CN116790523A - 一种利用全细胞转化生成异麦芽酮糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用全细胞转化生成异麦芽酮糖醇的方法；所述方法以异麦芽酮糖为底物，利用可表达甘露醇脱氢酶的重组细胞转化生产异麦芽酮糖醇，其中甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，比酶活为5U/mg；结果显示，利用本发明的转化方法，异麦芽酮糖醇产率可达到7.8％，时空产率可达到36mg/L·h；而且本发明为首次报道的异麦芽酮糖醇的生物法合成；与传统的化学合成法相比，不需要除杂、脱色、浓缩等步骤；为异麦芽酮糖醇的绿色高效合成提供了新方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用全细胞转化生成异麦芽酮糖醇的方法。
背景技术
蔗糖替代品，即代糖；相较于其它代糖(如赤藓糖醇等)，异麦芽酮糖醇被认为是蔗糖的“理想替代品”。在感官特性方面：尽管异麦芽酮糖醇的甜度仅有蔗糖的一半，但其具有与蔗糖相同或相似的甜味，无不良风味；在物化特性方面：异麦芽酮糖醇具有低吸湿性，高热、酸、碱耐受性，赋形性能好，在糖果、巧克力等产品中可以与蔗糖1:1替换而不需要改变配方和更换设备；在生理特性方面：异麦芽酮糖醇安全性高，世界多国对其使用范围和每日摄入量不做限制，不致龋齿、在体内的代谢不依赖于胰岛素，可供儿童、高血糖、糖尿病及肥胖人群食用。此外，异麦芽酮糖醇被报道具有益生元特性，能促进肠道益生菌(如双歧杆菌)增殖和短链脂肪酸产生，后者被证实具有抗炎、抗癌、增强免疫等作用。上述研究为异麦芽酮糖醇替代或部分替代蔗糖提供了充分的理论依据。因此，异麦芽酮糖醇作为一种新型的功能性糖醇，被广泛应用在食品领域中。
当前，异麦芽酮糖醇依赖于传统化学酶法合成，即以蔗糖为原料，通过蔗糖异构酶(Sucrose isomerase,SIase)催化生成异麦芽酮糖及杂糖(如海藻酮糖)，经除杂、脱色、浓缩、结晶等获得异麦芽酮糖晶体；而后再将异麦芽酮糖晶体溶解，在高温(140-200℃)、高压(8.5-10.0MPa)、雷尼镍、加氢条件下还原为异麦芽酮糖醇；再经浓缩、结晶、粉碎、造粒等工艺获得异麦芽酮糖醇。此工艺不仅要求高温、高压、加氢等危险性工艺，而且还存在过程繁杂、转化率低、环境污染和资源浪费等问题。说明当前传统化学酶法生产异麦芽酮糖醇的方式，已不符合我国工业转型升级和结构优化的发展趋势。
合成生物学这一新兴交叉学科的发展为多种化合物的绿色、高效、经济生产提供了新途径，已在天然活性成分(如青蒿素)、平台化合物(如1,4-丁二醇)、食物营养成分(如淀粉、蛋白质)等方面取得了令人瞩目的成果。相较于传统化学合成，生物合成主要通过生物体的代谢来合成特定成分，具有反应选择性强、反应速率高、反应条件温和、环境污染小、适用于大规模生产等优点。
因此，生物法合成或许为异麦芽酮糖醇的绿色、高效、经济生产提供了新思路。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供甘露醇脱氢酶或其相关生物材料的应用。
本发明第二方面的目的，在于提供一种甘露醇脱氢酶的制备方法。
本发明第三方面的目的，在于提供一种异麦芽酮糖醇的制备方法。
本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供甘露醇脱氢酶或其相关生物材料在(a1)～(a2)至少一种中的应用：
(a1)生产异麦芽酮糖醇；
(a2)制备生产异麦芽酮糖醇的产品；
所述甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述相关生物材料为下述(b1)～(b8)中的任一种；
(b1)编码所述甘露醇脱氢酶的核酸分子；
(b2)含有(b1)所述核酸分子的表达盒；
(b3)含有(b1)所述核酸分子的重组载体；
(b4)含有(b2)所述表达盒的重组载体；
(b5)含有(b1)所述核酸分子的重组细胞；
(b6)含有(b2)所述表达盒的重组细胞；
(b7)含有(b3)所述重组载体的重组细胞；
(b8)含有(b4)所述重组载体的重组细胞。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述载体包括但不限于质粒载体。
优选地，所述质粒载体包括pMA5载体、pHT43载体、pET-28a载体、pMJ19载体或pDXW-10载体中的至少一种。
优选地，所述重组载体通过将载体与所述的用于编码甘露醇脱氢酶的基因经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后连接获得的。
优选地，所述重组细胞非动物或植物新品种。
