CN105483107A - 一种蔗糖异构酶突变体及其生产异麦芽酮糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及定点突变获得一种蔗糖异构酶从而提高其产物特异性，以及通过制备固定化蔗糖异构酶并利用非水相催化体系实现固定化酶的分离。本发明中所提供的蔗糖异构酶其催化产物中异麦芽酮糖的含量大幅度提高，从90.28％升至99.16％，酶的制备过程易于实施且产酶效率高；蔗糖异构酶固定化技术有助于蔗糖异构酶在反复催化过程中保持较高的催化活性和极低的酶量损失，可以进行多批次的连续使用，可以大大降低操作难度，节约经济成本。

Description

一种蔗糖异构酶突变体及其生产异麦芽酮糖的方法
技术领域：
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及定点突变获得一种蔗糖异构酶从而提高其产物特异性，以及通过制备固定化蔗糖异构酶并利用非水相催化体系实现固定化酶的分离。
背景技术：
异麦芽酮糖(Isomaltulose)，也称帕拉金糖(Palatinose)，是一种还原性双糖，是蔗糖的同分异构体，1957年，由Weidenhagen等人在甜菜制作中首先发现。异麦芽酮糖具有与蔗糖类似的甜味特性和口感，但其甜度低，仅为蔗糖的52％，与蔗糖相比，其突出的优点主要体现在：(1)低致龋齿特性；(2)适合糖尿病人食用；(3)在人肠道中，选择性刺激双歧杆菌的生长；(4)极低的吸湿性，稳定性强，货架期也更长。作为一种有前途的功能性甜味剂，异麦芽酮糖已在日本、美国、西欧等国家得到广泛应用，应用范围包括硬糖、软糖、口香糖、巧克力、焙烤食品、水果罐头、果酱、运动饮料和牙膏等。另外，异麦芽酮糖也是异麦芽酮糖醇(Isomalt)的原料。异麦芽酮糖醇是近年来国际上新兴的一种功能性糖醇，广泛应用于无糖食品、无糖保健品和无糖药品等产品的生产上。
异麦芽酮糖由蔗糖异构酶EC5.4.99.22(Sucroseisomerase)，或叫异麦芽酮糖合成酶(Isomaltulosesyntheses)，蔗糖葡萄糖基变位酶(Sucroseglucosylmutase)，α-葡萄糖基转移酶(α-glucosyltransferase)催化蔗糖转变而成。目前，用于异麦芽酮糖生产的蔗糖异构酶来源于各种微生物，如沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Psedumonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、农杆菌属(Agrobacterium)和精朊杆菌属等(Protaminobacter)。美国专利No.4390627、4670387、4857461、5229276和5336617分别描述了以上一种或几种微生物来源的蔗糖异构酶的固定化酶或固定化细胞生产异麦芽酮糖。虽然上述几种细菌产的蔗糖异构酶能够把蔗糖转变成异麦芽酮糖，但产量很不稳定，转化率也不高，为8％～85％。而且，除了主产物外，酶转化液中还存在部分海藻酮糖和少量的异麦芽糖、异松三糖、葡萄糖和果糖等副产物，产物特异性不高。近年来，中国也有一些相关专利，如中国专利CN101200750A，一种大黄欧文氏菌及其在制备异麦芽酮糖中的应用，该发明可使蔗糖转化率高达99.5％(w/w)，异麦芽酮糖转化率达90％。中国专利CN1434861A，克雷伯氏菌属的细菌分离物以及从其中分离的异麦芽酮糖合成酶基因，该发明涉及一种新菌种的两个菌株，即新加坡克雷伯氏菌(Klebsiellasingaporensis)LX3及LX21。还涉及编码一种新型异麦芽酮糖合酶KIS的核苷酸序列(kis)。还涉及在植物中产生异麦芽酮糖的方法，此方法包括在该植株细胞中引入一种编码将蔗糖转化成异麦芽酮糖的核酸序列，从而使得转化细胞表达所述的核酸序列。以上专利所公开的生产异麦芽酮糖技术工艺，采用游离的菌体或游离酶转化蔗糖溶液提高了效率，但由于回收困难致使成本增加，酶的使用寿命较短，不利于生产的连续化。
针对上述游离菌体或游离酶的缺陷，许多学者对固定化技术进行了大量的研究。目前采用海藻酸钠进行固定化的方法已经成功地应用于工业化生产异麦芽酮糖中，但海藻酸钠固定化方法在生产中实际操作中存在以下几个问题：1、固定化操作程序多，效率低；2、固定化菌体的强度不够大，易破碎引起菌体的脱落；3、固定化过程中产生大量废弃物，造成浪费和污染。而固定化酶具有储存稳定性高、易于分离回收、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点，不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且具有节省能源与资源、减少污染的生成。
但固定化酶在催化反应完成后，需要回收重复利用，目前工厂中普遍使用柱式、膜反应器等装置来实现固定化酶的回收，这一操作要求设备复杂，操作性高等缺点。而非水双相反应体系可自然形成双相，选择合适的溶剂，即不影响酶在生产低聚果糖的催化活性，又能将固定化酶分配到有机相，有利于酶的重复性使用及产品的纯化。
发明内容：
在本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、蔗糖异构酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示蔗糖异构酶突变体中突变的氨基酸。如Tyr307Asp表示位置307位的氨基酸由亲本蔗糖异构酶的Tyr替换成Asp，位置的编号对应于SEQIDNO：2中蔗糖异构酶的氨基酸序列编号。ΔGln310表示第310位氨基酸Gln缺失，位置的编号对应于SEQIDNO：2中蔗糖异构酶的氨基酸序列编号。
本发明的目的在于以土壤发散菌UQ68J(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2005,71(3):1581-1590)编码蔗糖异构酶的sim基因作为研究对象，利用定点突变提高蔗糖异构酶的产物特异性，获得一种蔗糖异构酶突变体及其高效、低成本制备方法，建立异麦芽酮糖的大宗制备工艺和固定化工艺，并形成高效制造高品质、高纯度异麦芽酮糖的技术。
本发明解决上述问题的技术方案之一：是提供一种通过基因工程手段获得的异麦芽酮糖产物特异性显著提高的蔗糖异构酶突变体，其氨基酸序列如核苷酸序列表SEQIDNo.11所示，其核苷酸序列如核苷酸序列表SEQIDNo.10所示。
本发明解决上述问题的技术方案之二：是提供一种生产技术方案一所述蔗糖异构酶突变体的基因工程菌，所述菌株的制备方法如下：
(1)以PantoeadispersaUQ68J的基因组DNA为模板，扩增sim基因(核苷酸序列为SEQIDNO:1，氨基酸序列为SEQIDNO:2)，克隆到质粒pMD18-Tsimple上，得到带有sim基因的重组质粒pMD18-T-sim；
(2)pMD18-T-sim为模板，通过定点突变的方法获得体外重组产物sim8基因，其核苷酸序列如核苷酸序列表SEQIDNo.10所示，其表达产物即为SEQIDNO：11所示的第310位氨基酸由Gln突变为Glu的氨基酸突变体；
(3)将sim8基因克隆到质粒pMD18-Tsimple上，得到带有sim8基因的重组质粒pMD18-T-sim8，将该重组质粒经XbaI和SmaI双酶切后，克隆入pHY-WZX表达载体的相应位点，获得重组表达质粒pHY-sim8；
(4)将上述质粒电转化入地衣芽胞杆菌CBB3008即得重组菌；
所述地衣芽孢杆菌CBB3008为200810235368.0所公布的菌株，保藏编号CCTCCNO：M208236，亦可参考DandanNiu,etal发表的文章(MicrobialCellFactories,2009,8:58)。
本发明解决上述问题的技术方案之三：是提供一种技术方案一所述蔗糖异构酶突变体的生产方法，具体如下：以含有SEQIDNo.10所示核苷酸序列的菌株作为生产菌进行发酵培养，发酵条件如下：
发酵培养基质量体积比组成为：酵母膏2～4％，蛋白胨3.2～5.6％，葡萄糖10～30％，pH7.0；发酵温度42±1℃；发酵过程中维持溶氧为20％以上；发酵12h后，通过流加50％葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为5～10g/L；发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为7.0；发酵时间为150～180h；
发酵结束后，发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液，添加辅助制剂后精滤制备蔗糖异构酶液体成品；或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型蔗糖异构酶成品；
本发明解决上述问题的技术方案之四：是提供一种技术方案一所述蔗糖异构酶突变体生产异麦芽酮糖的方法，具体如下：
按每Kg蔗糖(干重)加入制备好的蔗糖异构酶10000U～20000U，将蔗糖异构酶加入到20～50％(w/v)的蔗糖溶液中，控制反应液在pH4.0～7.0，温度在30～60℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应4～12h，反应完成后取100μL样品进行高效液相色谱分析，异麦芽酮糖合成率可达100％；
进一步的，所述蔗糖异构酶为游离酶；
进一步的，所述蔗糖异构酶为固定化酶，所述反应液中还加入用于固定化载体及固定化酶回收的萃取液；
所述萃取液为乙酸丁酯，甲酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，己酸乙酯，己酸己酯，环己烷，正己烷，正庚烷，正辛烷中的一种；
所述萃取液与蔗糖溶液的体积比为10:90；
所述固定化酶的制备方法，具体如下：其固定化形式可以是丙烯酰胺、羟基琥珀酰亚胺、亚甲基(双丙烯酰胺)三元聚合物载体，也可以是大孔环氧基载体、非大孔环氧基载体及环氧基磁性载体；海藻酸钠，卡拉胶，明胶等凝胶载体；壳聚糖，聚碳酸乙烯撑脂(PVCA)载体，甲基丙烯酸类载体，二乙烯基苯交联下,丙烯酸胺(AM)、丙烯腈(AN)，AOT(二(2—乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠)/正庚烷/水/明胶组成的反相微乳凝胶，磁性高分子微球类载体，无机硅藻土或多孔玻璃比有机载体；
固定化步骤如下：
(1)固定化载体预处理：载体1～15g，加入2～60mL浓度为1M，pH为pH4.0～9.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液，20℃～45℃震荡摇晃1h，抽滤，再重复以上操作2～4遍；
(2)配制蔗糖异构酶液：将方案一所述蔗糖异构酶0.1～3g溶解于pH5.0～7.0的浓度为2M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，并使终体积为10mL，收集含蔗糖异构酶的溶解液；
(3)蔗糖异构酶的固定化：将步骤(2)配制的蔗糖异构酶溶解液中加入步骤(1)预处理好的固定化载体1g，于15℃～80℃，200r/min摇床反应24h，收集反应液，进行抽滤，弃滤液，收集滤渣，用pH3.8～7.9的0.2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤滤渣2～5次，收集洗涤渣，对于收集的洗涤渣，干燥后保存于4℃～15℃冰箱，即制备出固定化蔗糖异构酶；
进一步的，所述载体为环氧树脂载体—聚酰胺树脂ES-4；
进一步地，固定化所用载体的预处理条件为pH为7.5～8.5，温度20℃～30℃；
更进一步地，本发明中的蔗糖异构酶固定化酶可以连续进行多批次的反复催化制备异麦芽酮糖。
有益效果：
1.本发明中所使用的关键酶其催化产物中异麦芽酮糖的含量大幅度提高，从90.28％升至99.16％，酶的制备过程易于实施且产酶效率高；
2.采用本发明所述方法生产异麦芽酮糖，所制备的异麦芽酮糖纯度可以达到99％以上；
3.本发明的蔗糖异构酶固定化技术有助于蔗糖异构酶在反复催化过程中保持较高的催化活性和极低的酶量损失，可以进行多批次的连续使用，连续使用50批次后酶活损失小于20％；
4.本发明的异麦芽酮糖制备工艺充分结合了蔗糖异构酶的酶学特性和催化特性，可以高效高纯度完成糖浆的制备过程，无需后期糖液的分离纯化，其酶解工艺是一种新工艺，采用该工艺制备异麦芽酮糖可以大大降低操作难度，节约经济成本。
附图说明
图1.重组表达质粒pHY-sim的物理图谱
图2.异麦芽酮糖的制备工艺流程图
图3.异麦芽酮糖产品的成分图谱
其中，a-为蔗糖和异麦芽酮糖标品，b-为异麦芽酮糖产品.
