IT202000008209A1 - Procedimento di sintesi di un coniugato acido ialuronico-paclitaxel - Google Patents

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Monica Campisi
Cristian Guarise
Carlo Pizzocaro
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Fidia Farm Spa
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Description

?Procedimento di sintesi di un coniugato acido ialuronico-paclitaxel"
OGGETTO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione descrive il procedimento di sintesi industriale di un coniugato acido ialuronico-paclitaxel ottenuto secondo un processo di sintesi tra molecole di acido ialuronico (HA) e paclitaxel mediante l?introduzione dello spaziatore/linker acido 4-bromobutirrico tra l?acido ialuronico e il suddetto chemioterapico, secondo un?originale procedura di sintesi e purificazione che assicura la purezza del coniugato nella sua forma finale.
CAMPO DELL?INVENZIONE
Il paclitaxel (Taxol <?>) ? un agente antitumorale che svolge la sua azione antiproliferativa agendo sull?organizzazione dei microtubuli del sistema citoscheletrico cellulare: inibendo la depolarizzazione dei suddetti microtubuli, ne impedisce la normale riorganizzazione dinamica che avviene durante la divisione mitotica cellulare (Manfredi JJ et al., J Cell Biol, 1982, 94:688-696).
Le principali indicazioni terapeutiche del paclitaxel sono l?uso nella terapia del tumore avanzato della mammella, nella terapia del carcinoma polmonare, il trattamento del carcinoma ovario, del carcinoma della vescica, della prostata e dell?endometrio.
Il paclitaxel ? un composto insolubile in acqua e, di conseguenza, la composizione farmaceutica che lo vede attualmente impiegato comprende la sua miscelazione con Cremophor EL ? alcool etilico, (Pfeifer RW et al., Am J Hosp Pharm, 1993, 50:2520-2521) in rapporto 1:1, ed ? in questa formulazione che viene normalmente somministrato per infusione endovenosa continua. La presenza del Cremophor EL rappresenta la principale causa delle reazioni avverse che normalmente avvengono durante la somministrazione del paclitaxel, i.e. fenomeni di banale orticaria, dispnea e broncospasmo, fino allo shock anafilattico. Per questo motivo, tutti i pazienti in trattamento con la composizione farmaceutica paclitaxel?Cremophor EL devono essere sottoposti, prima dell?inizio della terapia, a un protocollo di premedicazione che consiste nella somministrazione di desametasone eventualmente associato a un antistaminico.
Possiamo dunque affermare che la formulazione del Taxol <? >attualmente in uso clinico (e la sua modalit? di somministrazione) costituisce un limite all?efficacia terapeutica dello stesso. E? questo il motivo per cui la ricerca si ? attualmente orientata sia verso la sintesi di prodrugs/coniugati di paclitaxel solubili in acqua, sia verso nuove formulazioni del suddetto farmaco antitumorale.
Il paclitaxel ? un alcaloide attualmente ottenuto per via semisintetica da un suo precursore derivato dagli aghi di Taxus Baccata. Chimicamente esso ? costituito da un anello taxanico a 15 atomi di carbonio legato a un anello ossietanico in posizione C4 e C5, mentre in posizione C13 ? presente un legame estereo, considerato indispensabile per la sua attivit? antitumorale.
Per superare i suddetti problemi conseguenti al tipo di formulazione si ? cercato, ad esempio, di incapsulare detto antitumorale in liposomi, nanocapsule e microsfere costituite da una parete polimerica formata da co-polimeri biodegradabili come l?acido poli-lattico, o non biodegradabili come l?etilenevinil-acetato, oppure microsfere formate da poli-fosfoestere caricate con paclitaxel per creare un sistema di rilascio prolungato del farmaco nel sito di trattamento (Nuijen B et al., Investigational New Drugs, 2001, 19:143-153).
Tuttavia, questi nuovi sistemi d?incapsulazione del paclitaxel hanno presentato problemi di stabilit?, produzione e riproducibilit?.
Sono stati effettuati anche diversi tentativi di solubilizzazione del suddetto farmaco con ciclodestrine, ma le nuove formulazioni non hanno dato i risultati desiderati (Nuijen B et al., Investigational New Drugs, 2001, 19:143-153).
