CN103710326A - 一种β-葡萄糖苷酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶及其应用，所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E，为首次从纤维素酶产生菌胞外粗酶液中分离得到。所述β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述β-葡萄糖苷酶的表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E在诱导纤维素酶或者半纤维素酶合成和提高产纤维素酶真菌胞外纤维素酶糖化水解效率方面都发挥了独特的作用。

Description

一种β-葡萄糖苷酶及其应用
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，特别涉及一种β-葡萄糖苷酶及其应用。
背景技术
生物质转化为葡萄糖往往需要至少三种不同的酶蛋白的协同作用，外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH)，作用于纤维素线状结构的末端，水解β-1，4糖苷键，依次从纤维素的末端切下纤维二糖。它可以作用于纤维素的结晶区和无定形区。(2)内切葡聚糖酶(EG)。这类酶作用于纤维素结构内部的无定形区，随机水解β-1，4糖苷键，将长链的纤维素截短，产生大量含有非还原性和还原性末端的小分子纤维素。内切葡聚糖酶的作用是为外切酶提供大量的反应末端。(3)β-葡萄糖苷酶(BG)。这类酶将纤维二糖或者短链葡聚糖水解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶参与纤维素水解的最后一步，常常被认为是纤维素降解过程的限速酶，也是利用纤维素酶进行高效生物质转化的主要瓶颈之一。β-葡萄糖苷酶的主要功能有两个，其一是其可以分解纤维二糖产生葡萄糖，减少了纤维二糖对外切酶和内切酶的产物抑制作用；其二是其可以将葡萄糖进行转糖基作用合成有诱导作用的二糖物质，如龙胆二糖，槐糖。这些有诱导作用的二糖物质可以促进纤维素酶和半纤维素酶的诱导合成。虽然最常见的β-葡萄糖苷酶(Cel3A)已经被深入研究很多年，但是其转糖基作用不明显。为了进一步提高纤维素水解效率，和解析纤维素酶作用机理，亟待发掘新型的β-葡萄糖苷酶。
里氏木霉测序后发现真菌胞外存在七种潜在的β-葡萄糖苷酶，分别为Cel1A，Cel1B，Cel3A，Cel3B，Cel3C，Cel3D和Cel3E。Cel3E是胞外唯一一个没有被深入研究的β-葡萄糖苷酶，至今从未在真菌胞外粗酶液中分离出来，其酶学性质和生物学功能不明晰清楚。
发明内容
本发明是从桧状青霉的胞外分离纯化得到了新型的β-葡萄糖苷酶，其在纤维素酶诱导，木质纤维素降解方面发挥了独特的作用。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种β-葡萄糖苷酶的表达基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，从桧状青霉胞外粗酶液中分离如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。
优选的是，从真菌胞外粗酶液中提取蛋白质，使用分子筛凝胶层析柱Sephadex S-200从蛋白质中分离出如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。
优选的是，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗所述分子筛凝胶层析柱。
一种如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在诱导纤维素酶产生菌合成纤维素酶和半纤维素酶中的应用。
优选的是，利用β-葡萄糖苷酶将葡萄糖转化为龙胆二糖和槐糖，以诱导纤维素酶合成，以及利用β-葡萄糖苷酶将木三糖水解为木二糖，以诱导纤维素酶或者半纤维素酶合成。
一种如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在提高纤维素酶产生菌胞外纤维素酶糖化水解效率中的应用。
优选的是，所述纤维素酶产生菌为里氏木霉或者桧状青霉。
本发明的有益效果是本发明是首次从真菌细胞的胞外粗酶液中分离出来，并且是从桧状青霉的胞外分离纯化得到的新型的β-葡萄糖苷酶，本发明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E与底物亲和能力极强，比如：以PNPG为底物，PpCel3E Km值为0.0019mM，为已报道的真菌胞外β-葡萄糖苷酶Km最低的。本发明所述β-葡萄糖苷酶在提高产纤维素酶真菌胞外纤维素酶糖化水解效率和在提高里氏木霉或者桧状青霉胞外纤维素酶糖化水解效率中起到很大的作用。本发明所述β-葡萄糖苷酶通过转糖基化作用将葡萄糖合成为龙胆二糖和槐糖以诱导纤维素酶合成，所述β-葡萄糖苷酶通过水解木三糖成为木二糖以诱导半纤维素酶合成。
