-1747 (Key Organics), 4.0 mL의 PBS pH7 및 0.5 mL의 1M HCl을 부가하고; 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 10분 동안 초음파 처리 (Sonifer 250 sonicator)한 다음에, 0.5 mL의 1M NaOH로 pH 7로 조정한 다음에, Sartorius 셀룰로스 아세테이트 필터로 0.2 μM에서 여과하였다.
제제 중 RN-1747 함량 분석:
HPLC-MS Agilent 1260 시스템: Kinetex C8 컬럼; 유속: 0.35 ml/분; 216 nm에서 UV 검출기; 이동상 (MP): 암모늄 아세테이트 (2 g/L) (A); 아세토니트릴 (B); 구배: 3분 동안 이동상 (B)의 20%, 그 다음에 4분 내에 (B)의 20%에서 97% 구배.
0.15 mg/mL의 RN-1747 표준을 주입하여 보정된 시스템 (RN-1747을 ACN 중에 1.5 mg/mL로 용해시키고, MP (20% (B)/80% (A))를 사용하여 1/10로 희석시킴). 체류 시간: 8.4분
상기 HAS1-올레일아미드/RN-1747 제제를 MP (20% (B)/80% (A))에서 1/3로 희석시키고, HPLC에 직접 주입하였다. RN-1747 체류 시간: 8.4분. 정량 분석은 RN-1747 표준의 면적을 참조하여 수행하였다. MS 분석으로 RN-1747의 구조 및 분해 산물의 부재를 확인하였다 (이론적 MS 395.9; 측정된 MS 395.5+Na+). 제제에서 검출된 RN-1747 함량: 0.44 mg/mL.
실시예 13: 제제 HAS1-올레일아미드 (13 mg/mL)/심바스타틴의 제조
실시예 3에서와 같이 제조된 HAS1-올레일아미드 65 mg (유도체화도 10% mol)을 50 mL 시험관에서 칭량하고, 20.5 mg의 심바스타틴 (Fluorochem) 및 5.0 mL의 PBS pH7을 부가하고; 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 10분 동안 초음파 처리 (Sonifer 250 sonicator)한 다음에, 0.5 mL의 1M NaOH로 pH 7로 조정한 다음에, Sartorius 셀룰로스 아세테이트 필터로 0.2 μM에서 여과하였다.
제제 중 심바스타틴 함량 분석:
HPLC-MS Agilent 1260 시스템: Kinetex C8 컬럼; 유속: 0.35 ml/분; 216 nm에서 UV 검출기; 이동상: 암모늄 아세테이트 (2 g/L) (A); 아세토니트릴 (B); 구배: 3분 동안 이동상 (B)의 40%, 그 다음에 4분 내에 (B)의 40%에서 97% 구배.
0.3 mg/mL의 심바스타틴 표준을 주입하여 보정된 시스템 (심바스타틴을 ACN 중에 3.0 mg/mL로 용해시키고, MP (40% (B)/60% (A))를 사용하여 1/10로 희석시킴). 체류 시간: 7.1분
상기 HAS1-올레일아미드/심바스타틴 제제를 MP (40% (B)/60% (A))에서 1/3로 희석시키고, HPLC에 직접 주입하였다. 심바스타틴 체류 시간: 7.1분. 정량 분석은 심바스타틴 표준의 면적을 참조하여 수행하였다. MS 분석으로 심바스타틴의 구조 및 분해 산물의 부재를 확인하였다 (이론적 MS 418.3; 측정된 MS 418.6+Na+). 제제에서 검출된 심바스타틴 함량: 0.20 mg/mL.
실시예 14: 제제 HAS1-올레일아미드 (13 mg/mL)/트리암시놀론 아세토나이드의 제조
실시예 3에서와 같이 제조된 HAS1-올레일아미드 65 mg (유도체화도 10% mol)을 50 mL 시험관에서 칭량하고, 20.5 mg의 트리암시놀론 아세토나이드 (Spectrum) 및 5.0 mL의 PBS pH 7을 부가하고; 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 10분 동안 초음파 처리 (Sonifer 250 sonicator)한 다음에, 0.5 mL의 1M NaOH로 pH 7로 조정한 다음에, Sartorius 셀룰로스 아세테이트 필터로 0.2 μM에서 여과하였다.