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明；下述实施例并不限定本发明，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：蔗糖异构酶基因在地衣芽胞杆菌中的克隆和表达
1、重组菌株的构建
以土壤发散菌(Pantoeadispersa)UQ68J的基因组DNA为模板，根据NCBI数据库中P.dispersaUQ68J的蔗糖异构酶基因sim(GenBank登录号：AY223549.1)的序列设计引物，用PrimeSTARHSDNA聚合酶以及引物F1(SEQIDNO:14)和R1(SEQIDNO:15)扩增不包含信号肽的sim基因(核苷酸序列SEQIDNO:1)，氨基酸序列见SEQIDNO:2。PCR扩增体系及反应条件参考HSDNAPolymerase说明书(TaKaRa)。将PCR产物克隆到质粒pMD18-Tsimple上，得到带有sim基因的重组质粒pMD18-T-sim。将该重组质粒经XbaI和SmaI双酶切后，克隆入pHY-WZX表达载体(DandanNiuandZhengxiangWang.JIndMicrobiolBiotechnol,2007,34:357-362)的相应位点，获得重组表达质粒pHY-sim，如附图1所示。
2、重组菌株的筛选
将上述质粒电转化入地衣芽孢杆菌CBB3008(CCTCCNO.M208236，中国发明专利ZL200810235368.0，DandanNiu,etal.MicrobialCellFactories,2009,8:58)中，在选择性平板上筛选转化子，并命名为地衣芽孢杆菌CBBD302(pHY-sim)。
将上述重组菌在含有50mL培养基的250mL三角瓶中进行发酵。发酵在发酵培养基(酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1～4％，葡萄糖10～20％，pH7.0)中，于42℃、220rpm下进行，发酵时间为120h。采用HPLC对蔗糖异构酶的酶活进行测定，具体条件如下：
检测器：ELSD(蒸发光检测器)
流动相A：75％乙腈
流动相B：25％水
柱温：30℃
进样量：10μL
液相流速：1mL/min
漂移管温度：90℃
氮气流量：2.2L/min
色谱柱：PrevailCarbohydrateES5u(250mm×4.6mm)
蔗糖异构酶SI酶活定义：1个酶活力单位是指在最适条件(30℃，pH6.0)下，1min内生成1μmol异麦芽酮糖的酶量。
实施例2：蔗糖异构酶突变体的构建与筛选
以Tyr307Asp为例，以质粒pMD18-T-sim为模板，利用引物F1(SEQIDNO:15)和R2(SEQIDNO:18)按常规PCR法扩增，得到PCR产物1。再利用引物F2(SEQIDNO:17)和R1(SEQIDNO:16)按常规PCR法扩增，得到PCR产物2。
上述两个反应同步进行,将两种扩增产物PCR产物1和PCR产物2进行纯化回收，以等摩尔混合并加入到第二步反应体系中，该反应体系中不加引物，其它同常规PCR反应体系，进行5～10次循环。
以第二步反应体系扩增产物为模板，加入引物F1和R1，其他同常规PCR反应体系，进行25～30次循环。扩增产物即为体外重组产物sim1。
对其他位点氨基酸的定点突变步骤同上，所用引物为SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:19～SEQIDNO:38，扩增产物即为体外重组产物sim2，sim3，sim4，sim5，sim6，sim7，sim8，sim9，sim10，sim11，突变位点及引物、产物对照表见表1，表2。
表1蔗糖异构酶突变体构建与产物序列对照表
表2引物序列表
将表1中的11个体外重组产物按照实施例1的方法克隆入质粒pHY-WZX的XbaI和SmaI位点，获得重组质粒pHY-sim1～pHY-sim11。再按照实施例1的方法将这11个重组质粒电转化入地衣芽胞杆菌CBB3008中，并对重组菌进行筛选。所获得的菌株分别命名为Tyr307Asp菌株，Tyr307Glu菌株，Tyr307Trp菌株，Tyr307Phe菌株，Tyr307Lys菌株，Tyr307His菌株，Pro308Ser菌株，Gln310Glu菌株，Gln310Asp菌株，Gln310Asn菌株和ΔGln310菌株。
实施例3：蔗糖异构酶突变体的酶活和催化产物分析
按照实施例1的方法进行酶活测定，具体结果如表3。由此表可知，突变并没有造成酶活力的明显下降，11个突变体均保持了较好的生物活性。
以10mL，50％浓度蔗糖为底物，30℃条件下添加蔗糖异构酶突变体的发酵液，反应时间延长至100min，使蔗糖转化完全，便于分析产物比例，得到的反应液稀释10倍，HPLC法检测。以实施例1所得重组菌CBBD302(pHY-sim)为对照，结果如表3所示。第310位Gln突变为Glu的突变体，带负电荷的酸性氨基酸突变为不带电荷的极性氨基酸，导致转化产物中异麦芽酮糖/海藻酮糖的比例变化最大，从野生型的异麦芽酮糖占90.28％升至99.16％，海藻酮糖比例从3.09％下降至0.79％，同时水解作用也有些微的降低。第310位Gln缺失的突变体则呈现出了相反的变化，从野生型中异麦芽酮糖比例90.28％下降至81.00％，海藻酮糖比例从3.09％升至10.96％，同时水解作用也有些微的升高，其它突变株的突变效果不明显。
综上，第310位Gln突变为Glu的突变体不仅保持了较好的生物活性，而且转化蔗糖生成的产物中异麦芽酮糖含量最高，是最优的突变体。
表3蔗糖异构酶突变体的酶活以及转化产物中糖组分的分析
实施例4：Gln310Glu菌株15L发酵工艺和酶的制备工艺的建立
将突变菌株Gln310Glu菌株在含有50mL培养基的250mL三角瓶中进行发酵。发酵在摇瓶发酵培养基(酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖15％，pH7.0)中，于42℃、220rpm下进行，发酵时间为120h。
进一步将重组菌在15L全自动发酵罐(B.Brawn，瑞士)中进行发酵试验，发酵培养基为酵母膏2％，蛋白胨3.2％，葡萄糖10％，pH7.0；工作发酵体积10L；发酵温度42±1℃；发酵过程中维持溶氧为20％以上；发酵12h后，通过流加50％葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为5～10g/L；发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为7.0；发酵时间为150h。多批次重复，发酵液中蔗糖异构酶的酶活为270～290U/mL。
实施例5：30m3体系下蔗糖异构酶的制备
将实施例4的工艺调整为30m3发酵体系对应的比例，同步换算补料速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种等操作，发酵培养基为酵母膏4％，蛋白胨5.6％，葡萄糖30％，pH7.0；发酵温度42±1℃；发酵过程中维持溶氧为20％以上；发酵12h后，通过流加50％葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为5～10g/L；发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为7.0；发酵时间为180h。发酵结束后，发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备蔗糖异构酶液体成品。重复5个批次的发酵生产验证，蔗糖异构酶发酵结束的酶活为300～325U/mL。
实施例6：蔗糖异构酶突变体的固定化
(1)树脂预处理
固定化选用树脂型号为ES-4。称取树脂样品5g，加入30mLK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液(1M，pH＝7.8)，30℃震荡摇晃1h，抽滤，再重复以上操作2遍，即树脂预处理好；
(2)配制蔗糖异构酶液
第(1)步完成后，将蔗糖异构酶0.3g溶解于pH6.0的2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，并使终体积为10mL，收集含蔗糖异构酶的溶解液。
(3)蔗糖异构酶的固定化
第(2)步完成后，加入第(1)步预处理好的环氧树脂(湿重)1g，于25℃，200r/min摇床反应24h，用于蔗糖异构酶的固定化，收集反应液。
(4)制备固定化蔗糖异构酶
第(3)步完成后，将第(3)步收集的反应液，进行抽滤，弃滤液，收集滤渣，对于收集的滤渣，用pH6.0的0.2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤3次，分别收集洗涤液和洗涤渣，对于收集的洗涤渣，干燥保存于4～15℃冰箱，即制备出固定化蔗糖异构酶，酶活力回收率平均高达78.8～82.6％。
实施例7：蔗糖异构酶突变体催化蔗糖制备异麦芽酮糖浆
未固定化的蔗糖异构酶用于异麦芽酮糖浆的制备。制备体系如下按每Kg蔗糖干重加入制备好的固定化蔗糖异构酶10000U，将固定化酶加入到20％(w/v)的蔗糖溶液中，控制反应液在pH4.0，温度在30℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应4h。反应完成后取100μL样品进行高效液相色谱分析，异麦芽酮糖合成率可达100％。
固定化后的蔗糖异构酶用于异麦芽酮糖浆的制备。制备体系如下按每Kg蔗糖干重加入制备好的固定酶20000U，将固定化酶加入到50％(w/v)的蔗糖溶液中，再按乙酸丁酯：蔗糖液＝10:90(v/v)加入乙酸丁酯，控制反应液在pH7.0，温度在60℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应12h。反应完成后取100μL样品进行高效液相色谱分析，异麦芽酮糖合成率可达100％。
实施例8：蔗糖异构酶固定化酶的重复利用和异麦芽酮糖浆的连续制备
按每Kg蔗糖干重加入制备好的固定酶15000U，将固定化酶加入到50％(w/v)的蔗糖溶液中，再按乙酸丁酯：蔗糖液＝10:90(v/v)加入乙酸丁酯，控制反应液在pH6.0，温度在45℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应8h。反应完成后取100μL样品进行高效液相色谱分析，异麦芽酮糖合成率可达100％。反应完成后，固定化蔗糖异构酶会自动分配到乙酸丁酯溶剂相(上相)，直接从容器底部排出产物异麦芽酮糖液(下相)。然后继续补加底物料液，直到酶活下降20％以上停止，可实现重复批次50批以上。

Claims (13)

1.一种蔗糖异构酶突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列如SEQIDNo.11所示。
2.权利要求1所述蔗糖异构酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如核苷酸序列表SEQIDNo.10所示。
4.一种包含权利要求3所述的基因的克隆载体、表达载体或宿主细胞。
5.权利要求4所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体为pMD18-Tsimple、所述的表达载体为pHY-WZX、所述的宿主细胞为地衣芽孢杆菌CBB3008。
6.权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求2所述的基因酶切、连接到pHY-WZX载体，得到重组质粒；
(2)所述的重组质粒转化至地衣芽孢杆菌CBB3008，得到重组菌株；
(3)表达所述的重组菌株，纯化获得如SEQIDNO：11所示的蔗糖异构酶突变体。
7.权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，用于高特异性的催化蔗糖生成异麦芽酮糖。
8.如权利要求7所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述催化蔗糖生成异麦芽酮糖的方法具体如下：
按每Kg蔗糖干重加入制备好的蔗糖异构酶10000U～20000U，将蔗糖异构酶加入到质量体积比为20～50％的蔗糖溶液中，控制反应液在pH4.0～7.0，温度在30～60℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应4～12h，反应完成后，异麦芽酮糖合成率可达100％。
9.如权利要求8所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述蔗糖异构酶为游离酶。
10.如权利要求8所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述蔗糖异构酶为固定化酶；所述反应液中还加入用于固定化载体及固定化酶回收的萃取液。
11.如权利要求10所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述萃取液为乙酸丁酯，甲酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，己酸乙酯，己酸己酯，环己烷，正己烷，正庚烷，正辛烷中的一种。
12.如权利要求10所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述萃取液与蔗糖溶液的体积比为10:90。
13.如权利要求10所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述固定化酶的制备方法如下：
(1)固定化载体预处理：载体1～15g，加入2～60mL浓度为1M，pH为pH4.0～9.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液，20℃～45℃震荡摇晃1h，抽滤，再重复以上操作2～4遍；
(2)配制蔗糖异构酶液：将权利要求1所述蔗糖异构酶0.1～3g溶解于pH5.0～7.0的浓度为2M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，并使终体积为10mL，收集含蔗糖异构酶的溶解液；
(3)蔗糖异构酶的固定化：将步骤(2)配制的蔗糖异构酶溶解液中加入步骤(1)预处理好的固定化载体1g，于15℃～80℃，200r/min摇床反应24h，收集反应液，进行抽滤，弃滤液，收集滤渣，用pH3.8～7.9的0.2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤滤渣2～5次，收集洗涤渣，对于收集的洗涤渣，干燥后保存于4℃～15℃冰箱，即制备出固定化蔗糖异构酶。
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