SK282717B6 - Spôsob prípravy ultravysokomolekulových hyalurónanov - Google Patents

Abstract

Spôsob prípravy hyalurónanov s ultravysokou molekulovou hmotnosťou niekoľkonásobne väčšou ako 10exp(6) daltonov spočíva v tom, že sa zmiešajú vodné roztoky dvoch látok nesúcich vzájomne asociujúce komponenty. Jednou látkou je kyselina hyalurónová, jej derivát alebo jej soľ s molekulovou hmotnosťou rádovo 10exp(4) - 10exp(9) daltonov, ktorá nesie zvolený substituent. Druhou je sieťujúca látka nesúca substituentovi zodpovedajúci asociujúci komponent. Subtituenty a asociujúce komponenty sa vyberú zo známych fyzikálno-chemicky interagujúcich dvojíc, napr. cyklodextríny a adamantány, alebo amfifilné či hydrofóbne liečivá.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy hyalurónanov s ultravysokou molekulovou hmotnosťou (> (2 - 3) x 10⁶ Da) fyzikálno-chemickým sieťovaním derivátov vysokomolekulovej kyseliny hyalurónovej alebo jej solí.

Doterajší stav techniky

Artritída je jedným z najfrekventovanejších ochorení postihujúcich ľudskú populáciu. Z vyše stovky rozdielnych typov artritíd najbežnejšou je osteoartritída (OA). OA sa zaraďuje medzi finančne náročnejšie, ekonomiku vysiľujúce ochorenia [Z. S. Šimon, Osteoarthritis 25 (1999) 345],

Pri OA objem synoviálnej (kĺbovej) tekutiny vzrastá; jej viskozita klesá; koncentrácia synoviálneho hyalurónanu (HA), ako aj jeho molekulová hmotnosť sa znižuje [J. G. Peyron, J. Rheum. 20, Suppl. 39 (1993) 10], Tieto zmeny sú označované ako spoluzodpovedné za následnú, zrýchlenú deštrukciu chrupiek. Intraartikuláme (injekčné) podanie vysokomolekulového HA pacientom (t. j. terapia označovaná v súčasnosti termínom „viscosupplementation“) sa hodnotí ako účinný kofaktor pri liečbe traumatizovaných artritických kĺbov [Γ. Kikuchi a spol., Osteoarthritis and Cartilage 4 (1996) 99],

Stred molekulových hmotností synoviálneho HA (u zdravých ľudí) je v rozsahu (1,6 - 10,9) x 10⁶ Da; koncentrácia hyalurónanu je 2 - 3 mg/ml [E. A. Balazs a spol., Arthritis Rheum. 10 (1967) 357], Molekulové hmotnosti v súčasnosti komerčne dostupných hyalurónanov, získaných z rôznych (biologických) zdrojov, akými sú napr. mikroorganizmy Streptococcus zooepidemicus či Streptococcus equii, kohútie hrebienky, a i., sú v rozsahu od stoviek tisícov až do cca 1 - 2 miliónov daltonov. Hyalurónan je soľ kyseliny hyalurónovej, ktorej makromolekulový reťazec tvoria pravidelne sa opakujúce jednotky kyseliny D-glukurónovej a N-acetyl-D- glukozamínu (obr. 1).

Vysokomolekulový HA viaže až 1000-krát väčšie množstvo vody, ako je jeho vlastná hmotnosť; s vodou vytvára pseudoplastické, elastoviskózne roztoky, ktoré majú tzv. „shear-dependent“ viskozitu a „frequency-dependent“ elasticitu [AT. E. Larsen a E. A. Balazs, Adv. DrugDelivery Rev. 7 (1991) 279], Pri nízkej hodnote strihového („shear“) napätia roztoky vysokomolekulového HA vykazujú vysokú viskozitu a nízku elasticitu; pri zvyšujúcich sa hodnotách strihového napätia sú tieto roztoky elastickejšie [L. S. Šimon, Osteoarthritis 25 (1999) 345], Takéto nenewtonovské správanie sa synoviálnej tekutiny je esenciálne pre lubrikáciu kĺbov počas rýchleho pohybu. Na povrchu chrupky sa totiž nachádza tenký film synoviálnej tekutiny, ktorý „zahládza“ drobné nerovnosti artikulámej štruktúry. Deficit tejto vrstvičky zvyšuje koeficient trenia pohybujúcich sa plôch kĺbov; nastupuje silná bolesť [M. Nishimura a spol., Biochim. Biophys. Acta 1380 (1998) /].

Ultračisté injekčné prípravky elastoviskóznych roztokov sodnej soli hyaluronátu (HEALON^R; Pharmacia, Uppsala, Švédsko), získaného z kohútích hrebienkov, našli široké uplatnenie predovšetkým pri operáciách v oftalmológii („viscosurgery“) [A. Nimrod a spol., J. Ocular Pharmacol. 8 (1992) 161], ale aj v reumatológii („viscosupplementation“) [J. G. Peyron, J. Rheumatology 20, Suppl. 39, (1993) 10; T. Kikuchi a spol., Osteoarthritis and Cartilage 4 (1996) 99],

Prednedávnom na intraartikuláme podanie pacientom s OA bol v USA (ale aj v niektorých iných krajinách) schválený ďalší preparát obsahujúci vysokomolekulový HA pô vodom z kohútích hrebienkov, s pomenovaním IIYLAN^R (Biomatrix Inc., Ridgefield, NJ, USA), pozostávajúci z chemicky presieťovaného HA [Z. S. Šimon, Osteoarthritis 25 (1999) 345], Dôvodom (tejto „inovácie“) je ten fakt, že čas, počas ktorého intraartikuláme depozitovaný hyalurónan môže prejavovať svoj účinok, je krátky. Biologický polčas po injekčnom podaní HA do kĺbu (kolena králika) bol ~ 13 hodín [71 J. Brown a spol., Exp. Physiol. 76 (1991) 125], Tumover endogénneho hyalurónanu v kĺboch trvá —12-48 hodín [J. Drobnik, Adv. Drug Delivery Rev. 7 (11991) 295], Podstatne dlhší biologický polčas vykazujú už spomínané vodorozpustné HYLAN^R-y [Z. ,S’. Šimon, Osteoarthritis 25 (1999) 345], ktoré sú pripravované chemickým zosieťovaním HA formaldehydom. Takouto metódou, t. j. - chemickým zosieťovaním pripravené HYLAN^R-y, sú označované ako obzvlášť účinné („viscosupplementation“) biomateriály. V ďalších vodonerozpustných HYLAN^R-ových preparátoch (géloch, membránach, mikropartikulách) je HA zosieťovaný pomocou vinylsulfónových skupín, čím sa vytvorí „nekonečná“ poly(makro)molekulová sieť [N. E. Larsen a E. A. Balazs, Adv. Drug Delivery Rev. 7 (1991) 279],

Sumarizujúc literárne údaje o predklinických a klinických výsledkoch získaných pri použití (injekčných) roztokov HYLAN^R-ov [A. E. Larsen a E. A. Balazs, Adv. Drug Delivery Rev. 7 (1991) 279; S. Al-Assaf a spol., Radiat. Phys. Chem. 46 (1995) 207; M. Wobig a spol., Clin. Ther. 20 (1998) 410; L. S. Šimon, Osteoarthritis 25 (1999) 345] sa dá usúdiť, že popri pozoruhodne výhodných vlastnostiach, akými sú biokompatibilita, biodegradabilita, (kompletná) rezorptibilita, neimunogenicita, a zriedkavá pyrogenicita, evidentne nevýhodným faktorom je ich enormne vysoká viskozita. Vzhľadom na to, že injekčné podávané HYLAN^R-y sú enormne viskózne pseudoplastické gély, ich prenikanie do úzkych štrbín poškodenej artikulámej štruktúry je evidentne silne limitované.