La ricerca chimica di nuove formulazioni di paclitaxel che rendano il farmaco maggiormente idrosolubile mantenendone inalterata l?efficacia come agente antitumorale, ha portato alla sintesi di nuovi analoghi modificati in C2' e C7 e, inoltre, alla preparazione di nuovi coniugati definiti anche come prodrugs.
In quest?ottica sono stati effettuati molti tentativi di sintesi di nuovi prodrugs che hanno portato, ad esempio, alla preparazione di farmaci come l?acetil-paclitaxel (Mellado W et al., Biochem Biophys Res Commun, 1984, 124(2): 329-336), o alla sintesi di nuovi esteri del suddetto farmaco con il succinato, il glutarato e l?acido sulfonico sul carbonio in posizione C2', esteri che tuttavia sono risultati instabili in ambiente acquoso.
E? inoltre noto anche l?utilizzo del PEG (poli-etilen-glicole) per la derivatizzazione del suddetto chemioterapico mediante esterificazione del paclitaxel in posizione C2'. Tale nuova molecola ? risultata molto idrosolubile ma anch?essa con una limitata stabilit?.
Infine, ? stato anche sviluppato un nuovo sistema di ?delivery system? del suddetto farmaco ottenuto tramite coniugazione del paclitaxel con la proteina sierica albumina (HSA): il coniugato paclitaxel-HSA ? risultato essere molto idrosolubile, ma senza dati certi di efficacia rispetto al paclitaxel per se (Nuijen B et al., Investigational New Drugs, 2001, 19:143-153).
Recentemente ? stato sintetizzato un nuovo sistema di rilascio del paclitaxel esterificato con acido ialuronico (HA) precedentemente modificato, ovvero derivatizzato con molecole di idrazide legate al gruppo carbossilico dell?HA tramite legame ammidico (Luo Y et al., Biomacromolecules, 2000, 1(2):208-218) (US 5,874,417). Si ? cos? ottenuto un nuovo sistema di trasporto del paclitaxel che permette al farmaco di raggiungere direttamente la superficie della membrana della cellula tumorale bersaglio, la quale ? caratterizzata da una sovra-espressione del recettore per l?HA, il CD44.
Per cercare di sviluppare tutte le potenzialit? dell?associazione del paclitaxel con l?HA, ? stato infine studiato e sintetizzato un nuovo coniugato tra l?HA e il chemioterapico, legati covalentemente tra loro in modo indiretto tramite uno spaziatore/linker, quale per esempio l?acido bromobutirrico, che rende il prodotto finale maggiormente idrosolubile e quindi di facile somministrazione (EP2045270).
Scopo della presente invenzione ? quello di individuare un nuovo processo di preparazione e purificazione che sia particolarmente efficiente e superi gli inconvenienti dello stato dell'arte sopra evidenziati.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
E' quindi oggetto della presente invenzione un originale processo di preparazione e purificazione del coniugato acido ialuronico-paclitaxel che comprende o consiste nelle seguenti fasi:
a) attivazione del gruppo carbossilico di uno spaziatore/linker acido 4-bromobutirrico mediante agente attivante, preferibilmente una carbodiimmide, ancor pi? preferibilmente 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide cloridrato (EDC), in presenza di un catalizzatore, preferibilmente DMAP (4-dimetilamminopiridina);
b) cristallizzazione dell?intermedio ottenuto dalla fase precedente in solvente organico, preferibilmente N-eptano, quindi sua filtrazione ed essiccamento;
c) aggiunta dell?intermedio ottenuto nella fase precedente al sale di TBA (tetrabutilammonio) dell?HA in DMSO;
d) purificazione del coniugato HA-paclitaxel cos? ottenuto che presenta un legame estereo tra il carbossile del polisaccaride HA e lo spaziatore/linker, detto spaziatore/linker essendo a sua volta legato mediante legame estereo tramite il suo carbossile al gruppo ossidrilico al carbonio C2' del paclitaxel, mediante precipitazione con una soluzione di etanolo/acqua contenente il sale NaBr, almeno un successivo lavaggio in etanolo/acqua e ulteriore lavaggio in etanolo, pre-essiccamento a 40?C e passaggio in camera satura di vapore acqueo a 40?C e a pressione ambiente, infine essicamento a 40?C sottovuoto.
Ulteriore oggetto dell?invenzione ? il coniugato HA-paclitaxel avente un grado di derivatizzazione o esterificazione compreso nell'intervallo dal 15% al 21% p/p, preferibilmente compreso nell'intervallo dal 16% al 20% p/p, dove l'acido ialuronico di partenza ? di origine fermentativa con peso molecolare medio ponderale compreso tra 140.000 e 250.000 Da, detto coniugato essendo in forma di polvere fine ed omogenea, con un grado di purezza superiore al 98% in peso sul secco e contenente una quantit? di di-Br-paclitaxel inferiore all?1% in peso.
Ulteriore oggetto dell'invenzione ? anche il coniugato HA-paclitaxel in forma di polvere fine ed omogenea contenente una quantit? di di-Br-paclitaxel inferiore all?1% in peso, preparato e purificato secondo quanto descritto e quindi estremamente puro rispetto allo stesso coniugato ottenuto con il processo secondo EP2045270.
Ulteriore oggetto della presente invenzione ? anche una composizione farmaceutica consistente essenzialmente del coniugato preparato e purificato con il processo sopra descritto, associato a diluenti/eccipienti farmacologicamente accettabili, preferibilmente una composizione farmaceutica formulata in acqua sterile, isotonica, contenente glucosio al 5% p/v, per uso nel trattamento del tumore avanzato della mammella, del carcinoma polmonare, del carcinoma ovarico, del carcinoma della vescica, della prostata e dell?endometrio e del mesotelioma.
La composizione secondo la presente invenzione trova uso nel trattamento di tutte le forme tumorali in cui viene normalmente impiegato il paclitaxel, tutti i noti derivati di tale farmaco sopra citati e i taxani in generale.
La presente invenzione descrive e rivendica quindi la preparazione e la purificazione del coniugato HA-paclitaxel secondo un processo originale di sintesi che consiste nell?introduzione di uno spaziatore/linker tra l?acido ialuronico e il chemioterapico di cui sopra, tramite la formazione del legame estereo tra il carbossile del suddetto polisaccaride e lo spaziatore/linker, detto spaziatore/linker essendo a sua volta legato (sempre con legame estereo) tramite il suo carbossile al gruppo ossidrilico al carbonio C2' del paclitaxel, dove lo spaziatore/linker usato per la sintesi del suddetto coniugato ? l?acido 4-bromobutirrico.
Tale nuovo procedimento di sintesi del coniugato HA-paclitaxel si differenzia da EP2045270 in quanto permette:
? la formazione del coniugato con un maggior grado di purezza,
? l?eliminazione della dialisi finale;
? la riduzione dell?utilizzo di solventi;
? l?ottenimento della materia prima (coniugato HA-Paclitaxel) come polvere fine ed omogenea, facilmente sterilizzabile via filtrazione una volta formulata in solvente acquoso;
? la riduzione dei tempi di sintesi.
Il coniugato HA-paclitaxel cos? preparato e purificato possiede un grado di derivatizzazione compreso nell?intervallo da 15% a 21% peso/peso (p/p), preferibilmente compreso da 16% a 20% p/p.
Di seguito, il grado di derivatizzazione o esterificazione del suddetto coniugato ? definito come la percentuale in peso del paclitaxel vs il peso dell?HA-paclitaxel, quindi 100mg di coniugato con grado di derivatizzazione compreso tra il 15% e il 21% p/p, conterranno 15mg, 16mg, 17mg, 18mg, 19mg, o 20mg, o 21mg del chemioterapico paclitaxel a seconda del grado di derivatizzazione indicato (per esemplificare ulteriormente, il grado di derivatizzazione al 20% p/p contiene 20mg di paclitaxel ogni 100mg di coniugato); ? tuttavia ovvio all?esperto del ramo che al termine di tali processi di sintesi industriale pu? essere presente una piccola variazione nei rapporti ponderali tra le molecole, quindi di seguito la Richiedente descrivendo e rivendicando l?intervallo di derivatizzazione del suddetto coniugato compreso dal 15% al 21% p/p, intende rivendicare tutti i valori percentuali scritti comprendenti ? 1%: a titolo esemplificativo, il grado 20% p/p ? conseguentemente da intendersi come 20% ? 1%.