附图说明
图1为本发明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E的同源树。
图2为本发明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E提高里氏木霉和桧状青霉的胞外纤维素酶糖化水解效率的比较图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明所述的β-葡萄糖苷酶为从桧状青霉的胞外粗酶液中发现并分离出来的，其序列与糖苷水解酶家族3相似，但是与常见的Cel3A不同，其分类属于Cel3E，由于其来自桧状青霉，所以命名为PpCel3E。新型的β-葡萄糖苷酶(PpCel3E)与其他真菌的Cel3E序列进行比对后发现，相似度大约为60％左右(如图1所示)。PpCel3E与黑曲霉的Cel3E同源性最高，为61％。
实施例1：分离纯化β-葡萄糖苷酶方法步骤为：
(1).制备桧状青霉的孢子悬液，将孢子悬液接种于装有发酵培养液的容器中，发酵培养液包含质量百分比为2％-8％的碳源，0.1％-5％的有机氮源，以及0.0001％-10％的无机盐，pH值调节在3.0-5.0之间。将容器置于摇床上震荡培养；
(2).发酵液利用高速离心，除去杂质，保留上清可溶性蛋白的部分。通过10kDa膜截留蛋白，超滤浓缩蛋白质；
(3).将浓缩后的蛋白置于分子筛凝胶层析柱Sephadex S-200，对样品进行收集；
(4)新型的β-葡萄糖苷酶鉴定由蛋白质质谱MALDI-TOF鉴定；
(5).以葡萄糖苷pNPG为底物，对纯化后的收集液测定β-葡萄糖苷酶酶活力，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE对纯化后蛋白纯度进行检测。
其中，
桧状青霉(Penicillium piceum)H16，保藏号：CGMCC No.8339，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china generalmicrobiological culture collection center)。
针对桧状青霉，最适的培养基条件如下：2.7％microcrystalline cellulose，3.3％corncob steep liquor，0.5％(NH4)28O4，0.6％KH2PO4，0.1％MgSO4，0.25％CaCO3，and0.2％Tween-80.发酵使用的玻璃容器一般选择300mL的三角瓶，培养50mL的培养液，于28度培养箱，水平震荡180rpm，5天。
蛋白分离纯化使用的仪器AKTA purifier(GE，Sweden)。使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗所述分子筛凝胶层析柱。
本发明所述蛋白分离纯化后，对分离得到的蛋白进行了酶活力测定与MALDI-TOF相结合的实验鉴定蛋白的种类。通过MALDI-TOF鉴定蛋白质后，得到所述β-葡萄糖苷酶的一段肽段序列“HYIGNEQETNR”，通过BLAST在NCBI数据库中进行检索，发现该肽段与黑曲霉CBS513.88的BGL M相似度高达92.977％，验证了所述β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶家族3。
实施例2：β-葡萄糖苷酶的性质的研究
1)应用本领域常规方法将β-葡萄糖苷酶对与羧甲基纤维素(CMC-Na)，水杨苷(Salicin)，PNPC，微晶纤维素(Avicel)，木聚糖(Xylan)、PNPG，和纤维二糖分别进行酶活力检测检测结果如下表1所示：PpCel3E对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，水杨苷(Salicin)，PNPC，微晶纤维素(Avicel)，木聚糖(Xylan)都没有酶活力。对PNPG，纤维二糖有较高的酶活力分别为31.0IU/mg，14.4IU/mg。PpCel3E对纤维寡糖具有水解能力，可以将纤维三糖分解为纤维二糖和葡萄糖，酶活力高达125IU/mg。
Figure BDA0000435509590000051
表1
2)对新型β-葡萄糖苷酶PpCel3E与底物亲和能力的检测：
以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(PNPG)为底物，PpCel3E Km值为0.0019mM，为已报道的真菌胞外β-葡萄糖苷酶Km最低，(如表2所示)说明PpCel3E与底物的结合力更强，有利于分解斜卧青霉胞外的Cel3A的Km值为0.0019mM，里氏木霉的Cel3A，CellA的Km分别为0.14mM，0.18mM。紫青霉(Penicillium purpurogenum)，青霉菌(Penicillium pinophilum)的Km值为5.1mM和5.5mM。