Podstata vynálezu

Uvedenú limitáciu efektívneho použitia injekčných roztokov ultravysokomolckulových hyalurónanov (napr. vodorozpustných HYLAN^R-ov pripravených chemickým sieťovaním), rieši navrhovaný spôsob využívajúci fyzikálnochemické sieťovanie vhodných derivátov vysokomolekulovej kyseliny hyalurónovej alebo jej solí. Želané zvýšenie molekulovej hmotnosti HA, či sformovanie sa trojrozmernej polymémej siete, sa uskutoční až priamo v mieste želaného pôsobenia. Týmto postupom sa získa vhodný a potrebný produkt, napr. na „liečenie“ OA, či mäkký/tekutý, prípadne až tuhý/tvrdý gél, napr. na vymodelovanie chýbajúceho kúska tkaniva. Navrhovaný postup narába s tzv. samoasociujúcimi supramolekulovými zlúčeninami. Efektívnejšia liečba sa dosiahne nasledovným originálnym postupom, ktorý pozostáva buď:

- z (dvoch) následných intraartikulámych injekcií (dvoch) asociujúcich komponentov, z ktorých aspoň jednu tvorí derivát vysokomolekulovej kyseliny hyalurónovej alebo jej soli. V dôsledku lepšej penetrability a permeability oboch nízko viskóznych kvapalín, z daných dvoch komponentov sa po vzájomnej asociácii vytvorí želaný produkt priamo na zvolenom mieste,

- alebo z intraartikulárneho podania oboch asociujúcich komponentov spolu s vhodne zvolenou nízkomolekulovou zlúčeninou (liečivom), ktorej prvotnou úlohou je zablokovať proces asociácie. Po injekcii takéhoto „koktailu“ molekuly nízkomolekulového liečiva najprv síce kompletne blo kujú proces asociácie, ale po eliminácii liečiva z artikulárneho prostredia nastane v želanom mieste samovoľná asociácia komponentov.

Teória vzniku inklúznych komplexov („host-guest“) asociáciou:

Komplexáciu molekúl asociujúcich komponentov, ktoré sa nazývajú HOSŤ a GUEST, je možné opísať nasledovnou rovnicou:

HOSŤ + GUEST <-------> HOSŤ---GUEST.

Ak stechiometria [HOSŤ] : [GUEST] sa rovná 1:1, potom v prípade termodynamickej rovnováhy sa stabilitná konštanta komplexácie - K - dá vyjadriť nasledovne:

[HOSŤ---GUEST] K = ------------------[HOSŤ] X [GUEST] .

Z uvedeného vyplýva, že v prípade ekvimolárnej zmesi ([HOSŤ] = [GUEST] = 1 mol/1 (moláma), koncentrácia vznikajúceho komplexu [HOSŤ—GUEST] je závislá len od číselnej hodnoty parametra K.

Hodnota log K komplexácie, napr. β-cyclodextrinu (β-CD), kde β-CD je „host“, s „guest“ molekulou amantadínu (AMANT), t. j. 1-amino-adamantán-hydrochloridu (liečivom zo skupiny antiparkinsoník [C. J. Gean a F. H. Meyers, POCKET DRUG GUIDE - Second Ed„ miliams & Wilkins, Baltimore, MD, USA, 1996]), resp. s 1-adamantánamóniom (pri 25 °C, pH 7,2), alebo s 1-adamantylamóniom (pri 25 °C, vo vode), sa rovná hodnote 3,92 ±0,02, alebo hodnote 5,04 [M. V. Rekharsky a Y. Inoue, Chem. Rev. 98 (1998) 1875], Uvedený proces komplexácie molekuly amantadínu s molekulou β-CD schematicky ukazuje obr. 2. V jeho časti a je znázornená chemická štruktúra amantadínu, v časti b je štruktúra β-cyklodextrínu, A, B, resp. A—B sú piktogramy ich molekúl pred asociáciou a po vzájomnej asociácii.