L?HA utilizzato per la sintesi del coniugato HA-paclitaxel pu? derivare da qualsiasi fonte, ad esempio per estrazione da creste di gallo (ad esempio secondo EP0138572 o WO2018020458), o per via biotecnologica (ad esempio secondo EP2614088 o EP2614087), o preferibilmente per via fermentativa (ad esempio secondo EP0716688), e avere un peso molecolare medio ponderale compreso tra i 400 e 3x10<6>Da, in particolare tra 400 e 1x 10<6>Da, ancor pi? in particolare tra 140.000 e 250.000 Da (per peso molecolare medio ponderale si intende quello calcolato col metodo della ?intrinsic viscosity? (Terbojevich et al., Carbohydr Res, 1986, 363-377)). L?HA-paclitaxel descritto e rivendicato dalla Richiedente possiede un grado di derivatizzazione compreso nell'intervallo dal 15% al 21% p/p, preferibilmente compreso nell'intervallo dal 16% al 20% p/p, preferibilmente preparato da un HA di origine fermentativa con peso molecolare medio ponderale compreso tra 140.000 e 250.000 Da.
Il coniugato HA-paclitaxel sopra descritto ? preparato e purificato secondo il suddetto originale processo di sintesi modificato rispetto allo stato dell?arte, e di seguito cos? dettagliato:
- il gruppo carbossilico dell?acido 4-bromobutirrico viene attivato da un agente attivante come una carbodiimmide, preferibilmente 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide cloridrato (EDC), in presenza di un catalizzatore, preferibilmente DMAP (4-dimetilamminopiridina), si ottiene cos? la formazione di un estere tra la funzione ossidrilica al carbonio in C2' del paclitaxel e il carbossile dello spaziatore/linker; il legame che quindi si forma tra detto spaziatore/linker e il paclitaxel ? di tipo estereo;
- l?intermedio ottenuto viene cristallizzato in solvente organico, preferibilmente N-eptano, quindi isolato per filtrazione ed essiccato; analizzato in HPLC come noto agli esperti del ramo, il suo grado di purezza risulta superiore al 98% in peso sul secco in quanto con questa fase si riduce drasticamente la presenza del di-Brpaclitaxel, che ? inferiore all?1% in peso;
- successivamente, per contatto diretto di detto intermedio con il sale di TBA (tetrabutilammonio) dell?HA, in dimetilsolfossido (DMSO) (il DMSO ottimizza la reazione di detta sintesi in comparazione al N-metil-2-pirrolidone (NMP) e alla dimetilformammide (DMF)) si ottiene la sostituzione nucleofila del COO-dell?HA al carbonio legato al bromo dello spaziatore/linker. In questo modo si forma il legame estereo tra l?HA e lo spaziatore/linker precedentemente legato al paclitaxel;
- il coniugato ottenuto viene quindi purificato mediante precipitazione con una soluzione di etanolo/acqua contenente NaBr, quindi lavato una o pi? volte in etanolo/acqua e successivamente lavato in etanolo<, >poi pre-essiccato a 40?C, lasciato a 40?C in camera satura di vapore acqueo a pressione ambiente, infine essiccato a 40?C sottovuoto.
Le fasi di pre-essiccamento e passaggio in camera satura di vapore acqueo a pressione ambiente sono condotte a 40?C, per un tempo di almeno 8 ore, mentre la fase di essiccamento ? condotta a 40?C, sottovuoto, per un tempo di almeno 16 ore.
Questa fase di purificazione del coniugato esclude il processo di dialisi.
Il prodotto finale ottenuto si presenta in forma di polvere fine ed omogenea, viene analizzato mediante HPLC come noto all?esperto e vengono cos? valutati il grado di derivatizzazione o esterificazione al carbossile e la purezza.
Il coniugato HA-paclitaxel preparato e purificato come sopra scritto risulta quindi essere privo di agenti contaminanti rappresentati principalmente da :
? di-Br-paclitaxel: sottoprodotto di reazione del tutto indesiderato, dovuto alla reazione di esterificazione di due molecole di acido 4-bromobutirrico con una molecola di paclitaxel su due ossidrili diversi. La riduzione del contenuto di questo prodotto secondario ? un notevole miglioramento del processo di sintesi e purificazione del coniugato, in quanto il di-Brpaclitaxel reagisce con due molecole di HATBA e determina quindi la formazione di un cross-linkato del tutto privo di efficacia terapeutica; ? residui di NaBr, di solventi e attivanti che sono eliminati grazie allo step di cristallizzazione dell?intermedio in N-eptano, allo step di precipitazione in etanolo e ai successivi lavaggi in soluzione idroalcolica del prodotto finale HA-pacliataxel. Il processo di cristallizzazione in N-eptano pu? infatti avvenire e quindi coinvolgere solo l?intermedio, portando in questo modo ad un prodotto puro facilmente isolabile da residui di vario genere presenti nel medium di reazione.
Grazie a tutti gli steps sopra elencati, si ottiene un coniugato in polvere fine estremamente puro, senza necessit? di attuare un processo di dialisi finale, determinando quindi anche un considerevole risparmio di solventi.
Il procedimento di sintesi e purificazione del coniugato HA-paclitaxel oggetto dell?invenzione si differenzia quindi da EP2045270 in quanto permette:
? la formazione del coniugato con un maggior grado di purezza,
? l?eliminazione della dialisi finale;
? la riduzione dell?utilizzo di solventi;
? l?ottenimento della materia prima come polvere fine ed omogenea, facilmente sterilizzabile via filtrazione una volta formulata in solvente acquoso;
? la complessiva riduzione dei suoi tempi di sintesi.
Al fine di meglio illustrare gli scopi e i vantaggi della presente invenzione ? fornito un esempio di preparazione e purificazione del coniugato HA-paclitaxel che, tuttavia, non costituisce in alcun modo una limitazione della portata delle rivendicazioni.
Esempio 1 : preparazione e purificazione del coniugato paclitaxel-HA con grado di derivatizzazione del 18% p/p
Preparazione del derivato estereo dell?HA (l?HA utilizzato per tale sintesi ha un peso molecolare medio ponderale compreso tra 160.000 e 230.000 Da) con il paclitaxel con un grado di derivatizzazione, cio? di esterificazione al carbossile, del 18% p/p.
A 308,7 mg di paclitaxel (1,0 eq) sciolto in 15 ml di diclorometano sono stati aggiunti 110,1 mg di acido 4-bromobutirrico, 151,9 mg ( 2,2 eq) di EDC e 19,5 mg (0,4 eq) di DMAP. Successivamente alla soluzione cos? ottenuta ? stata aggiunta acqua; dopo agitazione per qualche minuto, si attende che la fase organica si separi. La fase organica ? stata raccolta, mentre la fase acquosa (contenente il residuo di bromuro e i sali) ? stata eliminata. Alla soluzione organica cos? ottenuta sono stati aggiunti 25 ml di N-eptano a 10?C, ottenendo la cristallizzazione del prodotto intermedio, poi isolato per filtrazione e quindi essiccato. Sono stati ottenuti in questo modo 301 mg di prodotto intermedio secco.
300 mg (1,0 eq) di tale intermedio sono stati aggiunti a una soluzione di 1000 mg (4,9 eq) di HA-TBA (sale di HA con tetrabutilammonio) sciolti in 44 ml di DMSO. Dopo 1 giorno di reazione a T 40?C, alla soluzione sono stati aggiunti 50 ml di DMSO. Dopo 1 ora, ? stata aggiunta mediante lenta gocciolazione una soluzione a 40?C di etanolo/acqua in rapporto 96/4 contenente NaBr al 2% p/v, ottenendo cos? la precipitazione del prodotto. Il prodotto cos? ottenuto ? stato pi? volte lavato in etanolo/acqua (8,5/1,5) e infine rilavato con etanolo al 100% e quindi pre-essiccato a 40?C per 8 ore. Il prodotto pre-essiccato ? stato posto successivamente a 40?C in camera satura di vapore acqueo a pressione ambiente per altre 8 ore, e infine essiccato a 40?C sottovuoto per almeno 16 ore e comunque fino a essiccamento completato.
Il prodotto ? stato poi analizzato mediante analisi HPLC per controllare l?effettivo grado di derivatizzazione e il grado di purezza.
Il grado di purezza del coniugato risulta superiore al 98% in peso sul secco e la quantit? del di-Br-paclitaxel, ? inferiore all?1% in peso.
Il prodotto si presenta come polvere fine bianco-giallastra, omogenea e igroscopica.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Processo di preparazione e purificazione di un coniugato acido ialuronicopaclitaxel che comprende o consiste nelle seguenti fasi: a) attivazione del gruppo carbossilico di uno spaziatore/linker acido 4-bromobutirrico mediante agente attivante in presenza di un catalizzatore; b) cristallizzazione dell?intermedio ottenuto dalla fase precedente in solvente organico, quindi sua filtrazione ed essiccamento; c) aggiunta dell?intermedio ottenuto nella fase precedente al sale di TBA (tetrabutilammonio) dell?HA in DMSO; d) purificazione del coniugato HA-paclitaxel cos? ottenuto che presenta un legame estereo tra il carbossile del polisaccaride HA e lo spaziatore/linker, detto spaziatore/linker essendo a sua volta legato mediante legame estereo tramite il suo carbossile al gruppo ossidrilico al carbonio C2' del paclitaxel, mediante precipitazione con una soluzione di etanolo/acqua contenente il sale NaBr, almeno un lavaggio successivo in etanolo/acqua e ulteriore lavaggio in etanolo, pre-essiccamento a 40?C e passaggio in camera satura di vapore acqueo a 40?C e a pressione ambiente, infine essicamento a 40?C sottovuoto.
  2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1, dove nella fase a) di attivazione l'agente attivante ? una carbodiimmide, preferibilmente la 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide cloridrato (EDC).
  3. 3. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni precedenti, dove nella fase a) di attivazione il catalizzatore ? la 4-dimetilamminopiridina (DMAP).
  4. 4. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni precedenti, dove nella fase b) di cristallizzazione il solvente ? N-eptano.
  5. 5. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni precedenti, dove nella fase d) di purificazione il pre-essiccamento e il passaggio in camera satura di vapore acqueo a pressione ambiente sono condotte a 40?C, per un tempo di almeno 8 ore, mentre la fase di essiccamento ? condotta a 40?C, sottovuoto, per un tempo di almeno 16 ore.
  6. 6. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni precedenti, dove l'acido ialuronico di partenza ha un peso molecolare medio ponderale compreso tra i 400 e 3x10<6>Da, in particolare tra 400 e 1x 10<6>Da, ancor pi? in particolare tra 140.000 e 250.000 Da.
  7. 7. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni precedenti, dove l'acido ialuronico di partenza ? di origine estrattiva da creste di gallo, biotecnologica o fermentativa, preferibilmente fermentativa.
  8. 8. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni precedenti, dove l'acido ialuronico di partenza ? di origine fermentativa con peso molecolare medio ponderale compreso tra 140.000 e 250.000 Da.
  9. 9. Coniugato HA-paclitaxel avente un grado di derivatizzazione o esterificazione compreso nell'intervallo dal 15% al 21% p/p, preferibilmente compreso nell'intervallo dal 16% al 20% p/p, dove l'acido ialuronico di partenza ? di origine fermentativa con peso molecolare medio ponderale compreso tra 140.000 e 250.000 Da, detto coniugato essendo in forma di polvere fine ed omogenea, con un grado di purezza superiore al 98% in peso sul secco e contenente una quantit? di di-Br-paclitaxel inferiore all?1% in peso.
  10. 10. Coniugato HA-paclitaxel in forma di polvere fine ed omogenea contenente una quantit? di di-Br-paclitaxel inferiore all?1% in peso, preparato e purificato secondo il processo di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.
  11. 11. Coniugato secondo la rivendicazione 10, dove il grado di derivatizzazione o esterificazione ? compreso nell'intervallo dal 15% al 21% p/p, preferibilmente compreso nell'intervallo dal 16% al 20% p/p.
  12. 12. Composizione farmaceutica consistente essenzialmente del coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 o 9, associato a diluenti/eccipienti farmacologicamente accettabili, per uso nel trattamento del tumore avanzato della mammella, del carcinoma polmonare, del carcinoma ovarico, del carcinoma della vescica, della prostata e dell?endometrio e del mesotelioma.
  13. 13. Composizione farmaceutica per uso secondo la rivendicazione 12, formulata in acqua sterile, isotonica, contenente glucosio al 5% p/v.
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