CN116987749A - 一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用 - Google Patents
一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116987749A CN116987749A CN202311253256.9A CN202311253256A CN116987749A CN 116987749 A CN116987749 A CN 116987749A CN 202311253256 A CN202311253256 A CN 202311253256A CN 116987749 A CN116987749 A CN 116987749A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sucrose
- dehydrogenase
- reaction
- mmol
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 title claims abstract description 48
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 title claims abstract description 48
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 title claims abstract description 48
- PVXPPJIGRGXGCY-TZLCEDOOSA-N 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-fructofuranose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)C(O)(CO)O1 PVXPPJIGRGXGCY-TZLCEDOOSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 62
- 108020000290 Mannitol dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 108010047540 sucrose isomerase Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000905 isomalt Substances 0.000 claims description 24
- 235000010439 isomalt Nutrition 0.000 claims description 24
- HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N isomaltol Natural products CC(=O)C=1OC=CC=1O HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 4
- SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 1-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 0.000 claims 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 5
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- SERLAGPUMNYUCK-YJOKQAJESA-N 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SERLAGPUMNYUCK-YJOKQAJESA-N 0.000 description 27
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 8
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 101001056308 Homo sapiens Malate dehydrogenase, cytoplasmic Proteins 0.000 description 4
- 102100026475 Malate dehydrogenase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNQJZQMIEZWFIN-UHFFFAOYSA-N 1-(benzenesulfonyl)-4-(2-chlorobenzoyl)piperazine Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(=O)N1CCN(S(=O)(=O)C=2C=CC=CC=2)CC1 WNQJZQMIEZWFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100344720 Caenorhabditis elegans mdh-1 gene Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical class OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 239000007868 Raney catalyst Substances 0.000 description 1
- NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N Raney nickel Chemical compound [Al].[Ni] NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000564 Raney nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01047—Glucose 1-dehydrogenase (1.1.1.47)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01255—Mannitol dehydrogenase (1.1.1.255)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
- C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
- C12Y504/99011—Isomaltulose synthase (5.4.99.11)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用。该方法以蔗糖为底物，利用蔗糖异构酶，甘露醇脱氢酶，葡萄糖脱氢酶同步级联催化蔗糖反应生产异麦芽酮糖醇。本发明方法原料利用率高，异麦芽酮糖醇转化率较高，即异麦芽酮糖醇得率高，步骤简捷，生产成本低，污染小，对环境影响小，可实现异麦芽酮糖醇的规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于异麦芽酮糖醇的酶催化生产领域，具体涉及一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用。
背景技术
当前，异麦芽酮糖醇依赖于传统化学酶法合成，即以蔗糖为原料，通过蔗糖异构酶（Sucrose isomerase, SIase）催化生成异麦芽酮糖及杂糖（如海藻酮糖），经除杂、脱色、浓缩、结晶等获得异麦芽酮糖晶体；然后再将异麦芽酮糖晶体溶解，在高温（140-200℃）、高压（8.5-10.0 MPa）、雷尼镍、加氢条件下还原为异麦芽酮糖醇；再经浓缩、结晶、粉碎、造粒等工艺获得异麦芽酮糖醇。由此可见，传统化学酶法制备异麦芽酮糖醇不仅要求高温、高压、加氢等危险性工艺，而且还存在过程繁杂、转化率低、环境污染和资源浪费等问题。
因此，亟待开发出一种新的低成本、低污染、较高产率的异麦芽酮糖醇的方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法。采用本发明方法，异麦芽酮糖醇得率高，步骤简捷，生产成本低，污染小，对环境影响小，可实现异麦芽酮糖醇的规模化生产。
本发明的另一目的在于提供所述多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法在生产异麦芽酮糖醇中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法，包括以下步骤：以蔗糖为底物，利用蔗糖异构酶，甘露醇脱氢酶，葡萄糖脱氢酶同步级联催化蔗糖反应生产异麦芽酮糖醇。
所述蔗糖异构酶（SIsae）为来源于Pantoea dispersaUQ68J的SIase，其编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。
所述甘露醇脱氢酶（MDH）为来源于Pseudomonas fluorescens的甘露醇脱氢酶，其编码基因序列如SEQ ID NO.2所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述葡萄糖脱氢酶（GDH）为来源于Bacillus subtilis 168的葡萄糖脱氢酶，其编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述甘露醇脱氢酶还包括其突变体，所述突变体为如SEQ ID NO.4所示的甘露醇脱氢酶的氨基酸序列的第303位的His突变位Ala，其他氨基酸残基保持不变。所述甘露醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码基因序列如SEQ ID NO.6所示。
所述催化反应为在缓冲溶液体系中进行催化反应，其中，
所述蔗糖的用量为按其在所述反应体系的终浓度为10~60 mmol/L添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为30~50 mmol/L添加计算，更优选为按其在所述反应体系的终浓度为50 mmol/L添加计算。
所述蔗糖异构酶的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0~10 U/mL添加计算（所述的酶的用量不为零）；优选为按其在所述反应体系的终浓度为1~10 U/mL添加计算；更优选为按其在所述反应体系的终浓度为1 U/mL添加计算。
所述甘露醇脱氢酶的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0~10 U/mL添加计算（所述的酶的用量不为零）；优选为按其在所述反应体系的终浓度为5~10 U/mL添加计算；更优选为按其在所述反应体系的终浓度为5 U/mL添加计算。
所述葡萄糖脱氢酶的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0~10 U/mL添加计算（所述的酶的用量不为零）；优选为按其在所述反应体系的终浓度为1~10 U/mL添加计算；更优选为按其在所述反应体系的终浓度为1 U/mL添加计算。
所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液在所述反应体系的终浓度为50~350 mmol/L；优选为100~200 mmol/L；更优选为100 mmol/L。
所述催化反应的pH为5.5~8.0；优选为6.0。
具体的，本发明所述催化反应的反应体系包括以下组分及其浓度：50~350 mmol/L磷酸盐缓冲液，2~5 mmol/L 金属离子，1~10 U/mL蔗糖异构酶，1~10 U/mL葡萄糖脱氢酶，1~10 U/mL甘露醇脱氢酶或其突变体，10~60 mmol/L蔗糖，pH为5.5~8.0。
优选的，所述催化反应的反应体系包括以下组分及其浓度：100 mmol/L 磷酸盐缓冲液，5 mmol/L 金属离子，1 U/mL蔗糖异构酶，1 U/mL葡萄糖脱氢酶，5 U/mL甘露醇脱氢酶或其突变体，50 mmol/L蔗糖，pH为6.0。
所述金属离子为Mg2+，Ca2+，Fe2+，Co2+，Cu2+和Mn2+中的至少一种。优选为Mg2+和Fe2+中的至少一种；更优选为Mg2+。
所述催化反应的温度为20~50℃，优选为30℃。
所述催化反应的时间为50~100 h，优选为66 h。
本发明以蔗糖为底物，加入蔗糖异构酶，葡萄糖脱氢酶，甘露醇脱氢酶配制多酶反应体系，多酶催化途径包括：由蔗糖异构酶将蔗糖转化为异麦芽酮糖；由甘露醇脱氢酶将异麦芽酮糖转化为异麦芽酮糖醇，由葡萄糖脱氢酶将NADH转化为NAD+，供上述步骤循环使用NAD+。整个反应是放热反应，即在热力学上是行得通的，所以该酶催化体系能够得到很高的转化率。