제제 중 트리암시놀론 헥사세토나이드 함량 분석:
HPLC-MS Agilent 1260 시스템: Kinetex C8 컬럼; 유속: 0.35 ml/분; 216 nm에서 UV 검출기; 이동상 (MP): 암모늄 아세테이트 (2 g/L) (A); 아세토니트릴 (B); 구배: 3분 동안 이동상 (B)의 20%, 그 다음에 4분 내에 (B)의 20%에서 97% 구배.
0.3 mg/mL의 트리암시놀론 헥사세토나이드 표준을 주입하여 보정된 시스템 (트리암시놀론을 ACN 중에 3.0 mg/mL로 용해시키고, MP (20% (B)/80% (A))를 사용하여 1/10로 희석시킴). 체류 시간: 8.6분
상기 HAS1-올레일아미드/트리암시놀론 제제를 MP (20% (B)/80% (A))에서 1/3로 희석시키고, HPLC에 직접 주입하였다. 트리암시놀론 체류 시간: 8.6분. 정량 분석은 트리암시놀론 표준의 면적을 참조하여 수행하였다. MS 분석으로 트리암시놀론 헥사세토나이드의 구조 및 분해 산물의 부재를 확인하였다 (이론적 MS 532.6; 측정된 MS 532.3+Na+).
제제에서 검출된 트리암시놀론 헥사세토나이드 함량: 0.02 mg/mL.
실시예 15: 제제 HAS1-올레일아미드 (13 mg/mL)/연어 칼시토닌 (salmon calcitonin)의 제조
실시예 3에서와 같이 제조된 HAS1-올레일아미드 65 mg (유도체화도 10% mol)을 10 mL 시험관에서 칭량하고; 16.0 mg의 연어 칼시토닌 (Bachem), 및 5.0 mL의 0.2M CH3COONH4 pH 5.2를 부가하고, 상기 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 10분 동안 초음파 처리 (Sonifer 250 sonicator)한 다음에, Sartorius 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 0.2 μM에서 여과하였다. 제제 중 칼시토닌 함량 분석:
HPLC-MS Agilent 1260 시스템: Kinetex C8 컬럼; 유속: 0.35 ml/분; 254 nm에서 UV 검출기; 이동상 (MP): 암모늄 아세테이트 (2 g/L) (A); 아세토니트릴 (B); 구배: 3분 동안 이동상 (B)의 15%, 그 다음에 4분 내에 (B)의 15%에서 97% 구배.
0.8 mg/mL의 연어 칼시토닌 표준을 주입하여 보정된 시스템 (칼시토닌을 ACN 중에 8.0 mg/mL로 용해시키고, MP (15% (B)/85% (A))를 사용하여 1/10로 희석시킴). 체류 시간: 7.4분
상기 HAS1-올레일아미드/연어 칼시토닌 제제를 MP (15% (B)/85% (A))에서 1/3로 희석시키고, HPLC에 직접 주입하였다. 칼시토닌 체류 시간: 7.4분. 정량 분석은 연어 칼시토닌 표준의 면적을 참조하여 수행하였다. MS 분석으로 연어 칼시토닌의 구조 및 분해 산물의 부재를 확인하였다 (이론적 MS 3431.9; 측정된 MS (1144.4 = 3430.2+3H+)/3).
제제에서 검출된 연어 칼시토닌 함량: 3.2 mg/mL.
실시예 9-17에 기재된 제제를 동결-건조시킨 경우, 말토스, 만니톨 및 글루코스로부터 선택된 부형제, 바람직하게는 말토스를 4.5% w/w의 양으로 부가하는 것이 바람직하다. 상기 부가는 초음파 처리 후 0.2 μM 필터를 통한 여과 전에 수행되어야 한다.
실시예 16: 제제 HAS1-올레일아미드 (13 mg/mL)/파클리탁셀의 제조
실시예 4에서와 같이 제조된 HAS1-올레일아미드 65 mg (유도체화도 17% mol)을 50 mL 시험관에서 칭량하고, 20 mg의 파클리탁셀 및 5.0 mL의 PBS pH7을 부가하였다. 현탁액을 실온에서 약 2시간 동안 교반하고, 10분 동안 초음파 처리 (Sonifer 250 sonicator)한 다음에, Sartorius 셀룰로스 아세테이트 필터로 0.2 μM에서 여과하였다.
제제 중 파클리탁셀 함량 분석:
HPLC-MS Agilent 1260 시스템: Kinetex C18 컬럼; 유속: 1.0 ml/분; 220 nm에서 UV 검출기; 이동상 (MP): 암모늄 아세테이트 (2 g/L) (A); 아세토니트릴 (B); 구배: 3분 동안 이동상 (B)의 1%, 그 다음에 10분 내에 (B)의 5%에서 95% 구배.
