CN105400784B - 一种枯草芽孢杆菌诱导性强启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种启动子，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明提出的启动子为枯草芽孢杆菌诱导型强启动子，可用于构建高表达β‑半乳糖苷酶和高产表面活性素的重组菌株。该重组菌株表达β‑半乳糖苷酶的活性是含有启动子Pg2(SEQ ID NO：4所示核苷酸序列)重组菌株的3.6～5.5倍。该重组菌株表面活性素摇瓶产量高达9.74g/L，是相同培养条件下野生菌株的17.7倍。本发明枯草芽孢杆菌诱导型强启动子，还可普遍用于高表达其它外源蛋白和构建高产脂肽类生物表面活性剂的菌株。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及一种启动子、一种表达载体、一种重组菌株、一种制备重组菌株的方法、一种利用枯草芽孢杆菌提高表面活性素产量的方法和一种制备所述启动子的方法。
背景技术
任何一段能够独立与转录因子结合并起始转录的DNA序列都可以被称为启动子。在启动子中，能够被σ因子识别的区域具有非常保守的序列特征。其中，在转录起始位点(+1)上游大约10nt以及35nt处的两段序列(称为-10区与-35区)对于σ因子的识别具有决定性的作用，因此这两段序列也被称作狭义启动子或核心启动子。除这段核心启动子区域之外，-35区的上游序列也可能对转录的强度产生影响，这些序列被称作UP元件(UPelement)。
为了获得所需要的目的基因表达量，通常有两种思路进行启动子的遗传改造。一种方式是对目的基因本身的启动子进行突变改造，从而提高启动子的活性。另一种方式是将原有的启动子替换成其他的天然或人工构建的启动子，从而彻底改变下游基因的表达谱，实现对基因转录水平的人为控制。
在启动子替换方面，关键的工作在于目标启动子的选择。从来源分，可供利用的启动子系统包括内源启动子与外源启动子。内源启动子是指宿主物种自身或近源物种的启动子。例如对于枯草芽孢杆菌，提高目的基因表达量最常用的就是内源启动子P43。P43是枯草芽孢杆菌胞嘧啶/脱氧胞嘧啶脱氨酶基因的启动子，属于组成型强启动子。Yang等(2013)从B.licheniformis基因组中筛选到了启动子PluxS，将这一启动子与枯草芽孢杆菌Papr的-10区结合，得到的杂合启动子PlapS进一步提高了转录活性。此外，淀粉酶启动子PamyE、碱性蛋白酶启动子PaprE、苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白基因启动子Pcry3Aa等也都在枯草芽孢杆菌表达外源基因的过程中得到了一定程度的应用。外源启动子主要包括噬菌体启动子以及人工构建的具有某种特性(例如诱导表达)的杂合启动子。枯草芽孢杆菌基础研究中最常用的诱导型启动子是来自枯草芽孢杆菌噬菌体SPO-1的Pspac。Pspac将大肠杆菌阻遏蛋白基因lacI-lacO操纵子与噬菌体SPO-1启动子结合，能够通过IPTG诱导下游基因在枯草芽孢杆菌中表达。Chen等(2010)将大肠杆菌T7噬菌体RNA聚合酶与启动子系统引入枯草芽孢杆菌，成功的表达了异源分泌蛋白。启动子替换方法的优势在于目的性强，通过在一系列已知特性的启动子中选择最适合目的基因表达水平与表达条件的启动子，能够大大减少筛选所耗费的精力。
脂肽属于次级代谢产物，包括表面活性素、芬芥素、伊枯草菌素等多个家族。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
本发明是基于发明人下列问题的发现而完成的：
脂肽合成酶基因的表达量较低，因此需要对脂肽合成酶基因的启动子加以改造或将其替换为活性较强的启动子，以提高脂肽产量。
为此，本发明提出了一种枯草芽孢杆菌诱导型强启动子，用于在枯草芽孢杆菌中高表达表面活性素，具有枯草芽孢杆菌诱导型强启动子的枯草芽孢杆菌的表面活性素摇瓶产量高达9.74g/L，是相同培养条件下野生菌株的17.7倍。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种启动子。根据本发明的实施例，所述启动子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
AGCACTCTTTCCACTATCCCTACAGTGTTATGGCTTGAACAATCACGAAACAATAATTGGTACGTACGATCTTTCAGCCGACTCAAACATCAAATCTTACAAATGTAGTCTTTGAAAGTATTACATATGTAAGATTTAAATGCAACCGTTTTTTCGGAAGGAAATGATGACCTCGTTTCCACCGGAATTAGCTTGGTACCAGCTATTGTAACATAATCGGTACGGGGGTGAAAAAGCTAACGGAAAAGGGAGCGGAAAAGAATGATGTAAGCGTGAAAAATTTTTTATCTTATCACTTGACATTGGAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID NO：1)。
在本发明中，所述启动子被称为Pg3。根据本发明的实施例，所述启动子为诱导型强启动子，诱导剂为异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，可在IPTG诱导下强启动目标蛋白基因的表达。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体包括前面所述的启动子。包含前面所述的诱导型强启动子的表达载体，可以高表达目标蛋白基因。
根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述表达载体进一步包括目的基因，所述目的基因与所述启动子可操作地连接。根据本发明的实施例，所述启动子可在IPTG诱导下强启动目标蛋白基因的表达，当所述目的基因与所述启动子可操作的地连接，所述目的基因在IPTG诱导下，表达量显著提高。
根据本发明的实施例，所述目的基因具有SEQ ID NO：2或3所示的核苷酸序列。