另外，通过向上述反应体系中添加NADH和葡萄糖，可以提搞甘露醇脱氢酶的转化率。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明所公开的异麦芽酮糖醇的制备方法以来源广泛的蔗糖为底物，在一个多酶反应体系中，通过体外多酶高效催化将底物转化为异麦芽酮糖醇。本发明在异麦芽酮糖醇体外合成途径中，各个酶的比活不同，作用强度也不同，通过优化各个酶的最佳比例来提高催化效率，即通过过程优化，添加能够利用蔗糖的酶，从而建立优化的多酶体系，可以显著提高原料的转化效率和异麦芽酮糖醇的得率，较高得率和较高转化率又大大降低异麦芽酮糖醇的分离成本。
（2）本发明还对甘露醇脱氢酶进行了改造以提高异麦芽酮糖醇的得率。结果发现，将甘露醇脱氢酶氨基酸序列的第303位的His突变位Ala，其他氨基酸残基保持不变，得到的甘露醇脱氢酶突变体能显著提高异麦芽酮糖醇的得率。在相同的反应体系条件下，使用甘露醇脱氢酶突变体，异麦芽酮糖醇的终浓度为7.9 mM，蔗糖原子转化率达到79%，远高于使用未改造的甘露醇脱氢酶的效果（异麦芽酮糖醇的终浓度为6.5 mM，蔗糖原子转化率达到65%）。
（3）本发明方法原料利用率高，异麦芽酮糖醇转化率较高，即异麦芽酮糖醇得率高，步骤简捷，生产成本低，污染小，对环境影响小，可实现异麦芽酮糖醇的规模化生产。
附图说明
图1为转化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的体外多酶催化途径的示意图。
图2为蔗糖/异麦芽酮糖醇高效液相色谱图。
图3为异麦芽酮糖/异麦芽酮糖醇高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明所涉及到的术语及定义：
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通人员通常所了解相同的含义。
术语“酶催化反应”指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。
1、本发明实施例中涉及的实验材料如下：
①NADH、NAD+、蔗糖（Sucrose）购于Sigma公司，其产品编号为424490020；pET28a载体购于Novagen，Madison（麦迪逊），WI（美国威斯康星州）；大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)购于全式金生物科技有限公司。
2、本发明实施例涉及的催化体系中的蔗糖异构酶、甘露醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶可按照基因工程方法通过原核表达获得。
3、本发明中的酶活（U）：1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位（U）。
实施例1：酶的制备
1、蔗糖异构酶、甘露醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶的制备
本发明中，蔗糖异构酶（Sucrose isomerase，SIase）来源于Pantoea dispersaUQ68J，其NCBI登录号AY223549.1；甘露醇脱氢酶（Mannitol dehydrogenase，MDH）来源于Pseudomonas fluorescens，其NCBI登录号为AF007800.1；葡萄糖脱氢酶（Glucosedehydrogenase，GDH）来源于Bacillus subtilis168，其NCBI登录号为：>NC_000964.3:445344-446129。这些基因组DNA都可以从NCBI的官方网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上获得。这3个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过酶切连接到载体pET28a，获得相应的表达载体pET28a-SIase，pET28a-MDH，pET28a-GDH。再这3个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，并进行蛋白表达与纯化。其中，涉及的引物序列如下：
SIase-F : 5'- CGGAATTCCATGTTTCTTAATGGATTTAAGACAGTTAT -3' (EcoRI)；
SIase-R :5'- GTCGACGTTCAGCTTATAGATCCCGGCTTGCCACGGAGC -3'(SalI)；
MDH-F: 5'-CGggatccATGAAACTGAATAAGCAGAACCT-3'(BamHI)；
MDH-R:5'-CCCaagcttTTAAACCGGTTTCTTCAGGAGGTGCTTCA-3'(HindIII)；
GDH-F: 5'- CGggatccATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGT -3'；
GDH-R:5'- CCCaagcttTAACCGCGGCCTGCCTGGAATGAAGG -3'；
MDH1-F: 5'-ctgacctacctgggttttcTCAAGGGCTATCGGTTTGTGC-3'；
MDH1-R: 5'-aaaacccaggtaggtcagggccagcgcgcaaaacccaggtaggtcagggccagcgcgctg-3'；
蔗糖异构酶的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示：