0.46 mg/mL의 파클리탁셀 표준 (아세토니트릴 중에 용해)을 주입하여 보정된 시스템.
상기 HAS1-올레일아미드/파클리탁셀 제제를 아세토니트릴에서 1/3로 희석시키고, HPLC에 직접 주입하였다. 파클리탁셀 체류 시간: 11.3분. 정량 분석은 파클리탁셀 표준의 면적을 참조하여 수행하였다. MS 분석으로 파클리탁셀의 구조 및 분해 산물의 부재를 확인하였다 (이론적 MS; 측정된 MS 853.9+Na+). 제제에서 검출된 파클리탁셀 함량: 0.23 mg/mL.
실시예 17: 미셀 형성 테스트
소수성 활성 성분을 운반할 수 있는 미셀의 형성은 TEM 현미경 분석에 의해 입증되었다.
0.2 mg/mL로 희석시킨, 실시예 8의 제제 25 μl를 400 메쉬 그리드 상에 배치하고; 1% 우라닐 아세테이트로 염색한 후에, 샘플을 100 kV에서 작동하는 TecnaiG^2 (FEI) 투과 전자 현미경으로 관찰하였다. 이미지는 Veleta 디지털 카메라 (Olympus Soft Imaging System)로 수득하였다. 평균 직경이 10 내지 50 nm의 범위를 갖는, 미셀 시스템과 적합한 소포 (vesicles)를 명확하게 형성하였다 (도 1).
실시예 18: 보관 및 동결-건조시에 멸균된 제제의 안정성 평가
활성 성분 함량에 대한 본 발명에 따른 제제의 동결-건조 효과를 테스트하기 위한 실험적 테스트를 수행하였다. 특히, 0.2μM 필터를 통해 여과하기 전에 0.23 g의 말토스 (4.5% w/w)를 부가한, 실시예 8의 제제를 테스트하였다.
수득된 여과된 용액을 멸균 조건하에 9 x 1 mL 바이알들로 나누었다 (바이알당 0.5 mL). 상기 바이알을 동결 건조기 (Epsilon 2-6DLS plus)에 배치하고; 동결-건조기 프로브를 이들 중 하나에 배치하였다 (초기 동결 온도: 40℃; 샘플 동결: -17℃; 동결-건조 온도: -29℃). 동결-건조 단계에서 진공은 0.08 bar로 설정하였고; 동결-건조된 샘플은 붕괴되지 않은 연황백색 케이크 형태로 나타났다.
동결-건조 직후에 시료 1개를 H2O 0.58 mL에 용해시키고, 이미 기재된 HPLC-MS 방법으로 라파마이신 역가를 분석하였다. 다른 샘플은 40℃에서 6개월 동안 보관하고, 3개월 및 6개월 후에 라파마이신 적정을 수행하였다.
검출된 라파마이신 역가는 동결-건조 직후 및 40°에서 3 또는 6개월 후 모두 95%였으며, 이는 본원에 기재된 안정화 및 방출 시스템의 효능을 입증하였다.
실시예 19: HAS1-올레일아미드/라파마이신 유도체에 의해 유도된 활액 프로테아제 억제의 인 비트로 테스트.
실시예 10에서와 같이 제조된, 즉 13 mg/ml의 HAS1-올레일아미드 및 0.21 mg/ml의 라파마이신을 함유하는 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제는, 대조군으로서 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (당업자에게 알려진 바와 같이, GAPDH는 구성 효소로서, 모든 세포에서 생리학적으로 발현되며, 이의 억제는 세포 활성을 방지하여 세포 사멸을 초래한다. 테스트된 종에 의한 억제 평가는 상기 종의 독성 및 작용 특이성을 측정함)를 사용하여, 인 비트로에서 이의 활액 중 프로테아제, 특히 하기 효소에 대한 억제 효과를 평가하였고:
Figure pct00006
10개의 상이한 인간 메탈로프로테이나제 (MMPs);
Figure pct00007
엘라스타제;
Figure pct00008
아그레카나제 1 (ADAMTs4),
상기 제제가 다양한 농도로 존재할 때 다양한 프로테아제 (RFU/s)의 초기 가수분해율을 평가하였다. IC50, 즉 MMP의 효소 활성의 50%를 억제할 수 있는 억제제의 농도는 표준화된 MMP의 활성 대 제제의 농도를 보간하여 계산하였고, 그 값을 도 2에 나타내었다.
물질 및 방법:
MMP의 경우: "형광 MMP 억제제 프로파일링 키트 (Fluorimetric MMP Inhibitor Profiling Kit)" (BML-AK016)를 사용하였고; 실시예 10에 기재된 제제를, 라파마이신 0.013; 0.006 및 0.0016 mg/mL 각각에 해당하는, 0.8 mg/mL; 0.4 mg/mL 및 0.1 mg/mL의 HAS1-올레일아미드 농도에서 테스트하였고, 기질은 동일한 농도 (4.0 μM)를 사용하였다;
엘라스타제의 경우: "형광 Sensolyte Rh110 엘라스타제 키트 (Fluorimetric Sensolyte Rh110 Elastase kit)" (AS-72178)를 사용하였고; 실시예 10에 언급된 제제를, 라파마이신 0.0112; 0.0056 및 0.0016 mg/mL 각각에 해당하는, 0.7 mg/mL; 0.35 mg/mL 및 0.1 mg/mL의 HAS1-올레일아미드 농도에서 테스트하였고, 기질은 동일한 농도 (25 μM)를 사용하였다;
ADAMTs4의 경우: "아그레카나제 활성 분석 키트 (Aggrecanase Activity Assay Kit)" (KA-1497)를 사용하였고; 실시예 10에 언급된 제제를, 라파마이신 0.0096; 0.0048 및 0.0016 mg/mL 각각에 해당하는, 0.6 mg/mL; 0.3 mg/mL 및 0.1 mg/mL의 HAS1-올레일아미드 농도에서 테스트하였고, 기질은 동일한 농도 (1 μM)를 사용하였다;
GAPDH의 경우: "비색 GAPDH 활성 분석 키트 (Colorimetric GAPDH Activity Assay Kit)" (K680-100)를 사용하였고; 실시예 10에 기재된 제제를, 라파마이신 0.0096, 0.0048 및 0.0016 mg/mL 각각에 해당하는, 0.6 mg/mL; 0.3 mg/mL 및 0.1 mg/mL의 HAS1-올레일아미드 농도에서 테스트하였고, 기질은 동일한 농도 (1 μM)를 사용하였다.
수득된 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제는 MMP를 선택적으로 억제하여 MMP2 및 MMP9를 제외한 모든 메탈로프로테이나제에 대해 우수한 활성을 나타내는 것이 명백하며; 반대로, 이는 테스트한 다른 활액 중 프로테아제 또는 대조군 효소 (GAPDH)에는 영향을 미치지 않는다.
이는 상기 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제가 MMP, 특히 OA 환자의 활액에서 과발현되고 콜라겐 분해를 담당하는 MMP에 특이적이고 선택적으로 작용한다는 것을 의미한다.
실시예 20: HAS1-올레일아미드/라파마이신 유도체에 의해 유도된 연골 체외이식편 (cartilage explants)으로부터 콜라겐 방출에 대한 엑스 비보 테스트
상기 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제의 콜라겐 방출에 대한 효능을 문헌에 기재된 엑스 비보 연골 염증 모델에서 평가하였다 (Arns, S. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20: 2131-2140). 테스트된 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제는 상이한 농도의, 실시예 10에서 제조된 제제이다.
성체 소의 대퇴골 (adult bovine femur)로부터 수득된 대퇴과두 (femoral condyles) 및 슬개골-대퇴골 구 (patello-femoral groove)로부터 연골을 채취하고, 스틸 펀치로 연골 생검 (Ø = 3 mm)을 수행하였다. 상기 생검을 48-웰 멀티웰 플레이트 (BD Falcon, cat. no. 353078, Italy)에서, 2% 우태아 혈청 (Life Technologies, cat. no. 10270106, Italy)을 함유하는 DMEM/F-12 (1:1) (Life Technologies, cat. no. 11320074, Italy) 중에서 24시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 인큐베이션 후에, 상기 생검을 PBS로 세척하고, 하기 그룹으로 나누었다:
1) 대조군 그룹, 여기서 세포는 처리되지도, 자극되지도 않았음;
2) 염증유발 사이토카인 OSM (온코스타틴 M) 및 IL-1β (각각 10 ng/mL)로 처리한 그룹;
3) OSM 및 IL-1β에 노출시키고 HAS1-올레일아미드 (1.3 mg/mL)/라파마이신 (0.021 mg/mL)으로 처리한 그룹;
4) OSM 및 IL-1β에 노출시키고 HAS1-올레일아미드 (0.3 mg/mL)/라파마이신 (0.005 mg/mL)으로 처리한 그룹;
5) OSM 및 IL-1β에 노출시키고 HAS1-올레일아미드 (0.1 mg/mL)/라파마이신 (0.002 mg/mL)으로 처리한 그룹.
0, 7, 14 및 21일 후에, 상기 생검 배양 배지를 흡인하고, 염증성 사이토카인 및 테스트할 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제를 함유하는 새로운 배양 배지로 교체하였다. 21일 인큐베이션 후에, 상기 생검 배지를 수집하고, 방출된 가용성 콜라겐을 제조자 지침에 따라 "Sircol 콜라겐 분석 키트 (Sircol collagen assay kit)" (Biocolor, cat. no. S1000, UK)로 측정하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, IL-1/OSM으로 처리한 그룹의 생검은 예상대로 대조군보다 상당히 더 많은 양의 가용성 콜라겐을 배양 배지로 방출하였고, 이는 매우 심각한 염증 손상을 나타낸다. 상기 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제는 염증 자극에 의해 유도된 콜라겐 방출을 상당히 감소시키며, 실제로 이를 테스트한 가장 낮은 농도에서도 대조군 수준으로 감소시키고, 1.3/0.021 mg/ml의 농도에서는 이를 실질적으로 제거하였다. 이러한 효과로 상기 제제가 콜라겐 방출을 억제하는 능력을 확인하였고, HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제의 현저한 항-염증 효과를 나타내었다.
실시예 21: HAS1-올레일아미드/라파마이신 유도체에 의해 유도된 MMP13 발현에 대한 효과
콜라겐 방출 효능 테스트 (이전 실시예)로부터 수득된 상등액 중 MMP-13 농도가 연골 분해를 담당하는 주요 효소의 샘플 내 존재를 정량화하기 위해 결정되었다. 제조자의 지침에 따라, 이러한 목적을 위해 ELISA 분석 (Mybiosource, cat. no. MBS2880297, USA)을 사용하였다.
도 4에 제시된 결과는 염증성 사이토카인 OSM 및 IL-1β로 샘플을 처리하면 예상대로 상등액에서 MMP-13의 농도를 상당히 증가시키는 것을 보여주었다. 반대로, 라파마이신의 0.0048 및 0.0016 mg/mL 각각에 해당하는, 0.3 및 0.1 mg/mL의 농도의 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제로 처리한 샘플의 상등액은 테스트된 최저 농도에서도 대조군 샘플보다 유의미하게 더 낮은 MMP-13 수준을 함유한다. 이는 관절 연골 분해의 기본이 되는 염증 인자들의 발현을 감소시키는데 있어서 테스트된 제제의 효능을 명백히 확인하였다.
실시예 22: HAS1-올레일아미드/라파마이신 유도체에 의해 유도된 mTOR 억제의 인 비트로 테스트
mTOR을 억제하는데 있어서 실시예 10에서와 같이 제조된 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제의 효능을, 대조군으로서 무-라파마이신 (rapamycin-free) 버퍼 용액 (TRIS), 및 DMSO 중에 용해된 2개의 상이한 용량의 라파마이신을 "그대로" 사용하여, ELISA (K-Elisa mTOR Activity Kit Cat. No. CBA055; Merck) 분석으로 인 비트로에서 결정하였다. 상기 용량은 도 5의 차트에 개시되어 있고, 편의상 유도체의 경우, 라파마이신 농도를 지칭하였다. 라파마이신의 부재 시에 mTOR의 활성을 100%로 표준화하였다. 예상대로, 라파마이신에 대한 농도-의존적 반응이 관찰되었다. 상기 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제는 라파마이신 단독보다 훨씬 더 낮은 농도에서 mTOR를 억제하는 활성을 입증하였다. 구체적으로, 125 μM의 라파마이신 농도로 수득되는 억제를, 34.7 μM의 라파마이신, 즉 훨씬 더 적은 활성 성분 함량을 함유하는 HAS1-올레일아미드/라파마이신 제제로 달성하였다. 동일한 효과를 가지면서 훨씬 더 적은 양의 약제를 투여할 수 있다는 것은 라파마이신으로 인해 유발될 수 있는 심각한 부작용을 최소화하거나 또는 심지어 제거할 수 있다는 것을 의미한다.

