CN113151237A - 一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明在高酶活分散泛菌来源蔗糖异构酶的基础上，筛选获得两株单点热稳定性提高的突变菌株V280L，S499F以及一株组合突变体V280L/S499L。三株突变体在热稳定显著提高的同时，酶的活性不受影响。本发明中的这些突变体比天然蔗糖异构酶更适用于工业生产，具有非常巨大的应用前景和产业价值。

Description

一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法技术，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
蔗糖异构酶(EC5.4.99.11)，又被称为异麦芽酮糖合成酶，蔗糖变位酶，属于α-淀粉酶13家族，是一种工业应用价值极高的异构酶，可以高效异构蔗糖生成异麦芽酮糖和海藻酮糖，异麦芽酮糖是近年来新兴的一种功能性甜味剂，是糖尿病患者最理想的蔗糖替代糖，在食品、医药等工业中具有广阔的应用前景，而蔗糖异构酶是目前生物酶法工业化生产异麦芽酮糖最有效的酶。
目前已报道的蔗糖异构酶在生物催化过程中显示出有限的热稳定性，如来源于克雷伯氏菌sp.LX3的蔗糖异构酶，在50℃下的半衰期仅有1.8min，来源于肺炎克雷伯菌的蔗糖异构酶在50℃孵育20min后失去其40％的活性，大黄欧文菌来源的蔗糖异构酶在30℃保存24h后活性完全失去活性。
然而，大多数研究只是通过固定化酶或细胞表面展示来提高酶的热稳定性，但它们的热稳定性在工业应用中仍然令人不甚满意。因此，对蔗糖异构酶进行分子修饰以提高其热稳定性的研究将是本发明的研究重点。
发明内容
为了解决目前蔗糖异构酶突变体热稳定性不高的问题，本发明提供了一种蔗糖异构酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位和/或第499位的氨基酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，编码所述蔗糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位的缬氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为：V280L，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为：S499F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位缬氨酸突变为亮氨酸，同时将第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为：V280L/S499F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明提供了一种制备上述突变体的方法，所述方法具体步骤如下：
(1)以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，根据理性设计的位点，设计定点突变引物，进行PCR扩增获得含有突变位点的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体。
(2)将含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内。
(3)对上一步构建的重组细胞进行筛选验证，获得阳性克隆，然后通过培养发酵产酶，离心收集细胞，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心获得含有蔗糖异构酶突变体的粗酶液。
本发明还提供了一种编码上述蔗糖异构酶突变体的基因。
本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pXMJ19载体、pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体和pDXW-10载体中的任一种作为表达载体。
本发明还提供了一种携带上述基因，或上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酵母菌(Saccharomyces)中的任一种为表达宿主。
本发明还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，表达了上述蔗糖异构酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pXMJ19载体、pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体和pDXW-10载体中的任意一种为表达宿主。
本发明还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌以谷氨酸棒杆菌为宿主，表达了上述蔗糖异构酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以谷氨酸棒杆菌ATCC 13012为表达宿主。
本发明提供了一种提高蔗糖异构酶热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位和/或第499位的氨基酸进行突变。
本发明还提供了上述重组载体，或者上述重组细胞在制备蔗糖异构酶中的应用。
本发明还提供了上述蔗糖异构酶突变体，或编码上述突变体的基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在转化蔗糖生产异麦芽酮糖中的应用。
有益效果
(1)本发明在天然蔗糖异构酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造蔗糖异构酶分子结构，分析了突变后残基对酶热稳定性的影响，并最终获得了两株单点突变稳定性提高的突变菌株V280L，S499F以及组合突变株V280L/S499F。
(2)天然蔗糖异构酶的半衰期为11.2min，本发明提供的蔗糖异构酶突变体V280L在45℃时半衰期达到25.4min，是天然蔗糖异构酶的半衰期的2.26倍；蔗糖异构酶突变体S499F在45℃时半衰期达到21.5min，是天然蔗糖异构酶的半衰期的1.92倍；V280L/S499F在45℃时半衰期达到100min，是天然蔗糖异构酶的半衰期的8.9倍。
(3)本发明提供的蔗糖异构酶突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响。其中，突变体V280L和S499F在酶催化活性基本不变的情况下在45℃热处理20min后，突变体V280L和S499F以及组合突变体V280L/S499F分别保留49.1％，43.2％和93.3％的相对酶活，对照组则仅仅保留15.7％的相对酶活。