>ATGTTTCTTAATGGATTTAAGACAGTTATTGCTCTGACTATGGCAAGCTCGTTTTATCTTGCCGCCAGCCCGTTAACTAAGCCATCGACCCCTATTGCCGCAACGAATATACAAAAGTCCGCTGATTTTCCCATTTGGTGGAAACAGGCAGTATTTTACCAGATTTATCCCCGCTCATTTAAAGATAGCAATGGTGATGGTATCGGCGATATTCCCGGTATCATTGAGAAACTGGACTATTTAAAAATGCTGGGAGTTGATGCTATCTGGATAAACCCGCACTATGAGTCTCCTAACACCGACAATGGTTACGATATTAGTGATTATCGTAAAATCATGAAGGAGTACGGCAGCATGGCTGACTTTGACCGTCTGGTTGCCGAAATGAATAAACGTGGTATGCGCCTGATGATTGATATTGTTATCAATCATACCAGCGATCGTCACCGCTGGTTTGTGCAGAGCCGTTCAGGTAAAGATAATCCTTACCGCGACTATTATTTCTGGCGTGATGGTAAACAGGGACAGGCTCCCAATAACTATCCCTCTTTCTTTGGCGGTTCAGCCTGGCAACTGGATAAACAGACTGACCAGTATTATCTGCACTATTTTGCACCACAGCAGCCGGATCTGAACTGGGATAACCCAAAAGTTCGGGCTGAACTCTACGATATTCTGCGTTTCTGGCTGGATAAAGGCGTATCCGGACTACGTTTTGATACCGTGGCTACTTTCTCCAAAATTCCTGGCTTCCCGGACCTGTCAAAAGCGCAGCTGAAGAATTTTGCCGAAGCTTATACTGAGGGGCCGAATATTCATAAATATATCCATGAAATGAACCGCCAGGTACTGTCTAAATATAATGTTGCCACCGCTGGTGAAATCTTCGGTGTGCCAGTGAGTGCTATGCCGGATTATTTTGACCGGCGGCGTGAAGAACTCAATATTGCTTTCACCTTTGATTTGATCAGGCTCGATCGTTATCCCGATCAGCGCTGGCGTCGTAAACCATGGACATTAAGCCAGTTTCGTCAAGTTATCTCTCAGACTGACCGTGCCGCCGGTGAATTTGGCTGGAACGCCTTTTTCCTTGATAACCATGATAACCCGCGCCAGGTCTCACACTTTGGTGACGACAGCCCACAATGGCGCGAACGCTCGGCAAAAGCACTGGCAACGCTGCTGCTGACGCAGCGTGCCACGCCGTTTATCTTTCAGGGGGCGGAGTTGGGAATGACTAATTACCCCTTTAAAAATATAGAGGAATTTGATGATATTGAGGTTAAAGGCTTCTGGAACGACTATGTAGCCAGCGGAAAAGTAAACGCTGCTGAATTTTTACAGGAGGTTCGCATGACCAGCCGCGATAACAGCCGAACACCAATGCAGTGGAACGACTCTGTTAATGCCGGATTCACCCAGGGCAAACCCTGGTTTCACCTCAATCCCAACTATAAGCAAATCAATGCCGCCAGGGAGGTGAATAAACCCGACTCGGTATTCAGTTACTACCGTCAACTGATCAACCTGCGTCACCAGATCCCGGCACTGACCAGTGGTGAATACCGTGATCTCGATCCGCAGAATAACCAGGTCTATGCCTATACCCGTATACTGGATAATGAAAAATATCTGGTGGTAGTTAATTTTAAACCTGAGCAGCTGCATTACGCTCTGCCAGATAATCTGACTATTGCCAGCAGTCTGCTGGAAAATGTCCACCAACCATCACTGCAAGAAAATGCCTCCACGCTGACTCTTGCTCCGTGGCAAGCCGGGATCTATAAGCTGAACTGA*。
甘露醇脱氢酶的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示：
>ATGAAACTGAATAAGCAGAACCTCACCCAGCTGGCGCCCGAAGTGAAATTGCCAGCCTATACGCTTGCCGACACACGCCAGGGCATCGCCCATATCGGCGTCGGCGGCTTCCATCGCGCGCACCAGGCGTATTACACCGATGCGCTGATGAATACCGGCGAGGGCCTGGACTGGAGCATCTGCGGCGTTGGCCTGCGCAGCGAGGACCGCAAGGCCCGCGATGACCTGGCCGGCCAGGACTACCTGTTCACCCTGTACGAACTGGGCGACACCGACGACACCGAAGTGCGCGTGATCGGCTCGATCAGCGACATGCTGCTGGCCGAAGACAGCGCCCAGGCATTGATCGATAAACTGGCCAGCCCCGAGATTCGCATCGTCTCGCTGACCATCACCGAAGGCGGCTACTGCATCGACGACAGCAACGGCGAATTCATGGCCCACTTGCCGCAGATCCAGCACGACCTGGCTCATCCGTCGTCGCCAAAAACCGTGTTCGGCTTTATCTGCGCGGCATTGACCCAGCGCCGCGCGGCCGGCATCCCGGCGTTTACCGTGATGTCCTGCGATAACCTGCCCCACAATGGCGCTGTCACGCGCAAGGCACTGCTGGCGTTCGCCGCCCTGCACAACGCCGAGCTGCATGACTGGATCAAGGCCCATGTGAGCTTCCCGAACGCCATGGTCGACCGCATCACGCCGATGACCAGCACCGCCCACCGCCTGCAACTGCACGATGAACACGGCATCGACGATGCCTGGCCAGTTGTTTGCGAACCCTTTGTGCAGTGGGTACTGGAAGACAAATTCGTCAACGGCCGCCCGGCGTGGGAAAAGGTTGGCGTGCAGTTCACCGACGATGTGACACCCTATGAAGAGATGAAGATCGGCTTGCTCAACGGCAGCCACCTGGCCCTGACCTACCTGGGTTTTCTCAAGGGCTATCGGTTTGTGCACGAGACCATGAACGACCCGCTGTTCGTGGCCTACATGCGCGCCTACATGGACCTCGACGTCACGCCAAACCTCGCGCCGGTACCGGGCATCGACCTGACCGACTACAAGCAGACCCTGGTGGACCGCTTCTCCAACCAGGCGATTGCCGACCAGTTGGAACGGGTGTGTTCGGATGGCTCGTCGAAGTTTCCCAAGTTCACCGTGCCGACCATCAACCGCCTGATTGCCGACGGCCGTGAGACCGAGCGTGCAGCACTGGTCGTCGCGGCCTGGGCCTTGTATTTGAAGGGTGTGGATGAGAATGGCGTGAGCTACACAATCCCCGATCCGCGCGCCGAGTTCTGCCAGGGGCTGGTGAGTGACGATGCACTGATCAGCCAGCGGTTGCTGGCAGTGGAAGAGATTTTCGGTACGGCTATTCCCAACTCGCCTGAGTTTGTGGCAGCGTTCGAGCGGTGCTATGGGAGCCTGCGTGATAACGGCGTCACCACTACCCTGAAGCACCTCCTGAAGAAACCGGTTTAA*。
葡萄糖脱氢酶的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示：
>ATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCGTCGCTATTACAGGAGCTGCTTCAGGGCTCGGAAAGGCGATGGCCATTCGCTTCGGCAAGGAGCAGGCAAAAGTGGTTATCAACTATTATAGTAATAAACAAGATCCGAACGAGGTAAAAGAAGAGGTCATCAAGGCGGGCGGTGAAGCTGTTGTCGTCCAAGGAGATGTCACGAAAGAGGAAGATGTAAAAAATATCGTGCAAACGGCAATTAAGGAGTTCGGCACACTCGATATTATGATTAATAATGCCGGTCTTGAAAATCCTGTGCCATCTCACGAAATGCCGCTCAAGGATTGGGATAAAGTCATCGGCACGAACTTAACGGGTGCCTTTTTAGGAAGCCGTGAAGCGATTAAATATTTCGTAGAAAACGATATCAAGGGAAATGTCATTAACATGTCCAGTGTGCACGAAGTGATTCCTTGGCCGTTATTTGTCCACTATGCGGCAAGTAAAGGCGGGATAAAGCTGATGACAGAAACATTAGCGTTGGAATACGCGCCGAAGGGCATTCGCGTCAATAATATTGGGCCAGGTGCGATCAACACGCCAATCAATGCTGAAAAATTCGCTGACCCTAAACAGAAAGCTGATGTAGAAAGCATGATTCCAATGGGATATATCGGCGAACCGGAGGAGATCGCCGCAGTAGCAGCCTGGCTTGCTTCGAAGGAAGCCAGCTACGTCACAGGCATCACGTTATTCGCGGACGGCGGTATGACACAATATCCTTCATTCCAGGCAGGCCGCGGTTAA*。
甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
MKLNKQNLTQLAPEVKLPAYTLADTRQGIAHIGVGGFHRAHQAYYTDALMNTGEGLDWSICGVGLRSEDRKARDDLAGQDYLFTLYELGDTDDTEVRVIGSISDMLLAEDSAQALIDKLASPEIRIVSLTITEGGYCIDDSNGEFMAHLPQIQHDLAHPSSPKTVFGFICAALTQRRAAGIPAFTVMSCDNLPHNGAVTRKALLAFAALHNAELHDWIKAHVSFPNAMVDRITPMTSTAHRLQLHDEHGIDDAWPVVCEPFVQWVLEDKFVNGRPAWEKVGVQFTDDVTPYEEMKIGLLNGSHLALTYLGFLKGYRFVHETMNDPLFVAYMRAYMDLDVTPNLAPVPGIDLTDYKQTLVDRFSNQAIADQLERVCSDGSSKFPKFTVPTINRLIADGRETERAALVVAAWALYLKGVDENGVSYTIPDPRAEFCQGLVSDDALISQRLLAVEEIFGTAIPNSPEFVAAFERCYGSLRDNGVTTTLKHLLKKPV*。
实施例2：体外多酶催化将蔗糖转化为异麦芽酮糖醇
本发明通过一个体外多酶催化体系将蔗糖转为异麦芽酮糖醇（图1）。这些关键酶包括：
1）蔗糖异构酶（SIase），催化蔗糖到异麦芽酮糖；
2）甘露醇脱氢酶（MDH），催化异麦芽酮糖到异麦芽酮糖醇；
3）葡萄糖脱氢酶（GDH），催化葡萄糖到葡萄糖酸。
具体实验步骤如下：
（1）蔗糖异构酶、甘露醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的制备同实施例1。
（2）在一个2.0 mL的反应体系中含有终浓度为50 mmol/L磷酸盐缓冲液，5 mmol/LMgCl2，1 U/mL SIase，5 U/mL MDH，1 U/mL GDH，50 mmol/L蔗糖，催化反应体系的pH为6.0，在30℃进行催化反应，反应66 h。
（3）HPLC分析：根据反应时间的不同，同时蔗糖、异麦芽酮糖醇和异麦芽酮糖均能在示差检测器中被检测到，所以采用HPLC法测定底物和产物的浓度：采用Waters SugarPakI柱作为HPLC色谱柱，其规格6.5×300 mm×5 μm，流动相为去离子水，流速为0.5 mL/min，柱温为70℃；检测器选用时差折光检测器。HPLC可以用来区分反应液中的蔗糖、异麦芽酮糖、异麦芽酮糖醇，并且可以对三者进行定量。结果如图2和3所示：异麦芽酮糖醇的浓度与HPLC中异麦芽酮糖醇特征峰的强度是成正比的。反应结束后，异麦芽酮糖醇的终浓度为1mM，蔗糖原子转化率为10%。
实施例3：体外多酶催化将蔗糖转化为异麦芽酮糖醇
（1）蔗糖异构酶、甘露醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的制备同实施例1。
（2）在一个2.0 mL的反应体系中含有终浓度为150 mmol/L磷酸盐缓冲液，5 mmol/L MgCl2，1 U/mL SIase，5 U/mL MDH，1 U/mL GDH，50 mmol/L蔗糖，催化反应体系的pH为6.0，在30℃进行催化反应，反应66 h。
（3）反应结束后，异麦芽酮糖醇的终浓度为3.5 mM（定量方法同实施例2），蔗糖原子转化率达到35%。
实施例4：通过条件优化，利用体外多酶催化蔗糖转化为异麦芽酮糖醇
为了进一步提高异麦芽酮糖醇的转化率，本发明对多酶反应体系进行优化，保证原料蔗糖充分降解从而提高异麦芽酮糖醇的得率和转化率。具体实验步骤如下：
（1）蔗糖异构酶、甘露醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的制备同实施例1。
（2）在一个2.0 mL的反应体系中含有终浓度为200 mmol/L磷酸盐缓冲液，5 mmol/L MgCl2，1 U/mL SIase，5 U/mL MDH，1 U/mL GDH，50 mmol/L蔗糖，催化反应体系的pH为6.0，在30℃进行催化反应，反应66 h。
（3）反应结束后，异麦芽酮糖醇的终浓度为5 mM（定量方法同实施例2），蔗糖原子转化率达到50%。
实施例5：通过条件优化，利用体外多酶催化蔗糖转化为异麦芽酮糖醇
通过过程优化的体外多酶催化体系将蔗糖转化为异麦芽酮糖醇的示意图如图1所示。具体实验步骤如下：
（1）蔗糖异构酶、甘露醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的制备同实施例1。
（2）在一个2.0 mL的反应体系中含有终浓度为100 mmol/L磷酸盐缓冲液，5 mmol/L MgCl2，1 U/mL SIase，5 U/mL MDH，1 U/mL GDH，50 mmol/L蔗糖，催化反应体系的pH为6.0，在30℃进行催化反应，反应66 h。
（3）反应结束后，异麦芽酮糖醇的终浓度为6.5 mM（定量方法同实施例2），蔗糖原子转化率达到65%。
实施例6：甘露醇脱氢酶的改造用于提高异麦芽酮糖醇的得率
为了提高甘露醇脱氢酶催化异麦芽酮糖的催化性能，其编码基因种属来源为氨基酸序列如所示SEQ ID NO.4的甘露醇脱氢酶，对编码甘露醇脱氢酶的核苷酸序列进行单点突变，获得能提高甘露醇脱氢酶催化异麦芽酮糖的催化性能的甘露醇脱氢酶突变体，并命名为MDH1。
MDH1突变体为将MDH氨基酸序列（SEQ ID NO.4）的第303位的His突变位Ala，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列（SEQ ID NO.5），对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
（1）蔗糖异构酶、甘露醇脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶的制备同实施例1。
（2）在一个2.0 mL的优化后反应体系中含有100 mmol/L磷酸盐缓冲液，5 mmol/LMgCl2，1 U/mL SIase，5 U/mL MDH-1，1 U/mL GDH，50 mmol/L蔗糖，催化反应体系的pH为6.0，在30℃进行催化反应，反应66 h。
（3）反应结束后，异麦芽酮糖醇的终浓度为7.9 mM（定量方法同实施例2），蔗糖原子转化率达到79%。
MDH1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：
MKLNKQNLTQLAPEVKLPAYTLADTRQGIAHIGVGGFHRAHQAYYTDALMNTGEGLDWSICGVGLRSEDRKARDDLAGQDYLFTLYELGDTDDTEVRVIGSISDMLLAEDSAQALIDKLASPEIRIVSLTITEGGYCIDDSNGEFMAHLPQIQHDLAHPSSPKTVFGFICAALTQRRAAGIPAFTVMSCDNLPHNGAVTRKALLAFAALHNAELHDWIKAHVSFPNAMVDRITPMTSTAHRLQLHDEHGIDDAWPVVCEPFVQWVLEDKFVNGRPAWEKVGVQFTDDVTPYEEMKIGLLNGSALALTYLGFLKGYRFVHETMNDPLFVAYMRAYMDLDVTPNLAPVPGIDLTDYKQTLVDRFSNQAIADQLERVCSDGSSKFPKFTVPTINRLIADGRETERAALVVAAWALYLKGVDENGVSYTIPDPRAEFCQGLVSDDALISQRLLAVEEIFGTAIPNSPEFVAAFERCYGSLRDNGVTTTLKHLLKKPV*。
MDH1突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
>ATGAAACTGAATAAGCAGAACCTCACCCAGCTGGCGCCCGAAGTGAAATTGCCAGCCTATACGCTTGCCGACACACGCCAGGGCATCGCCCATATCGGCGTCGGCGGCTTCCATCGCGCGCACCAGGCGTATTACACCGATGCGCTGATGAATACCGGCGAGGGCCTGGACTGGAGCATCTGCGGCGTTGGCCTGCGCAGCGAGGACCGCAAGGCCCGCGATGACCTGGCCGGCCAGGACTACCTGTTCACCCTGTACGAACTGGGCGACACCGACGACACCGAAGTGCGCGTGATCGGCTCGATCAGCGACATGCTGCTGGCCGAAGACAGCGCCCAGGCATTGATCGATAAACTGGCCAGCCCCGAGATTCGCATCGTCTCGCTGACCATCACCGAAGGCGGCTACTGCATCGACGACAGCAACGGCGAATTCATGGCCCACTTGCCGCAGATCCAGCACGACCTGGCTCATCCGTCGTCGCCAAAAACCGTGTTCGGCTTTATCTGCGCGGCATTGACCCAGCGCCGCGCGGCCGGCATCCCGGCGTTTACCGTGATGTCCTGCGATAACCTGCCCCACAATGGCGCTGTCACGCGCAAGGCACTGCTGGCGTTCGCCGCCCTGCACAACGCCGAGCTGCATGACTGGATCAAGGCCCATGTGAGCTTCCCGAACGCCATGGTCGACCGCATCACGCCGATGACCAGCACCGCCCACCGCCTGCAACTGCACGATGAACACGGCATCGACGATGCCTGGCCAGTTGTTTGCGAACCCTTTGTGCAGTGGGTACTGGAAGACAAATTCGTCAACGGCCGCCCGGCGTGGGAAAAGGTTGGCGTGCAGTTCACCGACGATGTGACACCCTATGAAGAGATGAAGATCGGCTTGCTCAACGGCAGCGGACTGGCCCTGACCTACCTGGGTTTTCTCAAGGGCTATCGGTTTGTGCACGAGACCATGAACGACCCGCTGTTCGTGGCCTACATGCGCGCCTACATGGACCTCGACGTCACGCCAAACCTCGCGCCGGTACCGGGCATCGACCTGACCGACTACAAGCAGACCCTGGTGGACCGCTTCTCCAACCAGGCGATTGCCGACCAGTTGGAACGGGTGTGTTCGGATGGCTCGTCGAAGTTTCCCAAGTTCACCGTGCCGACCATCAACCGCCTGATTGCCGACGGCCGTGAGACCGAGCGTGCAGCACTGGTCGTCGCGGCCTGGGCCTTGTATTTGAAGGGTGTGGATGAGAATGGCGTGAGCTACACAATCCCCGATCCGCGCGCCGAGTTCTGCCAGGGGCTGGTGAGTGACGATGCACTGATCAGCCAGCGGTTGCTGGCAGTGGAAGAGATTTTCGGTACGGCTATTCCCAACTCGCCTGAGTTTGTGGCAGCGTTCGAGCGGTGCTATGGGAGCCTGCGTGATAACGGCGTCACCACTACCCTGAAGCACCTCCTGAAGAAACCGGTTTAA*。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法，其特征在于：以蔗糖为底物，利用蔗糖异构酶，甘露醇脱氢酶，葡萄糖脱氢酶同步级联催化蔗糖反应生产异麦芽酮糖醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蔗糖异构酶的编码基因序列如SEQ IDNO.1所示；
所述甘露醇脱氢酶的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述葡萄糖脱氢酶的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述甘露醇脱氢酶还包括其突变体，所述突变体为如SEQ ID NO.4所示的甘露醇脱氢酶的氨基酸序列的第303位的His突变位Ala，其他氨基酸残基保持不变。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述甘露醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码基因序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述利用蔗糖异构酶，甘露醇脱氢酶，葡萄糖脱氢酶同步级联催化蔗糖反应生产异麦芽酮糖醇的体系包括以下组分及其浓度：
50~350 mmol/L 磷酸盐缓冲液，2~5 mmol/L 金属离子，1~10 U/mL蔗糖异构酶，1~10U/mL葡萄糖脱氢酶，1~10 U/mL甘露醇脱氢酶或其突变体，10~60 mmol/L蔗糖，pH为5.5~8.0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述利用蔗糖异构酶，甘露醇脱氢酶，葡萄糖脱氢酶同步级联催化蔗糖反应生产异麦芽酮糖醇的体系包括以下组分及其浓度：
100 mmol/L 磷酸盐缓冲液，5 mmol/L 金属离子，1 U/mL蔗糖异构酶，1 U/mL葡萄糖脱氢酶，5 U/mL甘露醇脱氢酶或其突变体，50 mmol/L蔗糖，pH为6.0。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述金属离子为Mg2+，Ca2+，Fe2+，Co2+，Cu2+和Mn2+中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述利用蔗糖异构酶，甘露醇脱氢酶，葡萄糖脱氢酶同步级联催化蔗糖反应生产异麦芽酮糖醇的反应温度为20~50℃；反应时间为50~100 h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述利用蔗糖异构酶，甘露醇脱氢酶，葡萄糖脱氢酶同步级联催化蔗糖反应生产异麦芽酮糖醇的反应温度为30℃；反应时间为66 h。
10.权利要求1所述的方法在生产异麦芽酮糖醇中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311253256.9A CN116987749B (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311253256.9A CN116987749B (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116987749A true CN116987749A (zh) | 2023-11-03 |
| CN116987749B CN116987749B (zh) | 2023-12-01 |
Family
ID=88534163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311253256.9A Active CN116987749B (zh) | 2023-09-27 | 2023-09-27 | 一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116987749B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080220441A1 (en) * | 2001-05-16 | 2008-09-11 | Birnbaum Eva R | Advanced drug development and manufacturing |
| CN104762286A (zh) * | 2015-03-30 | 2015-07-08 | 江南大学 | 一种热稳定性和催化效率提高的蔗糖异构酶突变体 |
| CN109929863A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-06-25 | 江南大学 | 一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法 |
| CN111363759A (zh) * | 2020-01-21 | 2020-07-03 | 上海交通大学 | 合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株 |
| CN112920235A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-08 | 山东健奕宏生物制药有限公司 | 一种异麦芽酮糖醇的制备方法 |
| CN116693710A (zh) * | 2023-06-07 | 2023-09-05 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖及其制备方法与应用 |
| CN116790523A (zh) * | 2023-08-04 | 2023-09-22 | 广东省科学院生物与医学工程研究所 | 一种利用全细胞转化生成异麦芽酮糖醇的方法 |
-
2023
- 2023-09-27 CN CN202311253256.9A patent/CN116987749B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080220441A1 (en) * | 2001-05-16 | 2008-09-11 | Birnbaum Eva R | Advanced drug development and manufacturing |
| CN104762286A (zh) * | 2015-03-30 | 2015-07-08 | 江南大学 | 一种热稳定性和催化效率提高的蔗糖异构酶突变体 |
| CN109929863A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-06-25 | 江南大学 | 一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法 |
| CN111363759A (zh) * | 2020-01-21 | 2020-07-03 | 上海交通大学 | 合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株 |
| CN112920235A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-08 | 山东健奕宏生物制药有限公司 | 一种异麦芽酮糖醇的制备方法 |
| CN116693710A (zh) * | 2023-06-07 | 2023-09-05 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种治疗慢性阻塞性肺病的全真一气汤多糖及其制备方法与应用 |
| CN116790523A (zh) * | 2023-08-04 | 2023-09-22 | 广东省科学院生物与医学工程研究所 | 一种利用全细胞转化生成异麦芽酮糖醇的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| M. HAGHIGHATIAN ET AL: "Isomalt Production by Cloning, Purifying and Expressing of the MDH Gene From Pseudomonas fluorescens DSM 50106 in Different Strains of E. coli", PAKISTAN JOURNAL OF BIOLOGICAL SCIENCES, vol. 11, no. 16, pages 2001 - 2006 * |
| 岳敏等: "糖醇生产方法研究进展", 食品与发酵工业, vol. 35, no. 08, pages 93 - 104 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116987749B (zh) | 2023-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112159831B (zh) | 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法 | |
| KR20090033864A (ko) | 광학 활성 알코올의 제조방법 | |
| CN112877307B (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN112029739A (zh) | 7β羟基类固醇脱氢酶突变体及其在制备UDCA中的应用 | |
| EP4261280A1 (en) | Amino acid dehydrogenase mutant and application thereof | |
| CN109777788B (zh) | 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN114438049A (zh) | 胺脱氢酶及其编码核酸与应用 | |
| CN116987749B (zh) | 一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用 | |
| CN111471736B (zh) | 制备c1,2-位脱氢甾体化合物的方法 | |
| CN115044627B (zh) | 高效生产l-高苯丙氨酸的方法及一种产l-高苯丙氨酸的菌株 | |
| CN111349672A (zh) | 制备脱氧核糖核苷三磷酸生物合成新方法 | |
| KR101008556B1 (ko) | 엘－리보스의 생산방법 | |
| CN112195198B (zh) | 一种制备d-泛解酸的方法 | |
| CN113913399A (zh) | 来源于Candida maltosa Xu316的酮基泛解酸内酯还原酶 | |
| CN114085820A (zh) | 来源于Candida viswanathii的酮基泛解酸内酯还原酶 | |
| CN110713990B (zh) | 一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用 | |
| WO2015137565A1 (ko) | 신규 포름알데하이드 탈수소효소 및 이를 이용한 포름알데하이드의 생산방법 | |
| JP2006503559A (ja) | Ｄ−マンニトールを製造するための方法並びに微生物 | |
| CN111909973B (zh) | 一种生物催化合成d-(+)-葡萄糖醛酸的方法及其应用 | |
| WO2021004614A1 (en) | Biotechnological production of diols | |
| CN113025546B (zh) | 一种多酶级联转化l-酪氨酸生产酪醇的方法 | |
| CN114231507B (zh) | 一种胆分节杆菌胆碱氧化酶突变体及其应用 | |
| Jeromin et al. | Selective reductions of ketones in the presence of aldehydes with Chiralidon a superabsorbed alcohol dehydrogenase-a" green" metal free alternative to the Luche-reduction | |
| CN117327671A (zh) | 一种新型酮还原酶突变体及其制备方法与应用 | |
| CN111575258A (zh) | 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |