CN105441512A - 一种高效制备低聚果糖的方法及其酶制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于应用酶工程领域，具体涉及一株重组基因工程菌及其制备低聚果糖的方法。所述重组菌是通过将黑曲霉来源的果糖基转移酶编码基因fru3基因在芽孢杆菌宿主细胞中进行高效表达获得，所述重组菌还包含能使果糖基转移酶基因fru3基因在地衣芽孢杆菌中高效表达的启动子Pshuttle-09。此外，本发明利用疏水性组合溶剂对果糖基转移酶的保护性，通过在低聚果糖生产过程添加疏水溶剂的方式，提高酶的耐热性，从而提高底物蔗糖溶液浓度，制备出的低聚果糖无需后期脱色、精制、浓缩等工艺。利用这一技术，大大缩短了低聚果糖生产工艺路线，减少了设备投入，降低了生产成本。

Description

一种高效制备低聚果糖的方法及其酶制剂
技术领域：
本发明属于应用酶工程领域，具体涉及一株重组基因工程菌及其制备低聚果糖的方法。
背景技术：
低聚果糖(Fructooligosaccharides),简称FOS，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖,分子式为:G-F-Fn，n＝1-3(G为葡萄糖，F为果糖)。它是由蔗糖和1-3个果糖基通过β-2-1糖苷键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖及其混合物。工业上一般由蔗糖经果糖基转移酶(Fruetosyltransferase，EC2.4.1.9，FTS)的转糖基作用而生成低聚果糖，低聚果糖是一种保健食品，具有很多对人体有益的功能，如它热量低，促进矿物质吸收，不引起龋齿，降血脂，润肠通便，是双歧杆菌的增殖因子等，其作为功能性因子被广泛应用于食品中，如奶制品、饮料、糖果糕点、肉类加工品等。所以低聚果糖的工业化生产对促进我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。
目前低聚果糖的制备方法有两种：菊粉水解，蔗糖合成。因利用菊粉酶水解菊粉生产低聚果糖有产品成分复杂，工艺繁琐，成本高等缺点，所以大多数厂家逐渐改用果糖基转移酶催化蔗糖生产低聚果糖。
酶的来源及制备方法。果糖基转移酶存在于植物以及微生物中。据文献报道,植物中的果糖基转移酶催化活性很弱,产率低,且受到季节限制,而来自微生物的果糖基转移酶比植物的催化活性高,且耐高温,可催化较高浓度的蔗糖进行转糖基反应,使用方便。具有果糖基合成酶活性的微生物包括丝状真菌、酵母菌和细菌。不同微生物来源的果糖基转移酶的相对分子质量、米氏常数、最适作用温度、最适pH及基质特异性方面存在一定差异。如来源于节杆菌(Arthrobactersp.)的果糖基转移酶的分子质量为52kDa,最适温度为55℃,最适pH6.5,而来源于微杆菌(Microbacteriumsp.)的果糖基转移酶的分子质量46kDa,最适温度48℃,最适pH6.0。再比如来源于黑曲霉的果糖基转移酶在不同pH下,转果糖基活性/水解活性不同，在pH4.0～5.0和pH8.0时低聚果糖产量最高,而在pH5.0～8.0范围内的水解酶活力最高。目前，常被用来作为工业化生产的菌种有黑曲霉(Aspergillusniger)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)和出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)等。目前，国内外工业化生产的方法主要是通过选出高活性菌种后破碎菌体、菌体和酶分离制备液体酶制剂,进行低聚果糖的生产,工艺路线较长,设备多,而且通常制备的低聚果糖产品外观色泽差或呈褐色,产品应用范围受到限制。进一步通过野生型筛选、理化诱变和工艺条件优化的手段得到的果糖基转移酶普遍活力不高。而基因工程手段是提高果糖基转移酶活性的有效途径之一。
但是，受果糖基转移酶的酶学性质的影响，普遍耐热性差，反应温度不能过高，一般低于50℃，在此条件下，底物蔗糖的浓度最大为50％(w/v)，通过微生物的果糖基转移酶来进行低聚果糖的工业化生产，其理论的最大产率仅为55～60％(YunJW.Fructooligosaccharides-occurrence,preparation,andapplication.EnzymeMicrobTech,1996,19:107-117)。这一工艺后的半成品还需要经脱色、精制、浓缩等工艺，这些工艺存在操作复杂，消耗大，生产成本高等问题。
