CN103160511A - 同时适用于大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的启动子 - Google Patents
同时适用于大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的启动子 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103160511A CN103160511A CN2013101239157A CN201310123915A CN103160511A CN 103160511 A CN103160511 A CN 103160511A CN 2013101239157 A CN2013101239157 A CN 2013101239157A CN 201310123915 A CN201310123915 A CN 201310123915A CN 103160511 A CN103160511 A CN 103160511A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- promotor
- promoter
- subtilis
- expression
- bacillus subtilis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一个从地衣芽孢杆菌中分离的强启动子片段，该启动子在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中都表现了高活性，为枯草芽孢杆菌的重组蛋白表达提高了有力的启动元件。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体而言，涉及一种同时适用于大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的启动子及其应用。
背景技术
启动子是一段RNA聚合酶识别、结合和起始转录的特定DNA序列，通常位于基因的上游。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动转录过程，因此启动子是基因表达调控的重要顺式元件，对一个基因(或转录单元)的转录是否开始以及在什么时候开始起到决定性的控制作用，它与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等反式元件的相互作用是启动子调控模式的实质。
在基因工程中，常需构建高水平表达异源蛋白的表达载体，启动子对外源基因的表达水平影响极大，使其成为基因工程表达载体的重要元件。因此，研究启动子功能对于了解生物生长发育、探讨生物适应环境的机制及实现外源基因在转基因生物中的高效表达等均有重要意义。启动子的调控在转录环节中也占有十分重要的地位，故研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制的研究意义重大。目前，在表达载体上应用最广泛的大肠杆菌天然启动子有四种，即Ptac、Plac、PT7和PλL。酵母菌可控性启动子表达系统有半乳糖启动子(gal)、酸性磷酸酶启动子(pho)等。为了获得更强的启动子，人们利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子以满足不同外源基因的表达要求。实验表明，用杂合启动子可以提高基因的表达效率。
在枯草芽孢杆菌基因工程研究中，最常用的诱导性启动子是spac和xyl。spac是枯草芽孢杆菌噬菌体SPO1与大肠杆菌乳糖操纵子融合的启动子，在IPTG诱导下可以高效表达；xyl启动子由巨大芽孢杆菌术糖基因的表达元件构建而成。xyl由自己编码的xyR阻遏蛋白严格控制表达，与启动子spac相比，其调控更严谨，诱导效率更高。这2个启动子在枯草芽孢杆菌中应用很广，但是它们也有自己的缺点，其诱导物IPTG、木糖的价格较高，而且IPTG有毒性，因此它们在实际应用中有很大的局限性。
毫无疑问，分离获得新的强启动子是枯草芽孢杆菌生物技术应用和研究领域的热点。并且，来源于其他芽孢杆菌的启动子有可能在枯草芽孢杆菌中具有价值和潜力。本发明从从地衣芽孢杆菌基因组DNA中筛选到一个在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中有强转录活性的片段，该启动子包含了luxS基因的调控序列。目前尚无关于地衣芽孢杆菌luxS基因调控元件及其在大肠和枯草中应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种双启动子，其能够同时适用于大肠杆菌与枯草芽孢杆菌。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种启动子，其特征在于所述启动子具有SEQ IDNO.1所示的序列。
本发明另一方面还涉及含有上述启动子的载体。
本发明另一方面还涉及上述载体在大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌中表达的应用，优选的，所述的应用为在大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌中同时表达。
本发明公开了一个从地衣芽孢杆菌中分离的强启动子片段，该启动子在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中都表现了高活性，为枯草芽孢杆菌的重组蛋白表达提高了有力的启动元件。
附图说明
图1：双启动子结构示意图和序列：A：SD和bgaB代表核糖体结合位点和β-半乳糖苷酶编码基因；ylybCDS和luxsCDS代表ylyb和luxs基因的编码区；
B：SD代表核糖体结合位点；-10和-35指代原核启动子的保守序列；bgaB代表β-半乳糖苷酶编码基因；Sau3AI代表限制性消化酶。
图2：是双启动子在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中热稳定性β-半乳糖苷酶表达量：纵坐标为热稳定性半乳糖苷酶活性；浅色柱和深色柱分别代表E.coli DH5α(pShuttle-Fusl)和Bacillussubtilis PY79(pShuttle-Fusl)的热稳定性半乳糖苷酶的酶活。酶活单位为Mill U/mL粗酶液。
图3：SDS-PAGE检测双启动子对热稳定性β-半乳糖苷酶的表达：pLux和pDET-1为阴性对照，pShuttle-Hyb和pShuttle-Fusl为克隆启动子在枯草芽孢杆菌中介导的热稳定性半乳糖苷酶的的表达。Marker为蛋白分子量标准，单位为KD。
具体实施方式
以下结合实施例详细描述本发明内容：
实施例1：启动子克隆与序列
用Sau3A I不完全消化的B.licheniformis基因组DNA片段，克隆得到一个启动子片段，通过序列比对和预测(NCBI blast2.0；BPROM program)。双启动的结构如图1A所示，序列为图1B。
实施例2：双启动子片段的亚克隆及表达载体构建
用引物对lux-2(TTGGATCCTCTCTCCCCTCTAATCG)和insert-2(TTGGATCCAGGTCAATGCTTTTC)从克隆的启动子片段中PCR扩增分离的双启动子片段。用ApaI和EcoRl消化PCR扩增的双启动子片段，并连接至pGJ103的相应位点，转化大肠杆菌DH5α(E.coli DH5α)，挑选阳性克隆pGJ11。用引物对bgaup(GCGAATTCATGAATGTGTTATCCTC)和bgadown(TTGGATCCTCTA AACCTTCCCGG)从pDL扩增热稳定性半乳糖苷酶基因bgaB。用EcoRI和BamHI消化bgaB后回收，并与EcoRI和BamHI消化的pGJ11连接。将裂解物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到E.coli DH5α(pShuttle-Fusl)。将pShuttle-Fusl转化枯草芽孢杆菌PY79(Bacillus subtilis PY79)，筛选阳性克隆得到Bacillus subtilis PY79(pShuttle-Fusl)。
实施例3：双启动子对热稳定性半乳糖苷酶的高效表达
将E.coli DH5α(pShuttle-Fusl)和Bacillus subtilis PY79(pShuttle-Fus l)在液体LB培养基中培养，分别在12、24、36小时检测热稳定半乳糖苷酶的产量。热稳定性半乳糖苷酶的测定方法如下：
①测量菌液的OD595(数值控制在0.1-0.6范围内，若超过0.6，则需要用LB液体稀释；若稀释过量，数值则会＜0.1)，取一定体积的菌液于1.5ml的离心管中以最高速(12000)离心3min：
②到掉上清液，加入0.7ml的Z缓冲液悬浮沉淀(稀释：I1ml菌液离心弃上清→加入1mlZ·buffer，悬浮沉淀→吸取100μml悬液加入另一1.5ml离心管→加入900μl Z·buffer，摇匀(1O倍稀释液)→II吸取100μ悬液+700μl Z·buffer(100倍稀释液)，若需要再稀释则在I基础上再取出100μml悬液加入另一1.5ml离心管→加入900μlZ·buffer，摇匀→II)，再加入Triton X10μl(10％)和10mg/ml的溶菌酶10μl，充分混匀后于37℃水浴5min(或37℃培养箱)；
③取出离心管，加入4mg/ml的邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)200μl，混匀后置于28℃继续水浴(启动子转录活性检测用55℃水浴)；
④到反应进行到15min时，取出离心管，迅速加入5OOμl的4mol/L的Na2CO3中止反应；
⑤12000转离心3min，然后取上清并测量其OD420(若OD420超高，在上述4中，取悬液沉淀的悬浊液稀释为1/10、1/100、1/1000，加Z缓冲至0.7ml，再进入5)；
⑥以下列公式计算酶活
公式：酶活性＝(1000×A420)/(反应时间(min)×OD595)(密勒单位)
Z缓冲夜的配制
Na2HPO4·7H2O 60mmol
NaH2PO4 40mmol
KCl 10mmol
MgSO4·7 H2O 1mmol
*β-巯基乙醇，PH7.050mmol
*每次用时加入
在双启动子的转录调控下，β-半乳糖苷酶在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达效率如图2和图3所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (3)
1.一种启动子，其特征在于所述启动子具有SEQ IDNO.1所示的序列。
2.含有权利要求1所述启动子的载体。
3.权利要求2所述的载体在大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌中表达的应用，优选的，所述的应用为在大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌中同时表达。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013101239157A CN103160511A (zh) | 2013-04-11 | 2013-04-11 | 同时适用于大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的启动子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013101239157A CN103160511A (zh) | 2013-04-11 | 2013-04-11 | 同时适用于大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的启动子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103160511A true CN103160511A (zh) | 2013-06-19 |
Family
ID=48584045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013101239157A Pending CN103160511A (zh) | 2013-04-11 | 2013-04-11 | 同时适用于大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的启动子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103160511A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105400784A (zh) * | 2015-10-10 | 2016-03-16 | 清华大学 | 一种枯草芽孢杆菌诱导性强启动子及其应用 |
| CN105441512A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-03-30 | 天津科技大学 | 一种高效制备低聚果糖的方法及其酶制剂 |
-
2013
- 2013-04-11 CN CN2013101239157A patent/CN103160511A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YANG ET AL: "Generation of an Artificial Double Promoter for Protein Expression in Bacillus subtilis through a Promoter Trap System", 《PLOS ONE》, 8 February 2013 (2013-02-08) * |
| 白晓婷等: "大肠杆菌 枯草杆菌穿梭载体的构建及应用", 《畜牧与兽医》, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 8 - 10 * |
| 马磊等: "穿梭表达载体pYG43 的构建及碱性纤维素酶基因的分泌表达", 《安徽农业科学》, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 448 - 450 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105400784A (zh) * | 2015-10-10 | 2016-03-16 | 清华大学 | 一种枯草芽孢杆菌诱导性强启动子及其应用 |
| CN105400784B (zh) * | 2015-10-10 | 2019-01-15 | 清华大学 | 一种枯草芽孢杆菌诱导性强启动子及其应用 |
| CN105441512A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-03-30 | 天津科技大学 | 一种高效制备低聚果糖的方法及其酶制剂 |
| CN105441512B (zh) * | 2016-01-20 | 2019-02-19 | 天津科技大学 | 一种制备低聚果糖的方法及其酶制剂 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Calvio et al. | Swarming differentiation and swimming motility in Bacillus subtilis are controlled by swrA, a newly identified dicistronic operon | |
| Bubendorfer et al. | Specificity of motor components in the dual flagellar system of Shewanella putrefaciens CN‐32 | |
| Allers | Overexpression and purification of halophilic proteins in Haloferax volcanii | |
| Meng et al. | Enhanced expression of pullulanase in Bacillus subtilis by new strong promoters mined from transcriptome data, both alone and in combination | |
| Chityala et al. | High yield expression of novel glutaminase free l-asparaginase II of Pectobacterium carotovorum MTCC 1428 in Bacillus subtilis WB800N | |
| WO2017215204A1 (zh) | 一种枯草芽孢杆菌重组菌株及其制备方法与应用 | |
| CN109804072A (zh) | 地衣芽孢杆菌中flp介导的基因组整合 | |
| Le et al. | High-level soluble expression of a thermostable xylanase from thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus in Escherichia coli via fusion with OsmY protein | |
| Cheong et al. | Enhancing functional expression of heterologous proteins through random substitution of genetic codes in the 5'coding region | |
| Jia et al. | Homologous overexpression of a lipase from Burkholderia cepacia using the lambda Red recombinase system | |
| CN109486847A (zh) | 基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统 | |
| Ye et al. | A facile and robust T7-promoter-based high-expression of heterologous proteins in Bacillus subtilis | |
| CN103160511A (zh) | 同时适用于大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的启动子 | |
| Gao et al. | Exploring the N‐terminal role of a heterologous protein in secreting out of Escherichia coli | |
| CN112501193A (zh) | 一种烟酸及烟酰胺生物传感系统 | |
| CN106434733B (zh) | 一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体及其应用 | |
| Halbedel et al. | SecA is required for membrane targeting of the cell division protein DivIVA in vivo | |
| Ruller et al. | Efficient constitutive expression of Bacillus subtilis xylanase A in Escherichia coli DH5α under the control of the Bacillus BsXA promoter | |
| Le et al. | Using the IPTG-inducible P grac 212 promoter for overexpression of human Rhinovirus 3C protease fusions in the cytoplasm of Bacillus subtilis cells | |
| CN102899339A (zh) | 一种碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列及其高效表达方法 | |
| CN110004101A (zh) | 用于为目标蛋白量身构建最优的枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失表达宿主的方法 | |
| Xiao et al. | Peroxisome-targeted and tandem repeat multimer expressions of human antimicrobial peptide LL37 in Pichia pastoris | |
| Li et al. | Characterization of the diatomite binding domain in the ribosomal protein L2 from E. coli and functions as an affinity tag | |
| Guo et al. | Rational design of signal peptides for improved MtC1LPMO production in Bacillus amyloliquefaciens | |
| CN101712961B (zh) | 一种铁氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130619 |