Adamantylová skupina, tvarom takmer sférická, je jednou z najlepších „guest“ štruktúr, ktoré zapadajú veľmi tesne do prázdneho priestoru „host“ molekuly β-CD [JU C. Cromwell a spol., J. Phys. Chem. 89 (1985) 326; C. Amiel a B. Sébille, J. Inclusion Phenom. Mol. Recognit. Chem. 25 (1996) 61]. Hodnota rovnovážnej konštanty komplexácie (K) rôznych derivátov adamantánu s nesubstituovanými či substituovanými β-cyklodextrínmi dosahuje hodnotu rádovo 10⁴ - 10⁵ mol/1. (Jednu z najvyšších log K hodnôt, a to 7,8 ±0,1 (pri 25 °C), demonštruje dvojica α-CD vs. molekula indolu [M. V. Rekharsky a Y. Inoue, Chem. Rev. 98 (1998) 1875].)

Obrázok 3 schematicky ukazuje želaný proces asociácie dvoch derivátov vysokomolekulového hyalurónanu. Ich makromolekulový reťazec nesie buď substituent typu „samec“ (AMANT) alebo typu „samica“ (β-CD), ktoré sa dokážu vzájomne veľmi pevne zopnúť (podobne ako bežná šatová patentka). V prípade mnohonásobného „host-guest“ zopnutia sa derivátov hyalurónanu, akými sú ΗΑ-β-CD a HA-AMANT, vznikne stabilný polymakromolekulárny asociát/agregát typu ηΗΑ-β-CD x mHA-AMANT.

Najsľubnejšia sféra aplikácií nových (HA) biomateriálov je na liečbu pacientov, ale aj na prevenciu a ochranu ich zdravia pri diagnózach, akými sú napr. zápaly kĺbov - artritídy, očné zápaly, zhubné nádory, kožné poranenia a mnohé ďalšie.

Ďalej uvedené príklady ozrejmujú chránený postup, pričom nijako neobmedzujú rozsah ochrany vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Poznámka: V príkladoch 1 a 2 bola použitá vysokomolekulová kyselina hyalurónová; v príkladoch 3 - 7 jej (sodná) soľ.

Molekulové parametre použitej vzorky HA boli nasledovné: Číselný- (M_n); hmotnostný- (M_w); resp. tzv. z- (M_z) priemer molekulových hmotností: = 350,7 (326,5) kDa; = 647,1 (659,4; 666,0) kDa; resp. = 1050,4 (1066,1) kDa. Parametre <Rg_z ²>^{i :}, resp. A₂ stanovené vo vodnom roztoku NaC1 (0,15 mol/1): = 97,4 (97,2) nm, resp. 1,94 x 10'³ mol. ml/g².

Príklad 1

Príprava ΗΑ-β-CD derivátu priamou esterifikáciou karboxylových skupín vysokomolekulového hyalurónanu β-CD (1,14 g) sa rozdispergoval v dioxáne (100 ml) s prídavkom trifenylfosfmu (0,87 g). HA (0,3 g) sa separátne rozsuspendoval v dioxáne (20 ml) s prídavkom dietyl-azo-dikarboxylátu (0,44 g). Po zmiešaní oboch reaktantov reakcia prebiehala pri laboratórnej teplote za miešania počas asi 20 hodín. Po odparení väčšiny dioxánu (za zníženého tlaku) sa k reakčnej zmesi pridal etanol (150 ml). Zrazenina pastovitej konzistencie bola oddelená filtráciou a následne rozpustená vo vode (300 ml). Takýto vodný roztok bol opakovane (5-krát) prečistený ultrafiltráciou (cez membránu „Amicon PM-10“) a nakoniec lyofilizovaný. Výťažok HA-β-CD derivátu bol 0,53 g. Stupeň substitúcie (= 9,2 %) sa stanovil titráciou voľných karboxylových skupín ΗΑ-β-CD derivátu [M. Rinaudo a G. Hudry-Clergeon, J. Chim. Phys. 64 (1967) 1746],

Molekulové parametre pripraveného ΗΑ-β-CD derivátu uvedené v priloženej tabuľke sa stanovili („off-line“) prístrojom „Multi-Angle Laser Light-Scattering“ (MALLS), alebo „on-line“, keď MALLS slúžil ako detektor pre „Size-Exclusion Chromatographic“ (SEC) zariadenie [R. Mendichi a spol. , Polymér 39 (1998) 6611].

