CN104762286A - 一种热稳定性和催化效率提高的蔗糖异构酶突变体 - Google Patents

一种热稳定性和催化效率提高的蔗糖异构酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性和催化效率提高的蔗糖异构酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过对蔗糖异构酶晶体结构中B因子较高的氨基酸进行定点突变，即将蔗糖异构酶175位置处的E突变成N，同时进一步在突变体K576D的基础上将175位置处的E也突变成N，得到了两种热稳定性及催化效率均得到提高的蔗糖异构酶突变体。本发明突变体E175N和E175N/K576D在45℃的半衰期比天然蔗糖异构酶分别提高了130％、665％，催化效率Kcat/Km分别提高了38％和19％，催化蔗糖生产异麦芽酮糖时，突变体的异麦芽酮糖最大转化率分别比天然酶提高了1.8％和1.6％。本发明得到的两种突变体比天然蔗糖异构酶更适用于在工业上的应用。

Description

一种热稳定性和催化效率提高的蔗糖异构酶突变体
技术领域
本发明涉及一种热稳定性和催化效率提高的蔗糖异构酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
蔗糖异构酶(EC 5.4.99.11)，又称异麦芽酮糖合酶，蔗糖变位酶，是一种工业应用价值极高的异构酶，属于α-淀粉酶13家族，可以高效催化异构蔗糖生成异麦芽酮糖和海藻酮糖，异麦芽酮糖后续加氢可以生成异麦芽酮糖醇，异麦芽酮糖与异麦芽酮糖醇在医药上具有极高的价值，两者口感与蔗糖相似，特别是两者不容易引起人体血糖的升高，非常适合糖尿病患者的服用。利用蔗糖异构酶酶法转化蔗糖，与化学法合成异麦芽酮糖相比，具有转化率高，反应时间短，生产成本低。因此，在工业生产中可以达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。来源于Serratia plymuthica AS9蔗糖异构酶由600个氨基酸组成，包含了三个结构域。在酶转化底物生产产物时，温度越高，可以抑制转化过程中微生物的生长，防止酶在转化过程中被这些微生物降解。目前报道的大部分微生物来源的蔗糖异构酶热稳定性均很差，本发明中野生蔗糖异构酶在50℃下半衰期仅为8min左右，45℃下半衰期为40min。热稳定性差不利于蔗糖异构酶在工业上进行连续的酶转化以及酶的储藏运输，因此，通过蛋白质分子改造提高蔗糖异构酶的稳定性显得尤为重要。
在蛋白质分子改造中，目前常用的方法有理性设计、非理性设计和半理性设计。三种方法的主要区别在于是否充分了解酶蛋白分子结构以及是否需要使用生物信息学软件进行计算和预测。其中理性设计具有实验成本低、简单方便和时间短等优点。B因子(原子取代因素)指的是由热运动和位置混乱引起的原子在其平衡位置周围电子密度的模糊度。B因子越大，代表结构中一个氨基酸的活动范围越大，反之亦然。因此，氨基酸的B因子和其柔性具有一定的关系，B因子高的氨基酸更容易发生形状的改变和位置的移动，具有更好的柔性。反之，B因子低的氨基酸具有更好的刚性，不易发生变形和位移。在受热条件下，B因子高的氨基酸更容易受到影响而发生结构破坏，而导致酶活受到影响；而刚性好的B因子低的氨基酸则能更好地保持其构象的稳定，而维持酶活力。因此将蔗糖异构酶中B因子最高的氨基酸进行突变，降低其B因子，有可能提高酶的热稳定性。Rosetta Design软件可以对突变位点进行稳定性突变的预测，通过计算，将柔性较高的氨基酸(B因子值较大)替换成刚性增强的氨基酸。Rosetta Design通过计算得到的氨基酸，它们的疏水原子被隐藏，它们的极性原子具有形 成氢键的潜能，同时Rosetta Design预测得到的蛋白质骨架具有更低的能量。
发明人前期对来源于普城沙雷氏杆菌(S.plymuthica)的蔗糖异构酶进行了异源表达和定点突变改造，获得了两个热稳定性和分泌性能得到提高的蔗糖异构酶突变体(一种热稳定性和分泌效率提高的蔗糖异构酶突变体及其制备方法.2014102014687)。得到的突变体K576D和K576P热稳定性和分泌效率都得到了一定的提高(K576D和K576P在45℃下半衰期分别是野生酶的1.8和1.4倍；摇瓶发酵时两个突变体的胞外分泌效率分别是天然酶的4.6和4.7倍)，但是催化效率出现了不同程度的降低。为了进一步提高酶的应用性能，本发明将B因子分析和Rosetta Design软件计算相结合，选择新的突变位点进行分子改造，以进一步提高蔗糖异构酶的热稳定性和催化效率。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题是提供一种蔗糖异构酶突变体，突变体与亲本蔗糖异构酶相比有更好的热稳定性和催化效率。所述亲本基因与普城沙雷氏杆菌(Serratia plymuthica AS9)蔗糖异构酶基因(NCBI编号：NC_015567)一致，所述作为突变用的质粒模板为携带天然蔗糖异构酶编码基因的载体palI/pET24a(+)(中国专利，申请号：2014102014687)。