针对目前常用的工业化生产菌种的耐热性差的问题，研究人员普遍从两个方面进行研究。一种是自然界中寻找耐热性高产果糖基转移酶的菌株。另一种是采用PEG修饰、介孔分子筛吸水、疏水性溶剂保护和酶的冻干结晶体制备等手段将目前耐热性差的果糖基转移酶进行耐热性保护。
进一步，无论是通过哪一种酶的耐热性保护方法，所获得的在高温下高底物浓度下具有高活性的果糖基转移酶分子，必须经过高效和廉价的制备，才会具有工业应用的意义。再进一步，疏水性溶剂可以使酶的结构更加紧密，酶的稳定性提高，利用这一特点，一方面可以在不增加工艺步骤的前提下，实现高温高底物浓度下的低聚果糖的工业生产；另一方面，可以缩减后期脱色、精制、浓缩等工艺，提高相关应用工艺技术的完善与优化，降低生产成本。这对促进我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。
发明内容：
为了解决和克服上述低聚果糖生产中酶制剂成本高，生产工艺路线较长，设备多，成本高等问题和不足，本发明利用基因工程手段实现了黑曲霉来源的果糖基转移酶制剂的高效表达，并利用疏水性组合溶剂对果糖基转移酶的保护性，成功实现了在高温下、高浓度蔗糖液中进行低聚果糖的工业生产。利用这一技术，大大缩短了低聚果糖生产工艺路线，减少了设备投入，降低了生产成本。该方法技术先进，操作简单，生产成本低。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：提供一株芽孢杆菌重组菌株，所述重组菌是通过将黑曲霉来源的果糖基转移酶编码基因fru3基因在芽孢杆菌宿主细胞中进行高效表达获得，所述重组菌还包含能使果糖基转移酶基因fru3基因在芽孢杆菌中高效表达的启动子Pshuttle-09；
所述fru3基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；
所述启动子Pshuttle-09的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；
所述芽孢杆菌宿主细胞为地衣芽孢杆菌CBB3008，保藏编号CCTCCNo.M208236，具体参见中国发明专利ZL200810235368.0，及DandanNiu,etal.MicrobialCellFactories,2009,8:58；
所述重组菌在下述条件下生产果糖基转移酶的发酵液酶活为1650～1680U/mL：
发酵培养基质量体积比组成为：酵母膏2～4％，蛋白胨3.2～5.6％，葡萄糖10～30％，pH4～8；
发酵温度42±1℃；发酵过程中维持溶氧为20％以上；发酵12h后，通过流加50％葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为5～10g/L；发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为4～8；发酵时间为150～180h；
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：提供一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，具体为：按每Kg蔗糖(干)加入果糖基转移酶3000～12000U，将果糖基转移酶加入到2-110％(w/v)的蔗糖溶液中，再按疏水溶剂与蔗糖溶液体积比为2-50％加入疏水溶剂，控制反应液在pH3～8，温度在55～100℃，搅拌速度在50～200r/min的条件下反应4～24h；
所述疏水溶剂为DMSO，甲基叔丁基醚，异戊醇，正丁醇，叔丁醇，甲酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯，乙酸戊酯，环己烷，正庚烷，十二烷中的至少一种；
优选地，所述疏水溶剂为由乙酸丁酯、环己烷、正庚烷组成；
优选地，所述疏水溶剂为由乙酸丁酯：环己烷：正庚烷按体积比＝1：1：1组成。
有益效果：
1、本发明筛选获得的启动子，实现了果糖基转移酶的高效分泌表达，与原启动子相比，果糖基转移酶的分泌量提高了3倍多，可以达到1680U/mL以上，本发明有助于降低果糖基转移酶的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力；