ATGGAAATAACTTTTTACCCTTTAACGGATGCACAAAAACGAATTTGGTACACAGAAAAATTTTATCCTCACACGAGCATTTCAAATCTTGCGGGGATTGGTAAGCTGGTTTCAGCTGATGCGATTGATTATGTGCTTGTTGAGCAGGCGATTCAAGAGTTTATTCGCAGAAATGACGCCATGCGCCTTCGGTTGCGGCTAGATGAAAACGGGGAGCCTGTTCAATATATTAGCGAGTATCGGCCTGTTGATATAAAACATACTGACACTACTGAAGATCCGAATGCGATAGAGTTTATTTCACAATGGAGCCGGGAGGAAACGAAGAAACCTTTGCCGCTATACGATTGTGATTTGTTCCGTTTTTCCTTGTTCACCATAAAGGAAAATGAAGTGTGGTTTTACGCAAATGTTCATCACGTGATTTCTGATGGTATCTCCATGAATATTCTCGGGAATGCGATCATGCACATTTATTTAGAATTAGCCAGCGGCTCAGAGACAAAAGAAGGAATCTCGCATTCATTTATCGATCATGTTTTATCTGAACAGGAATATGCTCAATCGAAGCGGTTTGAAAAGGACAAGGCGTTTTGGAACAAACAATTTGAATCGGTGCCTGAACTTGTTTCCTTGAAACGGAATGCATCCGCAGGGGGAAGTTTAGATGCTGAGAGGTTCTCTAAAGATGTGCCTGAAGCGCTTCATCAGCAGATTCTGTCGTTTTGTGAGGCGAATAAAGTCAGTGTTCTTTCGGTATTTCAATCGCTGCTCGCCGCCTATTTGTACAGGGTCAGCGGCCAGAATGATGTTGTGACGGGAACATTTATGGGCAACCGGACAAATGCGAAAGAGAAGCAGATGCTTGGCATGTTTGTTTCTACGGTTCCGCTTCGGACAAACATTGACGGCGGGCAGGCGTTTTCAGAATTTGTCAAAGACCGGATGAAGGATCTGATGAAGACACTTCGCCACCAAAAGTATCCGTATAATCTCCTAATCAACGATTTGCGTGAAACAAAGAGCTCTCTGACCAAGCTGTTCACGGTTTCTCTTGAATATCAAGTGATGCAGTGGCAGAAAGAAGAGGATCTTGCCTTTTTGACTGAGCCGATTTTCAGCGGCAGCGGATTAAATGATGTCTCAATTCATGTAAAGGATCGATGGGATACTGGGAAACTCACCATAGATTTTGATTACCGCACTGATTTATTTTCACGTGAAGAAATCAACATGATTTGTGAGCGCATGATTACCATGCTGGAGAACGCGTTAACGCATCCAGAACATACAATTGATGAATTAACACTGATTTCTGATGCGGAGAAAGAGAAGCTGCTTGCGAGGGCCGGCGGTAAATCTGTGAGCTACCGTAAGGACATGACGATACCAGAGCTGTTCCAAGAAAAGGCTGAACTGCTTTCTGATCATCCAGCGGTTGTATTTGAAGATCGCACATTGTCCTATCGAACGTTACATGAGCAATCTGCACGCATCGCCAATGTGCTGAAACAGAAAGGGGTTGGCCCGGACAGTCCTGTCGCGGTTTTGATTGAACGCTCTGAACGGATGATTACAGCTATCATGGGAATTTTAAAAGCCGGCGGAGCCTATGTGCCGATTGATCCGGGTTTTCCTGCTGAGCGCATTCAATATATTTTGGAGGACTGCGGGGCGGATTTCATCCTGACTGAATCGAAGGTTGCGGCGCCTGAAGCCGATGCTGAGCTGATTGACTTAGATCAGGCGATTGAGGAAGGTGCAGAAGAAAGCCTGAATGCAGATGTGAACGCTCGGAACCTTGCCTACATTATTTACACATCGGGAACAACCGGACGCCCGAAAGGCGTTATGATCGAGCATCGCCAGGTTCATCATTTGGTTGAATCTCTGCAGCAGACGATTTATCAAAGCGGCAGCCAAACCCTGCGGATGGCATTGCTTGCGCCGTTCCACTTTGATGCGTCAGTGAAGCAGATCTTCGCGTCGCTTCTTTTGGGCCAAACCCTTTATATCGTACCGAAGAAAACAGTGACGAACGGGGCCGCCCTTACTGCATATTATCGGAAGAACAGCATTGAGGCGACGGACGGAACACCGGCTCATTTGCAAATGCTGGCAGCAGCAGGCGATTTTGAAGGCCTAAAACTGAAGCACATGCTGATCGGAGGAGAAGGCCTGTCATCTGTTGTTGCGGACAAGCTGCTGAAGCTGTTTAAAGAAGCCGGCACAGCGCCGCGTTTGACTAATGTGTACGGGCCGACTGAAACGTGCGTTGACGCGTCTGTTCATCCGGTTATCCCTGAGAATGCAGTTCAATCAGCGTATGTGCCGATCGGGAAAGCGCTGGGGAATAACCGCTTATATATTTTGGATCAAAAAGGCCGGCTGCAGCCTGAAGGCGTGGCGGGTGAGCTTTATATCGCGGGAGACGGTGTGGGCCGAGGCTATTTACATTTGCCTGAATTAACGGAAGAGAAGTTTTTACAAGATCCATTCGTGCCGGGCGATCGCATGTACCGGACCGGGGACGTGGTGCGCTGGCTTCCAGATGGAACAATCGAATATTTAGGCAGAGAGGATGACCAGGTCAAAGTCCGCGGATACCGGATTGAGCTTGGGGAAATTGAAGCCGTGATTCAGCAGGCGCCAGACGTTGCAAAAGCCGTTGTTTTGGCACGCCCTGACGAACAGGGAAATCTTGAGGTTTGCGCATATGTTGTGCAGAAGCCTGGAAGCGAATTTGCGCCAGCCGGTTTGAGGGAGCATGCGGCCAGACAGCTTCCTGACTATATGGTGCCGGCTTACTTTACAGAAGTGACAGAAATTCCGCTTACACCAAGCGGCAAAGTCGACCGCCGCAAGCTGTTTGCACTAGAGGTGAAGGCTGTCAGCGGCACTGCCTATACAGCGCCGCGAAATGAGACTGAAAAAGCAATCGCAGCCATTTGGCAGGACGTGCTGAACGTTGAGAAGGCGGGGATCTTTGACAATTTCTTTGAAACTGGCGGACATTCATTAAAAGCCATGACCCTTTTAACAAAGATTCATAAGGAAACAGGCATTGAGATTCCGCTTCAATTTTTGTTTGAGCATCCGACGATTACGGCTCTTGCAGAGGAAGCTGATCACAGAGAAAGCAAAGCTTTTGCGGTGATTGAACCTGCTGAAAAACAGGAGCATTACCCGCTTTCATTGGCACAGCAGCGAACATATATCGTCAGCCAGTTCGAGGATGCGGGAGTCGGCTATAACATGCCAGCAGCAGCAATTCTGGAAGGGCCTTTAGATATTCAAAAGCTGGAGCGCGCATTTCAGGGATTAATCCGACGCCACGAGTCATTGAGAACATCATTTGTTCTTGAAAACAGCACGCCGAGACAGAAAATTCACGATAGCGTTGATTTCAACATCGAAATGATTGAAAGAGGCGGCCGCTCAGATGAGGCAATTATGGCTTCATTCGTTCGGACATTTGATTTGGCGAAAGCTCCGCTGTTCAGAATCGGTTTGCTGGGGCTTGAAGAGAACCGTCATATGCTGCTGTTTGACATGCACCATTTGATTTCTGACGGTGTATCCATTGGCATTATGCTGGAGGAGTTAGCACGCATTTATAAAGGCGAACAGCTTCCTGATCTTCGTCTCCAGTATAAGGACTACGCTGTATGGCAAAGCAGACAGGCTGCTGAAGGGTACAAGAAGGACCAGGCTTATTGGAAGGAAGTCTTTGCAGGCGAGCTCCCGGTGCTTCAGCTTCTGTCCGATTACCCAAGACCACCTGTTCAAAGCTTTGAAGGGGATCGGGTGTCAATCAAGCTGGATGCGGGGGTAAAGGATCGCCTCAATCGTTTGGCTGAACAAAACGGCGCCACTTTATATATGGTGATGCTTTCCGCTTACTATACGCTTTTGTCAAAGTATACGGGGCAGGATGACATCATTGTCGGGACACCGTCAGCGGGCAGAAATCACTCCGATACAGAGGGCATTATCGGGATGTTCGTCAATACGCTTGCGATTCGCAGTGAGGTGAAGCAGAATGAGACGTTTACCCAATTGATCTCGCGTGTCCGCAAACGGGTGCTGGATGCCTTTTCTCATCAGGACTATCCGTTTGAGTGGCTTGTTGAAGATTTGAACATCCCGCGTGATGTTAGCAGGCATCCGCTGTTTGACACGATGTTCAGCCTTCAAAACGCGACAGAGGGCATTCCGGCTGTCGGCGATCTTTCCTTGTCTGTTCAAGAGACCAATTTCAAGATTGCCAAATTTGATTTGACGGTGCAGGCGAGAGAAACCGATGAAGGCATTGAGATTGATGTGGATTACAGCACAAAGCTGTTTAAACAAAGCACGGCAGACAGGCTGCTTACGCATTTTGCGCGTTTGCTTGAAGATGCTGCGGCTGATCCAGAGAAGCCGATTTCTGAGTATAAGCTTCTTTCTGAAGAGGAGGCTGCTTCGCAAATTCAGCAGTTTAACCCGGGCAGAACACCTTATCCGAAAGATAAAACAATTGTTCAGCTGTTTGAGGAGCAAGCGGCGAATACGCCAGACCACACTGCGCTTCAATATGAAGGCGAATCACTCACTTATCGTGAACTGAATGAACGGGCCAATCGTTTAGCCCGCGGCATTCTTTCTCTTGGAGCTGGCGAAGGCAGAACTGCGGCTGTCTTATGCGAGCGGTCAA(SEQ ID NO：2)。
ATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGACACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCTGAAAACCTCAGCGTGACACTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAA(SEQID NO：3)。
SEQ ID NO：2所示核苷酸序列是表面活性素合成酶(srfA)的部分基因序列，SEQID NO：3所示核苷酸序列是β-半乳糖苷酶(lacZ)的基因序列。根据本发明的实施例，当所述启动子与srfA核苷酸序列或lacZ核苷酸序列可操作的连接，表面活性素的产量显著提高，β-半乳糖苷酶的活性亦显著提高。
根据本发明的实施例，所述表达载体进一步包括抗性筛选基因，任选地，所述抗性筛选基因包括氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、红霉素抗性基因、新霉素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因的至少之一。根据本发明的实施例，在加有氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、新霉素、链霉素、壮观霉素的抗性平板上，可成功筛选出具有氨苄青霉素抗性、氯霉素抗性、红霉素抗性、新霉素抗性、链霉素抗性、壮观霉素抗性的菌株，从而成功筛选出成功导入所述表达载体的目的菌株，以用于后续目标蛋白的批量生产。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种重组菌株。根据本发明的实施例，所述菌株具有前面所述的启动子。根据本发明的实施例，具有所述启动子的菌株能够高表达目的蛋白。