Claims (25)

  1. C4-C20 알케닐아민을 갖는 황산화 히알루론산 아미드 (HAS)로서, 상기 아미드는, 알케닐아민 몰/HAS 이량체 몰로 표시되는 몰%의 유도체화도 (% molar degree of derivatisation)를, 2 내지 20%의 범위, 바람직하게는 5 내지 15%의 범위, 더 바람직하게는 10%로 갖는 황산화 히알루론산 아미드 (HAS).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 황산화 히알루론산은 디사카라이드 단위 (disaccharide unit)당 설페이트 기의 수를 0.5 내지 3.5의 범위로 갖는 것인 아미드.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 황산화 히알루론산은 디사카라이드 단위당 설페이트 기의 수를 0.5 내지 1.5의 범위로 갖는 것인 아미드.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 황산화 히알루론산은 디사카라이드 단위당 설페이트 기의 수를 1.5 내지 2.5의 범위로 갖는 것인 아미드.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 황산화 히알루론산은 디사카라이드 단위당 설페이트 기의 수를 2.5 내지 3.5의 범위로 갖는 것인 아미드.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알케닐아민은 올레일아민, (2E)-헥스-2-엔-1-아민 및 펜트-2-엔-1-아민으로부터 선택되는 것인 아미드.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 알케닐아민은 올레일아민인 것인 아미드.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 황산화 (sulfation)에 사용되는 출발 히알루론산의 분자량은 100,000 내지 250,000 Da의 범위인 것인 아미드.
  9. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 황산화에 사용되는 출발 히알루론산의 분자량은 500,000 내지 730,000 Da의 범위인 것인 아미드.
  10. 청구항 1 내지 9의 아미드, 및 소수성 또는 친수성 약제의 수성 미셀 현탁액 (Aqueous micellar suspensions).
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 미셀 크기는 5 내지 200 nm, 바람직하게는 10 내지 50 nm의 범위인 것인 미셀 현탁액.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 상기 아미드는 청구항 7의 올레일아미드인 것인 미셀 현탁액.
  13. 청구항 10, 11 또는 12에 있어서, 상기 아미드 농도는 4 내지 20 mg/mL의 범위인 것인 미셀 현탁액.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 올레일아미드 농도는 13 mg/mL인 것인 미셀 현탁액.
  15. 청구항 10 내지 14에 있어서, 상기 약제는 라파마이신, 트리암시놀론, 스타틴 (특히 심바스타틴), 칼시토닌, RN-1747, 4α-포르볼 12,13-디데카노에이트 (4αPDD), 에베롤리무스, 파클리탁셀 및 아라키돈산으로부터 선택되는 것인 미셀 현탁액.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 약제는 라파마이신인 것인 미셀 현탁액.
  17. 청구항 10 내지 16에 있어서, 버퍼 용액은 pH=7의 PBS 포스페이트 버퍼, pH 5 내지 8 범위의 2-N-모르폴리노 메탄설폰산, 및 pH 5 내지 8 범위의 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에틸설폰산으로부터 선택되는 것인 미셀 현탁액.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 버퍼 용액은 pH=7의 PBS인 것인 미셀 현탁액.
  19. 청구항 1 내지 18의 미셀 현탁액을 제조하는 방법으로서,
    - 축합제의 존재하에 비양성자성 무극성 용매 중에서 C4-C20 알케닐아민을 황산화 히알루론산의 벤잘코늄 또는 테트라부틸암모늄 염과 반응시키는 단계;
    - 상기 단계로부터 수득된 황산화 히알루론산 아미드를 약제의 수성 용액 또는 현탁액과 혼합하는 단계;
    - 상기 혼합물을 초음파 처리 및 멸균 여과하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 청구항 10 내지 18의 미셀 현탁액 및 선택적 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 부형제는 1 내지 9 중량% 범위의 농도의, 말토스, 만니톨 및 글루코스로부터 선택되는 것인 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 부형제는 4.5 중량% 농도의 말토스인 것인 조성물.
  23. 청구항 20 내지 22에 있어서, 국소 (local), 국소영역 (locoregional), 관절내 (intra-articular) 또는 골내 (intraosseous), 특히 관절내 주사 가능한 투여를 위한 조성물.
  24. 청구항 20 내지 23에 있어서, 골관절염 (osteoarthrosis) 치료에 사용하기 위한 조성물.
  25. 약제의 안정화 및 제어 방출을 위한 제제로서 사용하기 위한 황산화 히알루론산 아미드.
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