2、本发明筛选获得果糖基转移酶的启动子的方法，相当于转录效率的优化，有利于下游的发酵过程；本发明的重组菌的选育方法，经过适当修饰后，可以用于其它类型的工业酶制剂，特别是以地衣芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌等为宿主细胞的工业酶制剂生产菌株的选育；
3、本发明利用疏水性组合溶剂提高了对果糖基转移酶的保护性，成功实现了在高温下、高浓度蔗糖液中进行低聚果糖的工业生产，所制备的低聚果糖的糖浆中，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的转化率可高达56％～60％，高于同类产品5％～10％；
4、本发明采用的疏水溶剂保护技术，可以提高酶的耐热性，从而提高底物蔗糖溶液浓度，制备出的低聚果糖无需后期脱色、精制、浓缩等工艺，大大缩短了低聚果糖生产工艺路线，减少设备投入，节约生产成本20～28％。
附图说明：
图1重组质粒的构建过程；
图2底物保护溶剂的筛选结果；
图3温度对转化效率的影响；
图4低聚果糖产品的成分分析图谱。
具体实施方式：
本发明通过克隆来源于黑曲霉AspergillusnigerCBS513.88的fru3基因，并通过筛选最优的启动子，获得重组菌CBB3008-Pshuttle-09-fru3，以重组菌株发酵制备果糖基转移酶液，并通过筛选最优的保护溶剂获得了高效制备低聚果糖的新工艺。
下面结合实施例对本发明进行进一步说明；下述实施例并不限定本发明，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1果糖基转移酶编码基因在地衣芽孢杆菌中的克隆
采用TRNzol总RNA提取试剂提取黑曲霉(Aspergillusniger)CBS513.88的总RNA。以总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA，然后分别以第一链cDNA为模板，以引物(序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)将果糖基转移酶编码基因(序列SEQIDNO:1)进行PCR扩增。PCR扩增体系及反应条件参考HSDNAPolymerase说明书(TaKaRa)。再将PCR产物克隆入表达载体pHY-WZX(DandanNiuandZhengxiangWang.JIndMicrobiolBiotechnol,2007,34:357-362)的EcoRI、SacI位点中，获得重组表达质粒pHY-fru3。
实施例2使果糖基转移酶高效分泌表达的启动子的筛选
利用NCBI和文献查询芽孢杆菌来源的启动子(包括P43、Pshuttle-09、Pgrac、PxylA、PsacB、PmtlA、Pglv、PaprE、PaprN、PmanP、PHapII、PituD)的基因序列(依次为序列SEQIDNO:4～SEQIDNO:15)，再通过全基因合成技术(牛丹丹等。应用与环境生物技术学报，2007,13(4)：515-518)获得含有这12种启动子的质粒pUC18-promoter。构建这些启动子与果糖基转移酶相融合的表达载体，并电转化入地衣芽孢杆菌中，通过酶活的测定筛选出胞外酶活最高的重组菌株，具体包括以下步骤：
1、质粒pHY-Promoter-SP-fru3的构建
以包含上述12种不同启动子的质粒pUC18-promoter为模板，利用引物SEQIDNO:16和SEQIDNO:17对启动子P43进行PCR扩增。同时，以质粒pHY-fru3为模板，序列SEQIDNO:18和SEQIDNO:19为引物对质粒本身的信号肽(SP)进行PCR扩增。然后分别将这两个片段进行胶回收(TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0)，以等摩尔的这两个片段为模板，以SEQIDNO:16和SEQIDNO:19为引物，通过重叠延伸PCR扩增得到的片段命名为P43-SP。再将这个片段克隆入重组质粒pHY-fru3的BamHI与EcoRI位点，构建重组质粒pHY-P43-SP-fru3。使用表1和表2中所列的引物，按照该方法构建其它11个重组质粒pHY-Promoter-SP-fru3，具体过程见图1。
表1重组质粒构建所用引物对照表
表2引物序列表
2、重组菌的构建与筛选