(4)本发明所得的蔗糖异构酶突变体比野生型更适合于催化蔗糖生成异麦芽酮糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。
附图说明
图1：野生型蔗糖异构酶及蔗糖异构酶突变体纯酶液的SDS-PAGE分析；其中：M，protein maker；1，野生型pdsi纯酶液；2-12分别为：含有E76R，A100E，G152P，I205M，V280L，S328F，S499F，S563R，S563L，N578M，V280L/S499F纯酶液。
图2：45℃，pH6.0条件下孵育20min后野生型蔗糖异构酶及其突变体的残留活性。
图3：45℃条件下野生型蔗糖异构酶及蔗糖异构酶突变体V280L，S499F，V280L/S499F的半衰期。
图4：pH对野生型蔗糖异构酶及蔗糖异构酶突变体V280L，S499F，V280L/S499F酶活的影响。
图5：温度对野生型蔗糖异构酶及蔗糖异构酶突变体V280L，S499F，V280L/S499F酶活的影响。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的pXMJ19载体购自Invitrogen；下述实施例中所涉及的BHI液体培养基：购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl。
LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加2％琼脂。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
蔗糖异构酶酶活测定方法：取100μL适当浓度的纯酶加入到含有200g/L的蔗糖的50mM pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的900μL反应体系中；于30℃水浴条件下反应10min，然后100℃沸水浴10min终止酶促反应，离心取上清，适当稀释一定的倍数后，利用HPLC检测反应溶液中异麦芽酮糖的含量。
酶活定义：定义在30℃、pH 6.0的条件下，每分钟催化蔗糖生成lμmol异麦芽酮糖所需的酶量，为一个酶活单位U。
比酶活：定义为单位蛋白的酶活U/mg。
实施例1：含蔗糖异构酶突变体的重组质粒的构建
具体步骤如下：
(1)含有野生型的蔗糖异构酶pdsi的重组质粒的构建
化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型的蔗糖异构酶pdsi，与pXMJ19载体采用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶酶切后连接，制备得到重组载体pXMJ19-pdsi。
(2)含有突变体的重组载体的获得：
利用全质粒PCR技术，将步骤(1)制备得到的重组载体pXMJ19-pdsi为模板进行定点突变，分别获得含有突变体基因的重组质粒pXMJ19-A100E，pXMJ19-I205M，pXMJ19-S563L，pXMJ19-N578M，pXMJ19-G152P，pXMJ19-S328F，pXMJ19-E76R，pXMJ19-S563R，pXMJ19-V280L，pXMJ19-S499F，pXMJ19-V280L/S499F。
分别设计的引物序列如下：
A100E-F：GAGTATGGCAGCATGGAAGACTTTGACCGTTTA
A100E-R：TAAACGGTCAAAGTCTTCCATGCTGCCATACTC
I205M-F：GCCGAGCTGTACGACATGTTACGCTTCTGGCTG
I205M-R：CAGCCAGAAGCGTAACATGTCGTACAGCTCGGC
S563L-F：CTGCAAGAAAATGCCTTAACCTTAACTTTAGCCCC
S563L-R：GCTAAAGTTAAGGTTAAGGCATTTTCTTGCAGACTCGG
N578M-F：GGCATTTACAAATTAATGCACCACCACCACCA
N578M-R：TGGTGGTGGTGGTGCATTAATTTGTAAATGCC
G152P-F：TTTTGGCGCGACCCGAAACAAGGTCAAGCTCCGAAT
G152P-R：TTGACCTTGTTTCGGGTCGCGCCAAAAGTAGTAGTC
S328F-F：TTCCGCCAAGTTATCTTCCAAACCGATCGTGC
S328F-R：GCACGATCGGTTTGGAAGATAACTTGGCGGAA
E76R-F：CCGCACTACCGCAGTCCGAATACCGACAACGGC
E76R-R：TTCGGACTGCGGTAGTGCGGGTTGATCCAGAT
S563R-F：CTGCAAGAAAATGCCCGCACCTTAACTTTAGCC
S563R-R：GGCTAAAGTTAAGGTGCGGGCATTTTCTTGCAG
V280L-F：ATCTTTGGTGTTCCGCTGAGCGCCATGCCCGAT；
V280-R：ATCGGGCATGGCGCTCAGCGGAACACCAAAGAT；
S499F-F：ATCCCGGCACTGACCTTCGGCGAATACCGCGA；
S499F-R：ATCGCGGTATTCGCCGAAGGTCAGTGCCGGGAT。
其中，PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变形5min；然后进入30个循环；95℃变性30S，72℃退火30S，58℃延伸3.5min,4℃保温。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
将最终扩增片段用Dpn I酶在37℃水浴锅中作用1h用于去除模板，然后将PCR混合物化学转化到E.coli JM109感受态细胞中,转化液涂布含氯霉素(25μg/mL)LB固体培养基上，提取质粒并测序，测序工作由苏州金唯智完成。
实施例2：产蔗糖异构酶突变体重组大肠杆菌工程菌的构建及蔗糖异构酶的表达、分离、纯化
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1得到的重组质粒pXMJ19-pdsi、pXMJ19-A100E，pXMJ19-I205M，pXMJ19-S563L，pXMJ19-N578M，pXMJ19-G152P，pXMJ19-S328F，pXMJ19-E76R，pXMJ19-S563R，pXMJ19-V280L，pXMJ19-S499F，pXMJ19-V280L/S499F，通过电转化转化到C.glutamium ATCC13032感受态细胞中，分别制备得到基因工程菌：C.glutamium13032/pXMJ19-pdsi、C.glutamium13032/pXMJ19-A100E，C.glutamium13032/pXMJ19-I205M，C.glutamium13032/pXMJ19-S563L，C.glutamium13032/pXMJ19-N578M，C.glutamium13032/pXMJ19-G152P，C.glutamium13032/pXMJ19-S328F，C.glutamium13032/pXMJ19-E76R，C.glutamium13032/pXMJ19-S563R，C.glutamium13032/pXMJ19-V280L，C.glutamium13032/pXMJ19-S499F，C.glutamium13032/pXMJ19-V280L/S499F。
(2)分别将步骤(1)制备得到的基因工程菌接种至10mL含有25μg/mL氯霉素的BHI液体培养基中，在30℃、200rpm下培养过夜，制备得到种子液；
将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量转接至100mL含有25μg/mL氯霉素的BHI液体培养基中，在30℃，200rpm下培养至OD600为1.0时，加入终浓度为1mM的IPTG，在30℃条件下继续培养20h，得到发酵液。将制备得到的发酵液在8000×g，4℃条件下离心处理5min得到细胞菌体，并将细胞在洗涤3次后，用10mL柠檬酸钠磷酸二氢钠缓冲液(pH 6.0)重新悬浮。
用超声破碎仪在冰浴条件下处理重悬后的细胞30min，离心30min(8000×g，4℃)，去上清液即为粗酶液；
通过0.22-μm过滤器过滤上清液部分，然后进一步加载到1mL Ni亲和柱上，该亲和柱用50mM洗涤缓冲液(20mM Tris和500mM NaCl，pH 7.4)预平衡，然后洗脱缓冲液(20mMTris、500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)用线性梯度洗脱未结合蛋白和蔗糖异构酶；分别制备得到含有野生型pdsi的纯酶液，含有A100E的纯酶液，含有I205M的纯酶液，含有S563L的纯酶液，含有N578M的纯酶液，含有G152P的纯酶液，含有S328F的纯酶液，含有E76R的纯酶液，含有S563R的纯酶液，含有V280L的纯酶液，含有S499F的纯酶液，含有V280L/S499F的纯酶液；
分别将上述纯酶液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果如图1所示，结果显示：在63kDa处有明显的条带，证明蔗糖异构酶得到表达。
(3)为了测试单点突变对热稳定性的影响，对步骤(2)制备得到的纯酶进行热稳定性实验，进行初步筛选。
分别将步骤(2)制备得到的纯酶在45℃水浴锅中孵育处理20min后，取1mL，根据蔗糖异构酶酶活测定方法测定剩余酶的残余酶活，以未经过高温处理的纯酶液的酶活为空白对照，得到残余酶活的百分比，相关野生型蛋白以及突变体的酶活变化结果图2所示。
结果显示，突变体V280L和S499F以及组合突变体V280L/S499F分别保留49.1％，43.2％和93.3％的相对酶活，对照组则仅仅保留15.7％的相对酶活；而其他突变体的相对酶活均在18％以下；因此本发明的突变体V280L和S499F以及组合突变体V280L/S499F的热稳定性显著高于其他突变体。
(4)对步骤(2)制备得到的纯酶液进行比酶活测定
分别检测步骤(2)制备得到的含有野生型pdsi的纯酶液，含有V280L的纯酶液，含有S499F的纯酶液，含有V280L/S499F的纯酶液的比酶活，结果如表1所示：
表1 不同蔗糖异构酶的比酶活
Figure BDA0003078084370000061
实施例3：蔗糖异构酶突变体酶学性质
1、热稳定性
分别取实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型pdsi的纯酶液，含有V280L的纯酶液，含有S499F的纯酶液，含有V280L/S499F的纯酶液置于45℃恒温水浴中，每隔一段时间取样一次，根据蔗糖异构酶酶活测定方法测其残留酶活，比较其热稳定性，得到野生型pdsi以及其突变体的半衰期结果如表2和图3所示。
表2 不同蔗糖异构酶的半衰期
Figure BDA0003078084370000071
2、最适pH
将实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型pdsi的纯酶液，含有V280L的纯酶液，含有S499F的纯酶液，含有V280L/S499F的纯酶液置于含有柠檬酸/磷酸钠(pH4.0～8.0)的50mM缓冲液中，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性，结果如图4所示。
结果显示，突变体的最适pH为5.5，与野生型类似。
3、最适温度
将实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型pdsi的纯酶液，含有V280L的纯酶液，含有S499F的纯酶液，含有V280L/S499F的纯酶液置于含有柠檬酸/磷酸钠(pH6.0)的50mM缓冲液中，设置反应温度为20～50℃，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性，结果如图5所示。
结果显示，突变体的最适温度为30℃，与野生型类似。
4、蔗糖异构酶的动力学参数
以蔗糖为底物，在标准测定条件下测定了实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型pdsi的纯酶液，含有V280L的纯酶液，含有S499F的纯酶液，含有V280L/S499F的纯酶液的动力学参数。其中，蔗糖底物浓度分别为14.6、29.2、58.4、102、146、234、292和584mM；纯酶液的添加量为10μg，在30℃条件下反应10min，反应结束后，利用GraphPad Prism 8.0对实验数据进行回归分析，确定Vmax和Km值；结果如表3所示。
表3 不同蔗糖异构酶的动力学参数
Figure BDA0003078084370000072
结果显示，与野生型相比，突变体表现出相似的活性。这些突变体的Km和Kcat/Km等动力学参数变化较小，表明突变或热稳定性对酶的催化性质影响不大。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Thr Pro Ile Ala Ala Thr Asn
1 5 10 15
Ile Gln Lys Ser Ala Asp Phe Pro Ile Trp Trp Lys Gln Ala Val Phe
20 25 30
Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Pro Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Met Leu
50 55 60
Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Glu Ser Pro Asn Thr
65 70 75 80
Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Lys Ile Met Lys Glu Tyr