优选地，所述细胞包括原核细胞或真核细胞。
优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、链霉菌等中的至少一种。
优选地，所述真核细胞包括酵母细胞。
优选地，所述酵母细胞包括毕赤酵母、酿酒酵母等中的至少一种。
本发明的第二方面，提供了一种甘露醇脱氢酶的制备方法，通过培养本发明第一方面所述的重组细胞获得甘露醇脱氢酶。
优选地，所述培养基可为LB培养基、TB培养基或NB培养基。
优选地，所述LB液体培养基包括：蛋白胨8～12g/L、酵母膏4～6g/L、NaCl 8～12g/L。
优选地，所述LB固体固体培养基还包括1～3g/L琼脂粉。
优选地，所述培养的温度为20-40℃；和/或，时间为18-30h；和/或，转速为150-210rpm。
本发明的第三方面，提供一种异麦芽酮糖醇的制备方法，包括将本发明第一方面所述的重组细胞加入含有异麦芽酮糖的反应体系中进行转化反应。
优选地，所述方法具体包括使用含有异麦芽酮糖的缓冲液重悬上述细胞至细胞在缓冲液中的细胞浓度为OD600＝15-30，得到反应体系。
优选地，所述转化反应的培养基的配方包括但不限于：葡萄糖10～30g/L、蛋白胨8～12g/L、NaH2PO4 0.5～1g/L、Na2HPO4 12H2O 1～1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5～1.5g/L，pH为7～7.5。
优选地，所述转化的温度为25-40℃。
优选地，所述转化的pH为6-7.5。
优选地，所述转化的时间为150～210rpm转化20-30h。
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液但并不局限于此。
优选地，所述异麦芽酮糖在反应体系中的浓度为50-200g/L。
本发明的第四方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述的甘露醇脱氢酶或相关生物材料。
优选地，所述产品还包括异麦芽酮糖。
优选地，所述产品包括食品、药品、催化剂等。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种甘露醇脱氢酶及编码甘露醇脱氢酶的核酸分子以及包含上述核酸分子的表达载体或重组细胞在制备异麦芽酮糖醇中的应用，甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过培养重组细胞能够合成较高比酶活的甘露醇脱氢酶，其中比酶活为5U/mg；本发明还提供了一种以异麦芽酮糖为底物，利用可表达甘露醇脱氢酶的重组细胞转化生产异麦芽酮糖醇的方法，其中异麦芽酮糖醇产率可达到7.8％，异麦芽酮糖醇时空产率可达到36mg/L·h；本发明为首次报道的异麦芽酮糖醇的生物法合成；与传统的化学合成法相比，不需要除杂、脱色、浓缩等步骤，为异麦芽酮糖醇的绿色高效合成提供了新方法。
附图说明
图1为实施例4中的HPLC检测图，从左到右的峰分别为溶剂峰、异麦芽酮糖、异麦芽酮糖醇。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
下述实施例涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)13032、毕赤酵母(pichia pastoris)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtlis)168购自北纳生物公司；下述实施例中涉及的表达载体购自优宝生物；下述实施例中的涉及的异麦芽酮糖、异麦芽酮糖醇标样均购自Sigma公司；下述实施例中涉及的磷酸盐缓冲液购自中国上海麦克林公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L，其中固体培养基加入2g/L琼脂粉。
发酵培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、NaH2PO4 0.75g/L、Na2HPO4 12H2O 1.25g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，1mol/L的NaOH调pH至7.2。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
甘露醇脱氢酶酶活的检测方法：取100μL适当稀释后的纯酶加入到含有100g/L异麦芽酮糖的100mM pH6.5磷酸盐缓冲液的900μL反应体系中；于30℃反应30min，沸水浴5～10min以终止酶促反应，离心取上清，利用HPLC检测反应液中异麦芽酮糖醇的含量。
其中，甘露醇脱氢酶酶活的定义：在30℃、pH6.5的条件下，每min催化异麦芽酮糖反应生成1μmol产物异麦芽酮糖醇所需的酶量为一个活力单位(U)。
甘露醇脱氢酶比酶活的检测方法：取0.1mg纯酶加入含有100g/L异麦芽酮糖的100mM pH6.5磷酸盐缓冲液的1mL反应体系中；于30℃下反应20min，沸水浴5～10min以终止酶促反应，离心取上清液，利用HPLC检测反应液中异麦芽酮糖醇的含量；
其中，甘露醇脱氢酶比酶活的定义：每毫克酶蛋白所具有的酶活力，单位是U/mg。
异麦芽酮糖醇产率以及异麦芽酮糖醇时空产率的检测方法：将反应结束后的反应液样品进行离心取上清，并进行适当的稀释，HPLC法测定反应液当中异麦芽酮糖的残留含量以及异麦芽酮糖醇的含量；
其中，异麦芽酮糖醇产率的计算公式为：产率＝(反应后转化液中异麦芽酮糖醇的浓度/反应前转化液中异麦芽酮糖的初始浓度)×100％；
异麦芽酮糖醇时空产率的计算公式为：时空产率＝反应后转化液中异麦芽酮糖醇的浓度/反应时间；
异麦芽酮糖醇时空产率的定义：在30℃、pH6.5的反应条件下，单位时间内生成异麦芽酮糖醇的产量。
HPLC分析：因为异麦芽酮糖醇和异麦芽酮糖均能在示差检测器中被检测到，所以采用HPLC法测定底物和产物的浓度：采用Waters Sugar PakI柱作为HPLC色谱柱，其规格为6.5×300mm×5μm，流动相为去离子水，流速为0.5mL/min，柱温为70℃；检测器选用时差折光检测器。
实施例1：可表达来源于Pseudomonas fluorescens的甘露醇脱氢酶的大肠杆菌工程菌的构建
(1)从GENBANK获取来源于Pseudomonas fluorescens(Gene ID:AF007800.1)的甘露醇脱氢酶的核苷酸序列：
ATGAAACTGAATAAGCAGAACCTCACCCAGCTGGCGCCCGAAGTGAAATTGCCAGCCTATACGCTTGCCGACACACGCCAGGGCATCGCCCATATCGGCGTCGGCGGCTTCCATCGCGCGCACCAGGCGTATTACACCGATGCGCTGATGAATACCGGCGAGGGCCTGGACTGGAGCATCTGCGGCGTTGGCCTGCGCAGCGAGGACCGCAAGGCCCGCGATGACCTGGCCGGCCAGGACTACCTGTTCACCCTGTACGAACTGGGCGACACCGACGACACCGAAGTGCGCGTGATCGGCTCGATCAGCGACATGCTGCTGGCCGAAGACAGCGCCCAGGCATTGATCGATAAACTGGCCAGCCCCGAGATTCGCATCGTCTCGCTGACCATCACCGAAGGCGGCTACTGCATCGACGACAGCAACGGCGAATTCATGGCCCACTTGCCGCAGATCCAGCACGACCTGGCTCATCCGTCGTCGCCAAAAACCGTGTTCGGCTTTATCTGCGCGGCATTGACCCAGCGCCGCGCGGCCGGCATCCCGGCGTTTACCGTGATGTCCTGCGATAACCTGCCCCACAATGGCGCTGTCACGCGCAAGGCACTGCTGGCGTTCGCCGCCCTGCACAACGCCGAGCTGCATGACTGGATCAAGGCCCATGTGAGCTTCCCGAACGCCATGGTCGACCGCATCACGCCGATGACCAGCACCGCCCACCGCCTGCAACTGCACGATGAACACGGCATCGACGATGCCTGGCCAGTTGTTTGCGAACCCTTTGTGCAGTGGGTACTGGAAGACAAATTCGTCAACGGCCGCCCGGCGTGGGAAAAGGTTGGCGTGCAGTTCACCGACGATGTGACACCCTATGAAGAGATGAAGATCGGCTTGCTCAACGGCAGCCACCTGGCCCTGACCTACCTGGGTTTTCTCAAGGGCTATCGGTTTGTGCACGAGACCATGAACGACCCGCTGTTCGTGGCCTACATGCGCGCCTACATGGACCTCGACGTCACGCCAAACCTCGCGCCGGTACCGGGCATCGACCTGACCGACTACAAGCAGACCCTGGTGGACCGCTTCTCCAACCAGGCGATTGCCGACCAGTTGGAACGGGTGTGTTCGGATGGCTCGTCGAAGTTTCCCAAGTTCACCGTGCCGACCATCAACCGCCTGATTGCCGACGGCCGTGAGACCGAGCGTGCAGCACTGGTCGTCGCGGCCTGGGCCTTGTATTTGAAGGGTGTGGATGAGAATGGCGTGAGCTACACAATCCCCGATCCGCGCGCCGAGTTCTGCCAGGGGCTGGTGAGTGACGATGCACTGATCAGCCAGCGGTTGCTGGCAGTGGAAGAGATTTTCGGTACGGCTATTCCCAACTCGCCTGAGTTTGTGGCAGCGTTCGAGCGGTGCTATGGGAGCCTGCGTGATAACGGCGTCACCACTACCCTGAAGCACCTCCTGAAGAAACCGGTTTAA(SEQ ID NO.1)；
并通过人工合成得到此序列；将此序列以及表达质粒pET28a经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后进行连接，得到重组质粒pET28a-pfcr，将重组质粒pET28a-pfcr转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr。
(2)将得到的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr涂布在含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子接种至5mL含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养16h，然后提取质粒进行单双酶切验证，得到转化成功的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr。
其中甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如下所示：MKLNKQNLTQLAPEVKLPAYTLADT RQGIAHIGVGGFHRAHQAYYTDALMNTGEGLDWSICGVGLRSEDRKARDDLAGQDYLFTLYELGDTDDTEVRVIGSISDMLLAEDSAQALIDKLASPEIRIVSLTITEGGYCIDDSNGEFMAHLPQIQHDLAHPSSPKTVFGFICAALTQRRAAGIPAFTVMSCDNLPHNGAVTRKALLAFAALHNAELHDWIKAHVSFPNAMVDRITPMTSTAHRLQLHDEHGIDDAWPVVCEPFVQWVLEDKFVNGRPAWEKVGVQFTDDVTPYEEMKIGLLNGSHLALTYLGFLKGYRFVHETMNDPLFVAYMRAYMDLDVTPNLAPVPGIDLTDYKQTLVDRFSNQAIADQLERVCSDGSSKFPKFTVPTINRLIADGRETERAALVVAAWALYLKGVDENGVSYTIPDPRAEFCQGLVSDDALISQRLLAVEEIFGTAIPNSPEFVAAFERCYGSLRDNGVTTTLKHLLKKPV(SEQ ID NO.2)。
实施例2：甘露醇脱氢酶的表达
具体步骤如下：
(1)将质粒pET28a转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a作为空白对照；
(2)挑取实施例1获得的E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr接种至10ml LB培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养12h，得到种子液。
(3)将种子液以1％的接种量接种至50ml发酵培养基中，于20℃，180rpm的条件下培养20h，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr的培养液；
(4)将培养液于4℃、8000rpm离心5min收集菌体，先用缓冲液洗涤菌体2次，再利用缓冲液将菌体重悬至5ml，然后用超声波细胞破碎仪破碎细胞，最后于10000rpm，4℃的条件下进行离心20min后取上清，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr的粗酶液，检测粗酶液中的甘露醇脱氢酶的酶活。
检测结果如下：培养重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr获得的粗酶液中的甘露醇脱氢酶酶活为0.5U/mL。
实施例3：甘露醇脱氢酶的酶学性质
具体步骤如下：
将实施例2得到的培养重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr获得的粗酶液经亲和层析柱纯化后，得到纯酶PFCR。
1、检测纯酶PFCR的比酶活
检测结果为：PFCR的比酶活是5U/mg。