本发明的第一个目的是提供一种蔗糖异构酶突变体，所述突变体在氨基酸序列如SEQ ID NO.1的基础上，将第175位置的谷氨酸突变成天冬酰胺，命名为E175N。
编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中是SEQ ID NO.2所示的序列。
所述突变体，在本发明的一种实施方式中，还包括同时将第576位的赖氨酸突变为谷氨酸，所得突变体命名为E175N/K576D。
本发明的第二个目的是一种制备所述突变体的方法，包括如下步骤：
1)对蔗糖异构酶晶体结构进行分析，确定B因子较高的氨基酸，并结合Rosetta Design软件分析确定突变成何种氨基酸可以降低B因子；
2)设计定点突变所用引物，以携带蔗糖异构酶编码基因的载体为模板进行突变并构建两种突变体的质粒载体；
3)将突变质粒转化进宿主细胞；
4)挑选阳性克隆进行发酵培养，纯化获得蔗糖异构酶突变体。
本发明的第三个目的是提供一种含有所述突变体的氨基酸序列的重组质粒载体。
所述质粒载体，在本发明的一种实施方式中，是pET系列、pGEX系列、pPICZ系列、或pAN系列、或pUB中的任意一种。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述突变体的细胞。
所述细胞，在本发明的一种实施方式中，是细菌、酵母或者真菌。
本发明还要求保护所述突变体在生产异麦芽酮糖或海藻酮糖或异麦芽酮糖醇方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明构建了两个热稳定性和催化效率均得到了提高的蔗糖异构酶突变体E175N和E175N/K576D。
(1)热稳定性：在pH 6.0，45℃的水浴中，突变体E175N和E175N/K576D的半衰期为90.2min和300min左右，相比天然蔗糖异构酶半衰期的39.2min，分别提高了130％、665％。
(2)催化效率：酶动力学分析显示，E175N和E175N/K57D的Km值分别比天然酶下降了6.6％和11％；催化效率Kcat/Km分别提高了38％和19％。催化蔗糖生产异麦芽酮糖时，突变体的异麦芽酮糖最大转化率分别比天然酶提高了1.8％和1.6％。
因此，蔗糖异构酶突变体比亲本更适合蔗糖异构酶的运输保藏和在催化蔗糖生成异麦芽酮糖过程中的应用。
附图说明
图1：天然蔗糖异构酶三维模拟结构；
图2：天然酶与突变体在45℃、pH 6.0保温20min后的残留酶活比较；
图3：天然蔗糖异构酶及三种突变体纯酶SDS-PAGE凝胶电泳；其中，M代表蛋白分子量标准，泳道1为天然蔗糖异构酶，泳道2为突变体E175N；泳道3为突变体K576D；泳道4为突变体E175N/K576D；
图4：天然蔗糖异构酶及其突变体的酶学性质比较，其中(a)为最适温度，(b)为45℃下的热稳定性；
图5：天然蔗糖异构酶及其突变体30℃下制备异麦芽酮糖的转化率。
具体实施方式
实施例1：蔗糖异构酶定点突变体的制备
(1)蔗糖异构酶定点突变体的构建
来源于S.plymuthica的蔗糖异构酶2种定点突变体E175N和E175N/K576D：
本发明中，以相似度最高的Protaminobacter rubrum CBS 574.77蔗糖异构酶(SmuA)晶体结构(PDB ID:3GBD)为模板，通过EMBI-EBL在线服务器构建了S.plymuthica AS9蔗糖异构酶(PalI AS9)的三维模拟结构(图1)。通过氨基酸一级序列比对发现，SmuA和PalI AS9两 者之间只有一个氨基酸不同，相似度达到99.86％，因此可以认为PalI AS9有着SmuA近乎相同的三维结构和B因子参数。基于上述分析，选择PalI AS9中6个具有较高的B因子的氨基酸残基(表1)，之后利用Rosetta Design软件将它们替换成刚性增强的理想目标氨基酸。根据软件分析预测的结果，利用PCR介导的定点突变方法分别构建除之前已成功构建的K576D的剩下5种突变体N577K、S575D、K174D、E175N和G176D。
5种定点突变体的制备方法，根据S.plymuthica蔗糖异构酶的序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，分别设计并合成引入定点突变的引物，对蔗糖异构酶N577、S575、K174、E175和G176位置进行定点突变，测定DNA编码序列，分别测序确认蔗糖异构酶突变体的编码基因是否正确；将突变体基因连接到适当的表达载体中并导入大肠杆菌中进行表达，得到5种蔗糖异构酶定点突变体。
定点突变体编码基因的PCR扩增：利用PCR技术，以表达载体palI/pET-24a(+)为模板。
引入N577K定点突变的突变引物为(分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)：
N577K-F：5’-CAGCAATAGCAAAAAAGTGGTGAAAAAGAAT-3’
N577K-R：5’-ATTCTTTTTCACCACTTTTTTGCTATTGCTG-3’
引入S575D定点突变的突变引物为(分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)：
S575D-F：5’-ATTATTGACAGCAATGATAAAAACGTGGTGAAA-3’
S575D-R：5’-TTTCACCACGTTTTTATCATTGCTGTCAATAAT-3’
引入K174D定点突变的突变引物为(分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)：
K174D-F：5’-TTTTGGAAGGACGCAGATGAGGGCCAAGCGCCG-3’
K174D-R：5’-CGGCGCTTGGCCCTCATCTGCGTCCTTCCAAAA-3’
引入E175N定点突变的突变引物为(分别为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10)：
E175N-F：5’-TGGAAGGACGCAAAAAATGGCCAAGCGCCGAAT-3’
E175N-R：5’-ATTCGGCGCTTGGCCATTTTTTGCGTCCTTCCA-3’
引入G176D定点突变的突变引物为(分别为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12)：
G176D-F：5’-AAGGACGCAAAAGAGGATCAAGCGCCGAATAAC-3’
G176D-R：5’-GTTATTCGGCGCTTGATCCTCTTTTGCGTC-3’
PCR扩增程序设定为：首先，94℃预变性5min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸7min10s；最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
PCR产物纯化后，加入DPn I，37℃，水浴2h，降解模板，之后转化E.coli JM109，挑 取阳性克隆，LB液体培养基培养8-10h，保甘油管，送去测序。测序正确的突变体，从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到能够表达突变体N577K、S575D、K174D、E175N和G176D的五种重组菌株。
将它们和天然的蔗糖异构酶分别置于45℃、pH 6.0下保温20min后，计算残留的酶活力。如图2所示，野生的蔗糖异构酶酶活残留率为66.2％，而E175N、K174D、G176D、S575D和N577K五种突变体的酶活残留率则分别为79.0％、36.2％、43.3％、66.6％和63.8％。这个结果证明了，与野生的蔗糖异构酶相比，突变体E175N的热稳定性得到增强。
此外，发明人在单突变基础上进一步成功的构建了双突变体E175N/K576D。
引入E175N/K576D定点突变的突变引物为(分别为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14)(以突变体K576D的表达载体palI/pET-24a(+))：
E175N-F：5’-TGGAAGGACGCAAAAAATGGCCAAGCGCCGAAT-3’
E175N-R：5’-ATTCGGCGCTTGGCCATTTTTTGCGTCCTTCCA-3’
PCR扩增程序和转化大肠杆菌进行表达等操作如上所述。同样将双突变体置于45℃、pH 6.0下保温20min后，E175N/K576D的酶活残留率达到了97.3％(图2)，双突变体的热稳定性比天然酶有了更大的提高。
两种突变体分别命名为E175N和E175N/K576D。
(2)天然蔗糖异构酶和两种定点突变体的表达与纯化：
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性单克隆于LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)；大肠杆菌在37℃摇床培养2h，至OD600＝1.2左右，两种突变体E175N和E175N/K576D均加入0.05mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵24h后，将发酵液于4℃、8000g离心15min除菌体，收集离心发酵上清液。在磁力搅拌子低速搅拌下，向突变体发酵上清液中缓慢加入60％(NH4)2SO4，4℃放置盐析过夜。4℃、10000g离心20min，收集沉淀。用50mmol/L pH 5.3柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液复溶沉淀后，在50mmol/L pH 5.3柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中透析过夜，期间更换2-3次透析缓冲液，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品。采用AKTA avant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化，整个纯化过程温度控制为4℃。阳离子交换色谱纯化步骤：(1)平衡：用5倍体积的50mmol/L pH 5.3柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡强阳离子交换色谱柱；(2)上样：预先处理好的样品以1mL/min的流速上样；(3)洗脱：包括洗脱未吸附物质、杂蛋白和目的蛋白，流速1.0mL/min，洗脱液为含有1M NaCl的50mmol/L pH 5.3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，进行线性洗脱，检测波长为280nm，分批 收集含蔗糖异构酶酶活的洗脱液；洗脱过程只出现一个目的蛋白洗脱峰，后续测酶活及SDS-PAGE蛋白电泳发现，无论是野生型，还是突变体，峰顶收集的酶液为最纯的部分。如图3所示。
表1具有较高B因子的氨基酸残基
实施例2：酶活分析方法
1)酶活测定方法 
蔗糖异构酶酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)。蔗糖异构酶在一定条件下，催化蔗糖生成异麦芽酮糖，以及少量的海藻酮糖、葡萄糖和果糖。异麦芽酮糖为还原糖，蔗糖为非还原糖，3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比，故可以在540nm的波长下进行比色，计算酶活。酶活单位定义：在上述条件下，反应初始阶段每分钟释放1μmol异麦芽酮糖的酶量作为一个活力单位。
酶活力测定步骤：
A.预热：取1.8ml的10％蔗糖溶液(50mM pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)于试管中，置于30℃水浴锅预热。
B.反应：加入0.2ml适当稀释的样品酶液，振荡混匀，准确计时15min，加入3ml DNS混匀，放入冰水中终止反应，沸水浴7min，冷却。
C.测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15ml的，混匀。在540nm下测量其吸光值并计算酶活力。
实施例3：蔗糖异构酶突变体的最适温度和热稳定性
以pH 6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠(50mM)为缓冲液，在20到50℃温度范围测定天然蔗糖异构酶及突变体的最适温度。如图4(a)，E175N和E175N/K576D的最适温度均是35℃，比天然酶的最适温度提高5℃；E175N和E175N/K576D在40℃分别保留80.5％和86.8％的 活性，都比天然酶在40℃保留的活性要高一些。
