CN111363759A

CN111363759A - 合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株

Info

Publication number: CN111363759A
Application number: CN202010069250.6A
Authority: CN
Inventors: 程海荣; 王楠; 池萍
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111363759B

Abstract

本发明公开了一种合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株。采用解脂耶氏酵母为合成底盘，通过代谢工程改良手段，对该酵母进行基因编辑，增强其合成赤藓糖醇的能力，阻断合成副产物的途径。所述酵母菌株为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica ery949‑4ΔCGMCC No.19351。以发酵初始浓度为50～350克/升的葡萄糖作为碳源，以发酵初始浓度为5～30克/升的氮源以及无机盐类为原料，高温灭菌，冷却后接入所述解脂耶氏酵母菌株，在有氧的条件下进行连续发酵或分批补料发酵；发酵结束后，从发酵液中提纯赤藓糖醇。该菌株能以葡萄糖等碳源为原料高效合成赤藓糖醇，不合成副产物(如甘露醇等)，不消耗利用赤藓糖醇。

Description

合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及一种合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株；更具体涉及以解脂耶氏酵母菌为底盘微生物，通过代谢工程、基因工程的手段来构建高效发酵合成赤藓糖醇的方法，利用该方法获得能以葡萄糖等碳源发酵合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌，以及利用该重组菌株来发酵合成赤藓糖醇的方法。

背景技术

赤藓糖醇(Erythritol)是一种自然存在的四元醇，在海藻以及真菌中常作为一种细胞内碳源储存物质，在一些水果如葡萄、瓜类与梨中均发现有赤藓糖醇的存在(Munro etal.Food Chem Toxicol.1988；36(12):1139-74.)。在10％浓度下，甜度为同等蔗糖浓度的70％。由于赤藓糖醇的零热量以及非龋齿性以及非发酵性，广泛用于食品的配料中，如发明专利EP0303295A2、EP0676147A1、EP0719094A1、WO2012013296A3、EP0726713A4等均描述了赤藓糖醇在食品中的应用。赤藓糖醇还可以与其它功能糖(醇)进行复配应用于食品中(US8227006B2、US7754268B2、US2012/0128852A1、US7579032B2、EP1057414B1)。除了在食品中的应用外，赤藓糖醇在其它领域也得到应用，如发明专利US20060062752A1、US20060067902A1描述了赤藓糖醇在化妆品中的应用。发明专利WO200704425A1与US6245820均描述了赤藓糖醇在药物开发中的应用。

由于赤藓糖醇良好的性质与功能，其应用也日益广泛，因此更好的开发高效合成赤藓糖醇的方法具有重要的意义。目前赤藓糖醇均通过生物发酵合成。主要以葡萄糖或者甘油为碳源，以酵母如小丛梗孢Moniliella sp.(Lin et al.Process Biochem.2010；45:973–979),丝孢酵母菌Trichosporon sp.(Park et al.J Gen Appl Microbiol.1998；86:577–580),出芽短梗霉Aureobasidium sp.(Ishizuka et al.J Ferment Bioeng.1989；68:310–314.),圆酵母菌Torula sp.(Oh et al.J Ind Microbiol Biotechnol.2001；26:248–252),筑波假酵母菌Pseudozyma tsukubaensis(Jeya et al.Appl MicrobiolBiotechnol.2009；83:225–231.)以及解脂耶氏酵母菌Yarrowia lipolytica发酵合成(Cheng et al,Microbial Cell Factories,2018,17:133；本发明人于2013年申请的中国发明专利CN201310282059.X)。上述微生物发酵葡萄糖合成赤藓糖醇存在转化率较低(低于60％)，副产物较多(含有2-3％甚至更多的副产物)，而且发酵后期能消耗赤藓糖醇等问题，使得后续赤藓糖醇的含量较低(一般少于每升150克)以及纯化得率较低(一般低于90％)。因此在现有合成赤藓糖醇的酵母菌的基础上，通过代谢工程与基因工程手段提高赤藓糖醇的合成效率，阻断副产物合成途径，以及阻断分解赤藓糖醇的途径非常必要。

目前我国合成赤藓糖醇的微生物主要为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica，图1显示该酵母由葡萄糖合成与分解赤藓糖醇，以及由葡萄糖合成副产物甘露醇与阿拉伯糖醇的途径：首先葡萄糖(Glucose)经过己糖激酶(HK)磷酸化成为6-磷酸葡萄糖(G-6-P)并进入细胞内，然后通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶以及6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化下转变为5-磷酸核酮糖(5-P-Ru)。5-磷酸核酮糖在阿拉伯糖醇脱氢酶作用下可以转变为阿拉伯糖醇副产物。5-磷酸核酮糖分别异构转变为5-磷酸核糖(5-P-R)以及5-磷酸木酮糖(5-P-Xylu)，再在转酮酶(TKL1)催化下转化为7-磷酸景天庚酮糖(Sep-7-P)与3-磷酸甘油醛(3-P-GA)，再在转醛酶作用下转变为6-磷酸果糖(F-6-P)与4-磷酸赤藓糖(Ery-4-P)。4-磷酸赤藓糖在磷酸酶(EryPase)作用下去磷酸化变为赤藓糖(Erythrose)，再在赤藓糖还原酶还原下转变为赤藓糖醇(Erythritol)。同时6-磷酸葡萄糖在磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化下转变为6-磷酸果糖，在磷酸化酶作用下转变为果糖，果糖在甘露醇脱氢酶催化下转变为副产物甘露醇。

上述解脂耶氏酵母中的合成赤藓糖醇的途径中，通过过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶以及6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶来提高赤藓糖醇的合成效率已经有报道(详见本发明人2018年发表的研究论文Cheng et al,Microbial Cell Factories,2018,17:133)。而赤藓糖醇的合成过程是多酶催化的，提高其它酶的表达对赤藓糖醇的合成效率可能也有促进作用，同时敲除副产物合成途径的基因以及敲除赤藓糖醇利用途径的基因，对于提高赤藓糖醇的合成效率会有进一步的促进作用。但并不是任意过表达或者敲除一个基因就能获得性能显著提高的菌株，有些基因虽然是合成途径的基因，但是过表达反而会导致合成性能的减低。本发明通过创造性劳动选择性的过表达合成赤藓糖醇的相关基因，并且有选择性的敲除合成副产物的基因，以及有选择性的敲除赤藓糖醇代谢途径的基因，来获得合成赤藓糖醇效率提高的新菌株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的由葡萄糖发酵合成赤藓糖醇的菌株的不足之处，提供一种高效合成赤藓糖醇的重组解脂且无副产物甘露醇或阿拉伯糖醇的工程菌株的方法，并采用该方法构建一株高效发酵合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工程菌株，以及采用该菌株直接发酵合成与纯化赤藓糖醇的方法。

本发明通过代谢工程、基因工程的手段，将原有的合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母进行改良，使得该酵母能够利用葡萄糖等碳源高效合成赤藓糖醇，且不合成副产物甘露醇或阿拉伯糖醇等；更具体来说，是以合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母为合成底盘，该酵母英文名为Yarrowia lipolytica，之前也称Candida lipolytica，根据翻译不同，中文名可以为：解脂耶氏酵母、解脂亚罗威酵母、亚罗威解脂酵母、解脂耶罗维亚酵母，本发明中使用的解脂酵母的中文名称可以为解脂耶氏酵母、解脂亚罗威酵母或解脂耶罗维亚酵母。

本发明通过代谢工程改良手段，对该解脂耶氏酵母进行基因操作，过表达合成赤藓糖醇的部分基因，阻断合成副产物的代谢途径，从而使得重组的解脂耶氏酵母能由葡萄糖、甘油等碳源，高效发酵合成赤藓糖醇，且无副产物。采用代谢工程的手段得到由葡萄糖等碳源发酵合成赤藓糖醇的工程菌株；并从构建的菌株中优选获得一株合成赤藓糖醇能力最高的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ery949-4ΔCGMCC No.19351。本发明还提供采用该菌株由葡萄糖发酵合成与纯化赤藓糖醇的方法。

本发明具体是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，是以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica，之前称为Candidalipolytica)为底盘微生物，通过代谢工程、基因工程的手段，构建以葡萄糖、甘油、淀粉中的一种或几种为碳源发酵高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法。该方法能提高其合成赤藓糖醇的能力，同时无副产物合成。

作为本发明的一个实施方案，本发明使用的底盘微生物解脂耶氏酵母，可以是基因组中含有与SEQ ID No.1序列具有97％及以上同源性或相似性的DNA序列，且能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌株，如Yarrowia lipolytica CGMCC 7326(Huiling Cheng etal.Identification,characterization of two NADPH-dependent erythrosereductases in the yeast Yarrowia lipolytica and improvement of erythritolproductivity using metabolic engineering.Microbial Cell Factories,2018,17:133.)以及Yarrowia lipolytica ery929 CGMCC No.18478。

方案一、本发明的构建能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，包括在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中表达以下基因的一种或一种以上(使其获得相应的功能)：

(1)编码己糖激酶的基因；(过表达能提高葡萄糖进入细胞的速率)

(2)编码转酮酶的基因；(过表达提高合成赤藓糖醇的前体的能力)

(3)编码转醛酶的基因；(过表达提高合成赤藓糖醇的前体的能力)

(4)编码4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶的基因；(过表达提高合成赤藓糖醇的前体的能力)。

方案二、本发明的构建能合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，包括在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中敲除破坏其自身的以下基因中的一种或一种以上(使得解脂耶氏酵母失去相应的功能)：

(1)6-磷酸葡萄糖异构酶(6-P glucose isomerase,PGI)基因；(敲除破坏该基因，能提高葡萄糖进入磷酸戊糖途径的流量)

(2)甘露醇脱氢酶(mannitol dehydrogenase，MDH)基因；(敲除破坏甘露醇脱氢酶基因，使得重组菌株失去合成甘露醇的能力，从而提高赤藓糖醇的合成效率)

(3)阿拉伯糖醇脱氢酶(arabitol dehydrogenase，ArDH)基因；(敲除破坏阿拉伯糖醇脱氢酶基因，使得重组菌株失去合成阿拉伯糖醇的能力，从而提高赤藓糖醇的合成效率)

(4)赤藓糖醇脱氢酶(erythritol dehydrogenase)基因；(敲除该基因，使得酵母不能再利用分解赤藓糖醇，从而能积累更多的赤藓糖醇)

方案三、本发明的构建能合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，包括在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中表达以下基因的一种或一种以上：

(1)编码己糖激酶(Hexokinase，HK)的基因；

(2)编码转酮酶(Transketolase,TKL1)的基因；

(3)编码转醛酶(Transaldolase,TAL)的基因；

(4)编码4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶(Erythrose 4-P phosphatase,EryPase)的基因；

同时，敲除破坏其自身的以下基因中的一种或一种以上：

(1)6-磷酸葡萄糖异构酶基因(6-P glucose isomerase,PGI)；

(2)甘露醇脱氢酶基因(mannitol dehydrogenase，MDH)；

(3)阿拉伯糖醇脱氢酶基因(arabitol dehydrogenase，ArDH)；

(4)赤藓糖醇脱氢酶基因(erythritol dehydrogenase,eryPase)。

具体而言，以代谢工程、基因工程的手段，将解脂耶氏酵母进行改良，使得重组解脂耶氏酵母能够更好的利用葡萄糖高效地合成赤藓糖醇，是通过以下方法实现的：

(1)使用解脂耶氏酵母作为底盘，包括以上所述的本发明人构建的Yarrowialipolytica ery929 CGMCC No.18478，CGMCC No.7326等在内的任何能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母或解脂假丝酵母菌株都属于本发明使用的底盘范围。本发明使用的底盘解脂耶氏酵母菌株，特征之一是其基因组中含有与SEQ ID No.1序列具有97％及以上同源性或相似性的DNA序列。

(2)按照解脂耶氏酵母密码子偏好性优化合成己糖激酶基因(hexokinase,HK)，并在解脂耶氏酵母细胞中表达。

己糖激酶基因来自但不限于以下微生物：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeS288C NC_001144Hexokinase gene，SEQ ID NO.2)、树干毕赤酵母(Scheffersomycesstipitis CBS6054hexokinase，也称为Pichia stiptis，SEQ ID NO.3)、鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii hexokinase gene，SEQ ID NO.4)、球拟假丝酵母(Candida]glabrata hexokinase，SEQ ID NO.5)、或解脂耶氏酵母本身的己糖激酶基因(Yarrowialipolytica mRNAfor hexokinase，SEQ ID NO.6)。优选地，使用酿酒酵母、树干毕赤酵母、与解脂耶氏酵母的己糖激酶基因。更有选地，使用解脂酵母本身的己糖激酶基因。

(3)在解脂耶氏酵母细胞中表达己糖激酶基因的同时，还可以表达转酮酶基因。

转酮酶基因按照解脂耶氏酵母的密码子偏好性进行优化合成，表达的酶能将磷酸戊糖途径中间产物进行转酮反应，产生更多的赤藓糖醇合成前体4-磷酸赤藓糖。转酮酶基因来自但不限于以下微生物：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C-TKL1-2043bp，SEQ ID NO.7)、木兰假丝酵母(Candida magnoliae transketolase(cmTKL1)gene-2088bp，SEQ ID NO.8)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis CBS 6054TKL1 gene seq-2034bp，也称为Pichia stiptis，SEQ ID NO.9)，或解脂耶氏酵母本身的转酮酶基因(Yarrowia lipolytica Transketolase gene，SEQ ID NO.10)。优选地，使用酿酒酵母、树干毕赤酵母、与解脂耶氏酵母的转酮酶基因。更有选地，使用解脂酵母本身的转酮酶基因。

(4)在解脂耶氏酵母细胞中还可以表达编码产物具有转醛酶活性的基因(Transaldolase gene)。

转醛酶能够将7-磷酸景天庚酮糖与3-磷酸甘油醛转化为6-磷酸果糖与4-磷酸赤藓糖，后者去磷酸化为赤藓糖再被还原为赤藓糖醇。因此，在解脂耶氏酵母中增强转醛酶的活性能提高细胞内4-磷酸赤藓糖的水平，进而提高赤藓糖醇的转化水平。这些基因按照解脂耶氏酵母的密码子偏好性进行优化合成。该基因来自但不限于以下微生物：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica TAL gene，SEQ ID No.11)、法夫驹形氏酵母(Komagataellaphaffii GS115 Transaldolase，SEQ ID No.12)，汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii TAL，SEQ ID No.13)，热带假丝酵母(Candida tropicalis TAL，SEQ ID No.14)，树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis TAL，SEQ ID No.15)，。优选的，使用树干毕赤酵母，热带假丝酵母，解脂耶氏酵母。更优选地使用来自解脂耶氏酵母的转醛酶基因。

(5)在解脂耶氏酵母细胞中还可以表达4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因(4-Perythrose phosphatase gene,eryPase)。

4-磷酸赤藓糖磷酸化酶负责将4-磷酸赤藓糖去磷酸化成赤藓糖，后者被赤藓糖还原酶还原成赤藓糖醇，因此过表达该酶基因有可能提高赤藓糖醇合成前体。这些基因按照解脂耶氏酵母的密码子偏好性进行优化合成。基因来自但不限于以下微生物：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，SEQ ID No.16)，海栖热袍菌(Thermotoga maritima，SEQ IDNo.17)，埃希氏杆菌(Escherichia coli str.K-12sugar phosphatase，Sugarphosphatase YbiV,SEQ ID No.18)，还可以来自解脂耶氏酵母本身的磷酸化酶基因(Yarrowia lipolytica YALI0E35222g,SEQ ID No.19)。优选地，使用酿酒酵母、埃希氏杆菌、或解脂耶氏酵母本身的基因。更优选地，使用埃希氏杆菌、或解脂耶氏酵母本身的磷酸化酶基因。最优选地，使用埃希氏杆菌的磷酸化酶基因。

上述与赤藓糖醇合成相关的部分基因是通过以下方式在解脂耶氏酵母中过表达的，这些方式仅是作为示例来说明目的基因是如何整合在解脂耶氏酵母细胞中，而不是对本发明的限定。

(1)基因的优化合成与克隆。

按照解脂耶氏酵母密码子的偏好性优化合成上述需要表达的基因，并体外合成整合表达框。整合表达载体含有同源整合臂序列(包括左右两段)、启动子序列、终止子序列、筛选标记序列等必要的DNA元件。本发明中同源整合臂序列是一段来自解脂耶氏酵母基因组中的DNA序列，能够将左右同源臂之间的DNA序列通过同源双交换重组的方法插入到基因组中的同源DNA序列之间。启动子是一段能够诱发启动其下游基因转录的DNA序列，该序列可以是人工合成的启动子序列如UAS1B8、UAS1B16、hp4d等启动子序列(Blazeck etal.2013.Generalizing a hybrid synthetic promoter approach in Yarrowialipolytica.Appl Microbiol Biotechnol,97:3037-3052.)，也可以是来自解脂耶氏酵母本身基因的启动子序列如赤藓糖还原酶基因启动子序列、3-磷酸甘油脱氢酶基因的启动子序列等。终止子是一段能够终止其上游基因继续转录的DNA序列。筛选标记序列是指抗生素抗性基因如氨苄青霉素抗性基因等，或者营养选择型基因如蔗糖酶基因(Suc2，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用蔗糖)、木糖醇脱氢酶基因(XDH，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用木糖醇)、尿嘧啶核苷酸合成酶基因3(URA3，编码产物使得ura3缺陷型的解脂耶氏酵母能在不含尿嘧啶的基本培养基上生长)等。典型的整合表达质粒载体的示意图如图2所示：质粒含有左右同源整合臂序列、启动子序列、目的基因序列、终止子序列、解脂耶氏酵母筛选标记序列等必要的DNA元件。上述必要的DNA元件，除了本发明采用的上述目的基因序列(如解脂酵母本身的转酮酶基因、转醛酶基因等)外，其余均能在公共数据库中获取(如数据库：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

(2)含目的基因整合表达载体的转化。

将合成的整合表达载体转化解脂耶氏酵母(转化方法参考本发明人程海荣发表的论文：Journal of Functional Foods,2017,32：208～217)，在含筛选标记的培养基中筛选。若整合表达载体上含有蔗糖酶筛选标记，转化后则将酵母涂布在含蔗糖的YNB基本培养基上筛选(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)。若整合表达载体上含有潮霉素抗性基因筛选标记，转化后则将酵母涂布在含潮霉素的YPD培养基上筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)。提取转化子的基因组，用目的基因上的一对引物扩增，若能扩出相应大小的条带并且测序正确，说明目的基因已经整合到解脂耶氏酵母基因组中。接着采用Cre/loxP系统回收转化子中的筛选标记(原理参考文献：J.Microbiol.Methods,2003,55,727–737)，具体回收筛选方法详见实施例。第一种目的基因整合到基因组中，筛选标记回收后获得的工程菌株即可以作为宿主，继续转化第二种目的基因。验证第二种目的基因的整合、筛选标记的回收后获得的新的工程菌株又可以作为宿主用于转化其它的目的基因，依次操作，直到将全部目的基因整合到基因组中，并去除筛选标记基因。最终获得含有上述与赤藓糖醇合成相关基因的解脂耶氏酵母，过表达以下四种基因：

(1)己糖激酶基因；

(2)转酮酶基因；

(3)转醛酶基因；

(4)4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因。

进一步的，以代谢工程、基因工程的手段，将解脂耶氏酵母进行进一步改良，使得重组解脂耶氏酵母能够利用葡萄糖更高效地合成赤藓糖醇，除了在解脂耶氏酵母中表达上述基因外，还敲除以下基因，阻断或减少旁路副产物合成，使得合成赤藓糖醇的效果更显著。

(1)6-磷酸葡萄糖异构酶基因的敲除。

以酿酒酵母的6-磷酸葡萄糖异构酶序列为模板，与解脂酵母的蛋白质组序列对比，获得解脂酵母的6-磷酸葡萄糖异构酶基因序列(SEQ ID No.20)

(2)甘露醇脱氢酶基因(mannitol dehydrogenase gene，YlMDH)的敲除。

通过蛋白质序列对比，发明人在解脂耶氏酵母基因组中挖掘了甘露醇脱氢酶基因YlMDH(SEQ ID No.21)。经过原核蛋白表达活性测定，甘露醇脱氢酶能以果糖为底物合成甘露醇，而甘露醇与赤藓糖醇竞争底物葡萄糖，因此敲除甘露醇脱氢酶基因理论上能提高赤藓糖醇的合成得率。

(3)阿拉伯糖醇脱氢酶基因(Arabitol dehydrogenase gene,YlArDH)的敲除。

通过蛋白质序列对比，发明人在解脂耶氏酵母基因组中挖掘了阿拉伯糖醇脱氢酶基因YlArDH(SEQ ID No.22)。经过原核蛋白表达活性测定，阿拉伯糖醇脱氢酶均能以木酮糖为底物合成阿拉伯糖醇。而阿拉伯糖醇与赤藓糖醇合成的起始原料均为葡萄糖，因此敲除阿拉伯糖醇脱氢酶基因理论上能提高合成赤藓糖醇的得率。

(4)赤藓糖醇脱氢酶(erythritol dehydrogenase，YlEYD)的敲除。

现有的能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母除了能合成赤藓糖醇外，还能分解利用赤藓糖醇，尤其是发酵后期当葡萄糖浓度比较低的时候(如发明人之前获得的能合成赤藓糖醇的CGMCC No.7326与CGMCC No.18478菌株，如发酵后期当葡萄糖浓度低于30克/升时，不但不能合成赤藓糖醇，还会利用赤藓糖醇。因此，为了阻断赤藓糖醇的分解利用，就需要敲除赤藓糖醇脱氢酶基因，使得工程菌不能再利用赤藓糖醇。敲除赤藓糖醇脱氢酶另一个有益之处，是发酵后期能够进行补料葡萄糖，使得赤藓糖醇的浓度进一步提升，减少蒸发水的量，节约成本。而未敲除该基因的野生菌株不适宜后期补料，因为后期会消耗赤藓糖醇。经过基因组挖掘，在解脂耶氏酵母基因组中获得赤藓糖醇脱氢酶基因(SEQ ID No.23)。

上述与副产物合成相关的部分基因是通过以下方式在解脂耶氏酵母中敲除的，这些方式仅作为示例来说明上述基因是如何在解脂耶氏酵母细胞中被敲除的，而不是对本发明的限定。

分别克隆待敲除基因的上下游各1.2-1.5kb序列，二者进行融合，上下游之间插入筛选标记基因(如潮霉素抗性基因等)，标记基因两侧分别含有loxP序列，以便回收筛选标记重新利用，便于敲除下一个基因。还可以分别克隆待敲除基因的5’端与3’端400bp的DNA序列，二者进行融合，中间插入筛选标记基因，标记基因两侧分别含有loxP序列，以便回收筛选标记重新利用，便于敲除下一个基因。还可以体外直接合成待敲除基因的敲除框。具体在实施例加以说明。

第二方面，本发明还涉及一种采用上述构建能合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母的方法，获得的能由葡萄糖等碳源高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株，获得的菌株不再合成副产物(如甘露醇等)。

通过上述分子生物学的操作，获得一系列解脂耶氏酵母的突变株，其中包括过表达己糖激酶基因、转酮酶基因、转醛酶基因、4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因，同时又敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因、甘露醇脱氢酶基因、阿拉伯糖醇脱氢酶基因，赤藓糖醇脱氢酶基因的菌株。

第三方面，本发明提供一株能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ery949-4Δ(具体实施方式中记为ery949ΔPGIΔMDHΔArDHΔEYD)CGMCC No.19351。该菌株是对采用本发明的方法构建获得的一株合成赤藓糖醇产量最高同时又不合成副产物，不利用赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌株。

第四方面，本发明还涉及利用能合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株发酵合成赤藓糖醇的方法；所述方法包括如下步骤：

S1、将所述重组解脂耶氏酵母菌株，如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ery949-4ΔCGMCC No.19351菌株培养于含碳源、氮源、无机盐、氨基酸以及水的培养基中，在起始pH值3.0～7.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌发酵培养，发酵结束后菌液分离得到含赤藓糖醇的发酵液以及酵母细胞；

S2、从所述含赤藓糖醇的发酵液以及酵母细胞中分离纯化得到赤藓糖醇。

上述步骤S1中，发酵培养时，每隔一段时间取样检测底物碳源的剩余量与产物赤藓糖醇的生成量，当底物碳源利用完毕后结束发酵。

上述步骤S1中，所述培养基中的碳源可以为葡萄糖、果糖、甘油、淀粉中的一种或几种，所述碳源用量为50～350克/升。

上述步骤S1中，所述培养基中的氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、磷酸氢二铵、柠檬酸铵、氨基酸中的一种或几种的混合。所述培养基中氮源含量可以为5～30克/升。

上述步骤S1中，所述培养基中的无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜、氯化锌中的一种或一种以上。所述培养基中无机盐含量可以为0～1克/升。优选为0.1～0.5克/升。

上述步骤S2中，所述分离纯化包括：菌液分离得到澄清含赤藓糖醇的发酵液、浓缩得到富含赤藓糖醇浓缩液、一次结晶得到赤藓糖醇粗制品、粗品重溶、离子交换去除离子、脱色、浓缩、二次结晶得到赤藓糖醇精制品、干燥。

所述菌液分离为：发酵液离心或者膜过滤分离去除菌体，菌体加入水漂洗两次以充分回收其中的赤藓糖醇，得到澄清含赤藓糖醇的发酵液。

综上，为了进一步优化由葡萄糖等合成赤藓糖醇的途径，本发明选择磷酸戊糖途径效率较高的解脂耶氏酵母菌株作为出发菌株。本发明提供一种通过代谢工程、基因工程的手段，在解脂耶氏酵母中敲除与副产物合成的相关基因，表达与赤藓糖醇合成的相关基因，构建能由葡萄糖等碳源更高效发酵合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，得到一株合成赤藓糖醇产量与得率最高的菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ery949-4ΔCGMCC No.19351，以及采用该菌株由葡萄糖等碳源发酵合成与纯化赤藓糖醇的方法。

本发明的解脂耶罗维亚酵母菌株(Yarrowia lipolytica)ery929，已经于2019年9月10日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18478。

本发明的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ery949-4Δ，已经于2020年1月14日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19351。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)由葡萄糖合成赤藓糖醇的合成效率更高。由于敲除了PGI基因，葡萄糖不能经过糖酵解途径被消耗，补充低价值的甘油进入三羧酸循环维持细胞生长，因此更多的葡萄糖进入磷酸戊糖途径合成赤藓糖醇。同时过表达了合成赤藓糖醇的其它基因(转酮酶基因等)，新菌株合成赤藓糖醇的效率更高。

2)不合成副产物(如甘露醇等)。由于敲除了合成副产物的基因，新菌株不合成副产物，赤藓糖醇在发酵液中的纯度更高，有利于分离提取。由于不合成副产物，更多的葡萄糖流向产物赤藓糖醇的合成。

3)由于敲除了赤藓糖醇脱氢酶基因，不利用赤藓糖醇，有利于赤藓糖醇在发酵液中的积累，还有利于后期补料发酵，以进一步提高发酵液中赤藓糖醇的浓度，降低浓缩倍数，节约能源成本。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为酵母合成赤藓糖醇与副产物甘露醇、阿拉伯糖醇以及分解赤藓糖醇的途径；

图2为己糖激酶过表达DNA元件组合(表达框)示意图；

图3为基因过表达的4种基因表达分析；A-D分别为己糖激酶、转酮酶、转醛酶以及4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因的相对表达。

图4为转酮酶过表达DNA元件组合(表达框)示意图；

图5为转醛酶基因过表达DNA元件组合(表达框)示意图；

图6为4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因过表达DNA元件组合(表达框)示意图；

图7为6-磷酸葡萄糖异构酶基因敲除框元件示意图；

图8为四种基因敲除的PCR验证；lane1、3、5、7分别为PGI、ArDH、MDH、EYD基因被敲除的转化子PCR扩增，无扩增；lane2、4、6、8分别为对照菌株扩PGI、ArDH、MDH、EYD基因，能扩出。

图9为阿拉伯糖醇脱氢酶基因敲除框元件示意图；

图10为甘露醇脱氢酶基因敲除框元件示意图；

图11为赤藓糖醇脱氢酶基因敲除框元件示意图；

图12为赤藓糖醇脱氢酶基因敲除后菌株利用赤藓糖醇的色谱图比较；其中，A、B、C分别为未敲除的对照菌在含赤藓糖醇的培养基中培养不同时间后的色谱图；D、E、F分别为敲除赤藓糖醇脱氢酶基因后的菌株在含赤藓糖醇的培养基中培养不同时间后的色谱图；可见，A、B、C中随着发酵时间延长，明显可见赤藓糖醇的含量越来越少，最后完全被利用，而敲除赤藓糖醇脱氢酶基因后的菌株则不利用赤藓糖醇(D、E、F)，峰高均为25±1。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、在解脂耶氏酵母中过表达己糖激酶基因

按照如下顺序合成己糖激酶表达框：上游26S rDNA序列→启动子(hp4d)→己糖激酶基因序列→己糖激酶终止子序列→loxP→启动子(TEF)→木糖醇脱氢酶基因序列→终止子序列→loxP→下游26S rDNA序列。合成的含己糖激酶的表达框的序列为SEQ ID No.24。

构建的含己糖激酶基因的整合表达框中DNA元件示意图如图2所示，其中的己糖激酶基因可以来自酿酒酵母、树干毕赤酵母、鲁氏结合酵母、球拟假丝酵母、或解脂耶氏酵母本身的己糖激酶基因，此处选取解脂耶氏酵母本身的己糖激酶基因(SEQ ID No.6)。筛选标记可以用营养缺陷型标记如ura3基因代替，也可以用蔗糖酶Suc2基因。用该载体转化合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母(发明人之前获得的Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326等)，在含木糖醇的培养基上筛选。筛选培养基的成分为：酵母氮碱10克/升，硫酸铵5克/升，木糖醇20克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0。由于解脂耶氏酵母本身不能利用木糖醇，因此在含木糖醇的培养基中能生长的转化子就含有木糖醇脱氢酶基因，从而能生长，同时还含有己糖激酶基因。

然后将含有Cre重组酶的质粒pUB4-CRE(来自公开发表的文献：Fickers etal.2003.New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescuein the yeast Yarrowia lipolytica.J.Microbiol.Methods,55,727–737)转化表达己糖激酶的突变体，在含有潮霉素为选择标记的YPD琼脂培养基中筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)。长出的转化子转接在含有木糖醇的基本培养基中(酵母氮碱10克/升，硫酸铵5克/升，木糖醇10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)，选择木糖醇脱氢酶基因丢失的突变体(即不能再利用木糖醇)。然后在不含潮霉素的液体YPD培养基中培养不能利用木糖醇的突变体，再梯度稀释涂布在不含潮霉素的固体YPD培养基上，从长出的转化子中挑取转接在含有潮霉素的YPD琼脂培养基中，选择不能再抗潮霉素的突变体，即为过表达己糖激酶酶基因，同时筛选标记木糖醇脱氢酶基因也丢失的突变体，可用于过表达其它基因的宿主。按照南京诺唯赞生物科技有限公司的荧光定量检测试剂盒说明书进行提取总RNA、反转录以及荧光定量检测(产品货号Q711-02/03，试剂盒名称为ChamQ TM Universal

qPCR Master Mix)。提取该突变体的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR(qPCR)，检测己糖激酶基因的表达水平，与对照菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326相比，发现突变株的己糖激酶基因的mRNA的表达水平比对照菌株要高3.2倍(图3A)，说明己糖激酶酶基因在突变株中得到表达。将过表达己糖激酶基因同时筛选标记又丢失的转化子标记为ery::HK。

将上述过表达己糖激酶基因，同时木糖醇脱氢酶酶基因也丢失的突变体接种在发酵培养基中，合成赤藓糖醇的试验，与对比菌株(CGMCC No.7326)对比。发酵培养基的成分为：一水葡萄糖350克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锌0.05克/升，氯化锰0.01克/升，七水硫酸镁0.1克/升，pH6.0，灭菌。在3升发酵罐中进行发酵，含1.5升发酵培养基，温度30度，搅拌500转每分钟，通气。定时取样检测，发现突变株ery::HK在80小时时葡萄糖利用完全，赤藓糖醇156.5±5.5克/升，甘露醇13.5±1.5克/升，赤藓糖醇的合成效率为1.9克/升·小时。若将酿酒酵母的己糖激酶基因代替上述来自解脂酵母的己糖激酶基因，转化解脂酵母菌株，发酵试验结果为，赤藓糖醇含量为153.5±4.5克/升，甘露醇11±1.5克/升，赤藓糖醇的合成效率为1.9克/升·小时。而对照菌株Y.lipolytica CGMCCNo.7326需要在95小时将葡萄糖消耗完，合成的赤藓糖醇的量为153±4.5克/升，赤藓糖醇的合成效率为1.6克/升·小时。由发酵结果可以看出，仅过表达己糖激酶基因，解脂耶氏酵母合成赤藓糖醇的合成效率即能有所提高。

实施例2、在解脂耶氏酵母中过表达转酮酶基因

以转酮酶基因替换实施例1中的己糖激酶基因，其余DNA元件可以保持不变，也可以相应的变化，如启动子序列可以采用其它启动子序列，如甘油脱氢酶基因启动子序列等。筛选标记木糖醇脱氢酶基因也可以采用蔗糖水解酶基因等。合成的含转酮酶基因的表达框的序列为SEQ ID No.25.

构建的含转酮酶基因的整合表达框中DNA元件示意图如图4所示，转酮酶基因来自但不限于以下微生物：酿酒酵母、木兰假丝酵母、树干毕赤酵母，或解脂耶氏酵母本身的转酮酶基因。此处使用解脂耶氏酵母本身的转酮酶基因TKL1(SEQ ID No.10)。DNA转化、转化子菌株筛选以及筛选标记的回收利用的方法同实施例1。所用的底盘菌株可以是实施例1中获得的含过表达己糖激酶基因的转化子ery::HK，也可以是其它能合成赤藓糖醇的菌株(如发明人之前获得的专利菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326等)。在过表达己糖激酶基因的基础上过表达转酮酶基因的转化子标记为ery::HK::TKL1，将仅过表达转酮酶基因的转化子标记为ery::TKL1。因，同时筛选标记木糖醇脱氢酶基因也丢失的突变体，可用于过表达其它基因的宿主。按照南京诺唯赞生物科技有限公司的荧光定量检测试剂盒说明书进行提取总RNA、反转录以及荧光定量检测(产品货号Q711-02/03，试剂盒名称为ChamQ TMUniversal

qPCR Master Mix)。提取过表达转酮酶基因的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR(qPCR)，检测转酮酶基因的表达水平，与对照菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326相比，发现突变株的转酮酶基因的mRNA的表达水平比对照菌株要高4.3倍(图3B)，说明转酮酶基因在突变株中得到表达。

将获得的过表达转酮酶基因的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。不同转化子发酵合成赤藓糖醇与副产物的效果如下表1：

表1

由上表可见，和对比菌株相比，同时过表达己糖激酶与转酮酶基因能够提高赤藓糖醇的合成效率。

实施例3、在解脂耶氏酵母中过表达转醛酶基因

合成含转醛酶基因的表达框，其序列为SEQ ID No.26。构建的含转醛酶基因的整合表达框中DNA元件示意图如图5所示。转醛酶基因来自但不限于以下微生物：树干毕赤酵母，热带假丝酵母，Komagataella phaffii酵母，汉逊德巴利酵母，解脂耶氏酵母。此处使用解脂耶氏酵母本身的转醛酶基因TAL(SEQ ID No.11)。DNA转化、转化子菌株筛选以及筛选标记的回收利用的方法同实施例1。所用的底盘菌株可以是实施例2中获得的含过表达己糖激酶基因的转化子ery::HK::TKL1，也可以是其它能合成赤藓糖醇的菌株(如发明人之前获得的专利菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326等)。在过表达己糖激酶基因与转酮酶基因的基础上过表达转醛酶基因的转化子标记为ery::HK::TKL1::TAL，将仅过表达转酮酶基因的转化子标记为ery::TAL。按照南京诺唯赞生物科技有限公司的荧光定量检测试剂盒说明书进行提取总RNA、反转录以及荧光定量检测(产品货号Q711-02/03，试剂盒名称为ChamQ TM Universal

qPCR Master Mix)。提取过表达转醛酶基因的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR(qPCR)，检测转醛酶基因的表达水平，与对照菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326相比，发现突变株的转醛酶基因的mRNA的表达水平比对照菌株要高3.3倍(图3C)，说明转醛酶基因在突变株中得到表达。

将获得的过表达转醛酶基因的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。合成赤藓糖醇与副产物的效果如下表2：

表2

由上表可见，和对比菌株相比，同时过表达己糖激酶、转酮酶与转醛酶基因能够提高赤藓糖醇的合成效率。

实施例4、在解脂耶氏酵母中过表达4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因

合成含4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因的表达框，其序列为SEQ ID No.27。构建的含4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因的整合表达框的DNA元件示意图如图6所示。此处使用埃希氏杆菌的磷酸化酶基因，并按照解脂耶氏酵母密码子偏好性合成。DNA转化、转化子菌株筛选以及筛选标记的回收利用的方法同实施例1。所用的底盘菌株可以是实施例3中获得的转化子ery::HK::TKL1::TAL，也可以是其它能合成赤藓糖醇的菌株(如发明人之前获得的专利菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326等)。在过表达己糖激酶基因、转酮酶基因以及转醛酶基因的基础上过表达4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因，获得的转化子标记为ery::HK::TKL1::TAL::EryPase，将仅过表达4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因的转化子标记为ery::EryPase。按照南京诺唯赞生物科技有限公司的荧光定量检测试剂盒说明书进行提取总RNA、反转录以及荧光定量检测(产品货号Q711-02/03，试剂盒名称为ChamQ TM Universal

qPCR Master Mix)。提取过表达4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR(qPCR)，检测4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因的表达水平，与对照菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326相比，发现突变株的4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因的mRNA的表达水平比对照菌株要高3.7倍(图3D)，说明4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因在突变株中得到表达。

将获得的过表达4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。合成赤藓糖醇与副产物的效果如下表3：

表3

由上表可见，和对比菌株相比，同时过表达己糖激酶、转酮酶、转醛酶与4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因能够提高赤藓糖醇的合成效率。为了方便书写，将同时过表达己糖激酶、转酮酶、转醛酶与4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因的解脂耶氏酵母标记为ery949。

实施例5、在解脂耶氏酵母中敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因

合成6-磷酸葡萄糖异构酶基因的敲除框，其序列为SEQ ID No.28。6-磷酸葡萄糖异构酶基因的敲除框的DNA元件示意图如图7所示。DNA转化、转化子菌株筛选以及筛选标记的回收利用的方法同实施例1。所用的底盘菌株可以是实施例4中获得的转化子ery::HK::TKL1::TAL::EryPase(ery949)，也可以是其它能合成赤藓糖醇的菌株(如发明人之前获得的专利菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326等)。在过表达己糖激酶基因(HK)、转酮酶基因(TKL1)、转醛酶基因(TAL)以及4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因(EryPase)的基础上敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因(PGI)，获得的转化子标记为ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI(ery949△PGI)，将仅敲除PGI基因的转化子标记为ery△PGI。敲除了PGI基因的转化子用来自其本身基因的一对引物扩增，理论上应该不能扩出来，而对照能扩出来。提取其基因组，进行PCR反应，结果如图8所示。图8中1为PGI敲除的突变株，不能扩出PGI基因，而对照菌能扩出(图8中2)，说明PGI基因被敲除了。

将获得的6-磷酸葡萄糖异构酶基因被敲除的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。但是另外补加15克/升的甘油。合成赤藓糖醇与副产物的效果如下表4：

表4

由上表可见，和对比菌株相比，同时过表达己糖激酶、转酮酶、转醛酶与4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶基因，敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因能够进一步提高赤藓糖醇的合成效率。

实施例6、在解脂耶氏酵母中敲除阿拉伯糖醇脱氢酶基因

合成阿拉伯糖醇脱氢酶基因的敲除框，其序列为SEQ ID No.30。阿拉伯糖醇脱氢酶基因的敲除框的DNA元件示意图如图9所示。DNA转化、转化子菌株筛选以及筛选标记的回收利用的方法同实施例1。所用的底盘菌株可以是实施例5中获得的转化子ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI(ery949△PGI)，也可以是其它能合成赤藓糖醇的菌株(如发明人之前获得的专利菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326等)。在过表达己糖激酶基因(HK)、转酮酶基因(TKL1)、转醛酶基因(TAL)，4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因(EryPase)以及敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因(PGI)的基础上进一步敲除阿拉伯糖醇脱氢酶基因，获得的转化子标记为ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI△ArDH(ery949△PGI△ArDH)，将仅敲除ArDH基因的转化子标记为ery△ArDH。提取ArDH基因被敲除的转化子提取基因组，用来自ArDH基因的一对引物进行PCR扩增，若该基因被敲除则不能被扩增出来，而对照能被扩增出来。结果如图8所示。图8中3为ArDH基因被敲除的转化子，不能扩出相应大小的片段，而对照菌能扩出(图8中4)，说明ArDH基因被敲除了。

将获得的阿拉伯糖醇脱氢酶基因被敲除的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。但是另外补加15克/升的甘油。合成赤藓糖醇与副产物的效果如下表5：

表5

由上表可见，和对比菌株相比，敲除阿拉伯糖醇脱氢酶基因对提高赤藓糖醇的合成效率不明显，但能在一定程度上减少副产物的含量。

实施例7、在解脂耶氏酵母中敲除甘露醇脱氢酶基因

合成甘露醇脱氢酶基因的敲除框，其序列为SEQ ID No.29。甘露醇脱氢酶基因的敲除框的DNA元件示意图如图10所示。DNA转化、转化子菌株筛选以及筛选标记的回收利用的方法同实施例1。所用的底盘菌株可以是实施例6中获得的转化子ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI△ArDH(ery949△PGI△ArDH)，也可以是其它能合成赤藓糖醇的菌株(如发明人之前获得的专利菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326等)。在过表达己糖激酶基因(HK)、转酮酶基因(TKL1)、转醛酶基因(TAL)，4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因(EryPase)以及敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因(PGI)与ArDH基因的基础上进一步敲除甘露醇脱氢酶基因，获得的转化子标记为ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI△ArDH△MDH(ery949△PGI△ArDH△MDH)，将仅敲除MDH基因的转化子标记为ery△MDH。提取MDH基因被敲除的转化子提取基因组，用来自MDH基因的一对引物进行PCR扩增，若该基因被敲除则不能被扩增出来，而对照能被扩增出来。结果如图8所示。图8中5为MDH基因被敲除的转化子，不能扩出相应大小的片段，而对照菌能扩出(图8中6)，说明MDH基因被敲除了。

将获得的甘露醇脱氢酶基因被敲除的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1。但是另外补加15克/升的甘油。合成赤藓糖醇与副产物的效果如下表6：

表6

由上表可见，和对比菌株相比，敲除甘露醇脱氢酶基因能够进一步提高赤藓糖醇的合成效率。敲除甘露醇脱氢酶基因后，发酵液中通过液相色谱能明显检测到的多元醇副产物的含量为0，说明甘露醇脱氢酶是主要的负责副产物合成的酶。

实施例8、在解脂耶氏酵母中敲除赤藓糖醇脱氢酶基因

合成赤藓糖醇脱氢酶基因的敲除框，其序列为SEQ ID No.31。赤藓糖醇脱氢酶基因的敲除框的DNA元件示意图如图11所示。DNA转化、转化子菌株筛选以及筛选标记的回收利用的方法同实施例1。所用的底盘菌株可以是实施例7中获得的转化子ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI△ArDH△MDH(ery949△PGI△ArDH△MDH)，也可以是其它能合成赤藓糖醇的菌株(如发明人之前获得的专利菌株Yarrowia lipolytica CGMCC No.7326等)。在过表达己糖激酶基因(HK)、转酮酶基因(TKL1)、转醛酶基因(TAL)，4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因(EryPase)以及敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因(PGI)、ArDH基因与MDH基因的基础上进一步敲除赤藓糖醇脱氢酶基因，获得的转化子标记为ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI△ArDH△MDH△EYD(ery949△PGI△ArDH△MDH△EYD，即ery949-4△)，将仅敲除EYD基因的转化子标记为ery△EYD。提取EYD基因被敲除的转化子提取基因组，用来自EYD基因的一对引物进行PCR扩增，若该基因被敲除则不能被扩增出来，而对照能被扩增出来。结果如图8所示。图8中7为EYD基因被敲除的转化子，不能扩出相应大小的片段，而对照菌能扩出(图8中8)，说明EYD基因被敲除了。

将获得的赤藓糖醇脱氢酶基因被敲除的转化子进行发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基成分与条件同实施例1，另外补加15克/升的甘油。合成赤藓糖醇与副产物的效果如下表7：

表7

由上表可见，和对比菌株相比(ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI△ArDH△MDH，即ery949△PGI△ArDH△MDH)，进一步敲除赤藓糖醇脱氢酶基因虽然合成效率并没有显著提高，但是赤藓糖醇的含量有所提高。由于赤藓糖醇脱氢酶是解脂耶氏酵母中负责分解利用赤藓糖醇的第一个酶，因此敲除该基因有利于延长发酵时间，以便消耗发酵液中的可利用的氮源等营养成分，有利于产品后续分离纯化。还有利于后期补充葡萄糖继续发酵。

实施例9、菌株ery::HK::TKL1::TAL::EryPase△PGI△ArDH△MDH△EYD(即： ery949-4△)不利用赤藓糖醇对比分析实验

将不同的菌株发酵葡萄糖合成赤藓糖醇，发酵培养基成分与条件同实施例8。当葡萄糖消耗完全后，将发酵时间延长到120小时，150小时与180小时，分别测定发酵液中赤藓糖醇的含量(注：取样时用无菌水补充挥发的水分至起始的体积，以免水分挥发导致测定结果不准确，本发明中液相检测取样时均补充水分至起始体积)，结果如下表8：

表8

由上表可见，即使延长发酵时间，EYD基因被敲除的菌株其发酵液中赤藓糖醇的含量不会降低，而未敲除EYD基因的菌株其发酵液中赤藓糖醇的含量逐渐降低。

为了更直观的反映EYD基因被敲除的菌株(ery949△PGI△ArDH△MDH△EYD)与对照菌株(CGMCC No.7326)利用赤藓糖醇的情况，将二者分别接种在含10克/升赤藓糖醇的液体培养基中培养(酵母粉5克/升，蛋白胨3克/升，赤藓糖醇10克/升，pH6.5)，在30度振荡培养，定时取样测定赤藓糖醇的含量变化。由图12明显可见，到34小时时，对照菌利用完全赤藓糖醇(图12中A-C)，而EYD基因被敲除的菌则不利用赤藓糖醇(图12中D-F)。

选择合成赤藓糖醇最好的代表性菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ery949-4Δ(即ery949△PGI△ArDH△MDH△EYD)进行保存，保存编号为CGMCC No.19351。下面的步骤以该代表性菌株为例，进行发酵合成赤藓糖醇的优化试验。

(1)CGMCC No.19351菌株在温度25度，葡萄糖浓度为50克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌溶氧效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖50克/升，酵母粉3克/升，蛋白胨2克/升，磷酸氢二铵1克/升，起始pH5.5，在25℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至60小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为22克/升，转化率为44％。

(2)CGMCC No.19351菌株在温度25度，葡萄糖浓度为200克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖200克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨5克/升，磷酸氢二胺3克/升，氯化锰0.01克/升，氯化铜0.01克/升，氯化锌0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在25℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至70小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为110克/升，转化率为55％。

(3)CGMCC No.19351菌株在温度28度，葡萄糖浓度为300克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，氯化锌0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在28℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至85小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为185克/升，转化率为61.7％。

(4)CGMCC No.19351菌株在温度32度，葡萄糖浓度为350克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.2，发酵培养基成分为：葡萄糖350克/升，酵母粉15克/升，蛋白胨10克/升，柠檬酸铵5克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，氯化锌0.01克/升，硫酸镁0.4克/升，起始pH5.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至95小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为205克/升，转化率为58.6％。

(5)CGMCC No.19351菌株在温度33度，葡萄糖浓度为320克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.5，发酵培养基成分为：葡萄糖320克/升，酵母粉12克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.01克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.4克/升，起始pH5.5，在33℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至118小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为198克/升，转化率为61.8％。

(6)CGMCC No.19351菌株在温度35度，葡萄糖浓度为100克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.5，发酵培养基成分为：葡萄糖100克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨2克/升，柠檬酸铵1克/升，氯化锰0.01克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.05克/升，起始pH5.5，在35℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至115小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为42.5克/升，转化率为42.5％。

(7)CGMCC No.19351菌株在温度30度，起始pH3.0，葡萄糖浓度为310克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为1.0，发酵培养基成分为：葡萄糖310克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，用柠檬酸调起始pH3.0，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至105小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为189克/升，转化率为60.9％。

(8)CGMCC No.19351菌株在温度33度，葡萄糖浓度为250克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖250克/升，酵母浸膏10克/升，玉米浆干粉5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在33℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至80小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为145克/升，转化率为58％。

(9)CGMCC No.19351菌株在温度30度，起始pH7.0，葡萄糖浓度为300克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉12克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，用氢氧化钠调起始pH7.0，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至78小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为188克/升，转化率为62.7％。

(10)CGMCC No.19351菌株在温度30度，甘油浓度为100克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：甘油100克/升，酵母粉8克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵2克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定甘油含量与赤藓糖醇含量。至150小时时甘油才消耗完毕。测定赤藓糖醇含量为36克/升，转化率为36％。与用葡萄糖相比，用甘油做原料发酵时间长，转化率较低。

(11)CGMCC No.19351菌株在温度30度，葡萄糖浓度为280克/升，甘油浓度为20克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖浓度为280克/升，甘油浓度为20克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH6.5，赤藓糖醇含量。至80小时时葡萄糖与甘油均消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为187克/升，280克/升葡萄糖与20克/升甘油的混合碳源的转化率为62.3％。

(12)CGMCC No.19351菌株在温度35度，甘油浓度为200克/升条件下发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含300毫升发酵培养基的2升的三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：甘油200克/升，酵母粉15克/升，玉米浆干粉5克/升，蛋白胨3克/升，柠檬酸铵2克/升，氯化锰0.02克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定甘油含量与赤藓糖醇含量。至180小时时甘油才消耗完毕，赤藓糖醇含量92克/升，转化率为46％。

(13)以淀粉为原料，CGMCC No.19351菌株发酵合成赤藓糖醇的试验。

100克淀粉(来自玉米)加入350毫升冷水中，边加边搅拌，直至变为淀粉乳，得415毫升淀粉乳(淀粉质量体积百分比24％，即240克/升)。煮沸，加入0.2克耐高温α-淀粉酶，搅拌直到淀粉液化变为清澈透明。降温至60度加入0.2克中温β-淀粉酶以及0.1克普鲁兰酶糖化，保温5小时后用于发酵原料，加入酵母粉3.5克，玉米浆干粉2克，柠檬酸铵1.5克，硫酸镁0.1克，108℃灭菌30分钟，冷却。将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在此培养基中，起始菌体密度(OD600)为1.2，起始pH5.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖与赤藓糖醇含量。至85小时时发酵培养基中葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为99.6克/升，折合由淀粉合成赤藓糖醇的转化率为41.5％。由淀粉的转化率低于葡萄糖的转化率，原因可能是上述处理并没有将淀粉全部转化为葡萄糖，仍产生较多的低聚糊精类，解脂酵母不能利用。

上述各发酵的实施方案中，发酵过程要定时补充蒸发的水分至发酵起始的重量。发酵起始时记下含发酵液的发酵瓶的重量，每次取样时再记下重量，用无菌水补充水至发酵起始的重量。每次取样量为0.2毫升，稀释十倍后用于HPLC液相检测碳源原料(如葡萄糖、甘油等)与赤藓糖醇的含量。分析柱为Shodex的SP0810糖柱，示差检测器，纯水为流动相，流速为1ml/min，柱温70度。

(14)CGMCC No.19351菌株在150升发酵罐中发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含110升发酵培养基的150L发酵罐中，起始菌体密度(OD600)为1.0，发酵培养基成分为：葡萄糖320克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.01克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.1克/升，氯化锌0.02克/升，起始pH6.5，在30℃发酵，搅拌转速起始每分钟300转(rpm)，通气量每分钟200升，待菌体长到OD600超过3.0时提高至350rpm，通气增加到每分钟250升。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。至85小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为198.4克/升，转化率为62％。

(15)CGMCC No.19351菌株在150升发酵罐中进行补料发酵合成赤藓糖醇的试验。

将重组酵母CGMCC No.19351菌株接种在含110升发酵培养基的150L发酵罐中，起始菌体密度(OD600)为1.0，发酵培养基成分为：葡萄糖320克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.01克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.1克/升，氯化锌0.02克/升，起始pH6.5，在30℃发酵，搅拌转速起始每分钟300转(rpm)，通气量每分钟200升，待菌体长到OD600超过3.0时提高至350rpm，通气增加到每分钟250升。定时取样测定葡萄糖含量与赤藓糖醇含量。当葡萄糖含量在50-100克/升时补充600克/升灭菌的葡萄糖溶液10升，继续发酵。至125小时时葡萄糖消耗完毕，测定赤藓糖醇含量为220克/升，总共消耗葡萄糖为41.2千克，生成赤藓糖醇27.4千克，转化率为64％。可以看出后期补料有利于赤藓糖醇浓度的提高。这一有益效果得益于赤藓糖醇脱氢酶基因的敲除，阻断了赤藓糖醇的利用，使得赤藓糖醇在发酵液中不断积累。

上述各发酵实施例中，所述的发酵培养基均经过灭菌处理，冷却至室温后再接入菌种。

(16)从发酵液中纯化赤藓糖醇的试验。

发酵结束后，发酵液装入500毫升离心管中，在6000g条件下离心20分钟获得澄清的含赤藓糖醇的上清。沉淀酵母细胞再用200毫升纯净水悬浮洗涤以使胞内的赤藓糖醇释放出来，离心得上清。将发酵上清与洗涤细胞的溶液合并，转入旋转蒸发瓶中蒸发浓缩，期间测定折光，当折光达到65时停止蒸发。将浓缩液转入球形烧瓶中，置于梯度冷却机中用磁力搅拌棒缓慢搅拌，每分钟50转。当温度降低到30℃时开始出现可见细小颗粒状结晶，随着温度的逐渐下降，结晶量逐渐增加，此时增加搅拌速度至每分钟80转。结晶量不再增加时，停止搅拌，离心分离晶体，得到赤藓糖醇粗制品。重新溶解至折光45，依次进行离子交换、脱色，去除离子与色素，再进行浓缩、结晶、离心与干燥的步骤，得到赤藓糖醇精制品。

特别需要说明的是，本发明选择性的过表达己糖激酶(HK)、转酮酶(TKL)、转醛酶(TAL)以及4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因(EryPase)以及敲除6-磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、阿拉伯糖醇脱氢酶(ArDH)、甘露醇脱氢酶(MDH)以及赤藓糖醇脱氢酶基因(EYD)并不是任意选择的，而是经过反复试验验证的，并取得了上述有益效果的。由图1可以看出，合成赤藓糖醇的途径中除了本发明过表达的四种酶基因外，还有其余几种酶基因，如5-磷酸核酮糖异构酶基因(RPI)、5-磷酸核酮糖差向异构酶基因(RPE)等。我们过表达了RPI(YALI0B06941g)、RPE(YALI0C11880g)基因，但是并未取得有益的效果，赤藓糖醇的合成效率并未有明显的提高，与对比菌株基本一致，也含有副产物(表9)。解脂酵母中合成副产物的途径与基因并未见已知文献报道，发明人通过基因组挖掘研究，试验了多种可能参与副产物合成的基因，其中包括上述两种基因(ArDH、MDH)，发现敲除这两种基因尤其是敲除MDH基因能取得明显的有益效果，不再合成副产物(表6，表7)。而敲除可能的参与副产物合成的基因(如敲除基因YALI0B16192g、YALI0E12463g、YALI0F02211g，这三种基因在NCBI基因数据库中能获取)副产物含量与对比基本一致(表10)。

表9

表10

菌株(△表示基因敲除符号)	副产物含量(g/L)	发酵时间(h)
			ery△YALI0B16192g	12±1.5	95±3
ery△YALI0E12463g	12±1.5	95±3
			ery△YALI0F02211g	12±1.5	95±3
CGMCC No.7326	12±1.5	95±3

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，发明人可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株

<130> KAG41722

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 1

cagatcttgg tggtagtagc aaatattcaa atgagaactt tgaagactga agtggggaaa 60

ggttccgtgt gaacagcagt tggacacggg taagtcgatc ctaaggggtg gcataactgt 120

cgcgtacggc ccgataaggg ccttctccaa aagggaagcc ggttgaaatt ccggcacttg 180

gatgtggatt ctccacggca acgtaactga atgtggggac ggtggcacaa gtcttggaag 240

gagttatctt ttctttttaa cggagtcaac accctggaat tagtttgtct agagataggg 300

tatcgttccg gaagaggggg gcagctttgt cccctccgat gcacttgtga cgccccttga 360

aaacccgcag gaaggaatag ttttcacgcc aagtcgtact gataaccgca gcaggtctcc 420

aaggtgaaca gcctctagtt gatagaataa tgtagataag ggaagtcggc aaaatagatc 480

cgtaacttcg ggataaggat tggctctggg ggttggtgga tggaagcgtg ggagacccca 540

agggactggc agctgggcaa ctggcagccg gacccgcggc agacactgcg tcgctccgtc 600

cacatcatca accgccccag aactggtacg gacaagggga atctgactgt ctaattaaaa 660

catagctttg cgatggttgt aaaacaatgt tgacgcaaag tgatttctgc ccagtgctct 720

gaatgtcaaa gtgaagaaat tcaaccaagc gcgcgggtaa acggcgggag taactatgct 780

ctcttaaggt agccaaatgc ctcgtcatct aattagtgac gcgcatgaat ggattaacga 840

gattcccact gtccctatct actatgtagc gaaaccacag ccaagggaac gggcttggca 900

gaatcagcgg ggaaagaaga ccctgttgag cttgactcta gtttgacatt gtgaagagac 960

atagggggtg tagaataagt gggagcttcg gcgccggtga aataccacta cccttatcgt 1020

ttctttactt atttagtaag tggaagtggt ttaacaacca ttttctagca ttcctttcca 1080

ggctgaagac attgtcaggt ggggagtttg gctggggcgg cacatctgtt aaaagataac 1140

gcagatgtcc taagggggac tcaatgagaa cagaaatctc atgtagaaca aaagggtaaa 1200

agtccccttg attttgattt tcagtgtgaa tacaaaccat gaaagtgtgg cctatcgatc 1260

ctttagttgt tcggagtttg aacctagagg tgccagaaaa gttaccacag ggataactgg 1320

cttgtggcag tcaagcgttc atagcgacat tgctttttga tccttcgatg tcggctcttc 1380

ctatcatacc gaagcag 1397

<210> 2

<211> 1302

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

atgacaattg aaagcactct agctcgggaa ttagaaagct tgattttacc cgctgattcc 60

atagtgaatg tagttgacca attccaagag gagttgttat cacggcttca gacaaatacg 120

atttctatgc tcccgcagtg tttagtccca gataaacgat cgcgatggaa ccctgaagac 180

aaaattctga ccattgattt cggcgggaca agactgaaat ttgcaattat ctctctgccc 240

caaatcgtta tcgaatacaa tgatgccttc gaacttacct acaacatcgt tgattcgaat 300

ttctttaatc aaatcatcta tacaatatgt accaggctgg ctgcaaatgg ttatataaaa 360

aaaaagaacg agtcatctga ggcgtctaaa ttttttgttt ccgtgacatt cagttttcct 420

ctaaatccag aaggggaggt agttgcaatg ggaaaaggat ttgtgatgac tgacaccctt 480

caaggatcca cggtgaaaca gctcatccaa tcttcctttc accggattat atcagaaaat 540

atcgaagaat ttttctgtac catgaacgtg tgtcatgtaa taaacgatgc aattgcagtt 600

tcactaacaa gcaaatttat atgcgaaaac gattccatct cattaataat aggaactggt 660

acaaatgcat gttttgaggt tccatacgga tatttaccac ctttcaagag agatgccctg 720

agagaaacat taccgtcaag ctataataag gagacattaa atttcaaaca tgttctcatt 780

aattctgaaa ttggctttat tggtaaaaat gtcattgcat tgcaaccgtt tgacattcat 840

ggagcaatct catacgaaat gccactagag tgcgttactt ctggtaaatg gcttccccta 900

tcattaaaaa atattctatt gcaatataac ataatcccca aaaacttccc agtagagttc 960

aatggggaac tggtatgcca gctggcagaa gactgtacta atgcttggtt cgaaaacgaa 1020

cattatgcac taatttgtca gatcgcacga ctattaatca agagagccgc attttatgtt 1080

gctgcaattg tacaagctat tgatatcatc acaggctgca aaaactataa ctttattcat 1140

attggctacg ttggatcctt tctccacaat tcaaattttt atcgagagca gataaaatat 1200

tactccagca tacatattaa gttgcaattc ttaaatcaca gtaatcttct aggcgctgca 1260

atagccacct acttgaacaa atcagacaac caagttcaat aa 1302

<210> 3

<211> 1653

<212> DNA

<213> 树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)

<400> 3

atggctatga tccacaactc ttccaaagtc gcatcaccaa cagaagaaag cataatactt 60

cctatgaagg gccttcatgg agatgtcact ataagtccaa cacccattct cataaaccag 120

agcgaggaaa gtgacttcat agacgagttg ctgtcttcta cttctacttc cagcgaacct 180

tcgcccaact catccatttc cactgatagc tcgtgtcttt tatcttccgt agtaaacgat 240

tttgtttatg atctcaccag tcagaacttc ctcgaacaga cggagtttct tgtcgccgac 300

ttgaatgagt cgttatctag aaactccaag ataaccatgt tgcccaacta caatatttct 360

ccaacaggac aggagtcagg tgagtttttg gtcattgact tgggaggctc caccttgaga 420

atcgctgtta tcaagataga ccaagcgtcg gattcagacg acgaagacag atcaaaaaga 480

atacacatct tgatggagaa gaactggact atcgataaca gcttcaagac tctcgatctt 540

aacttcttca agttcatagg ctccaagatc cacgagatat tgtgccatca ggatttgatt 600

gatatccgca acaatataaa gactgggatc acctggtcgt tccctttgaa gaccacatcg 660

tacaataacg gtaagatcgt ccatgtctct aagggctaca ccattcatcc agaaatctac 720

aaccaggact tgaagtccat tttagaatca gttttactaa acgagtttga tttacacatt 780

gacgtcaaaa gcattttgaa cgattccttg gccgtgtact cggcaggtgc cttcattgat 840

aagtatacca agttggcact tgttttggga acgggattca acatgtgctg ctcattatct 900

acatcggaca agatgcattc tgacaagacg ttggaaagct gcgacaagat cttattcaac 960

actgaactca gtttgtttgg tgaacatttg attaagagca tagctaccaa atatgattcg 1020

ttgattgacg agagattcaa aacctttgac tttcatttca agccattcat gtcaactgat 1080

cctaataccc attccatttt ccaacctaac gagttgatga caagtggtag atacttgcca 1140

gagttgactc gtttggtgtt ggtagattta gttgaagcta aagaaatctt tgtcaacata 1200

agccaaaagg aggaactttt atcttcggcc tatgatggct tcagtggtga gttgatgtgc 1260

ttcatcaacg aatcgacaaa cgttgacgcc attaccgaaa aattgtgtgc tcaatatggt 1320

tggtctgctt ctgaagtcac catcggagat gttttgacgt tgaagaagat tgttcaaagt 1380

attgttgaaa gagcagcctt cattgtttcc gtctcgattg tgtccttcat taagttgctc 1440

caacagcaca atgatgatca ctttgactca tccatcatca acattggata tgttggctca 1500

gtgttgaagc atttcaatgt ctacagagac ttggttaaac aatatgttaa cgataatgac 1560

gatattaaaa ggttaggagt ccaggttgat tttaagttga ttgagaatag ttcaatcatt 1620

ggtgctgcta tcggtgcagc atactattca taa 1653

<210> 4

<211> 1260

<212> DNA

<213> 鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces)

<400> 4

atgacggtta ataattcaat tttaagtcaa gttcgggagc agctaatacc atctgaatca 60

ctagaaaatg tatcgaagaa atttcaatta gaattgaaag atagactaca gaaaagtaaa 120

aaatcaatga ttgttggtgg ttgggtccct aaaaaatcaa tgataagaac tagggaaaaa 180

tttccccaca gcttcctggc aattgatttt gttggatcga cattgaaatt cgcattaatt 240

tctatgccca attgtcaaat tgttttccaa gatgagttcc atattactgc caaactggtc 300

gattataaat tctttgatac catgattaca tggatttcgt tcaagctaaa tgaatacctt 360

gcaggcgagg agcagagagc taagttttta gtatcaatca ccttcagttt ccccttaaac 420

gatagattag agattattac catgagtaag ggttttgaaa tgtcgctgga tataatgcgt 480

aaaagcgtca aagaaatcat tgcttcttca tttgctcgag tactctcaga tctgcctgag 540

agaaaatttg acgttgaagt ttgtgatgtg attaacgatt ctgtcgccgt ttatttgaca 600

agtaagttca tgtgcaagaa cgaaagcgtt tctttaattc taggcacggg gatcaattca 660

tgctttgaat tatctccaga gcaggtaccg cctaagaaga ggccccataa tacccccagc 720

aactgcaatt gtctcatcaa tgtagaggca ggatttctgg gtaatggcac tgtcaatgtt 780

actaaatttg actatcacgg tgatggtgaa tggaatatgc cactagaaga catctcatcc 840

ggaaagtgga tgccaattac atttgcaaat attttaaaac gataccgcat cgttggatta 900

gactctactt caataaacgg agaactatta gttgaaattg cggaaaacag gtataagggt 960

aaattggatg gtgaaagttt gagactaatt cgagaaattt cgagatcact gatacaaaga 1020

ggcgcattct atgtggtagc catgttattt gctgttggat cacttgttaa cgggggcatt 1080

aacagtaatc aaactaaaga agcaattgaa gttggttacg tcggttcctt tttggcacat 1140

tcaaactatt acaaaagcca aattgccctg tattctcgaa accgaatgca tttccaattt 1200

ctccataata gtaacttact tggtgctgca gtggccactt atttgaatag atgcaattaa 1260

<210> 5

<211> 1320

<212> DNA

<213> 球拟假丝酵母(Candida] glabrata)

<400> 5

atgagaccga ttgggacaat gacaatagct aatccggaaa agatcttaga agaggtcaag 60

agccaacttg gagtgcgcca gtctttagct acaataactg agaaatttca agaggagctt 120

gatttcatgt tgaagaattg taagaagtct atgttacctt tcccacaggt ttgttgccga 180

ggatggtctg agtataatga gcctatggac atgcttgcca ttgattttgg aggaagtgtt 240

cttaagtttg ctgtgattaa tatgccccag tgccaaatgg agctaaaata tgagttggag 300

attaaatcaa agatagttga tttcaaattt tttgacaata tagtggaatg gatatgcaat 360

cgtattccaa taaacaacga aagaagtcta cctagaaaat ttatagtcgc tattacattc 420

agtttcccag taaatgctaa caacgaaatt gtagccatgg gaaaaggatt taggatgtca 480

ccagaactga aaggcattag tatattagat atcttgaaac aatcttttga tcgattagaa 540

aaggagtaca gttcatcatt tacttttgag ataagcaatg taattaatga ctcattggcg 600

gttcatatga catctaaata tcttcaaagt gacaacaacg ataaaatctc tttgatatta 660

ggaactggtg tgaattcctg ctttgaagta caatacgaag atttgcctca gttcaaaaag 720

gatattttaa cgcagttttc agatgattat agagaaaaag ttcttatcaa ttcagaaatg 780

ggattcttgg gaaggtattc caaatccatt gagttcggca actttgacac taatatagac 840

gataaaatgc ccttagaatc cataacatct ggtaaatgga taccacaaat actacacaat 900

ataataagat attacaacct tttgccaatg gtcggagatg aggaaataaa atatgatgga 960

agactaatat gcgaaatatt atctgacggt gaatgccctt cagagtacct tttgtctttg 1020

tgggattatg aagtatacca aattataagg caaataacaa aactgctaat caatagggct 1080

gctatatacc ttgtggcagc aatcattgcc ataagaaaat tcgttagccc cgaaatatat 1140

tttacaaagg gtggaataga tatagactat gtgggcagtt ttttgaacta ttgtcagtac 1200

taccaagaaa gaatacactt ccattccaaa gggatggtga aactgcaatt tcttaacgat 1260

agtaaccttt atggatgcgc gattacagct tatagtaaca tctttgagaa tcggatatga 1320

<210> 6

<211> 1605

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 6

atggttcatc ttggtccccg aaaacccccg tcccgaaagg gctcaatggc agacgtcccg 60

cgggacctgc tggagcaaat ctcccagctt gaaaccatct tcaccgtttc gcccgaaaag 120

ctgcgtcaaa tcaccgacca ctttgtgtcc gagctcgcta aaggcctcac aaaggagggt 180

ggagatatcc ccatgaaccc cacctggatt ctgggatggc ccaccggaaa ggagagcggc 240

tgctatctgg ctctcgacat gggtggcacc aacctgcgag ttgtcaaggt gactctggac 300

ggcgaccgag gcttcgacgt catgcagtcc aagtaccaca tgccccccaa catcaaggtc 360

ggcaagcaag aggagctgtg ggagtacatt gccgaatgtc tgggcaagtt cttggccgac 420

aattatcctg aggctcttga tgcccatgag cgaggacgag atgtcgacag aaccgctgcg 480

cagagcttca ctcgagacaa gtctcctcct ccccacaacc agcacatttc gtgttctcct 540

ggcttcgaca tccacaagat tcctctcggt ttcacctttt catatccctg ctctcagccc 600

gccgtcaacc gaggtgtact gcagcgatgg accaagggtt tcgacattga gggagtcgag 660

ggcgaggacg tggtccccat gctggaagct gccctcgaaa gaaagaacat tcctatttcc 720

atcaccgccc tgatcaacga caccaccgga actatggtgg cctccaacta ccacgacccc 780

cagatcaagc tgggtaacat ctttggtact ggtgtcaacg ccgcctacta cgagaaggtc 840

aaggacattc ccaagctcaa gggtctcatc cccgacagca ttgatcccga gacccccatg 900

gccgtcaatt gcgagtatgg agccttcgac aatgagcaca aggttctccc tagaaccaag 960

tgggacatca tcatcgatga ggagtctccc cgacccggtc agcagacctt cgagaagatg 1020

agtgctggct actacctggg agaattgctt cgtctggttc ttctggacct gtacaaggac 1080

gggtttgtgt tcgagaacca gggcaagaac ggtcaggagc ttggaaacgg caacatcaac 1140

aagtcgtatt tcttcgacac ctctttcctg tctctgattg aggaggatcc ctgggagaac 1200

ttgactgatg tcgagattct cttcaaggag aagcttggta ttaacaccac tgagcccgag 1260

cgaaagctca ttcgtcgact ggccgagctc attggtactc gatccgctcg aatctctgcc 1320

tgtggtgtcg ctgccatctg taagaaggct ggctacaagg aggctcacgc tggagctgac 1380

ggatccgtgt tcaacaagta ccccggattc aaggagcgag gcgcccaggc tctcaacgag 1440

atttttgagt ggaacctgcc caaccctaag gaccacccca tcaaaatcgt tcccgctgag 1500

gatggtagcg gtgttggagc tgctctgtgc gctgctctca ccatcaagcg agtcaagcag 1560

ggtcttcccg ttggtgtcaa gcccggtgtc aagtacgata tttag 1605

<210> 7

<211> 2043

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 7

atgactcaat tcactgacat tgataagcta gccgtctcca ccataagaat tttggctgtg 60

gacaccgtat ccaaggccaa ctcaggtcac ccaggtgctc cattgggtat ggcaccagct 120

gcacacgttc tatggagtca aatgcgcatg aacccaacca acccagactg gatcaacaga 180

gatagatttg tcttgtctaa cggtcacgcg gtcgctttgt tgtattctat gctacatttg 240

actggttacg atctgtctat tgaagacttg aaacagttca gacagttggg ttccagaaca 300

ccaggtcatc ctgaatttga gttgccaggt gttgaagtta ctaccggtcc attaggtcaa 360

ggtatctcca acgctgttgg tatggccatg gctcaagcta acctggctgc cacttacaac 420

aagccgggct ttaccttgtc tgacaactac acctatgttt tcttgggtga cggttgtttg 480

caagaaggta tttcttcaga agcttcctcc ttggctggtc atttgaaatt gggtaacttg 540

attgccatct acgatgacaa caagatcact atcgatggtg ctaccagtat ctcattcgat 600

gaagatgttg ctaagagata cgaagcctac ggttgggaag ttttgtacgt agaaaatggt 660

aacgaagatc tagccggtat tgccaaggct attgctcaag ctaagttatc caaggacaaa 720

ccaactttga tcaaaatgac cacaaccatt ggttacggtt ccttgcatgc cggctctcac 780

tctgtgcacg gtgccccatt gaaagcagat gatgttaaac aactaaagag caaattcggt 840

ttcaacccag acaagtcctt tgttgttcca caagaagttt acgaccacta ccaaaagaca 900

attttaaagc caggtgtcga agccaacaac aagtggaaca agttgttcag cgaataccaa 960

aagaaattcc cagaattagg tgctgaattg gctagaagat tgagcggcca actacccgca 1020

aattgggaat ctaagttgcc aacttacacc gccaaggact ctgccgtggc cactagaaaa 1080

ttatcagaaa ctgttcttga ggatgtttac aatcaattgc cagagttgat tggtggttct 1140

gccgatttaa caccttctaa cttgaccaga tggaaggaag cccttgactt ccaacctcct 1200

tcttccggtt caggtaacta ctctggtaga tacattaggt acggtattag agaacacgct 1260

atgggtgcca taatgaacgg tatttcagct ttcggtgcca actacaaacc atacggtggt 1320

actttcttga acttcgtttc ttatgctgct ggtgccgtta gattgtccgc tttgtctggc 1380

cacccagtta tttgggttgc tacacatgac tctatcggtg tcggtgaaga tggtccaaca 1440

catcaaccta ttgaaacttt agcacacttc agatccctac caaacattca agtttggaga 1500

ccagctgatg gtaacgaagt ttctgccgcc tacaagaact ctttagaatc caagcatact 1560

ccaagtatca ttgctttgtc cagacaaaac ttgccacaat tggaaggtag ctctattgaa 1620

agcgcttcta agggtggtta cgtactacaa gatgttgcta acccagatat tattttagtg 1680

gctactggtt ccgaagtgtc tttgagtgtt gaagctgcta agactttggc cgcaaagaac 1740

atcaaggctc gtgttgtttc tctaccagat ttcttcactt ttgacaaaca acccctagaa 1800

tacagactat cagtcttacc agacaacgtt ccaatcatgt ctgttgaagt tttggctacc 1860

acatgttggg gcaaatacgc tcatcaatcc ttcggtattg acagatttgg tgcctccggt 1920

aaggcaccag aagtcttcaa gttcttcggt ttcaccccag aaggtgttgc tgaaagagct 1980

caaaagacca ttgcattcta taagggtgac aagctaattt ctcctttgaa aaaagctttc 2040

taa 2043

<210> 8

<211> 2091

<212> DNA

<213> 木兰假丝酵母(Candida magnoliae)

<400> 8

atgtcttctc ccaagttcag tgaaatcgac cagaaggccg ttgacaccat ccgcgtgctg 60

gccgccgacg ttgtcggcaa ggccaacagt ggccaccctg gtgcccccat gggtctggct 120

ccgctggcgc acgtcttgtg gcagtacgtc atgaagttca acccgaagaa cccatactgg 180

ttcaaccgcg accgcttcgt gctgtccaac ggccacgcct gtgcgctgca gtacatcatg 240

ctgcaccttt acggctacga catcacgatg gacgacctgc agcacttccg ccagttcaac 300

tcgaacacgc cgggtcaccc cgagcgcgag ctgcccggta tcgaggtcac tactggtcct 360

ctcggccagg gtattgtgaa cgccgttggt cttgccattg ctgagaagca gatcgctacg 420

aacttcaacc gccccgagca cgaggttgtt agcgcccaca cgtactgcat ccttggtgac 480

ggatgcctta tggagggcgt tagccacgag ggcctggcgc ttgctggcca cctcaagctc 540

ggcaagctca ttgctttcta cgacgacaac cacatctcca ttgacggtga cacgaacctc 600

gccttcacgg agaacacgga ggagcgcctg aaggcttacg gctggcatgt tcagcacgtc 660

aaggacggca acaacgacat ggctggcatc ttcgaggcca tcgagaacgc caagaaggtc 720

actgaccagc cgtcgttcat ccgtgtcacg actaccattg gctacggctc cgtgaatgct 780

ggcacgcacg gtgtccatgg ctcgcccctg aagcctgatg acatggccca cctcaagaag 840

gagtggggct tcgagcccga ccaatacttc gtcattccct ctgaggttag cagccaggcg 900

ttcacgaagg gtgcgcaggg cgcggagctc gagcgcgctt gggacgagga ggttcgccac 960

tacaaggaga agtaccagaa ggaggccgag gagcttattc gccgcgcgag gcggaagctg 1020

cccgagggct gggagaaggc cctccctact tactcgccta gcgaccccgc tgttgcttcg 1080

cgtaagctga gcgagaccgt gctcacgaag attgagtctg cgcttcccga gcttgttagt 1140

ggctcggctg atctgactgg ctcgaatctg accatctgga agggcgctgt ctcgttccag 1200

cctcctgaga cgaagctcgg tgactatgcc ggccgttacc tgcactacgg tgttcgcgag 1260

cacggcatgg ttgctatcat gaacggtatt gacgcgttcg gcggtctcat ccccgttggt 1320

ggcactttct tgaacttcgt ctcctatgcc tcgggtgcca tgcgtctggc tggtctgtct 1380

ggccaccgca cgattgttct tgccacgcac gactccattg gtcttggtga ggatggccct 1440

acgcaccagc ctattgagac gctggctcac ttccgcgcca cgcccaacgt catggtctgg 1500

cgcccggccg acggtaacga ggtaagcgct gcctacaagg tcgccatcga gagcctcgag 1560

acgcctacga ttatggcgct ttcgcgccag aacctgcccc agcttgaggg ctcgtcgatc 1620

gagaaggctg tcaagggtgg ctacgtcctg aacgagtccg ttgagaaccc gcaggttatc 1680

attgcttcca cgggctctga ggttggcatc tctgtcgacg cggcgaagct gctcgagaag 1740

gatggcattc gtgtgcgcgt tgtctccatg cctgagttct acaccttcga tggccagtcc 1800

gaggagtaca agctgtccgt gttccctgat ggtgtgcctg tcctgagcgt tgaggttatg 1860

tcggcgttcg gctggagcaa gtacgctcac gagagcttcg ccattgacca cttcggtgcc 1920

tctggcaagt acacggacct gtacaaggcg ttcgacttca cgcccgaggg tgttgccaag 1980

cgcgctaagg cgacgcttga cttctaccag ggcaagaacc ctctgtcgcg catccacacg 2040

gcgttccccc accttgtcca gcgtggcccg ggcccttacc acaccaagta a 2091

<210> 9

<211> 2034

<212> DNA

<213> 树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)

<400> 9

atgtcgtccg tcgatcaaaa agctatcagc accatccgtc ttttggctgt ggatgccgtc 60

gctgctgcca actccggtca cccaggtgct ccattgggtt tggctccagc tgcccacgcc 120

gtattcaaga agatgagatt caaccctaag gataccaagt ggatcaacag agacagattc 180

gtcttgtcca acggtcacgc ctgtgccttg ttgtactcga tgttggttct ctacggctac 240

gacttaaccg tcgaagactt gaagaagttc agacaattgg gctccaagac ccctggtcac 300

ccagaaaaca ccgatgttcc aggtgctgaa gtcactaccg gtccattagg tcaaggtatc 360

tgtaacggtg ttggtattgc ccttgcccaa gctcaattcg ctgccaccta caacaagcca 420

gacttcccta tctccgactc gtacacctac gtcttcttgg gtgacggttg tttgatggaa 480

ggtgtttctt cggaagcctc ttctcttgct ggtcacttgc aattgggtaa tttgattgcc 540

ttctgggacg acaacaagat ctccattgac ggttctactg aagttgcatt caccgaagac 600

gttatcgcca gatacaagtc gtacggatgg cacattgttg aagtcagcga tgcagacacc 660

gatatcactg ccattgctgc tgccatcgac gaagccaaga aggttaccaa taagccaact 720

ttggttagat tgactaccac catcggtttc ggttcgcttg ctcaaggtac tcatggtgtc 780

cacggtgctc cattgaaggc tgatgacatc aagcaattga agactaagtg gggcttcaac 840

ccagaagaat ccttcgctgt tccagctgaa gttactgctt cctacaacga gcacgttgct 900

gaaaaccaga agattcaaca acaatggaac gaattgttcg ctgcctacaa gcaaaagtac 960

ccagaattgg gtgctgagct ccaacgtcgt ttggacggta agttgccaga aaactgggac 1020

aaagccttgc cagtctacac cccagccgac gctgccgttg ctaccagaaa gttgtctgaa 1080

atcgtcttgt ccaagatcat tccagaagtg ccagaaatca ttggtggttc tgccgatttg 1140

actccttcca acttgaccaa ggccaagggc actgttgact tccagcctgc cgctactggc 1200

ttgggtgatt actctggtag atacatcaga tacggtgtta gagaacacgc tatgggtgct 1260

atcatgaacg gtatcgctgc ctttggtgcc aactacaaga actacggtgg tactttcttg 1320

aactttgtct cctatgctgc tggtgccgtc agattgtctg cattgtctga attcccaatc 1380

acttgggtcg ctacacacga ctctatcggt ttgggtgaag acggtccaac ccatcaacct 1440

atcgaaacat tggctcattt cagagctact ccaaacatct ctgtctggag accagctgat 1500

ggtaatgaaa cctctgctgc ttacaagagt gctatcgaat ctacccacac tccacacatt 1560

cttgccttga ccagacaaaa cttgccacaa ttggaaggat ccagtattga aaaggcttct 1620

aagggtggtt acactttggt ccaacaagac aaggctgaca tcatcatcgt tgctactggt 1680

tccgaagtgt ctcttgctgt cgatgccctc aaggtcttag aaggccaagg catcaaggct 1740

ggtgtcgtct ccttgccaga tcaattgacc ttcgacaagc aatctgaaga atacaagttg 1800

tctgtcttgc cagatggcgt tccaatcttg tctgttgaag ttatgtccac cttcggctgg 1860

tctaagtact ctcaccaaca attcggtttg aacagattcg gtgcttccgg taaagctcca 1920

gaaatcttca agctcttcga attcacccca gaaggtgttg ctgaaagagc tgccaagact 1980

gttgccttct acaagggcaa ggatgttgtg tctccattgc gttctgcctt ctga 2034

<210> 10

<211> 2085

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 10

atggctcccc aattttcaaa gactgacgag actgccatca acaccatccg aaccttggct 60

attgatgctg tggccaaggc taactccggc caccccggtg ccccaatggg tctggctcct 120

gttgcccacg ttctgtggaa ctactacatg aacttcacct cctccaaccc cgagtggatc 180

aaccgagacc gattcattct ctccaacgga cacgcctgca tgctgcacta ctccctgttg 240

cacctgtttg gctacgacat cactatcgat gatctcaaga acttccgaca gctcaactcc 300

aagactcccg gccaccccga ggctgagact cccggtatcg aggtcaccac cggtcccctg 360

ggtcagggtg tctccaacgc tgttggtttc gccattgccc aggcccacct tggcgcaacc 420

tacaacaagc ctggctacga catcatcaac aactacactt actgcatctt cggagatggt 480

tgcatgatgg agggtgttgc ctccgaggct atgtctcttg ccggacatct gcaactcggt 540

aacctcatca ccttctacga tgataaccac atttccattg acggtgacac caacgtggcc 600

ttcaccgagg acgtcagcca gcgacttgag gcctacggat gggaggtcat ctgggtcaag 660

gacggtaaca acgatctggc cggcatggct gctgccatcg agcaggccaa gaagtccaag 720

gacaagccca cttgtatccg actcaccacc atcattggtt acggctctct gcaacagggt 780

acacacggtg ttcacggctc tcctctcaag cctgatgata tcaagcagtt caaggagaag 840

gttggcttca accccgagga gacctttgcc gtccccaagg agaccactga tctctacgcc 900

aagactattg accgaggcgc aaacgccgag aaggagtgga acgaactctt cgccaagtac 960

ggtaaggagt atcccaagga gcactctgag atcatccgac gattcaagcg agagctgccc 1020

gagggatggg agaaggctct gcctacctac acccccgccg acaatgccgt tgcttctcga 1080

aagctgtccg agattgtcct caccaagatc cacgaggtcc tccccgagct tgttggtggt 1140

tccgccgatc tgaccggctc aaacctgacc cgatggaagg acgctgttga tttccagcct 1200

cctgtcaccc accttggtga ctactccggc cgatatatcc gatacggtgt tcgagagcac 1260

ggcatgggcg ctatcatgaa cggtatgaac gcttacggag gtatcatccc ctacggaggt 1320

actttcctta acttcgtctc ctacgccgct ggtgccgtcc gactgtctgc cctgtctggc 1380

caccacgtta tctgggttgc tacccatgac tccattggtc tgggtgagga tggccctacc 1440

catcagccca ttgagactgt cgcctggctc cgagccaccc ccaacctctc tgtgtggcga 1500

cctgccgacg gtaacgagac ctccgctgct tactacaagg ccatcaccaa ctaccacact 1560

ccctctgtcc tgtctctgac ccgacagaac ctgcctcagc ttgagggctc ttccatcgag 1620

aaggcctcca agggtggtta ccagctcatc tccgaggaca agggtgacat ctaccttgtg 1680

tccactggtt ctgaggttgc catctgtgtt gctgccgcca agctcctcaa ggagaagaag 1740

ggtatcactg ccggtgtcat ctctctgccc gactggttca ccttcgagca gcagtctctc 1800

gaataccgaa agtctgtttt ccccgatggc atccccatgc tttccgtcga ggtctactcc 1860

gactttggct ggtctcgata ctctcaccag cagtttggtc tggaccgatt cggtgcttct 1920

gctcccttcc agcaggtcta cgatgccttt gagttcaatg ccgagggtgt cgccaagcga 1980

gctgaggcca ccattaacta ctacaagggc cagactgtca agtctcctat tcagcgagcc 2040

ttcgacccca ttgacgtcaa cacccgaccc ggccacggtg tctaa 2085

<210> 11

<211> 978

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 11

atgtcttcca actctcttga acagcttaag gccgccggca ccaccgttgt caccgacact 60

ggtgaattcg agtccatcgc caagtacaag ccccaggacg ccaccaccaa cccctctctg 120

atcctggccg cttccaagaa gcccgagtac gccaagctca ttgacgaggc cgtttctttc 180

gccaagacca agtcctccga ccccaaggag caggtcaaca ttgctctgga ccagctgctc 240

atcgagttcg gctccgagat tctcaagatt gtccccggtc gagtctccac cgaggtcgac 300

gcccgactct ctttcgacaa ggacgccacc atcaagaagg ctctgcagct cattgacctc 360

tacaaggcca agggcatttc ttctgaccga atcctcatca agatcgcctc cacctatgag 420

ggtatccagg ctgccaagga gctcgagtcc aagcacggta tccactgtaa cctgactctt 480

ctcttctcct tcgtccaggc cgttgcctgt gctgaggcca aggtcaccct catctctccc 540

tttgttggcc gaatcctcga ctggcacaag gccgccaccg gcaagaccta cgacgctgcc 600

gaggaccccg gtgtcatctc cgtcaagaac attttcgact actacaagaa gttcgactac 660

aagaccattg tcatgggtgc ttctttccga aacaccggtg agatcaagga gcttgctggc 720

tgtgacttcc tgaccatctc ccccggtctg cttgaggagc tgctcaactc caccgacccc 780

gtcccccaga agctgttcgc cgacaaggcc aagtctctgg acattgagaa gaaggcctac 840

ctcgacgagg agcccatctt ccgacgagac tttaacgagg accagatggc caccgagaag 900

ctctccgacg gtatccgaaa gttcgctgct gacgccgtca ccctttccaa gctcattgag 960

accaagctct ccgcttag 978

<210> 12

<211> 975

<212> DNA

<213> 法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)

<400> 12

atgtctaact ctttggaaca attaaaagct gcaggaactg ttgttgttac tgacactggt 60

gaatttgaat ccattgctaa gtacactcct caggacgcta ccacaaaccc ttcattgatc 120

cttgcagcct ctaacaaggc cgagtatgcc aagttgattg atattgctgt tgactacgca 180

aagaagcaag gtggatctgt tgaagagcaa gcaaacattg ccctagaccg tctcttgatc 240

gagtttggta aggagattct aaagattgtt ccaggccgtg tatccactga ggttgatgct 300

cgtctgtctt ttgacaagga ggccactatc aagaaggctt tggagatcat tgagttgtac 360

aagtctgtag gcgttgagaa ggaccgtatt ttgatcaaaa tcgcctcaac ctgggaggga 420

attcaagccg cccgtgagtt ggaggccaag tacggaatcc actgtaactt gactttactc 480

ttctcttttg tgcaggccgt tgcttgtgct gaggcaaaag tcaccttaat ttctccattc 540

gtgggccgta ttttggactg gtacaaggct tcaacgggta aggattacaa aggtgatgag 600

gacccaggtg ttcaatctgt gaaggcaatc ttcaattact acaagaagtt cggttacgac 660

accattgtta tgggagcttc tttcagaaac actggtgaga tcaaggctct agctggttgt 720

gatttcctga ccattgctcc taagttgttg gaagagctgt tgaactccaa ggaacctgtt 780

cctcaaaagt tggacgcatc tgctgcttca tccttggaca ttgaacgtgt ttcttacatt 840

gatgatgagg ctgccttcag attcggcttg aatgaagatg ccatgtccac tgagaagttg 900

tccgaaggta tccgtaagtt ttcggccgac tgtgtgactc tactgaattt gttgaaggag 960

aaggtccagg cttaa 975

<210> 13

<211> 972

<212> DNA

<213> 汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)

<400> 13

atggctaacg cattagaaca attaaagtct accggtactg ttattgtcac cgatactggt 60

gaatttgaat caattgccaa atacacccca caagatgcta ccaccaatcc atcgttgatt 120

ttggcggctt ctaagaaggc tgaatacgcc aagttgattg acattgccat tgactacgct 180

caagataagg gatccaatcc taaggaaaaa gcttcaattg ctttagatcg tttgttggtt 240

gaattcggta aggaaatctt gaagattgtc cctggtagag tttctaccga agttgacgcc 300

agattgtctt tcaacaagga cgctaccatc aagaaggcca ttgaaatcat caagttatac 360

gaatccgttg gtatttctaa ggacagaatc ttgatcaaga ttgcttccac gtgggaaggt 420

atccaagctg ctagagaatt agaatccaag cacggaattc actgtaactt gactttatta 480

ttctctttcg tgcaagctgt tgcttgtgct gaagccaagg ttaccttgat ctctccattc 540

gtcggtagaa tcttagactg gttcaaggct tccactggta aggaatacga tggtgaaacc 600

gacccaggtg tgatctctgt cagaaagatt ttcaactact acaagaaata cggttacgac 660

accattgtca tgggtgcttc tttcagaaac actggtgaaa ttaaggcttt agcgggttgt 720

gatttcttga caatcgctcc aaagttatta gaagaattgt acaactctaa tgaagatgtt 780

ccaaagaaat tggactcttc ttctgctaat gccactgatg aagaaaaagt ctcttacatc 840

gataacgaag cagaattcag atacttattt aatgaagatg ctatggctac cgaaaaatta 900

tcagaaggta tcagaaactt cgctaaggat tgtgtcacct tattggatca attggaagca 960

agattcaaat aa 972

<210> 14

<211> 972

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母(Candida tropicalis)

<400> 14

atgtcctcaa actcattaga acaattaaaa gctaccggta ctaccattgt caccgatact 60

ggtgaattcg aacaaattgc caagtacaag ccacaagatg ccaccaccaa cccatccttg 120

atcttggctg ccgctaaaaa tccagactac gccagtgtca ttgatgttgc cattgaatac 180

gccaaagaaa aaggttctac cccaagagaa aaggctgaag ttgccctcga tagattattg 240

attgaattcg gtaagagaat cttggacatt gttccaggta gagtctcaac tgaagttgat 300

gccagattat cctttgacaa agaagccacc atcaaaaagg ctttgcaatt gattgatttg 360

tacaaagctc aaggtattga caagagcaga attttgatca agattgcttc cacttgggaa 420

ggtatccaag ctgctagaga attggaatct aaacacggta ttcactgtaa cttgactttg 480

ttgttcaact ttgctcaagc tgttgcttgt gctgaagctg gtgttacttt gatttcccca 540

ttcgttggta gaatcttgga ctggtacaaa gcttctactg gtgaaactta tactgctgaa 600

accgacccag gtgtcaaatc tgttaaagaa atttacactt actacaagaa atacggttac 660

aacaccattg ttatgggtgc ttctttcaga aacactggtg aaatcaaagc cttagctggt 720

gttgatttct tgaccatttc tccaaaatta ttagaagaat tgtacaactc tactgatgct 780

gttccaactg ttttggatgt tgaaaccgct aaagcttctg atattgaaaa agtcactttt 840

gttgatgatg aagctgcttt cagatttgca ttaaatgaag atgccatggc cactgaaaaa 900

ttatcccaag gtatcagaca atttggtaaa gacgctgtca ctttattgac tgaattggaa 960

aaaagatttt aa 972

<210> 15

<211> 972

<212> DNA

<213> 树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)

<400> 15

atgtcctcca actcccttga acaattgaaa gccacaggta ccgtcatcgt caccgacacc 60

ggtgaattcg actcgattgc caagtacact ccacaagatg ccaccaccaa cccatcgttg 120

attttggctg ctgctaagaa gcctgaatac gccaaggtca ttgacgtcgc cattgaatac 180

gccaaggaca agggttcctc caagaaggaa aaggctgaaa tcgccttgga ccgtttgttg 240

attgaattcg gtaagaacat cttggccatt gttccaggaa gagtgtctac cgaagtcgac 300

gccagattgt ctttcgacaa agaggccacc atcaagaagg ctcttgaatt gattgccttg 360

tacgaatccc aaggtatctc caaggacaga atcttgatca agatcgcctc cacttgggaa 420

ggtatccaag ctgccagaga attggaagcc aagcacggta tccactgtaa cttgactttg 480

ttgttctctt tcgttcaggc agttgcctgt gctgaagcca aggtcacctt gatctcgcca 540

ttcgtcggca gaatcttgga ctggtacaag gcttctaccg gaaagaccta cgaaggtgac 600

gaagacccag gtgtgatttc tgtcagagcc atctacaact actacaagaa gtacggctac 660

aaaactattg tcatgggtgc ctctttcaga aacaccggtg aaatcaaggc tttggctggt 720

tgcgactact taactgttgc tcctaagttg ttggaagaat tgttgaactc cactgaacca 780

gttccacaag tgttggacgc tgcttctgcc tctgctactg atgtcgaaaa ggtttcttac 840

gtcgatgacg aagctacctt cagatacttg ttcaacgaag acgccatggc taccgaaaag 900

ttggcccaag gtatcagagc tttcggcaag gacgctgtca ccttgttgga acaattggaa 960

gccagattct aa 972

<210> 16

<211> 741

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 16

atggcagaat tttccgctga tctgtgtctt tttgacctgg atggtactat cgtgtctaca 60

acagtggccg cagagaaggc atggaccaag ttgtgttacg aatacggtgt tgatccttcc 120

gagctgttta agcattctca tggtgcaaga acacaagagg ttttgagacg atttttccct 180

aagttggatg atacagacaa taagggtgtt cttgccctgg aaaaggatat tgcccattct 240

tacttggaca cagtgagcct tattcctggt gcagagaacc tgctgctgtc gctggatgtg 300

gatactgaga ctcaaaagaa gctgcctgaa cgaaagtggg ctatcgttac ctctggttct 360

ccctacttgg cattttcctg gttcgagaca atcttgaaga atgttggaaa gcccaaggtt 420

ttcattactg gttttgacgt gaagaacggt aagcctgatc ccgagggtta ctccagagcc 480

cgtgatctgt tgcgtcaaga tttgcaactg actggtaagc aggatctgaa gtacgttgtc 540

tttgaagatg cacccgtggg catcaaggcc ggtaaggcaa tgggcgcaat tactgtgggt 600

atcacatcct cgtacgataa gagcgttctg tttgacgcag gagcagatta cgtggtctgt 660

gatttgacac aggtttccgt ggttaagaac aatgaaaacg gtattgtcat ccaggtgaac 720

aaccctttga cacgagcctg a 741

<210> 17

<211> 651

<212> DNA

<213> 海栖热袍菌(Thermotoga maritima)

<400> 17

atggaagcgg tgattttcga catggatgga gtgctcatgg acacagagcc tctctacttc 60

gaagcttaca gaagagtcgc ggaaagctat ggaaaacctt acacggagga tctccacagg 120

agaataatgg gagttcctga aagagaaggt cttcccatcc tcatggaagc tctggagata 180

aaagattctc tggagaactt caaaaagagg gtccacgaag aaaaaaagcg cgttttctct 240

gagcttctca aggaaaatcc gggtgtaaga gaggcgctcg agttcgtaaa gagcaaaaga 300

ataaaactcg cgctcgcaac ctccacacca cagcgagaag cgctggagag attgagaaga 360

ctcgatctcg aaaagtactt cgacgtcatg gtgttcggtg atcaggtgaa gaacggaaag 420

cctgatccag agatatacct tctcgttctg gaaaggttga atgtggtccc agagaaggtt 480

gtggtcttcg aagactcaaa gagcggtgtt gaagccgcaa aaagcgccgg catagaaaga 540

atctatggag tcgttcactc tttgaacgac ggtaaagcgc ttcttgaagc gggtgcggtt 600

gctctggtga aacccgagga aatcctgaac gttctcaaag aggttcttta a 651

<210> 18

<211> 816

<212> DNA

<213> 埃希氏杆菌(Escherichia sp.)

<400> 18

atgagcgtaa aagttatcgt cacagacatg gacggtactt ttcttaacga cgccaaaacg 60

tacaaccaac cacgttttat ggcgcaatat caggaactga aaaagcgcgg cattaagttc 120

gttgttgcca gcggtaatca gtattaccag cttatttcat tctttcctga gctaaaggat 180

gagatctctt ttgtcgcgga aaacggcgca ctggtttacg aacatggcaa gcagttgttc 240

cacggcgaac tgacccgaca tgaatcgcgg attgttattg gcgagttgct aaaagataag 300

caactcaatt ttgtcgcctg cggtctgcaa agtgcatatg tcagcgaaaa tgcccccgaa 360

gcatttgtcg cactgatggc aaaacactac catcgcctga aacctgtaaa agattatcag 420

gagattgacg acgtactgtt caagttttcg ctcaacctgc cggatgaaca aatcccgtta 480

gtgatcgaca aactgcacgt agcgctcgat ggcattatga aacccgttac cagtggtttt 540

ggctttatcg acctgattat tcccggtcta cataaagcaa acggtatttc gcggttactg 600

aaacgctggg atctgtcacc gcaaaatgtg gtagcgattg gcgacagcgg taacgatgcg 660

gagatgctga aaatggcgcg ttattccttt gcgatgggca atgctgcgga aaacattaaa 720

caaatcgccc gttacgctac cgatgataat aatcatgaag gcgcgctgaa tgtgattcag 780

gcggtgctgg ataacacatc cccttttaac agctga 816

<210> 19

<211> 1374

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 19

atgctctttg cacctatcac cctcctggcc attgtcgctg gtgtgtctgc ccagaccacc 60

gcccataacg acttcagcgc ctacgatgag attgtttcca aggccacccg aacacccaag 120

ttctccacca tcaatcctgc tgccactgat atcgccaagg ctgccgagac tgccgctgtc 180

aactccttca aggacaagcc tctcgttaag ggtaaggcct ttgataagtt ctaccaggtg 240

tggctcgaga acactgacaa gtggaaggct cgggacgagc ccggtctcgt tgagctccag 300

aagcagggta tcactctgac caactactgg ggtctcactc acccctctga gcccaactat 360

gttggtgttg tcggtggtga ctactttggt atctttgatg atgccttcct ccgaatccct 420

gagaatgtgt ccactgttgt cgatctgctc gactccaaga acatctcttg ggccgagtac 480

caagaacacc agccccatgc cggcttcgag ggtttcaatt actctcgaca gtccgattac 540

gccaacgatt acgtccgaaa gcacaaccct ctcattatct acgactccgt tgtgtccaac 600

cctcacaacc tcggttacat caagaactac actgagttca acaaggacct aaagaacaag 660

gatcttcccc aatgggcctt cttcaccccc aacatgacca acgatggtca cgataccgat 720

atttctgttt cgggtcggta cgttaccaac tgggtcaagc ctctgctcaa caacaccgag 780

ttcgccaagg acagtctcat catcatcacg ttcgatgaga acgagaccta caaggaccag 840

aactcggtcc tcgctattct tcttggtggt gccgtccccg accatctgcg aggtaccact 900

gacgatacat tctacgacca ctactccaac ctcgccaccg tcgaggccaa ttgggagctc 960

ccccatcttg gacgtggcga tgttaatgcc aacgtcttca agtttgtcgc cgatgagctc 1020

aacatcaaga accgaaacat ttccactgag ggtttgtacc ataacgcctc tcagcctggt 1080

tactttatgg acgacaccgt ccctatcccg gtccctgacc tgactgccgt tggtatttcc 1140

ggtaacaaga ttctgcccaa gatcgccgag atctggggca aggctgctga gaagaactct 1200

actgtcgcct accctaactc cactgcgtcc gctacttccg gcgctggcgt cgctaaccct 1260

gacctcaacc acacctctcc cagcgttgtt ccctccaaga acaccaatgg agccaccctc 1320

attactcttt ctggagctgc tcttgttggt gccatcggtg ctcttcttct ctaa 1374

<210> 20

<211> 1668

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 20

atggctcagt ccttcacgac cttcaagcag gcctccgacc ttcccgcgtg gcagaagctc 60

cagacgctct atgactccaa gggcaagtcg ctgcccgtca agcagctgtt caaggaggac 120

cccgagcggt tcaacaagct gtcgcatacc ttcaccaact ttgatgactc caagattctg 180

tttgatttct ccaaaaacat tgtcgacgac gagattctgg cccagctggt ggagctggcc 240

aaggaggcca acgtctatgg cctgcgagac gagctgtttg agggcgacaa gatcaacttc 300

acagagaacc gagccgtttt ccaccccgct ctgcgaaacc gagccaacgt ggccatggac 360

gtggacgaca agaatgtcgc tcccgaggtc gacgacgtgc ttgctcacat gaaggagttc 420

tccgagcagg tccgaagcgg cgagtggaag ggttacaccg gcaaggagat cactgatatc 480

gtcaacattg gtatcggagg ctccgatctc ggccccgtca tggtctccga ggccctcaag 540

ccttacgcca agaagggtct gcgagctcac tttgtgtcca acattgatgg tacctccatt 600

gctgaggagg tcattaagca gctcaacccc gagaccaccc tgttcctgat tgcctccaag 660

accttcacca ccgctgagac catcaccaac gccacctcgg ccaagacctg gttcctggag 720

accgccaagg acactaagca cgtggccaag cactttgttg ctctctctac caacaaggag 780

aaggttgtcg agttcggcat cgatgaggcc aacatgtttc cttttgcctc ttgggttgga 840

ggccgatact cggtctggtc ctccattgga ctgtcagtcg ccatctacgt tggctttgac 900

cacttcaatg acttcctcaa gggtgccgag gctgttgaca agcacttcaa ggaggctcct 960

cccgagaaga acatccccct gctcggcggt ctgctgtccg tttggtacaa caacttcttc 1020

aacgctcaga ctcacctcat tgctcccttt gaccagtacc tgcaccgatt ccctgcctac 1080

ctgcagcagc tgtccatgga gtccaacggt aagggcgtga cccgatccaa cgagtacgtc 1140

aagtactcca ctggacccgt tctgtttggt gagcccgcca ccaacgccca gcactccttc 1200

ttccagctgg ttcaccaggg tactaagctc atccccgccg acttcattct ggccgcacag 1260

tcccacaacc ccatcgacca caacctgcac cagcgaatgc tggcttccaa cttctttgcc 1320

cagtctgagg ctctgatggt tggcaagacc caggagcagg ttgaggccga gggcaccccc 1380

gccgaccttg ttccccacaa gatcttcctg ggcaaccgac ccaccacctc cattctcacc 1440

cagctcatta cccccgccac ccttggcgct ctgattgctt actacgagtg ggtcaccttt 1500

accgagggtg ccgtgtggaa catcaactcc tttgaccagt ggggagttga gcttggaaag 1560

gctctggcca agaagatcca gcccgagctg gagaacaagt ctgagattga tgctcacgac 1620

ggatccacta acggtctgat caaccagtac aaggcttggg ccgcttga 1668

<210> 21

<211> 771

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 21

atgtctggac cttccaccct cgccacggga ctgcaccctc tccccacaga gaccccaaag 60

ttccccacca acatcatgga ccgattctcc ctcaagggta aggttgcctc cgtcaccggc 120

tcctcgtcag gtatcggcta ctgcgtggcc gaggcctacg cccaggccgg tgccgacgtg 180

gccatctggt acaactccca ccccgccgac gcaaaggctg agcacctcgc taagacctac 240

ggcgtcaagg ccaaggccta caagtgccct gtcaccgacg ccgccgccgt ggagtccacc 300

atccagcaga tcgagaagga ctttggcacc attgacatct tcgtcgccaa cgctggtgtc 360

ccctggaccg ccggccccat gatcgacgtg cccgacaaca aggagtggga caaggtcatc 420

aacctggatc tcaacggtgc ctactactgc gccaagtacg ccggccagat cttcaagaag 480

aagggcaagg gatccttcat cttcaccgcc tccatgtccg gccacattgt caacatcccc 540

cagatgcagg cctgctacaa cgccgccaag gccgctctgc tgcacctgtc tcgatcgctg 600

gccgtcgagt gggccggctt tgcccgatgc aacacagtct cccctggcta catggccacc 660

gagatctccg actttgtccc caaggagacc aaggagaagt ggtggcagct cattcccatg 720

ggccgagagg gagacccctc cgagctctac ctacctctac cttgcctctg a 771

<210> 22

<211> 1032

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 22

atgtctctct tttcactcgc caagaaaacc gccgtcatca ccggaggaag tggtggtctg 60

ggtatcgcag ctgccaagca gcttcttcga gccggagcct ctgttgctct ggtcgacaac 120

aacctgcctc gaatccagcc tgctgccgag cagcttctag agtggtacaa gaccgccaac 180

gaggctcatc ataacgtccg accaaccccc atctatgcct ctcctactgg cacacacaag 240

gtttctgaaa cagaaacaga atcaacaact gggggcttga acgagcactc tccacacgat 300

atcaccaagc ctgacatctc tctggatgct tctgcagact ccagtcagtc gtctgttgcc 360

cacgacgctg ctcgagccca cgaagctgca ggaatacctc ctggaaaggg caagaacttt 420

ccccagcaac gaatctctgc ctgggcatgc gatgtatctg acgtccacca ggtctccgat 480

accgtcaagg ccattcgaga gcaccacaag agccccctcg atattttggt caactgtgcc 540

ggattctgcg agaatatgac tgcctttgat tatcccaacc cccaggtcaa gcgactgctg 600

gacgtcaacc tcatgggatc ctacaacttc gctaccgagg tggccaagtc gcttgtcctg 660

gacgagtctc ctggatctct gattctggtt gcatccatga gtggctccat tgtcaacgac 720

ccccagcccc agacccccta caacatgtcc aaggcaggtg tcatccacat ggccaagtct 780

ctggctgccg agtgggccca gtacaacatc cgagtcaaca ctctgtctcc cggctacatt 840

cttactcctc tgacccgtca catcatcgag actgacggag agctccgaaa cgactgggag 900

cgacgaattc ctttccgacg aatggctgag cccgaggagt ttggaggccc tattgtcttc 960

atggcttccg acgcctccag ctacatgacc ggccacgatc tcattgtcga tggaggttac 1020

accatctggt aa 1032

<210> 23

<211> 942

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 23

atggtttctt cagccgctac ttctgctctg cccatctcgg caccctacac cttctaccct 60

caggctcgag ttcctgcccc caagaagctc gttggactca atgctgctct ggaggcccag 120

aagaaccccg agttcgaggt gaagcccgag atctttaagg agttctctct gcccgacggt 180

gttgccattg tcaccggagg aaactccggt attggtcttg agtactcagt ctgcctcgcc 240

gagctcggtg ccactgtcta ctgtcttgac atgcccgaga ctccctctga ggagttcctg 300

gcttgccagt cctacgttaa gcgaatgccc ggcaacgcct ctctggtctt caagcgagcc 360

gacgtcactg acgaggagac tatgaactcc ctcttccaga acattgccga gacccacggc 420

aagattgacg ttgtcatcgc taacgccggt gtgcttggac ctcgagcctc ttgcaacgag 480

taccccgctg actggttccg aaaggtcatg gacgtcaacg tcaccggtgt ctttatcacc 540

gcccaggccg cctctcgaca gatgattgcc accaagactt ctggttctat cattgtcacc 600

gcctccatgt ccggctccat tgtcaaccga gacatgccct ggtgcgccta caacgcctcc 660

aaggccgctg ctgctcatct tgtcaagtcc atggctgctg agctcggcca gtttgagatt 720

cgagtcaact ccatctcccc cggtcacatc cagactgcta tgactgacgt ctgtcttgac 780

gctgagcccg gtcttggtaa ccagtgggcc ttccagaacc ccatgggccg acttggaggt 840

gtctccgagc ttcgaggagt ctgcgcctac cttgcatctt ccgcctcctc ctacaccacc 900

ggctctgaca ttcttgtctg cggtggccac cacgtctggt aa 942

<210> 24

<211> 5260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cagatcttgg tggtagtagc aaatattcaa atgagaactt tgaagactga agtggggaaa 60

ggttccgtgt gaacagcagt tggacacggg taagtcgatc ctaaggggtg gcataactgt 120

cgcgtacggc ccgataaggg ccttctccaa aagggaagcc ggttgaaatt ccggcacttg 180

gatgtggatt ctccacggca acgtaactga atgtggggac ggtggcacaa gtcttggaag 240

gagttatctt ttctttttaa cggagtcaac accctggaat tagtttgtct agagataggg 300

tatcgttccg gaagaggggg gcagctttgt cccctccgat gcacttgtga cgccccttga 360

aaacccgcag gaaggaatag ttttcacgcc aagtcgtact gataaccgca gcaggtctcc 420

aaggtgaaca gcctctagtt gatagaataa tgtagataag ggaagtcggc aaaatagatc 480

cgtaacttcg ggataaggat tggctctggg ggttggtgga tggaagcgtg ggagacccca 540

agggactggc agctgggcaa ctggcagccg gacccgcctg aggtgtctca caagtgccgt 600

gcagtcccgc ccccacttgc ttctctttgt gtgtagtgta cgtacattat cgagaccgtt 660

gttcccgccc acctcgatcc ggctgaggtg tctcacaagt gccgtgcagt cccgccccca 720

cttgcttctc tttgtgtgta gtgtacgtac attatcgaga ccgttgttcc cgcccacctc 780

gatccggctg aggtgtctca caagtgccgt gcagtcccgc ccccacttgc ttctctttgt 840

gtgtagtgta cgtacattat cgagaccgtt gttcccgccc acctcgatcc ggctgaggtg 900

tctcacaagt gccgtgcagt cccgccccca cttgcttctc tttgtgtgta gtgtacgtac 960

attatcgaga ccgttgttcc cgcccacctc gatccggcac gggcaaaagt gcgtatatat 1020

acaagagcgt ttgccagcca cagattttca ctccacacac cacatcacac atacaaccac 1080

acacatccac aatggaaccc gaaactaaga tggttcatct tggtccccga aaacccccgt 1140

cccgaaaggg ctcaatggca gacgtcccgc gggacctgct ggagcaaatc tcccagcttg 1200

aaaccatctt caccgtttcg cccgaaaagc tgcgtcaaat caccgaccac tttgtgtccg 1260

agctcgctaa aggcctcaca aaggagggtg gagatatccc catgaacccc acctggattc 1320

tgggatggcc caccggaaag gagagcggct gctatctggc tctcgacatg ggtggcacca 1380

acctgcgagt tgtcaaggtg actctggacg gcgaccgagg cttcgacgtc atgcagtcca 1440

agtaccacat gccccccaac atcaaggtcg gcaagcaaga ggagctgtgg gagtacattg 1500

ccgaatgtct gggcaagttc ttggccgaca attatcctga ggctcttgat gcccatgagc 1560

gaggacgaga tgtcgacaga accgctgcgc agagcttcac tcgagacaag tctcctcctc 1620

cccacaacca gcacatttcg tgttctcctg gcttcgacat ccacaagatt cctctcggtt 1680

tcaccttttc atatccctgc tctcagcccg ccgtcaaccg aggtgtactg cagcgatgga 1740

ccaagggttt cgacattgag ggagtcgagg gcgaggacgt ggtccccatg ctggaagctg 1800

ccctcgaaag aaagaacatt cctatttcca tcaccgccct gatcaacgac accaccggaa 1860

ctatggtggc ctccaactac cacgaccccc agatcaagct gggtaacatc tttggtactg 1920

gtgtcaacgc cgcctactac gagaaggtca aggacattcc caagctcaag ggtctcatcc 1980

ccgacagcat tgatcccgag acccccatgg ccgtcaattg cgagtatgga gccttcgaca 2040

atgagcacaa ggttctccct agaaccaagt gggacatcat catcgatgag gagtctcccc 2100

gacccggtca gcagaccttc gagaagatga gtgctggcta ctacctggga gaattgcttc 2160

gtctggttct tctggacctg tacaaggacg ggtttgtgtt cgagaaccag ggcaagaacg 2220

gtcaggagct tggaaacggc aacatcaaca agtcgtattt cttcgacacc tctttcctgt 2280

ctctgattga ggaggatccc tgggagaact tgactgatgt cgagattctc ttcaaggaga 2340

agcttggtat taacaccact gagcccgagc gaaagctcat tcgtcgactg gccgagctca 2400

ttggtactcg atccgctcga atctctgcct gtggtgtcgc tgccatctgt aagaaggctg 2460

gctacaagga ggctcacgct ggagctgacg gatccgtgtt caacaagtac cccggattca 2520

aggagcgagg cgcccaggct ctcaacgaga tttttgagtg gaacctgccc aaccctaagg 2580

accaccccat caaaatcgtt cccgctgagg atggtagcgg tgttggagct gctctgtgcg 2640

ctgctctcac catcaagcga gtcaagcagg gtcttcccgt tggtgtcaag cccggtgtca 2700

agtacgatat ttaggcaatt aacagatagt ttgccggtga taattctctt aacctcccac 2760

actcctttga cataacgatt tatgtaacga aactgaaatt tgaccagata ttgttgtaaa 2820

tagaaaatct ggcttgtagg tggcaaaatc ccgtctttgt tcgtcggttc cctctgtgac 2880

tgctcgtcgt ccctttgtgt tcgactgtcg tgttttgttt tccgtgcgtg cgcaagtgag 2940

atgcccgtgt tcgaatacgg tagtcgcacg gaataacttc gtataatgta tgctatacga 3000

agttatagag accgggttgg cggcgcattt gtgtcccaaa aaacagcccc aattgcccca 3060

attgacccca aattgaccca gtagcgggcc caaccccggc gagagccccc ttctccccac 3120

atatcaaacc tcccccggtt cccacacttg ccgttaaggg cgtagggtac tgcattctgg 3180

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 26

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tcttcctatc ataccgaagc ag 5422

<210> 27

<211> 5260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cagatcttgg tggtagtagc aaatattcaa atgagaactt tgaagactga agtggggaaa 60

ggttccgtgt gaacagcagt tggacacggg taagtcgatc ctaaggggtg gcataactgt 120

cgcgtacggc ccgataaggg ccttctccaa aagggaagcc ggttgaaatt ccggcacttg 180

gatgtggatt ctccacggca acgtaactga atgtggggac ggtggcacaa gtcttggaag 240

gagttatctt ttctttttaa cggagtcaac accctggaat tagtttgtct agagataggg 300

tatcgttccg gaagaggggg gcagctttgt cccctccgat gcacttgtga cgccccttga 360

aaacccgcag gaaggaatag ttttcacgcc aagtcgtact gataaccgca gcaggtctcc 420

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<400> 28

gcaaggagac agcgtggtga ttcaacagga ttaaaaacag tctggttcca tggttatttt 60

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<210> 29

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

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agaagcctga agcgtcacaa caggagccgg cggtgtcaga aacgccagtc aagggcaagg 3480

ccaagaagat cacctttgac gaggacggaa tgagtgccga gcccatcgtt gagaagaaaa 3540

aggtggttgt ggaggagtct gaagacgaca gtgacgatgc ccccgaggag gaaacactgg 3600

aggatggaca ggaaaagacc ctggccaagc aaaaggaaca gcagcggctg gcagcattag 3660

agaaggcgga agagaagaag aagcggcggg aggccaacga ggtgctggct aaacaggcca 3720

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<210> 30

<211> 3782

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gacattctca ccagactgag atgtactacg accacgctag ccgagagtgg gtcaagcagg 60

acaccattcg aaagttctac aacaacggca ccgagtccga gatcgtcaag gagtctcggg 120

atcctattgg caagtagaca ttgaggtctt cttttagtaa atagttctgt ccatttactg 180

gacattttaa catagcaatt tattctcata ctgaatcacc agattttagg ttcccttatc 240

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cgtcatatag gtacttgtac gtcactcttc agagagaact ctccacggag tcttatatcc 420

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tgtagtgctg gtttcgtttc ttgagaaact cttcatgttg ctgttgatcc tcttctctca 720

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ccgtcgcctc ttcatcgtcc tcagcgtagt actcgttgtc tcccagagtg ccggcatacg 900

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ggaactccgt ggtgcccgac gacgcctcat cgcttcggat aactcctgct atacgaagtt 1080

atacctgagg tgtctcacaa gtgccgtgca gtcccgcccc cacttgcttc tctttgtgtg 1140

tagtgtacgt acattatcga gaccgttgtt cccgcccacc tcgatccggc tgaggtgtct 1200

cacaagtgcc gtgcagtccc gcccccactt gcttctcttt gtgtgtagtg tacgtacatt 1260

atcgagaccg ttgttcccgc ccacctcgat ccggctgagg tgtctcacaa gtgccgtgca 1320

gtcccgcccc cacttgcttc tctttgtgtg tagtgtacgt acattatcga gaccgttgtt 1380

cccgcccacc tcgatccggc tgaggtgtct cacaagtgcc gtgcagtccc gcccccactt 1440

gcttctcttt gtgtgtagtg tacgtacatt atcgagaccg ttgttcccgc ccacctcgat 1500

ccggcacggg caaaagtgcg tatatataca agagcgtttg ccagccacag attttcactc 1560

cacacaccac atcacacata caaccacaca catccacaat ggaacccgaa actaagatgt 1620

cgaagaagtt taacggtaag gtctgtctgg tcaccggcgc tggtggcaac atcggtcttg 1680

ctaccgccct ccgtctggcc gaagagggca cggccatcgc ccttctggac atgaaccgag 1740

aggctctgga aaaggctgaa gcctccgtcc gtgaaaaggg cgtcgaagcc cgatcctatg 1800

tctgtgacgt cacgtccgaa gaggccgtga tcggtacggt ggatagcgtg gtccgggact 1860

tcggtaagat cgacttcctg ttcaacaacg ccggctatca gggagccttc gcccccgtgc 1920

aggactaccc gtccgacgat ttcgcccgag tgctgacgat caacgtcact ggtgccttcc 1980

acgtcctcaa ggccgtttcg cgacagatga tcacgcagaa ctacggtcga atcgtcaaca 2040

ccgccagcat ggccggtgtg aagggaccgc caaacatggc cgcctatggt acgtccaagg 2100

gagccatcat cgccctgacc gaaacggccg ctcttgacct tgccccctac aacatccgtg 2160

tgaacgccat cagccccggt tacatgggtc ccggtttcat gtgggagcgt caggtcgagc 2220

ttcaggccaa ggtcggaagc cagtatttct ccaccgatcc caaggtcgtg gcccagcaga 2280

tgatcggcag cgttccgatg cgacgatatg gcgacatcaa cgagattccg ggcgtggtgg 2340

ctttcctgct gggtgatgat tccagcttca tgacgggtgt gaacctgccg attgctggcg 2400

gttgagcaat taacagatag tttgccggtg ataattctct taacctccca cactcctttg 2460

acataacgat ttatgtaacg aaactgaaat ttgaccagat attgttgtaa atagaaaatc 2520

tggcttgtag gtggcaaaat cccgtctttg ttcgtcggtt ccctctgtga ctgctcgtcg 2580

tccctttgtg ttcgactgtc gtgttttgtt ttccgtgcgt gcgcaagtga gatgcccgtg 2640

ttcgaattgg gtagtcgcac ggaagaataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 2700

gtaggatgaa ggaggtgaac atgacaacca ggaggattcg gcctgccagg agcacgtact 2760

tggaccggtc cttgtcgtca atagagggga gaccagggag acctcgcttg gacttgtcct 2820

tgacaaaggc gtcgttaaga gcgatgaaaa gaccgccaat gacggacagg tttcgcagaa 2880

tgaagccaaa gtcaaagatg aggccgtagg ccagagcctg ggtgacaatg actccgacca 2940

gcagaccgca accgacctca attcgcttct tggcggtgac catgaaggat ccggcgatca 3000

tggcaaccac gttgagcagc agaaagatga cggtgataaa cttggggatg tgcttgaagt 3060

tggtgatgta gtagacctgg tcagaccact gtgtgaggat tcggagcgcg tcctccagga 3120

aagtgacgac aatgaggaac cggccgaggg tgggaagatg gggcttgacc gggcccgagt 3180

acttgtccag gaagacctca atcttctggg tcacggcctt gaccttgtcg gcaaagtcgc 3240

cctctgtgat tgtggatttg aggttgaagt cgcggttctg ggagtaggac gaaaactgtt 3300

gaccctgggg ggctgcgaat tgcggcgcgt cgctctggac gggtatctgg tggtatttgg 3360

cggtgcctcg gatcgacatt gttgtatggt gtggtgttaa cacaggaaga ttgtgaaagg 3420

tagaatatgt aatcttgtgt gtgccaggtg gtctttcgag agtttgttca gatcagcatg 3480

cccacttcgc tgcagtagcc aaaaacagat gtgtggaatg ggaagggtgg gaagctggga 3540

ctaggcaggg tagttgtaag tggacgttgg agggctaata tatctccgtt attccgccat 3600

tgcgtgtcct cttatacaga ttggccactt ttacggcgat gacatctccc atcttgctgt 3660

tctcttcggt taattaatta ggtcatctca aactacagta ttagctacag tccacgtcat 3720

gcggcggcaa gctactgtat ttggtggggt tgggggggaa aggatgttta ttactgtaga 3780

gc 3782

<210> 31

<211> 3814

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cacctttctg ccccaaagta cttgtacaaa aatagacccc aaattgcacc tttcaaacct 60

ccaacatctt cacccacatc tctctgaccc caactcaccg caccatcgct gatgcgtctc 120

aacggcacac tctaggtttc gtttgtgggg cgatgagtgt cccctcatca tctgcacgct 180

ctttcaagtg tctcccctct tggcggctgg cgttccgggc tgtggaagat tccagaagtg 240

cggaagtgca gtaagcggga cgagggactt tctcggagct ctgtcacgtg aatctctcgg 300

ccgaagcgtc acgtggcaga atttatgcgt gtcctcttct tcctgtgacg gatcgacatt 360

gccacgatgc tacaaaaaga gtagcggcaa aaggagtaag tggtcaacag ccatgtagct 420

tagctcacaa aaagaagaga gcaaagaatc gaggaacgga atcgaaggat gaagagcaga 480

gcaacgtagt gtagagagat gacttccgta tcacgagcaa gcaaacatct tcactctcca 540

agagctgcca ctgtagcatc aacatgagac atggcaagta ttatgcatgg tgcacttgta 600

acatagcccc cagatcaggg atattctgaa actagagcca tctcaacaca acagtctctt 660

tgtgtagcta cttgtaccct ttttctcttc ctctctccag ccagacatct ttgctagcgc 720

ctataatgta acccatcaag acatgcacag gagatgctta atcggagtgt gtggtctgta 780

ggggagatcg agagagactg caattgacag agagatcgaa gttggaatga gagagactga 840

aaattaagcg agcttgggtg tttgcccctc ccctcacacc ctcggatact gtacctacat 900

atccaggccg gtttggcacg gcatcaaaag cctcctacaa gaatgtatat gcaactcttc 960

tacaagtaga tttccgcgct tgcaccaacg gctacgccca agacggggct cgtacccgtc 1020

cgtctatggt tcagccgcca acgaaaaaaa aaaaaaagga tggctgtaat tttattatgc 1080

atcgcttcgg ataactcctg ctatacgaag ttatacctga ggtgtctcac aagtgccgtg 1140

cagtcccgcc cccacttgct tctctttgtg tgtagtgtac gtacattatc gagaccgttg 1200

ttcccgccca cctcgatccg gctgaggtgt ctcacaagtg ccgtgcagtc ccgcccccac 1260

ttgcttctct ttgtgtgtag tgtacgtaca ttatcgagac cgttgttccc gcccacctcg 1320

atccggctga ggtgtctcac aagtgccgtg cagtcccgcc cccacttgct tctctttgtg 1380

tgtagtgtac gtacattatc gagaccgttg ttcccgccca cctcgatccg gctgaggtgt 1440

ctcacaagtg ccgtgcagtc ccgcccccac ttgcttctct ttgtgtgtag tgtacgtaca 1500

ttatcgagac cgttgttccc gcccacctcg atccggcacg ggcaaaagtg cgtatatata 1560

caagagcgtt tgccagccac agattttcac tccacacacc acatcacaca tacaaccaca 1620

cacatccaca atggaacccg aaactaagat gtcgaagaag tttaacggta aggtctgtct 1680

ggtcaccggc gctggtggca acatcggtct tgctaccgcc ctccgtctgg ccgaagaggg 1740

cacggccatc gcccttctgg acatgaaccg agaggctctg gaaaaggctg aagcctccgt 1800

ccgtgaaaag ggcgtcgaag cccgatccta tgtctgtgac gtcacgtccg aagaggccgt 1860

gatcggtacg gtggatagcg tggtccggga cttcggtaag atcgacttcc tgttcaacaa 1920

cgccggctat cagggagcct tcgcccccgt gcaggactac ccgtccgacg atttcgcccg 1980

agtgctgacg atcaacgtca ctggtgcctt ccacgtcctc aaggccgttt cgcgacagat 2040

gatcacgcag aactacggtc gaatcgtcaa caccgccagc atggccggtg tgaagggacc 2100

gccaaacatg gccgcctatg gtacgtccaa gggagccatc atcgccctga ccgaaacggc 2160

cgctcttgac cttgccccct acaacatccg tgtgaacgcc atcagccccg gttacatggg 2220

tcccggtttc atgtgggagc gtcaggtcga gcttcaggcc aaggtcggaa gccagtattt 2280

ctccaccgat cccaaggtcg tggcccagca gatgatcggc agcgttccga tgcgacgata 2340

tggcgacatc aacgagattc cgggcgtggt ggctttcctg ctgggtgatg attccagctt 2400

catgacgggt gtgaacctgc cgattgctgg cggttgagca attaacagat agtttgccgg 2460

tgataattct cttaacctcc cacactcctt tgacataacg atttatgtaa cgaaactgaa 2520

atttgaccag atattgttgt aaatagaaaa tctggcttgt aggtggcaaa atcccgtctt 2580

tgttcgtcgg ttccctctgt gactgctcgt cgtccctttg tgttcgactg tcgtgttttg 2640

ttttccgtgc gtgcgcaagt gagatgcccg tgttcgaatt gggtagtcgc acggaagaat 2700

aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atgtgttaac ttattgcatt taatattatg 2760

attatgattc gaaaacacta ggaacgttgt atttgtagaa cttcaccagt aatcaatgta 2820

ggagtacgag taatagaata atctcgggac agcaatgtaa gagacttaca catttcagaa 2880

ttgatgaaat ttgcacttgg aacgaagtcc ctcgaactgc aaccgctatt tgcacgaact 2940

cgccgcttcc tgaaagacgc tgaagactca acttgctaaa ctgagaatta ataccgtttc 3000

ttgaaatcta cttgtagtta ctctttattg cactctgtag caggaaagga ttaatacaac 3060

tacttgtagt cctctgaacg cgaatcacct cacaccatct aagacaagtg tgcagataat 3120

tgcatcaagt aagccctaca caacggtgga ggaaaaagca acccgaccag gcagagggcc 3180

aggaacactc cgacagtctc ggacgcttct gggagtctct tacacatgaa aaatctgatt 3240

caccgggagt gcacgttgcc ccagattttt gtttttcatt tcactgcctt accatgtccg 3300

gagacgagaa acttttgcgg aagacccttt cgggaagtct ctatgcacca cacaccgctt 3360

tagaggtcac gatatttgaa aatgtgtttc ggatctactg tatgtacatc ttagaaactc 3420

gctcgggtga acaaatttca gccccggata ttaccgaccc gtacccgaga ttgtactgtt 3480

gtccaacata ggttacatcg ggatgttccg tacagcccgc gcactttgaa agcacatgct 3540

acgttagggg ggatttatgg agcaaattgc ggtgttctgt tactgttgta caactcgtga 3600

gcggaatctc tctattgaga gtcgtgctca taccgaataa tcgatttgct tccaatttca 3660

cttacagagc acatgaatct ttgccaccag gagatctgca tctttagtaa gaaaaagaca 3720

gtatcgtcgt cacacgtcac atgacctcaa acctgttgtc gacacagctg tcgatcagca 3780

cgtggtctct ccagcttccc gctgaagatt agtt 3814

Claims

1.一种能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于，以解脂耶氏酵母菌株为底盘微生物，通过代谢工程或基因工程手段，构建以葡萄糖、甘油、淀粉中的一种或几种为碳源发酵高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法。

2.如权利要求1所述的能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述底盘微生物为基因组中含有与SEQ ID NO.1序列具有97％及以上同源性的DNA序列的解脂耶氏酵母菌株。

3.如权利要求1所述的能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于，在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中表达以下基因的一种或一种以上：

(1)编码己糖激酶的基因；

(2)编码转酮酶的基因；

(3)编码转醛酶的基因；

(4)编码4-磷酸-赤藓糖磷酸化酶的基因。

4.如权利要求1或3所述的能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中敲除其自身的以下基因中的一种或一种以上：

(1)6-磷酸葡萄糖异构酶基因；

(2)甘露醇脱氢酶基因；

(3)阿拉伯糖醇脱氢酶基因；

(4)赤藓糖醇脱氢酶基因。

5.一种如权利要求1-4中任一项所述的构建方法构建得到的能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株。

6.一株能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，所述菌株为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ery949-4Δ，保藏编号为CGMCC No.19351。

7.一种利用如权利要求5或6所述的能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株发酵合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、将所述重组解脂耶氏酵母菌株培养于含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基中，在起始pH值3.0～7.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌发酵培养，发酵结束后菌液分离得到含赤藓糖醇的发酵液以及酵母细胞；

8.如权利要求7所述的利用能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株发酵合成赤藓糖醇的方法，其特征在于：

步骤S1中，所述培养基中的碳源为葡萄糖、果糖、甘油中的一种或几种混合，所述培养基中碳源含量为50～350克/升；所述培养基中的氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合，一般用量5～30克/升；所述培养基中的无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜、氯化锌中的一种或一种以上。

9.如权利要求7所述的能高效合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株发酵合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，

步骤S2中，所述分离纯化包括：菌液分离得到澄清含赤藓糖醇的发酵液、浓缩得到富含赤藓糖醇浓缩液、一次结晶得到赤藓糖醇粗制品、粗制品重溶、离子交换去除离子、脱色、浓缩、二次结晶得到赤藓糖醇精制品、干燥。