2、检测温度对纯酶PFCR的影响
取0.1mg的纯酶PFCR加入到有1ml含有10g/L异麦芽酮糖的pH为6.5的100mM磷酸盐缓冲液中，放在不同温度的水浴锅中，其温度范围为20-50℃，梯度间隔为5℃，反应30分钟后，沸水浴10分钟终止酶促反应，离心取上清，经过适当稀释处理后，HPLC法测定上清液中的酶活。
检测结果：PFCR在30℃的条件下酶活最高，最适反应温度为30℃。
3、检测pH对纯酶PFCR的影响
参考2中的检测方法，采用1ml的反应体系，保持反应温度为30℃，将反应的缓冲液分别替换成不同pH的磷酸盐缓冲液(pH范围为4.5-8.5)、梯度间隔为0.5，然后加入PFCR反应30分钟，沸水浴10分钟终止酶促放液，离心取上清，经过适当稀释处理后，HPLC法测定上清液中的酶活。
检测结果：PFCR在pH为5-8的范围内酶活相对较高，其中，最适反应pH为6.5。
4、检测纯酶PFCR的异麦芽酮糖醇产率
取0.1mg的纯酶PFCR加入到有1ml含有10g/L异麦芽酮糖的pH为6.5的100mM磷酸盐缓冲液中，于30℃水浴锅中反应30分钟后，沸水浴10分钟终止酶促反应，离心取上清，经过适当稀释处理后，HPLC法测定上清液中的异麦芽酮糖醇产量。
检测结果：PFCR的异麦芽酮糖醇产率为7.8％。
实施例4：重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr的应用
将实施例1获得的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pfcr接种于1L发酵罐的发酵培养基的体系放大培养，发酵产酶结束后，将培养液于4℃、8000rpm离心5min，弃去上清并回收菌体；然后用浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次之后，再用缓冲液对菌体进行悬浮，向含100g/L底物异麦芽酮糖的0.1mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲液中添加洗涤后的菌体至缓冲液中菌体的浓度为OD600＝25，得到1L的转化体系；同时在30℃、180rpm条件下持续转化20h，便得到较高浓度异麦芽酮糖醇的转化反应液；整个转化过程中需通过加入氨水调节pH稳定在6.5。
检测反应液中异麦芽酮糖的异麦芽酮糖产率以及异麦芽酮糖时空产率，其中HPLC结果见图1。
检测结果为：利用此方法转化生产异麦芽酮糖醇20h，可将反应体系中100g/L的异麦芽酮糖转化为7.2g/L的异麦芽酮糖醇，异麦芽酮糖醇产率达7.2％、时空产率高达36mg/L·h。
实施例5：可表达来源于Pseudomonas fluorescens的甘露醇脱氢酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建
(1)将实施例1中的如SEQ ID NO.1所示的核酸序列以及表达质粒pHT01经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后进行连接，得到重组质粒pHT01-pfcr，将重组质粒pHT01-pfcr转化至枯芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168中，得到重组大肠杆菌(Bacillus subtilis)168/pHT01-pfcr。
(2)将得到的重组菌(Bacillus subtilis)168/pHT01-pfcr涂布在含有浓度为100μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子接种至5mL含有浓度为100μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养16h，然后提取质粒进行单双酶切验证，得到转化成功的重组菌(Bacillussubtilis)168/pHT01-pfcr。
实施例6：重组菌(Bacillus subtilis)168/pHT01-pfcr的应用
将实施例5获得的重组菌(Bacillus subtilis)168/pHT01-pfcr接种于1L发酵罐的发酵培养基的体系放大培养，发酵产酶结束后，将培养液于4℃、8000rpm离心5min，弃去上清并回收菌体；然后用浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次之后，再用缓冲液对菌体进行悬浮，向含100g/L底物异麦芽酮糖的0.1mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲液中添加洗涤后的菌体至缓冲液中菌体的浓度为OD600＝25，得到1L的转化体系；同时在30℃、180rpm条件下持续转化25h，便得到较高浓度异麦芽酮糖醇的转化反应液；整个转化过程中需通过加入氨水调节pH稳定在7。