Príklad 2

Postupuje sa identicky ako v príklade 1, ale na rozdiel od β-cyklodextrínu sa použije α-CD, gama-CD, alebo niektorý zo substituovaných cyklodextrínov, akými sú napr. hydroxyetyl^-CD, hydroxypropyl^-CD, (parciálne substituovaný) sulfobutyl^-CD a ďalšie.

Príklad 3

Príprava ΗΑ-β-CD derivátu s využitím „spacer“-a

HA (106 mg) sa rozpustil vo vodnom roztoku pufra 2-(N-morfolino)-etánsulfonátu sodného (MES; 0,05 mol/1; 57 ml; pH 5,5). Do tohto roztoku sa postupne pridával („spacer“) t j. dihydrazid kyseliny adipovej (ADH; 600 mg) a aktivátor (karboxylových skupín na HA) l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)-karbodiimid (EDC; 127 mg). Po pridaní všetkého EDC sa reakčná zmes dialyzovala; medziprodukt (HA-ADH) sa získal lyofilizáciou.

K vodnému roztoku β-CD (100 mg/30 ml) sa pridal aktivátor hydroxylových skupín, a to l-kyano-4-dimetylamino-pyridinium-tetrafluoroborát (CDAP; 20 mg) rozpustený v acetonitrile (2 ml) s prídavkom trietylamínu (< 0,2 molov; pH 7,8). Po 2 minútach bol pridaný vo vode rozpustený HA-ADH (90 mg/10 ml). Reakcia bola po 2 hodinách zastavená prídavkom etanolamínu (2 ml). Reakčná zmes sa najprv dialyzovala; produkt bol následne purifikovaný opakovanou ultrafiltráciou a nakoniec lyofilizovaný. (Tento reakčný postup je vhodný na zavedenie akéhokoľvek homobifunkčného „spacer“-a obsahujúceho (dvojicu) koncových amino- alebo hydrazínových skupín.)

SK 282717 Β6

Príklad 4

Postupuje sa identicky ako v príklade 3, ale na rozdiel od β-cyklodextrínu sa použije α-CD, gama-CD, alebo niektorý zo substituovaných cyklodextrínov, akými sú napr. hydroxyetyl-p-CD, hydroxypropyl-p-CD, (parciálne substituovaný) sulfobutyl-P-CD a ďalšie.

Príklad 5

Príprava ΗΑ-β-CD derivátu väzbou cez amino- či hydrazínovú skupinu

Pri tomto postupe sa použije amino- alebo hydrazínový derivát β-CD pripravený napr. výmenou za tozyl-skupinu. Reakcia HA s amino- či hydrazínovým derivátom β-CD sa uskutoční za podmienok identických ako v príklade 3, t. j. s využitím aktivácie karboxylových skupín na HA pomocou EDC.

Príklad 6

Postupuje sa identicky ako v príklade 5, ale na rozdiel od β-cyklodextrínu sa použije napr. α-CD či gama-CD a i.

Príklad 7

Príprava ΗΑ-ΛΜΑΝΤ derivátu

HA (130 mg) sa rozpustil v MES pufri (0,05 mol/1; 20 ml; pH 5,5). Do roztoku sa za miešania postupne pridával amantadín, t. j. 1-amino-adamantán-hydrochlorid (AMANT; 270 mg), rozpustený v 35 ml rovnakého MES pufra a následne sa pridal EDC, t. j. aktivátor karboxylových skupín na HA (150 mg). Reakčná zmes sa miešala pri laboratórnej teplote počas asi 20 hodín. Hodnota pH sa udržiavala v intervale 6,0 - 6,5 pomocou zriedenej HC1 (0,1 mol/1). Po skončení reakcie sa roztok prefiltroval (cez papierový filter „Whatman No. 3“); filtrát sa ďalej dočisťoval (5-krát) opakovanou ultrafiltráciou (cez membránu „Amicon PM-10“). Finálny produkt (HA-AMANT) sa získal (vo výťažku 105 mg) lyofilizáciou. Molekulové parametre pripraveného HA-AMANT derivátu sú uvedené v tab. I.