按照文献(DandanNiu,etal.MicrobialCellFactories,2009,8:58)的方法将上述重组质粒电转化入地衣芽孢杆菌CBB3008中，在选择性平板上筛选转化子，分别命名为地衣芽孢杆菌CBB3008-P43-fru3、CBB3008-Pshuttle-09-fru3、CBB3008-Pgrac-fru3、CBB3008-PxylA-fru3、CBB3008-PsacB-fru3、CBB3008-PmtlA-fru3、CBB3008-Pglv-fru3、CBB3008-PaprE-fru3、CBB3008-PaprN-fru3、CBB3008-PmanP-fru3、CBB3008-PHapII-fru3、CBB3008-PituD-fru3。以含有质粒pHY-fru3(命名为地衣芽孢杆菌CBB3008-PamyL-fru3)的菌株为对照。
将上述重组菌在含有50mL培养基的250mL三角瓶中进行发酵。发酵在发酵培养基(酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1～4％，葡萄糖10～20％，pH7.0)中，于42℃、220rpm下进行，发酵时间为120h。再通过酶活测定对重组菌进行筛选，结果汇总于表3。
其中，果糖基水解酶的酶活测定如下：
(1)以蔗糖为底物的酶活的测定方法
在最适条件下，每分钟产生1μmol的葡萄糖为一个酶活力单位。
(2)标准曲线的绘制
称取无水葡萄糖，配制不同浓度的葡萄糖标准溶液(0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mg/mL)，取标准葡萄糖1mL溶液于15mL刻度试管中，再加入1.5mL的DNS试剂于各管中，混匀，沸水浴加热15min后用流水冷却，每管加入10.5mL蒸馏水，摇匀后于540nm波长处测取数值，以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，相应的吸光度为纵坐标作标准曲线。
(3)样品的测定
取9mL10％的蔗糖溶液，pH6.0的柠檬酸-磷酸缓冲液于三角瓶中，加入1mL酶液，充分混合，在50℃的条件下，转速200r/min水浴摇床反应60min，取上层清液作为DNS样品检测。
样品液适当稀释，使糖浓度为0.1～0.8mg/mL，取稀释后的糖液0.5mL于15mL刻度试管中，加DNS试剂1.5mL，沸水煮沸15min，冷却后入10.5mL去离子水，在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖对应样品中糖含量。
表3摇瓶条件下不同重组菌中果糖基转移酶的酶活测定
经上述步骤筛选获得能提高果糖基转移酶表达效果的启动子为Pshuttle-09，其核苷酸序列为：
GATCGTCACAATGCGCCATCAAACCGTTGACAAGCGTCCCCGTCAGATGGCCGGGAGCCGGATGAACCACCATTCCGCGCGGCTTGTTGACGACAAGAACGTCCTGATCTTATTATAATATAAGGCCCCCCCCTCATAAAAAGGAAAAGCATTGACCTGAAAACTTATCGGTAAAGTATGATATAATACAAAAAGACCGATTAGAGGGGAGAGAGGAAACATGCCTTCAGTTGAAAGTTTTGAACTTGACCATAATGCAGTAAAAGCGCCTTACGTCAGACACTGAGGAGTCCATAAAGTG(SEQIDNO:5)。
重组菌CBB3008-Pshuttle-09-fru3合成与分泌果糖基转移酶的水平是对照的3倍多。
实施例315L发酵罐中果糖基转移酶的高效分泌表达
进一步将重组菌CBB3008-Pshuttle-09-fru3在15L全自动发酵罐(B.Brown，瑞士)中进行发酵试验。
发酵培养基为：酵母膏3％，蛋白胨4％，葡萄糖20％，pH7；
工作发酵体积10L；发酵温度42±1℃；发酵过程中维持溶氧为20％以上；发酵12h后，通过流加50％葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为8g/L；发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为7；发酵时间为150h；
结果汇总于表4，重组菌CBB3008-Pshuttle-09-fru3合成与分泌果糖基转移酶的水平达到1500U/mL，较对照菌株的果糖基转移酶合成水平有大幅度提高，提高幅度为329％。
表415L发酵罐中重组菌合成果糖基转移酶的水平
实施例4：10吨～30吨发酵体系下发酵制备果糖基转移酶
按照实施例3中15L发酵罐的工艺，相应调整操作流程后CBB3008-Pshuttle-09-fru3菌株在10吨～30吨发酵体系下制备果糖基转移酶。发酵结束后，重组菌CBB3008-Pshuttle-09-fru3中果糖基转移酶的酶活为1650～1680U/mL。
实施例5：底物保护剂单筛选
将十五种溶剂DMSO，甲基叔丁基醚，异戊醇，正丁醇，叔丁醇，甲酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯，乙酸戊酯，环己烷，正庚烷，十二烷(具体见附图2)分别按20％(v/v)添加量添加到110％(w/v)蔗糖底物溶液中，将温度提高到60℃。在此条件下按每Kg蔗糖(干)加入酶6500U，加入果糖基转移酶进行转苷实验，选出高温下对酶稳定性提高的溶剂，其中乙酸丁酯，正庚烷和环己烷三种疏水剂保护作用下转化效率较对照组均提高1～2倍。
实施例6：保护剂组合
将乙酸丁酯，环己烷，正庚烷三种疏水溶剂按一定比例组合，配成组合保护剂。具体组合条件如表5；
表5酶保护溶剂的组合与比例
将以上组合溶剂按20％(v/v)添加量到110％(w/v)底物溶液中，之后加入果糖基转移酶在60℃高温下进行低聚果糖制备效果。底物保护溶解的筛选结果如表5所示，组合7是最佳的组合保护剂，也即，乙酸丁酯：环己烷：正庚烷＝1：1：1(体积比)。
实施例7：最大底物浓度的选择
由于高温条件下底物的溶解度提高，再通过组合保护剂的保护作用，使果糖基转移酶可以在高温条件下保留其活性。故将优选的组合溶剂按20％(v/v)添加到2％～110％(w/v)底物溶液中，按每Kg蔗糖(干)加入酶6500U，加入果糖基转移酶在60℃高温下进行转苷实验，控制反应液在pH6，搅拌速度在100r/min。在此温度条件范围内，110％(w/v)底物溶液的转苷效率达57.5％以上。
实施例8：最适温度的选择
进一步确定在最大底物浓度条件下，筛选最适反应温度。将优选的组合溶剂按20％(v/v)添加到110％(w/v)底物溶液中，按每Kg蔗糖(干)加入酶6500U，加入果糖基转移酶在55～100℃高温下进行转苷实验，控制反应液在pH6，搅拌速度在100r/min。结果显示65℃条件下，转苷效率最高达到60％以上，见图3。
实施例9：效果实验
1、提供一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，具体为：按每Kg蔗糖(干)加入果糖基转移酶3000U，将实施例3所产果糖基转移酶加入到2％(w/v)的蔗糖溶液中，再按疏水溶剂与蔗糖溶液体积比为2％加入疏水溶剂，疏水溶剂为乙酸丁酯：环己烷：正庚烷＝1：1：1(体积比)，控制反应液在pH3～8，温度在55℃，搅拌速度在50r/min的条件下反应4h，反应结束后低聚糖占总糖比例56.2％；
2、提供一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，具体为：按每Kg蔗糖(干)加入果糖基转移酶10000U，将实施例3所产果糖基转移酶加入到60％(w/v)的蔗糖溶液中，再按疏水溶剂与蔗糖溶液体积比为25％加入疏水溶剂，疏水溶剂为乙酸丁酯：环己烷：正庚烷＝1：1：1(体积比)，控制反应液在pH3～8，温度在80℃，搅拌速度在100r/min的条件下反应15h，反应结束后低聚糖占总糖比例57.8％；
3、提供一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，具体为：按每Kg蔗糖(干)加入果糖基转移酶12000U，将实施例3所产果糖基转移酶加入到110％(w/v)的蔗糖溶液中，再按疏水溶剂与蔗糖溶液体积比为50％加入疏水溶剂，疏水溶剂为乙酸丁酯：环己烷：正庚烷＝1：1：1(体积比)，控制反应液在pH3～8，温度在100℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应24h，反应结束后低聚糖占总糖比例60.2％；
4、提供一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，具体为：按每Kg蔗糖(干)加入果糖基转移酶12000U，将市售果糖基转移酶加入到110％(w/v)的蔗糖溶液中，再按疏水溶剂与蔗糖溶液体积比为50％加入疏水溶剂，疏水溶剂为乙酸丁酯：环己烷：正庚烷＝1：1：1(体积比)，控制反应液在pH3～8，温度在100℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应24h，反应结束后低聚糖占总糖比例50.2％；
实施例10：在30m3大宗制备低聚果糖
以果糖基转移酶催化生产低聚果糖所用条件是，按每Kg蔗糖(干)加入酶7000U，将实施例3所产果糖基转移酶加入到110％(w/v)的蔗糖溶液中，再按疏水溶剂：蔗糖液＝20:80(v/v)加入疏水溶剂，控制反应液在pH6，温度在65℃，搅拌速度在100r/min的条件下反应24h，所制备的低聚果糖的糖浆中，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的转化率可高达61.03％(图4和表6)，高于同类产品10％。
表6产品中各种糖在总糖中所占的比例
本实施例中蔗果三糖含量的测定方法采用HPLC法，具体实验方法按GB/T23528-2009执行。

Claims (8)

1.一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，其特征在于，具体为：按蔗糖干重每Kg加入果糖基转移酶3000～12000U，将果糖基转移酶加入到2-110％的蔗糖溶液中，再按疏水溶剂与蔗糖溶液体积比为2-50％加入疏水溶剂，控制反应液在pH3～8，温度在55～100℃，搅拌速度在50～200r/min的条件下反应4～24h。
2.如权利要求1所述的一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述疏水溶剂为DMSO，甲基叔丁基醚，异戊醇，正丁醇，叔丁醇，甲酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯，乙酸戊酯，环己烷，正庚烷，十二烷中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述疏水溶剂为由乙酸丁酯、环己烷、正庚烷组成。
4.如权利要求3所述的一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述疏水溶剂为由乙酸丁酯：环己烷：正庚烷按体积比1：1：1组成。
5.如权利要求1所述的一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述果糖基转移酶产自一株芽孢杆菌重组菌株，所述重组菌是通过将黑曲霉来源的果糖基转移酶编码基因fru3基因在芽孢杆菌宿主细胞中进行高效表达获得，所述重组菌还包含能使果糖基转移酶基因fru3基因在芽孢杆菌中高效表达的启动子Pshuttle-09。
6.如权利要求5所述的一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌宿主细胞为地衣芽孢杆菌CBB308。
7.如权利要求5所述的一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述fru3基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述启动子Pshuttle-09的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。
8.如权利要求5所述的一种高温高糖浓度下生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述重组菌发酵生产果糖基转移酶的方法如下：
发酵培养基质量体积比组成为：酵母膏2～4％，蛋白胨3.2～5.6％，葡萄糖10～30％，pH4～8；
发酵温度42±1℃；发酵过程中维持溶氧为20％以上；发酵12h后，通过流加50％葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为5～10g/L；发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为4～8；发酵时间为150～180h。
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