检测反应液中异麦芽酮糖的异麦芽酮糖产率以及异麦芽酮糖时空产率。
检测结果为：利用此方法转化生产异麦芽酮糖醇20h，可将反应体系中100g/L的异麦芽酮糖转化为5.2g/L的异麦芽酮糖醇，异麦芽酮糖醇产率达5.2％、时空产率高达20.8mg/L·h。
可见，利用此方法制备异麦芽酮糖醇可行，为首次报道异麦芽酮糖醇的生物法或酶法合成，为工业化酶法生产异麦芽酮糖醇奠定了理论基础。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.甘露醇脱氢酶或其相关生物材料在(a1)～(a2)至少一种中的应用：
(a1)生产异麦芽酮糖醇；
(a2)制备生产异麦芽酮糖醇的产品；
所述甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述相关生物材料为下述(b1)～(b8)中的任一种；
(b1)编码权利要求1所述甘露醇脱氢酶的核酸分子；
(b2)含有(b1)所述核酸分子的表达盒；
(b3)含有(b1)所述核酸分子的重组载体；
(b4)含有(b2)所述表达盒的重组载体；
(b5)含有(b1)所述核酸分子的重组细胞；
(b6)含有(b2)所述表达盒的重组细胞；
(b7)含有(b3)所述重组载体的重组细胞；
(b8)含有(b4)所述重组载体的重组细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、链霉菌、毕赤酵母、酿酒酵母中的至少一种。
4.一种合成甘露醇脱氢酶的的制备方法，其特征在于，通过培养权利要求2所述的重组细胞获得甘露醇脱氢酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养的条件为：温度为20-40℃；和/或，时间为18-30h；和/或，转速为150-210rpm。
6.一种异麦芽酮糖醇的制备方法，其特征在于，包括将权利要求2所述的重组细胞加入含有异麦芽酮糖的反应体系中进行转化反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应体系的制备方法为使用含有异麦芽酮糖的缓冲液重悬上述细胞至细胞在缓冲液中的细胞浓度为OD600＝15-30，得反应体系。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述转化的条件为：温度为25-40℃；
和/或，pH为6.0-7.5；和/或，时间为20-30h；和/或，转速为150-210rpm。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述异麦芽酮糖在反应体系中的浓度为50-200g/L。
10.一种产品，所述产品包含权利要求1～3任一项所述的甘露醇脱氢酶或相关生物材料或权利要求4～5任一项所述方法制备的甘露醇脱氢酶；优选地，所述产品还包括异麦芽酮糖。
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| CN116987749A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-03 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用 |
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- 2023-08-04 CN CN202310985154.XA patent/CN116790523A/zh active Pending
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| CN116987749A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-03 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用 |
| CN116987749B (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-01 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种多酶级联反应催化蔗糖生产异麦芽酮糖醇的方法及其应用 |
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