Figure BDA0000435509590000052
表2
3)β-葡萄糖苷酶的转糖基能力检测：以高浓度葡萄糖为底物，加入适量的实施例1中纯化后的β-葡萄糖苷酶，于30-50℃反应72h，利用糖分析色谱柱Agilent Zorbax Carbohydrate柱分析产物的种类和浓度。其中，选择的葡萄糖浓度为40-60g/L，在0℃反应72h。对转糖基后的产物进行检测时，利用Carbohydrate柱对纤维二糖，龙胆二糖，槐糖进行检测。HPLC检测时流速为1.0mL/min，乙腈为流动相。
4)对新型β-葡萄糖苷酶在木质纤维素降解方面的研究：以脱木素的玉米秸秆为底物，将β-葡萄糖苷酶按照一定比例，向不同纤维素酶中进行添加，置于水浴摇床上进行反应。其中，最优选择的底物为5％的脱木素的生物质材料，纤维素酶添加量最优为20FPU/g底物，β-葡萄糖苷酶的添加量为40μg/g底物。糖化反应在50℃水浴摇床中反应96h。产物利用HPLC87P糖分析柱进行检测。
实施例3：PpCel3E在诱导产纤维素酶菌合成纤维素酶或者半纤维素酶中的应用。
以40g/L的葡萄糖为底物，加入100μgPpCel3E，在50℃水浴摇床中反应72h。反应结束后，利用安捷伦Agilent ZORBAX Carbohydrate糖分析色谱柱分析产物的种类和浓度，检测条件为以乙腈为流动相，流速为1.0mL/min，检测温度为30℃。检测标品选择为：槐糖和龙胆二糖。
以木三糖为底物，加入100μgPpCel3E，在50℃水浴摇床中反应72h。利用Aminex HPX-87H糖分析色谱柱分析产物的种类和浓度，检测条件是以5mM硫酸为流动相，流速为0.6mL/min，检测温度为60℃。
Figure BDA0000435509590000071
表3
如上表3显示，PpCel3E具有较好的转糖基作用，可以利用葡萄糖合成β-1，2键连接的槐糖，合成β-1，6键连接的龙胆二糖。每克PpCel3E可以将葡萄糖转化1100g龙胆二糖，和142g槐糖。并且每克PpCel3E可以水解木三糖，生成42g木二糖。龙胆二糖，槐糖，木二糖都是纤维素酶，半纤维素酶合成的诱导物。
龙胆二糖和槐糖是通过纤维二糖透过酶从胞外转运进入细胞内部，对纤维素酶的调控因子进行影响，导致能促进纤维素酶转录的转录因子表达量上调，从而影响到纤维素酶合成量。同理，木二糖不仅可以诱导纤维素酶的合成，还可以诱导半纤维素酶的合成。
实施例4：PpCel3E在提高里氏木霉或者桧状青霉胞外纤维素酶糖化水解效率中的应用
以脱木素玉米秸秆为底物，底物浓度为5％，反应体积为5mL。里氏木霉，桧状青霉的粗酶液酶用量保持在20FPU/g底物，当PpCel3E以低浓度蛋白量(40μg/g底物)添加到里氏木霉，桧状青霉的胞外纤维素酶中，该糖化实验在50℃水浴摇床中反应96h。糖化过程中每隔一定时间取样一次，样品高速离心后，通过HPLC-87P柱分析葡萄糖浓度的变化。
如图2所示，里氏木霉，桧状青霉粗酶液在上述糖化条件下，糖化96h后葡萄糖浓度分别为10.3mg/mL和14.4mg/mL。当添加40μgPpCel3E/g底物到里氏木霉，桧状青霉的粗酶液中，糖化效率分别提高了20％和27％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
Figure IDA0000435509680000021
Figure IDA0000435509680000031

Claims (9)

1.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种β-葡萄糖苷酶的表达基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，从桧状青霉胞外粗酶液中分离如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，从真菌胞外粗酶液中提取蛋白质，使用分子筛凝胶层析柱Sephadex S-200从蛋白质中分离出如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗所述分子筛凝胶层析柱。
6.一种如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在诱导纤维素酶产生菌合成纤维素酶和半纤维素酶中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，利用β-葡萄糖苷酶将葡萄糖转化为龙胆二糖和槐糖，以诱导纤维素酶合成，以及利用β-葡萄糖苷酶将木三糖水解为木二糖，以诱导纤维素酶或者半纤维素酶合成。
8.一种如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在提高纤维素酶产生菌胞外纤维素酶糖化水解效率中的应用。
9.如权利要求8所述的纤维素酶产生菌的应用，其特征在于，所述纤维素酶产生菌为里氏木霉或者桧状青霉。
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