Príklad 8

Asociácia („host-guest“ komplexácia) dvoch vysokomolekulových HA derivátov

HA-AMANT (pripravený podľa príkladu 7), ako aj HA-β-CD (pripravený podľa príkladu 1) sa rozpustili vo vodnom roztoku NaCl (0,15 mol/1) a zmiešali tak, aby molámy pomer [HA-AMANT]/[HA-p-CD] sa rovnal 80 : 20, resp. 50 : 50. Hmotnostný priemer molekulových hmotností (M_w) stanovený metódou MALLS pre ekvimolárnu zmes oboch biopolymérov sa rovnal 556,0 kDa, t. j. signifikantne prevyšoval hodnotu M_w tak oboch biopolymérov jednotlivo, ako aj hodnotu predstavujúcu prostý aritmetický súčet (pozri tabuľku v prílohe). Obdobne hodnota <Rg_z ²>^1/2 = = 80,6 nm nameraná pre uvedenú ekvimolárnu zmes bola signifikantne väčšia ako hodnota stanovená pre čisté makrobiomolekuly jednotlivo, t. j. 23,8 (25,2) nm v prípade HA-AMANT a 40,2 nm pre ΗΑ-β-CD.

Príklad 9

Postupuje sa identicky ako v príklade 8, ale v tomto prípade sa zmieša roztok vzorky pripravenej postupom opísaným v príklade 7 s roztokom vzorky pripravenej postupom podľa príkladu 2, 3, 4, 5 alebo 6.

Tabuľka: Molekulové parametre syntetizovaných (biopolymérov individuálne a po ich vzájomnom zmiešaní

Parameter	HÄ-e-a SSC-MALLS	n-wurr
30 : 20	60 : 50
SBC-MMIS	MALLS	MÄLLS	KALLS
Hn/[knal	106,2	51,0
	18E(J	ÓH	51,2	293,0	556,0
M/lKDal	302,5	156,1
dsV'’/Μ	40,2	23,8	25(€	69,6	80,6

Poznámka: Z hľadiska kvantitatívneho, hodnoty <Rg_z ²>^l/2, ako aj Mw stanovené pre asociáty vznikajúce v zmesi dvoch biopolymérov signifikantne prevyšujú parametre zistené pri meraniach oboch makromolekulových komponentov jednotlivo. Keďže nominálne hodnoty za predpokladu prostej aditivity ([1] + [1]) by sa rovnali: <Rgz²Z>^1/2 = 64,0 (65,4) nm a Mw = 272,1 (276,5) kDa, tendencia formovania sa väčších agregátov medzi danými dvoma typmi makromolekúl derivátov HA je evidentná a výrazná.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob prípravy ultravysokomolekulových hyalurónanov, vyznačujúci sa tým, že sa na kyselinu hyalurónovú, jej zvolený derivát alebo soľ kyseliny hyalurónovej s molekulovou hmotnosťou 10⁴ - 10⁶ Da, nesúci vybraný substituent, aplikuje fyzikálno-chemické sieťovanie látkou nesúcou asociujúcu skupinu, pričom sieťovanie prebieha tak, že sa zmiešajú vodné roztoky oboch látok s molámym pomerom 1 : 99 až 99 : 1, a následne asociujúca skupina sieťovacej látky naviaže na seba substituent sieťovanej látky.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako substituent sa výhodne použije cyklodextrín.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako látka nesúca asociujúcu skupinu sa výhodne použije adamantán.