85 90 95
Gly Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu Met Asn Lys Arg
100 105 110
Gly Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn His Thr Ser Asp Arg
115 120 125
His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gly Lys Asp Asn Pro Tyr Arg
130 135 140
Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Gln Gly Gln Ala Pro Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Leu Asp Lys Gln Thr
165 170 175
Asp Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Pro Gln Gln Pro Asp Leu Asn
180 185 190
Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Ala Glu Leu Tyr Asp Ile Leu Arg Phe
195 200 205
Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp Thr Val Ala Thr
210 215 220
Phe Ser Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asn Phe Ala Glu Ala Tyr Thr Glu Gly Pro Asn Ile His Lys Tyr Ile
245 250 255
His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lys Tyr Asn Val Ala Thr Ala
260 265 270
Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Val Ser Ala Met Pro Asp Tyr Phe Asp
275 280 285
Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr Phe Asp Leu Ile Arg
290 295 300
Leu Asp Arg Tyr Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lys Pro Trp Thr Leu
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Gln Val Ile Ser Gln Thr Asp Arg Ala Ala Gly Glu
325 330 335
Phe Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Gln
340 345 350
Val Ser His Phe Gly Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg Glu Arg Ser Ala
355 360 365
Lys Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe Ile
370 375 380
Phe Gln Gly Ala Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro Phe Lys Asn Ile
385 390 395 400
Glu Glu Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp Asn Asp Tyr Val
405 410 415
Ala Ser Gly Lys Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln Glu Val Arg Met
420 425 430
Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Asp Ser Val
435 440 445
Asn Ala Gly Phe Thr Gln Gly Lys Pro Trp Phe His Leu Asn Pro Asn
450 455 460
Tyr Lys Gln Ile Asn Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys Pro Asp Ser Val
465 470 475 480
Phe Ser Tyr Tyr Arg Gln Leu Ile Asn Leu Arg His Gln Ile Pro Ala
485 490 495
Leu Thr Ser Gly Glu Tyr Arg Asp Leu Asp Pro Gln Asn Asn Gln Val
500 505 510
Tyr Ala Tyr Thr Arg Ile Leu Asp Asn Glu Lys Tyr Leu Val Val Val
515 520 525
Asn Phe Lys Pro Glu Gln Leu His Tyr Ala Leu Pro Asp Asn Leu Thr
530 535 540
Ile Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro Ser Leu Gln Glu
545 550 555 560
Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala Gly Ile Tyr Lys
565 570 575
Leu Asn
<210> 2
<211> 1737
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggcaagcc cgctgaccaa gccgagtacc ccgatcgcag ccaccaacat ccagaagagc 60
gccgattttc cgatttggtg gaagcaagct gtgttctacc agatctaccc gcgcagtttc 120
aaggacagta acggcgacgg catcggtgat atcccgggca ttattgaaaa gctggattat 180
ttaaagatgc tgggtgtgga tgcaatctgg atcaacccgc actacgagag tccgaatacc 240
gacaacggct acgacatcag cgattatcgc aaaatcatga aagagtatgg cagcatggca 300
gactttgacc gtttagttgc cgaaatgaat aaacgcggca tgcgtctgat gatcgacatc 360
gttattaatc ataccagcga ccgccaccgt tggtttgttc agagccgtag cggcaaagac 420
aatccgtatc gtgactacta cttttggcgc gacggtaaac aaggtcaagc tccgaataat 480
tacccgagct tctttggcgg cagcgcatgg caactggata aacagaccga ccagtactat 540
ttacactact ttgccccgca acaaccggat ttaaattggg acaatccgaa agtgcgtgcc 600
gagctgtacg acatcttacg cttctggctg gataagggcg tgagcggttt acgttttgat 660
accgttgcca cattcagcaa aattccgggc ttcccggatc tgagcaaggc ccaactgaaa 720
aacttcgcag aggcatatac cgagggtccg aacatccaca agtacatcca cgagatgaac 780
cgtcaagttc tgagcaaata caatgtggcc accgctggtg agatctttgg tgttccggtg 840
agcgccatgc ccgattactt cgatcgtcgc cgcgaggagc tgaacattgc ctttaccttc 900
gatttaattc gcttagaccg ctaccccgat cagcgctggc gccgtaagcc gtggacttta 960
agtcaattcc gccaagttat cagccaaacc gatcgtgccg ccggtgagtt tggctggaat 1020
gccttctttt tagacaacca tgataaccct cgccaagtta gccattttgg cgatgatagc 1080
ccgcaatggc gtgaacgcag cgcaaaagct ttagccacac tgctgttaac ccagcgtgcc 1140
acccctttca tctttcaagg tgccgagctg ggcatgacca attatccttt taaaaatatt 1200
gaagagttcg atgacattga ggtgaagggc ttctggaacg actacgttgc aagtggcaag 1260
gttaacgccg ccgaatttct gcaagaagtt cgcatgacca gccgcgacaa tagccgtacc 1320
ccgatgcagt ggaacgatag cgttaatgcc ggcttcaccc aaggtaaacc gtggtttcat 1380
ctgaacccga actataagca aatcaacgcc gcccgcgaag tgaacaagcc ggacagcgtg 1440
tttagttact accgccagct gattaatctg cgccatcaga tcccggcact gaccagtggc 1500
gaataccgcg atttagatcc gcagaacaac caagtgtacg cctacacccg cattttagac 1560
aacgagaaat atttagttgt ggttaacttc aaaccggagc agctgcatta tgctttaccg 1620
gacaatttaa ccatcgccag ttctttactg gagaacgtgc atcagccgag tctgcaagaa 1680
aatgccagta ccttaacttt agccccgtgg caagccggca tttacaaatt aaattaa 1737
<210> 3
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ala Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Thr Pro Ile Ala Ala Thr Asn
1 5 10 15
Ile Gln Lys Ser Ala Asp Phe Pro Ile Trp Trp Lys Gln Ala Val Phe
20 25 30
Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Pro Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Met Leu
50 55 60
Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Glu Ser Pro Asn Thr
65 70 75 80
Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Lys Ile Met Lys Glu Tyr
85 90 95
Gly Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu Met Asn Lys Arg
100 105 110
Gly Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn His Thr Ser Asp Arg
115 120 125
His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gly Lys Asp Asn Pro Tyr Arg
130 135 140
Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Gln Gly Gln Ala Pro Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Leu Asp Lys Gln Thr
165 170 175
Asp Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Pro Gln Gln Pro Asp Leu Asn
180 185 190
Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Ala Glu Leu Tyr Asp Ile Leu Arg Phe
195 200 205
Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp Thr Val Ala Thr
210 215 220
Phe Ser Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asn Phe Ala Glu Ala Tyr Thr Glu Gly Pro Asn Ile His Lys Tyr Ile
245 250 255
His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lys Tyr Asn Val Ala Thr Ala
260 265 270
Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Leu Ser Ala Met Pro Asp Tyr Phe Asp
275 280 285
Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr Phe Asp Leu Ile Arg
290 295 300
Leu Asp Arg Tyr Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lys Pro Trp Thr Leu
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Gln Val Ile Ser Gln Thr Asp Arg Ala Ala Gly Glu
325 330 335
Phe Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Gln
340 345 350
Val Ser His Phe Gly Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg Glu Arg Ser Ala
355 360 365
Lys Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe Ile
370 375 380
Phe Gln Gly Ala Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro Phe Lys Asn Ile
385 390 395 400
Glu Glu Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp Asn Asp Tyr Val
405 410 415
Ala Ser Gly Lys Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln Glu Val Arg Met
420 425 430
Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Asp Ser Val
435 440 445
Asn Ala Gly Phe Thr Gln Gly Lys Pro Trp Phe His Leu Asn Pro Asn
450 455 460
Tyr Lys Gln Ile Asn Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys Pro Asp Ser Val
465 470 475 480
Phe Ser Tyr Tyr Arg Gln Leu Ile Asn Leu Arg His Gln Ile Pro Ala
485 490 495
Leu Thr Ser Gly Glu Tyr Arg Asp Leu Asp Pro Gln Asn Asn Gln Val
500 505 510
Tyr Ala Tyr Thr Arg Ile Leu Asp Asn Glu Lys Tyr Leu Val Val Val
515 520 525
Asn Phe Lys Pro Glu Gln Leu His Tyr Ala Leu Pro Asp Asn Leu Thr
530 535 540
Ile Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro Ser Leu Gln Glu
545 550 555 560
Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala Gly Ile Tyr Lys
565 570 575
Leu Asn
<210> 4
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ala Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Thr Pro Ile Ala Ala Thr Asn
1 5 10 15
Ile Gln Lys Ser Ala Asp Phe Pro Ile Trp Trp Lys Gln Ala Val Phe
20 25 30
Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Pro Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Met Leu
50 55 60
Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Glu Ser Pro Asn Thr
65 70 75 80
Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Lys Ile Met Lys Glu Tyr
85 90 95
Gly Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu Met Asn Lys Arg
100 105 110
Gly Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn His Thr Ser Asp Arg
115 120 125
His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gly Lys Asp Asn Pro Tyr Arg
130 135 140
Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Gln Gly Gln Ala Pro Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Leu Asp Lys Gln Thr
165 170 175
Asp Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Pro Gln Gln Pro Asp Leu Asn
180 185 190
Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Ala Glu Leu Tyr Asp Ile Leu Arg Phe
195 200 205
Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp Thr Val Ala Thr
210 215 220
Phe Ser Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asn Phe Ala Glu Ala Tyr Thr Glu Gly Pro Asn Ile His Lys Tyr Ile
245 250 255
His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lys Tyr Asn Val Ala Thr Ala
260 265 270
Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Val Ser Ala Met Pro Asp Tyr Phe Asp
275 280 285
Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr Phe Asp Leu Ile Arg
290 295 300
Leu Asp Arg Tyr Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lys Pro Trp Thr Leu
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Gln Val Ile Ser Gln Thr Asp Arg Ala Ala Gly Glu
325 330 335
Phe Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Gln
340 345 350
Val Ser His Phe Gly Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg Glu Arg Ser Ala
355 360 365
Lys Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe Ile
370 375 380
Phe Gln Gly Ala Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro Phe Lys Asn Ile
385 390 395 400
Glu Glu Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp Asn Asp Tyr Val
405 410 415
Ala Ser Gly Lys Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln Glu Val Arg Met
420 425 430
Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Asp Ser Val
435 440 445
Asn Ala Gly Phe Thr Gln Gly Lys Pro Trp Phe His Leu Asn Pro Asn
450 455 460
Tyr Lys Gln Ile Asn Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys Pro Asp Ser Val
465 470 475 480
Phe Ser Tyr Tyr Arg Gln Leu Ile Asn Leu Arg His Gln Ile Pro Ala
485 490 495
Leu Thr Phe Gly Glu Tyr Arg Asp Leu Asp Pro Gln Asn Asn Gln Val
500 505 510
Tyr Ala Tyr Thr Arg Ile Leu Asp Asn Glu Lys Tyr Leu Val Val Val
515 520 525
Asn Phe Lys Pro Glu Gln Leu His Tyr Ala Leu Pro Asp Asn Leu Thr
530 535 540
Ile Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro Ser Leu Gln Glu
545 550 555 560
Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala Gly Ile Tyr Lys
565 570 575
Leu
<210> 5
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ala Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Thr Pro Ile Ala Ala Thr Asn
1 5 10 15
Ile Gln Lys Ser Ala Asp Phe Pro Ile Trp Trp Lys Gln Ala Val Phe
20 25 30
Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Pro Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Met Leu
50 55 60
Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Glu Ser Pro Asn Thr
65 70 75 80
Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Lys Ile Met Lys Glu Tyr
85 90 95
Gly Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu Met Asn Lys Arg
100 105 110
Gly Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn His Thr Ser Asp Arg
115 120 125
His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gly Lys Asp Asn Pro Tyr Arg
130 135 140
Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Gln Gly Gln Ala Pro Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Leu Asp Lys Gln Thr
165 170 175
Asp Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Pro Gln Gln Pro Asp Leu Asn
180 185 190
Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Ala Glu Leu Tyr Asp Ile Leu Arg Phe
195 200 205
Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp Thr Val Ala Thr
210 215 220
Phe Ser Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asp Leu Ser Lys Ala Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asn Phe Ala Glu Ala Tyr Thr Glu Gly Pro Asn Ile His Lys Tyr Ile
245 250 255
His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lys Tyr Asn Val Ala Thr Ala
260 265 270
Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Leu Ser Ala Met Pro Asp Tyr Phe Asp
275 280 285
Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr Phe Asp Leu Ile Arg
290 295 300
Leu Asp Arg Tyr Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lys Pro Trp Thr Leu
305 310 315 320
Ser Gln Phe Arg Gln Val Ile Ser Gln Thr Asp Arg Ala Ala Gly Glu
325 330 335
Phe Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Gln
340 345 350
Val Ser His Phe Gly Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg Glu Arg Ser Ala
355 360 365
Lys Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe Ile
370 375 380
Phe Gln Gly Ala Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro Phe Lys Asn Ile
385 390 395 400
Glu Glu Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp Asn Asp Tyr Val
405 410 415
Ala Ser Gly Lys Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln Glu Val Arg Met
420 425 430
Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn Asp Ser Val
435 440 445
Asn Ala Gly Phe Thr Gln Gly Lys Pro Trp Phe His Leu Asn Pro Asn
450 455 460
Tyr Lys Gln Ile Asn Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys Pro Asp Ser Val
465 470 475 480
Phe Ser Tyr Tyr Arg Gln Leu Ile Asn Leu Arg His Gln Ile Pro Ala
485 490 495
Leu Thr Phe Gly Glu Tyr Arg Asp Leu Asp Pro Gln Asn Asn Gln Val
500 505 510
Tyr Ala Tyr Thr Arg Ile Leu Asp Asn Glu Lys Tyr Leu Val Val Val
515 520 525
Asn Phe Lys Pro Glu Gln Leu His Tyr Ala Leu Pro Asp Asn Leu Thr
530 535 540
Ile Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro Ser Leu Gln Glu
545 550 555 560
Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala Gly Ile Tyr Lys
565 570 575
Leu

Claims (10)

1.一种蔗糖异构酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位和/或第499位的氨基酸进行突变得到的。
2.如权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是：
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位的缬氨酸突变为亮氨酸得到的；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位缬氨酸突变为亮氨酸，同时将第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的。
3.编码权利要求1或2所述的蔗糖异构酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，以pXMJ19载体、pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体和pDXW-10载体中的任一种作为表达载体。
6.携带权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述重组载体的重组细胞。
7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、酵母菌(Saccharomyces)中的任一种为表达宿主。
8.一种提高蔗糖异构酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位和/或第499位的氨基酸进行突变。
9.权利要求4或5所述的重组载体，或权利要求6或7所述的重组细胞在制备蔗糖异构酶中的应用。
10.权利要求1或2所述突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述的重组载体，或权利要求6或7所述的重组细胞在转化蔗糖生产异麦芽酮糖中的应用。
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