将纯化的天然蔗糖异构酶和突变体用50mM pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释至蛋白含量为0.25mg/mL，且pH为6.0，置于45℃恒温水浴中，每隔20min取样一次，测其残留酶活，比较其稳定性，如图4(b)所示。E175N和E175N/K576D半衰期分别为90.2min和300min，分别是天然酶半衰期的2.30和7.65倍。可见，两种蔗糖异构酶定点突变体的稳定性得到了不同程度的提高，特别是双突变体得到了很大程度的提高。
实施例4：蔗糖异构酶突变体的动力学参数测定
本研究测定了天然酶及突变体E175N、K576D、E175N/K576D在30℃下的动力学参数。动力学研究的结果如表2所示。
结果显示，与天然酶(WT)相比，所有突变体的Km值都有所下降，E175N、K576D和E175N/K576D分别下降了6.6％、2.0％和11.0％，Km值的降低表明了突变体对底物的亲合力得到了增强。此外，E175N、K576D和E175N/K576D的催化常数Kcat都得到了提高，分别是天然酶的1.3、1.0和1.1倍。与天然酶相比，催化常数Kcat和底物亲合力的提高，直接导致了突变体E175N、K576D和E175N/K576D的催化效率Kcat/Km提高了38.2％、4.2％和19.4％。
如图1所示，Lys576和Glu175远离蔗糖异构酶的催化中心和异构区域，突变可能会导致除催化中心和异构区域的其他部分区域的结构变得紧凑，使得底物不容易从催化中心脱离，从而可能会对酶的动力学参数产生积极的影响。
表2蔗糖异构酶突变体的动力学参数
实施例5突变体在异麦芽酮糖生产中的应用
本研究对蔗糖异构酶突变体催化蔗糖制备异麦芽酮糖的条件进行了优化。结果显示，蔗糖异构酶突变体最佳转化条件：pH 6.0、30℃、加酶量20U/g、底物浓度400g/L和转化时间8h，与天然酶制备异麦芽酮糖的最优条件相同。在最优转化条件下，天然酶、E175N、K576D和E175N/K576D异麦芽酮糖最大转化率分别为87.9％、89.5％、88.5％和89.3％(图5)。与天然酶相比，E175N、K576D和E175N/K576D的最大转化率分别提高了1.8％、0.7％和1.6％。 可以看出，不仅蔗糖异构酶突变体的热稳定性得到提高，而且对异麦芽酮糖的生产也起到了一定的促进作用，说明蔗糖异构酶突变体具有更好的应用性能。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种蔗糖异构酶突变体，其特征在于，所述突变体包括在氨基酸序列如SEQ ID NO.1的基础上，将第175位置的谷氨酸突变成天冬酰胺。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体还包括同时将第576位的赖氨酸突变为谷氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码。
4.一种制备权利要求1-2任一所述突变体的方法，包括如下步骤：
1)对蔗糖异构酶晶体结构进行分析，确定B因子较高的氨基酸，并结合Rosetta Design软件分析确定突变成何种氨基酸可以降低B因子；
2)设计定点突变所用引物，以携带蔗糖异构酶编码基因的载体为模板进行突变并构建两种突变体的质粒载体；
3)将突变质粒转化进宿主细胞；
4)挑选阳性克隆进行发酵培养，纯化获得蔗糖异构酶突变体。
5.含有权利要求1或2所述突变体的氨基酸序列的重组质粒载体。
6.根据权利要求5所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体是pET系列、pGEX系列、pPICZ系列、或pAN系列、或pUB中的任意一种。
7.表达权利要求1或2所述突变体的细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞是细菌、酵母或者真菌。
9.权利要求1或2所述突变体在生产异麦芽酮糖或海藻酮糖或异麦芽酮糖醇方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是将突变体用于催化蔗糖制备异麦芽酮糖，转化条件为pH 6.0、30℃、加酶量20U/g、底物浓度400g/L、转化8h。
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