根据本发明的实施例，上述重组菌株还可以进一步具有下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述重组菌株进一步包括目的基因，所述目的基因与所述启动子可操作地连接，任选地，所述目的基因具有SEQ ID NO：2或3所示的核苷酸序列，任选地，所述重组菌株为枯草芽孢杆菌。根据本发明的实施例，在枯草芽孢杆菌中，目的基因与所述启动子可操作地连接，在诱导剂IPTG的诱导下，强启动子增强启动，目的基因包括外源蛋白，如β-半乳糖苷酶和内源蛋白，如表面活性素合成酶表达量显著提高。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备前面所述重组菌株的方法。根据本发明的实施例，包括：将前面所述的启动子或所述的表达载体引入宿主细胞中，任选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。根据本发明的实施例，将前面所述的启动子或表达载体引入枯草芽孢杆菌中，在诱导剂IPTG的诱导下，目的基因包括外源蛋白，如β-半乳糖苷酶和内源蛋白，如表面活性素合成酶表达量显著提高。
根据本发明的实施例，上述制备所述重组菌株的方法还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述引入是通过电穿孔转化法进行的。根据本发明的实施例，电穿孔转化法(电转)电压是15kV/cm、时间是5ms，在上述电转条件下，可高效地将所述启动子或表达载体引入枯草芽孢杆菌中，同时又能保持电转后枯草芽孢杆菌的细胞状态，从而使得目的基因在枯草芽孢杆菌中高效表达。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种利用枯草芽孢杆菌提高目的基因表达量的方法。根据本发明的实施例，在枯草芽孢杆菌中，使SEQ ID NO：2或3所示的核苷酸序列处于所述的启动子的控制之下。如前所述，所述启动子是诱导型强启动子。根据本发明的实施例，SEQ ID NO：2或3所示的核苷酸序列处于所述的启动子的控制之下，SEQ ID NO：2或3所示的核苷酸序列可以被高效启动表达，SEQ ID NO：2表示表面活性素合成酶(srfA)的部分基因序列，SEQ ID NO：3表示β-半乳糖苷酶(lacZ)的基因序列，即表面活性素合成酶和β-半乳糖苷酶的表达量被大幅提高。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种利用枯草芽孢杆菌制备目的蛋白的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：在适于所述目的蛋白表达的条件下，培养前面所述的重组菌株，以便获得所述目的蛋白，其中，所述目的蛋白是所述目的基因编码的蛋白。根据本发明的实施例，在适于目标蛋白表达的条件下，重组菌株生长迅速，菌株状态良好，所述启动子被高效诱导，启动目的基因的表达，从而获得大量的目的蛋白。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种制备前面所述启动子的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：通过拼接PCR将SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列进行点突变，以便获得所述启动子，其中，所述拼接PCR的引物具有SEQ ID NO：5～8所示的核苷酸序列。
AGCACTCTTTCCACTATCCCTACAGTGTTATGGCTTGAACAATCACGAAACAATAATTGGTACGTACGATCTTTCAGCCGACTCAAACATCAAATCTTACAAATGTAGTCTTTGAAAGTATTACATATGTAAGATTTAAATGCAACCGTTTTTTCGGAAGGAAATGATGACCTCGTTTCCACCGGAATTAGCTTGGTACCAGCTATTGTAACATAATCGGTACGGGGGTGAAAAAGCTAACGGAAAAGGGAGCGGAAAAGAATGATGTAAGCGTGAAAAATTTTTTATCTTATCACTTGAAATTGGAAGGGAGATTCTTTATTATAAGAATGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID NO：4)。
TTGACATTGGAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATTGTG(SEQ ID NO：5)。
TTATTATAAAGAATCTCCCTTCCAATGTCAAGTGATAAG(SEQ ID NO：6)。
GGGGTACCCAGCTATTGTAACATAATCGGTACG(SEQ ID NO：7)。
CGGGATCCAATTGTTATCCGCTCACAATTCCGTGATGGTGATGGTGATG(SEQ ID NO：8)。
在本发明中，SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列被称为Pg2，SEQ ID NO：5被称为PMF，SEQ ID NO：6被称为PMR，SEQ ID NO：7被称为PgroEF，SEQ ID NO：8被称为Pg2R。根据本发明的实施例，点突变位点设计在引物PMF和PMR上，通过SEQ ID NO：5～8所示的核苷酸序列进行对SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列进行拼接PCR，可以对SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列(Pg2)进行点突变，所得Pg3启动子具有在IPTG诱导下高效启动目的基因表达的功能，其中目的基因包括外源蛋白基因和内源蛋白基因。
根据本发明的实施例，上述制备前面所述启动子的方法还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列是通过利用具有SEQID NO：7～8所述的核苷酸序列的引物对SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列进行PCR扩增得到的。
AGCACTCTTTCCACTATCCCTACAGTGTTATGGCTTGAACAATCACGAAACAATAATTGGTACGTACGATCTTTCAGCCGACTCAAACATCAAATCTTACAAATGTAGTCTTTGAAAGTATTACATATGTAAGATTTAAATGCAACCGTTTTTTCGGAAGGAAATGATGACCTCGTTTCCACCGGAATTAGCTTGGTACCAGCTATTGTAACATAATCGGTACGGGGGTGAAAAAGCTAACGGAAAAGGGAGCGGAAAAGAATGATGTAAGCGTGAAAAATTTTTTATCTTATCACTTGAAATTGGAAGGGAGATTCTTTATTATAAGAATGTGG(SEQ ID NO：9)。
在本发明中，SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列称为PgroE，PgroE是枯草芽孢杆菌中分子伴侣GroEL的核心启动子序列，SEQ ID NO：8所示的引物序列引入了大肠杆菌阻遏蛋白基因lacO操纵子序列，因此，通过SEQ ID NO：7～8所述的核苷酸序列的引物对对PgroE进行扩增，可以高效获得SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列(Pg2)。根据本发明的实施例，通过利用具有SEQ ID NO：7～8所述的核苷酸序列的引物对SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列进行PCR扩增得到的Pg2，后续进行点突变所获得的启动子，具有在IPTG诱导下高效启动目的基因表达的功能，其中目的基因包括外源蛋白基因和内源蛋白基因。
附图说明
图1是根据本发明实施例的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7中分子伴侣GroEL的核心启动子PgroE的凝胶电泳鉴定结果，
其中，M为分子量标准，PgroE条带大小为417bp；
图2是根据本发明实施例的启动子Pg2的构建示意图；
图3是根据本发明实施的启动子Pg3的突变位点示意图；
图4是根据本发明实施例的β-半乳糖苷酶基因lacZ的克隆和质粒构建示意图；
图5是根据本发明实施例的启动子Pg3调控高表达β-半乳糖苷酶基因lacZ的质粒构建过程示意图；
图6是根据本发明实施例的启动子Pg3和Pg2调控高表达β-半乳糖苷酶的酶活比较结果图；
图7是根据本发明实施例的用于启动子Pg3替换表面活性素合成酶天然启动子PsrfA的质粒(Pg3-srfA)的构建示意图；以及
图8是根据本发明实施例的启动子Pg3替换表面活性素合成酶启动子PsrfA的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA的表面活性素产量的统计结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
枯草芽孢杆菌诱导型强启动子
在本发明的一个方面，本发明提出了一种枯草芽孢杆菌诱导型强启动子。
本发明所提出的枯草芽孢杆菌诱导型强启动子Pg3具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，Pg3是由人工构建的杂合启动子Pg2(SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列)进一步在-10区和-35区进行双定点突变获得的启动子序列。
所述的-10区和-35区双定点突变，是指-10区的SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列突变为SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列以及-35区的SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列突变为SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
TATTAT(SEQ ID NO:10)。
TATAAT(SEQ ID NO:11)。
TTGAAA(SEQ ID NO:12)。
TTGACA(SEQ ID NO:13)。
杂合启动子Pg2，是由来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7(于2014年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏登记号为CGMCC NO.8906)中分子伴侣GroEL的核心启动子区与大肠杆菌阻遏蛋白基因lacO操纵子组合构成的杂合启动子。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7分子伴侣GroEL的核心启动子区具有SEQID NO：9所示的核苷酸序列，被称为PgroE。
大肠杆菌阻遏蛋白基因lacO操纵子，具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
AATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID NO:14)。
构建(制备)枯草芽孢杆菌诱导型强启动子Pg3的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种枯草芽孢杆菌诱导型强启动子Pg3的构建方法。下面结合图1～3对构建枯草芽孢杆菌诱导型强启动子Pg3的步骤进行详细描述：
(1)从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7中克隆分子伴侣基因groEL的核心启动子PgroE(其序列为SEQ ID NO：9所示)，PgroE的凝胶电泳鉴定结果如图1所示。
(2)采用PCR方法，在下游引物中添加大肠杆菌阻遏蛋白基因lacO操纵子(其序列为SEQ ID NO:14所示)，将lacO操纵子引入PgroE的3’端，扩增获得能够被IPTG诱导的人工启动子Pg2(其序列为SEQ ID NO:4所示)。构建示意图如图2所示。
(3)将Pg2进行双定点突变，将-10区的SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列突变为SEQID NO:11所示的核苷酸序列以及-35区的SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列突变为SEQ IDNO:13所示的核苷酸酸序列，从而获得强诱导型新启动子Pg3(其序列为SEQ ID NO:1所示)。突变位点示意图如图3所示。
在枯草芽孢杆菌中高表达目标蛋白的方法
在本发明的再一方面，本发明提出了一种在枯草芽孢杆菌中高表达目标蛋白的方法。
其一，本发明提出了一种使用诱导型强启动子Pg3，在枯草芽孢杆菌中高表达外源酶β-半乳糖苷酶的方法。下面结合图4～6对上述方法进行详细描述：
(1)以大肠杆菌BL21基因组为模板，克隆β-半乳糖苷酶基因lacZ(其序列为SEQ IDNO：3所示)。经BamH I+Sma I双酶切后连接至质粒pHT08，以便获得质粒pTS1112。构建过程示意图如图4所示。
(2)在扩增启动子Pg3和Pg2的引物两端分别添加了Kpn I与BamH I酶切位点(引物序列如SEQ ID NO：7～8所示)，将启动子插入质粒pTS1112，获得高表达lacZ的重组质粒。构建过程示意图如图5所示。
(3)将以Pg2和Pg3为启动子的表达β-半乳糖苷酶的重组质粒通过电穿孔转化进入野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7的感受态细胞(处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态的细胞)，分别获得重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg2-lacZ和Bacillus subtilis THY-7/Pg3-lacZ。
(4)对两株重组菌株进行摇瓶发酵培养，以IPTG诱导表达β-半乳糖苷酶，测定β-半乳糖苷酶活性，从而验证Pg3启动子的诱导型强启动能力，结果如图6所示。重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg3-lacZ的β-半乳糖苷酶活性，在12-36小时期间，达到THY-7/Pg2-lacZ的3.6～5.5倍。
其二，本发明提出了一种使用诱导型强启动子Pg3替换枯草芽孢杆菌表面活性素合成酶的天然启动子PsrfA，从而高效合成表面活性素的方法。下面将结合图7～8对上述方法进行详细描述：
(1)从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7基因组中扩增片段长度为5kb的表面活性素合成酶基因片段srfA(其序列为SEQ ID NO:2所示)。
(2)将srfA基因片段采用BamH I和Xho I双酶切，插入质粒pHT08的启动子下游。进一步采用BamH I和Kpn I双酶切，把构建的Pg3诱导型强启动子插入到表面活性素合成酶基因片段的5’端。筛选获得重组质粒Pg3-srfA，构建过程示意图如图7所示。
(3)将质粒Pg3-srfA导入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7的感受态细胞，采用氯霉素抗性平板筛选启动子Pg3与表面活性素合成酶天然启动子PsrfA发生单交换同源重组的重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA，并采用菌落PCR验证所获得的重组菌株的启动子的替换正确性。
(4)对重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA进行摇瓶发酵培养，加入1.25mM IPTG诱导Pg3启动子高效合成表面活性素。重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA与野生菌株Bacillus subtilis THY-7的对比培养,并分别测量表面活性素产量。测量结果表明，重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA的表面活性素产量在摇瓶48h时达到9.74g/L，是野生菌株Bacillus subtilis THY-7的17.7倍。测量结果如图8所示。
含有启动子Pg3的表达载体、重组菌株
在本发明的最后一个方面，本发明提出了一种含有所述启动子Pg3的表达载体和一种含有所述启动子Pg3的重组菌株。
表达载体的宿主菌为枯草芽孢杆菌或其它芽孢杆菌，重组菌株为枯草芽孢杆菌或其它芽孢杆菌。
上述重组菌株的构建(制备)方法，是采用电穿孔转化法(Sambrook J等.Molecular Cloning:A Laboratory manual.Cold Spring Harbor,NY:Cold SpringHarbor Laboratory Press.1989)将载体导入受体菌，如果是以高表达内源/外源目的基因为目标，则不进行同源交换重组，直接筛选得到所需要的重组菌株。如果是以染色体上的启动子替换为目标，则含有内源目的基因的载体导入受体菌进行同源单交换重组后，进而筛选得到所需要的重组菌株。此处的筛选是基于表达载体上所携带的抗性筛选基因，任选地，所述抗性筛选基因包括氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、红霉素抗性基因、新霉素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因的至少之一。
综上，根据本发明的实施例，本发明所提出的一种枯草芽孢杆菌强诱导型启动子Pg3，可在IPTG诱导下强启动目标蛋白基因的表达。在本发明的一个实施例中，发明人采用启动子Pg3诱导表达的β-半乳糖苷酶，酶活可以达到-35区和-10区核心启动子未突变的启动子Pg2的2倍。在本发明的另一个实施例中，发明人将启动子Pg3经过同源单交换重组，成功替换了表面活性素合成酶天然启动子PsrfA，获得的重组枯草芽孢杆菌合成表面活性素的摇瓶产量达到9.74g/L，是野生菌株Bacillus subtilis THY-7的17.7倍。本发明所提出枯草芽孢杆菌强诱导型启动子Pg3及其在枯草芽孢杆菌高表达目标蛋白中的应用和其在构建(制备)表面活性素高产菌株中的应用，具有重要的价值和良好的工业应用前景。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1设计与构建枯草芽孢杆菌诱导型强启动子Pg3
以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY-7基因组DNA为模板，使用Pyrobest高保真聚合酶(购自Takara公司)扩增分子伴侣GroEL的核心启动子序列PgroE(序列如SEQ IDNO：9所示)，所用引物为PgroEF与PgroER(序列如SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:15所示)。
CGGGATCCCCGTGATGGTGATGGTGATG(SEQ ID NO:15)。
扩增条件为：94℃，5min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。最后对PCR扩增产物切胶回收，测序比对回收产物与目标序列的一致性，比对序列一致的回收产物即为所要获得的PgroE产物。
在下游引物PgroER(如SEQ ID NO:15所示序列)中添加大肠杆菌阻遏蛋白基因lacO操纵子(序列如SEQ ID NO:14所示)，得到引物Pg2R(序列如SEQ ID NO:8所示)。以PgroE为模板，使用引物PgroEF与Pg2R进行PCR扩增，从而将lacO操纵子引入PgroE的3’端。PCR扩增条件为：94℃，5min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。最后对扩增产物进行切胶回收，测序比对回收产物序列与目标序列的一致性，比对序列一致的回收产物即为所要获得的人工启动子Pg2(序列如SEQ ID NO:4所示)，启动子Pg2能够被IPTG诱导。
通过拼接PCR对Pg2进行点突变，从而进一步提高Pg2的转录活性。将突变位点设计在引物PMF及PMR(序列如SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示)的5’端。以Pg2为模板，PgroEF/PMR以及PMF/Pg2R为引物，使用Pyrobest高保真聚合酶分别进行第一轮扩增。扩增条件为：94℃，5min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。将第一轮PCR扩增产物混合稀释后作为模板，PgroEF/Pg2R为引物进行第二轮扩增，扩增条件与第一轮相同。扩增产物经Kpn I+BamH I双酶切得到突变后的启动子(序列如SEQ ID NO:1所示)，将其命名为Pg3。
实施例2构建启动子Pg3调控的高表达β-半乳糖苷酶的重组菌株
所述β-半乳糖苷酶基因lacZ来自大肠杆菌BL21(购自天根生化科技(北京)有限公司)。以BL21基因组DNA为模板，使用引物lacZF/lacZR(序列如SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17所示)及phusion高保真聚合酶进行扩增。
CGGGATCCAAAGGAGGAAGGATCTATGACCATGATTACGGATTCACTG(SEQ ID NO:16)，
TCCCCCGGGTTATTTTTGACACCAGACCAACTG(SEQ ID NO:17)。
扩增条件为98℃，1min；98℃，10s，60℃，10s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。得到的lacZ基因片段经BamH I+Sma I双酶切后连接至pHT08质粒(购自MobiTec公司)，获得质粒pHT-lacZ(pTS1112)，构建过程示意图如图4所示。
将启动子Pg3和Pg2片段经Kpn I+BamH I双酶切后与质粒pHT-lacZ连接，即可获得高表达外源目标蛋白β-半乳糖苷酶的重组质粒Pg2-lacZ和Pg3-lacZ。构建过程示意图如图5所示。使用Xue等人的方法(Xue G P,Johnson J S and Dalrymple B P.High osmolarityimproves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteriaBacillus subtilis and Bacillus licheniformis J.Microbiol.Methods.1999,34(3):183-191)制备THY-7野生菌感受态细胞，利用电转化的方法将提取Pg2-lacZ和Pg3-lacZ质粒转入THY-7野生菌感受态细胞，电击条件为15kV/cm，5ms。将电转化产物涂布在含氯霉素(Cm，5ug/mL)的LB平板上，筛选CmR阳性克隆并验证，经验证的阳性克隆即为可在IPTG诱导下高水平表达β-半乳糖苷酶的重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg2-lacZ和Bacillussubtilis THY-7/Pg3-lacZ。
实施例3培养启动子Pg3调控的高表达β-半乳糖苷酶的重组菌株
对实施例2所得到的Bacillus subtilis THY-7/Pg2-lacZ和Bacillus subtilisTHY-7/Pg3-lacZ两个重组菌株进行发酵培养。将平板上的单菌落接入20mL LB+Cm液体培养基中，在37℃、200rpm震荡条件下培养过夜。第二天吸取5mL培养物，接种入装有100mL LB+Cm液体培养基的摇瓶(药瓶容积500mL)中，同时加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃、200rpm条件下震荡培养。在培养过程中取样，检测β-半乳糖苷酶的活性。
每次取样将取样菌液离心，收集菌体，用Z-Buffer(Na2HPO4·12H2O 60mM(21.49g/L)，NaH2PO4·2H2O 40mM(6.24g/L)，KCl 10mM(0.746g/L)，MgSO4·7H2O 1mM(0.246g/L)，β-巯基乙醇50mM)洗涤后重悬，加入溶菌酶破壁。然后取一定量处理后的菌液，加入显色底物(o-NPG)，28℃反应30min。反应终止后使用采用紫外-可见分光光度计在420nm下测量反应液的吸光度，从而确定细胞内β-半乳糖苷酶的活性。
测量结果如图6所示，在12-36h的培养过程中，Bacillus subtilis THY-7/Pg3-lacZ的β-半乳糖苷酶活性远远高于未进行突变改造的Bacillus subtilis THY-7/Pg2-lacZ，在12h、24h和36h时，分别是THY-7/Pg2-lacZ的5.5、3.6和3.9倍。因此，启动子Pg3具有比Pg2更高的启动活性。
实施例4构建启动子Pg3替换表面活性素合成酶天然启动子PsrfA的重组菌株
以Bacillus subtilis THY-7基因组DNA为模板，以srfAF与srfAR为引物(序列如SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19所示)。
CGGGATCCAAAGGAGGAAGGATCTATGGAAATAACTTTTTACCCTTTAACG(SEQ ID NO:18)。
CCGCTCGAGTTGACCGCTCGCATAAGACAG(SEQ ID NO:19)。
使用Pyrobest高保真聚合酶(购自Takara公司)进行PCR扩增表面活性素合成酶基因srfA片段srfA(序列见SEQ ID NO:2所示)，扩增片段长度为约5kb。将srfA进行BamH I+Xho I双酶切后连入携带Pg2启动子的质粒pHT08,即得到重组质粒Pg2-srfA。将Pg2-srfA电转入THY-7感受态细胞，筛选CmR阳性克隆，经验证得到启动子Pg2替换PsrfA的重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg2-srfA。该菌株中，表面活性素合成酶基因srfA在Pg2的控制下表达。
将Pg3进行Kpn I+BamH I双酶切后与切除启动子Pg2(Kpn I+BamH I双酶切)的质粒Pg2-srfA连接，即得到重组质粒Pg3-srfA(构建过程示意图如图7所示)。将Pg3-srfA电转入THY-7感受态细胞，筛选CmR阳性克隆，测序验证后得到PsrfA替换为Pg3的重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA。该菌株中，表面活性素合成酶基因srfA在Pg3的控制下表达。
实施例5培养启动子Pg3替换表面活性素合成酶天然启动子PsrfA的重组菌株
将Pg3-srfA电转入THY-7感受态细胞，筛选CmR阳性克隆，经验证得到启动子Pg3替换PsrfA的重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA。该菌株中，表面活性素合成酶基因srfA在Pg3的控制下表达。
对获得的重组菌株Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA与Bacillus subtilisTHY-7分别进行发酵培养，培养物接种到培养基的同时加入终浓度为1.25mM的IPTG(发酵培养过程和条件同实施例3相同)。在发酵不同时间取样，检测Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA与Bacillus subtilis THY-7的细胞生长状况及表面活性素产量。
发酵液中表面活性素的浓度采用HPLC分析，HPLC分析流动相为甲醇和水用量比例为85/15，流速为1mL/min，色谱柱为C18-ODS反相色谱柱，柱温40℃，紫外检测器，检测波长205nm。
重组菌株发酵液Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA的OD600可增长至50左右，显著高于Bacillus subtilisTHY-7野生菌株。表面活性素浓度的统计结果如图8所示：Bacillus subtilis THY-7/Pg3-srfA表面活性素产量可达9.74g/L，为THY-7野生菌产量(0.55g/L)的17.7倍。表面活性素浓度峰值出现在发酵36h，48h与36h的产量基本相当。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (17)
1.一种启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的启动子。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，进一步包括目的基因，所述目的基因与所述启动子可操作地连接。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2或3所示。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体进一步包括抗性筛选基因。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述抗性筛选基因包括氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、红霉素抗性基因、新霉素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因的至少之一。
7.一种重组菌株，其特征在于，其含有权利要求1所述的启动子。
8.根据权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，进一步包括目的基因，所述目的基因与所述启动子可操作地连接。
9.根据权利要求8所述的重组菌株，其特征在于，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2或3所示。
10.根据权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为枯草芽孢杆菌。
11.一种制备权利要求7～10任一项所述重组菌株的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述的启动子或权利要求2～6任一项所述的表达载体引入宿主细胞中。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述引入是通过电穿孔转化法进行的。
14.一种利用枯草芽孢杆菌提高目的基因表达量的方法，其特征在于，包括：
在IPTG诱导下，在枯草芽孢杆菌中，使SEQ ID NO：2或3所示的核苷酸序列处于权利要求1所述的启动子的控制之下。
15.一种利用枯草芽孢杆菌制备目的蛋白的方法，其特征在于，包括：
在适于所述目的蛋白表达的条件下，培养权利要求10所述的重组菌株，以便获得所述目的蛋白，
其中，所述目的蛋白是所述目的基因编码的蛋白，
所述适于所述目的蛋白表达的条件包括在IPTG诱导下。
16.一种制备权利要求1所述的启动子的方法，其特征在于，包括：通过拼接PCR将SEQID NO：4所示的核苷酸序列进行点突变，以便获得所述启动子，
其中，所述拼接PCR的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5～8所示。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列是通过利用引物对SEQ ID NO：9所述的核苷酸序列进行PCR扩增得到的，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示。
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |