CN114107158A - 一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 - Google Patents

一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114107158A
CN114107158A CN202111579636.2A CN202111579636A CN114107158A CN 114107158 A CN114107158 A CN 114107158A CN 202111579636 A CN202111579636 A CN 202111579636A CN 114107158 A CN114107158 A CN 114107158A
Authority
CN
China
Prior art keywords
isomaltulose
corynebacterium glutamicum
recombinant
gene
recombinant corynebacterium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111579636.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114107158B (zh
Inventor
苏慧慧
郭艺山
黄俊生
陈秀萍
黄冬婷
高俊永
苏江滨
张平军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Biological and Medical Engineering of Guangdong Academy of Sciences
Original Assignee
Institute of Biological and Medical Engineering of Guangdong Academy of Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Biological and Medical Engineering of Guangdong Academy of Sciences filed Critical Institute of Biological and Medical Engineering of Guangdong Academy of Sciences
Priority to CN202111579636.2A priority Critical patent/CN114107158B/zh
Publication of CN114107158A publication Critical patent/CN114107158A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114107158B publication Critical patent/CN114107158B/zh
Priority to AU2022422808A priority patent/AU2022422808A1/en
Priority to PCT/CN2022/112647 priority patent/WO2023115997A1/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99011—Isomaltulose synthase (5.4.99.11)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程和发酵工程领域。本发明通过在谷氨酸棒杆菌中表达异麦芽酮糖合成酶，所述异麦芽酮糖合成酶的编码基因序列如NCBI Gene ID:AY223549.1所示，并在表达载体多克隆位点处引入信号肽序列(SEQ ID NO.1)，比较发现本发明重组菌是在目前报道的工程菌中异麦芽酮糖得率和纯度同时最高的，实现在以糖蜜为出发能源的基础上不影响谷氨酸棒杆菌生长情况的同时也提高了异麦芽酮糖的产量。

Description

一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
技术领域
本发明属于代谢工程和发酵工程领域，具体涉及一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用。
背景技术
蔗糖过量使用所带来的肥胖、动脉硬化、高血压、糖尿病、龋齿等疾病，已成为社会越来越关注的问题。异麦芽酮糖(Isomaltulose,IsomaltuloseTM,
Figure BDA0003426589340000011
Lylose)亦称帕拉金糖、异构蔗糖、益寿糖、巴糖，其分子式为C12H22O11·H2O，其分子质量为360，是葡萄糖和果糖以α-1，6糖苷键相连的右旋糖(6-o-α-D吡喃葡糖基-D-果糖)是一种天然的新型功能性糖。异麦芽酮糖不仅具有甜味纯正、热值低、吸湿性低、安全性高和不致龋齿等优异性质，而且其在体内的代谢不依赖于胰岛素，可供高血糖、糖尿病及肥胖人群食用。因此，异麦芽酮糖被认为是蔗糖的“理想替代品”，在食品、制药及化工等领域拥有巨大的应用潜力和市场前景。
目前利用廉价废弃生物质作为碳源发酵生产高附加质产品成为研究热点。而制糖工业中主要的副产物糖蜜，与其他废弃物如秸秆等木质纤维素原料相比，不需要进行预处理即含有大量的可发酵糖，其中绝大多数为蔗糖，同时含有无机盐、维生素等成分，可提供微生物生长代谢所需的影响物质，是十分具有潜力的廉价生物质资源。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种革兰氏阳性菌，在显微镜下呈现出棒杆状，在平板上菌落为圆形呈淡黄色，目前已经广泛用于氨基酸的生成。相比于大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌属于美国FDA认证食品级安全菌株，其具有高安全性，低致敏性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率比较低等优点，因此它在基因工程领域发挥着重要作用。在谷氨酸棒杆菌中因为不存在异麦芽酮糖合成酶，不存在通过廉价底物合成异麦芽酮糖的途径。因此只有高效表达外源异麦芽酮糖合成酶才能使得谷氨酸棒杆菌具有合成异麦芽酮糖的能力。
发明内容
本发明通过在谷氨酸棒杆菌中表达异麦芽酮糖合成酶，并在表达载体多克隆位点处引入信号肽序列后且在以糖蜜为出发能源的基础上不影响谷氨酸棒杆菌生长情况的同时也提高了异麦芽酮糖的产量。
本发明的第一个目的是提供一种重组谷氨酸棒杆菌，整合有异麦芽酮糖合成酶基因，所述的异麦芽酮糖合成酶基因如NCBI Gene ID:AY223549.1所示。
优选地，所述的重组谷氨酸棒杆菌，整合有信号肽基因，所述信号肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述的重组谷氨酸棒杆菌的出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述谷氨酸棒杆菌工程菌的方法，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽基因和如NCBI Gene ID:AY223549.1所示的异麦芽酮糖合成酶基因分别连接至表达载体上获得重组载体，将所述重组载体转入谷氨酸棒杆菌中，经过筛选得到重组谷氨酸棒杆菌。
优选地，所述的表达载体为pEC-XK99E，以启动子Ptrc控制异麦芽酮糖合成酶基因的表达。
优选地，所述异麦芽酮糖合成酶基因插入至pEC-XK99E的BamHI与XbaI酶位点间，所述信号肽基因插入至pEC-XK99E的EcoRI与KpnI酶位点间。
优选地，所述的异麦芽酮糖合成酶来源于分散泛菌。
优选地，构建上述谷氨酸棒杆菌工程菌的步骤如下：构建pEC-XK99E-UQ68J SIase(表达异麦芽酮糖合成酶基因)；构建pEC-XK99E-cgR0949(表达cgR0949信号肽)；构建pEC-XK99E-cgR0949-UQ68J SIase(同时表达cgR0949信号肽和异麦芽酮糖合成酶基因)；将表达载体pEC-XK99E-UQ68J SIase和pEC-XK99E-cgR0949-UQ68J SIase分别转入宿主谷氨酸棒杆菌ATCC13032，分别得到最终生成异麦芽酮糖的谷氨酸棒杆菌菌株。
本发明的第三个目的是提供所述的重组谷氨酸棒杆菌在制备以下任一所述中的应用：
(1)异麦芽酮糖合成酶或其制剂；
(2)产异麦芽酮糖及其衍生物；
(3)含异麦芽酮糖的功能性食品。
本发明的一种实施方式中，将所述的重组谷氨酸棒杆菌单菌落接种至CGXII培养基，25-35℃、200-250rpm培养18-24h得到种子液，然后将种子液按培养基体积的5-10％添加至CGXII培养基中，在25-35℃、200-250rpm下培养不少于18-24h。
本发明的另一种实施方式中，将所述的重组谷氨酸棒杆菌接种到含有CGXII培养基中，25-35℃、200-250rpm培养18-24h，然后按培养基体积的5-10％添加至含糖蜜和玉米浆的发酵罐中的发酵培养基，在25-35℃、pH为5-7下发酵，控制溶氧大于30％。
优选地，所述发酵罐成分含有糖蜜100-500g/L，玉米浆1-25g/L。
优选地，所述的发酵培养基含有甘蔗糖蜜350g/L，玉米浆12g/L；或甜菜糖蜜400g/L，玉米浆15g/L。
更优选地，所述的糖蜜为制糖工业废弃糖蜜，包括但不限于甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、甜高粱秸秆汁。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌可实现异麦芽酮糖在胞外积累，在7L发酵罐中，以甘蔗糖蜜为碳源的其异麦芽酮糖产量达到169.29g/L，蔗糖转化率为96.7％，其时空产率为2.26g/(L·h)，纯度可达98％；以甜菜蔗糖蜜为碳源的其异麦芽酮糖产量达到166.76g/L，蔗糖转化率为97％，其时空产率为2.32g/(L·h)，纯度可达98％，是在目前报道的工程菌中得率和纯度同时最高的；
(2)本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌构建方法简便，适用于工业化生产应用；
(3)本发明循环利用工业废弃物糖蜜，实现低成本且高效生产异麦芽酮糖。
附图说明
图1为构建重组pEC-XK99E-UQ68J SIase质粒图谱。
图2为构建重组pEC-XK99E-cgR0949质粒图谱。
图3为构建重组pEC-XK99E-cgR0949-UQ68J SIase质粒图谱。
图4为不同菌株摇瓶发酵的细胞生长情况。
图5为不同菌株摇瓶发酵上清液中异麦芽酮糖的产量过程图。
图6为发酵条件初步优化后不同菌株摇瓶发酵的细胞生长情况。
图7为发酵条件初步优化后不同菌株摇瓶发酵上清液中异麦芽酮糖的产量过程图。
图8为甘蔗糖蜜浓度与玉米浆浓度的优化结果。
图9为甜菜糖蜜浓度与玉米浆浓度的优化结果。
图10为本发明重组菌在甘蔗糖蜜最优浓度条件下的7L发酵罐中发酵产异麦芽酮糖过程。
图11为本发明重组菌在甜菜糖蜜最优浓度条件下的7L发酵罐中发酵产异麦芽酮糖过程。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
异麦芽酮糖的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Waters 2695，RID检测器，Sugar-ParkTMI(Waters，USA)，流动相：超纯水，流速0.5mL/min，柱温65℃，进样体积为20uL。
种子活化培养基(LBB)(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠5，脑心浸液10，装液量为30mL液体/250mL三角锥形瓶。
种子活化固体培养基(LBB)(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠5，脑心浸液10，琼脂粉20。
感受态培养基(LBHI)(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠5，甘氨酸25，异烟肼5，Tween 805mL，装液量为50mL液体/250mL三角锥形瓶。
电击后恢复培养基LBHIS(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠5，脑心浸液20，山梨醇91。
转化子检出固体培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠5，脑心浸液20，山梨醇91，琼脂粉20。
种子培养基(g/L)：糖蜜20，玉米浆15，KH2PO41.5，pH6.8-7.2。
发酵培养基(g/L)：糖蜜50，玉米浆25，KH2PO41.5，MgSO40.8，CaCO330，FeSO40.2，pH6.8-7.2。
优化发酵培养基(g/L)：糖蜜150，玉米浆20，KH2PO41.5，MgSO40.8，CaCO330，FeSO40.2，pH6.8-7.2。
灭菌条件：120℃，20min，所有培养基用于转化子检出或用于重组菌培养时加入25mg/L卡那霉素。
实施例1构建重组质粒pEC-XK99E-UQ68J SIase
使用质粒pEC-XK99E作为表达载体来表达UQ68J SIase。以质粒pET-28a-UQ68J-SIase为模板(其质粒序列见Su H H,Xu R Y,Yang Z D,et al.Green synthesisofIsomaltulose from Cane Molasses by an Immobilized Recombinant Escherichiacoli strain and Its PrebioticActivity[J].LWT-Food Science and Technology,2021,143(43):111054.)，使用引物pF(5’-GGATCCGCAACGAATATACAAAAGT-3’)和pR(5’-TCTAGATCAGTTC AGCTTATAGATCCCG-3’)，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶扩增UQ68J SIase序列，PCR条件为95℃预变性5min；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸120s，反应35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，获得的PCR产物，其核苷酸序列为：gcaacgaatatacaaaagtccgctgattttcccatttggtggaaacaggcagtattttaccagatttatccccgctcatttaaagatagcaatggtgatggtatcggcgatattcccggtatcattgagaaactggactatttaaaaatgctgggagttgatgctatctggataaacccgcactatgagtctcctaacaccgacaatggttacgatattagtgattatcgtaaaatcatgaaggagtacggcagcatggctgactttgaccgtctggttgccgaaatgaataaacgtggtatgcgcctgatgattgatattgttatcaatcataccagcgatcgtcaccgctggtttgtgcagagccgttcaggtaaagataatccttaccgcgactattatttctggcgtgatggtaaacagggacaggctcccaataactatccctctttctttggcggttcagcctggcaactggataaacagactgaccagtattatctgcactattttgcaccacagcagccggatctgaactgggataacccaaaagttcgggctgaactctacgatattctgcgtttctggctggataaaggcgtatccggactacgttttgataccgtggctactttctccaaaattcctggcttcccggacctgtcaaaagcgcagctgaagaattttgccgaagcttatactgaggggccgaatattcataaatatatccatgaaatgaaccgccaggtactgtctaaatataatgttgccaccgctggtgaaatcttcggtgtgccagtgagtgctatgccggattattttgaccggcggcgtgaagaactcaatattgctttcacctttgatttgatcaggctcgatcgttatcccgatcagcgctggcgtcgtaaaccatggacattaagccagtttcgtcaagttatctctcagactgaccgtgccgccggtgaatttggctggaacgcctttttccttgataaccatgataacccgcgccaggtctcacactttggtgacgacagcccacaatggcgcgaacgctcggcaaaagcactggcaacgctgctgctgacgcagcgtgccacgccgtttatctttcagggggcggagttgggaatgactaattacccctttaaaaatatagaggaatttgatgatattgaggttaaaggcttctggaacgactatgtagccagcggaaaagtaaacgctgctgaatttttacaggaggttcgcatgaccagccgcgataacagccgaacaccaatgcagtggaacgactctgttaatgccggattcacccagggcaaaccctggtttcacctcaatcccaactataagcaaatcaatgccgccagggaggtgaataaacccgactcggtattcagttactaccgtcaactgatcaacctgcgtcaccagatcccggcactgaccagtggtgaataccgtgatctcgatccgcagaataaccaggtctatgcctatacccgtatactggataatgaaaaatatctggtggtagttaattttaaacctgagcagctgcattacgctctgccagataatctgactattgccagcagtctgctggaaaatgtccaccaaccatcactgcaagaaaatgcctccacgctgactcttgctccgtggcaagccgggatctataagctgaactga。
用限制性内切酶BamHI和XbaI酶切上一步所得UQ68J SIase基因序列PCR产物，回收酶切体系为：PCR产物10μL，BamHI 0.6μL，XbaI0.6μL，10X buffer 5μL，加入双蒸水23.8μL。进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物并回收目的片段。同时将质粒pEC-XK99E做同样的双酶切处理，然后胶回收酶切产物。
连接插入片段和质粒，采用T4连接酶进行连接。将载体和插入片段按1：1到1：9的摩尔比混合，加入等量的连接混合溶液，在22℃下连接1h或4℃过夜。然后转化E.coli DH5α感受态细胞(感受态制备方法详见TransGen Biotechn大肠杆菌感受态试剂盒说明书)。挑选菌落PCR正确的转化子进行测序验证，得到重组质粒pEC-XK99E-UQ68J SIase(图1)。
实施例2构建重组质粒pEC-XK99E-cgR0949-UQ68J SIase
以购买的质粒pAU3质粒为模板(pAU3质粒序列见文献Zhang L,Jia H,Daqing XU.Construction of a novel twin-arginine translocation(Tat)-dependent typeexpression vector for secretory production of heterologous proteins inCorynebacterium glutamicum.Plasmid,2015,82:50-55.)，使用引物CRgF(5’-GAATTCatgggtaagcaccgtcgcaacaat-3’)和CRgR(5’-GGTACCaacctcagctgcctgtgctgggga-3’)，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶扩增cgR0949序列。PCR条件为95℃预变性5min；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸15s，反应35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，获得cgR0949信号肽序列，其核苷酸序列为：Atgggtaagcaccgtcgcaacaattcaaacgcaactcgcaaggctgtagcagcatctgcagttgcgcttggaccaaccgcagctatcgcctccccagcacaggcagctgaggtt(SEQ ID NO.1)。
用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切上一步所得cgR0949信号肽序列PCR产物，回收酶切体系为：PCR产物10μL，EcoRI 0.6μL，KpnI 0.6μL，10X buffer 5μL，加入双蒸水23.8μL。进行2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物并回收目的片段。同时将质粒pEC-XK99E做同样的双酶切处理，然后胶回收酶切产物。
连接插入片段和质粒，采用T4连接酶进行连接。将载体和插入片段按1：1到1：15的摩尔比混合，加入等量的连接混合溶液，在22℃下连接1h或4℃过夜。然后转化E.coli DH5α感受态细胞(感受态制备方法详见TransGen Biotechn大肠杆菌感受态试剂盒说明书)。挑选菌落PCR正确的转化子进行测序验证，得到重组质粒pEC-XK99E-cgR0949(图2)。
使用实施例1所述的方法，以质粒pET-28a-UQ68J-SIase为模板，使用引物pF和pR进行PCR扩增获得UQ68J SIase基因序列。用限制性内切酶BamHI和XbaI酶切UQ68J SIase基因序列PCR产物。进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物并回收目的片段。同时将质粒pEC-XK99E-cgR0949做同样的双酶切处理，然后胶回收酶切产物。
连接插入片段和质粒，采用T4连接酶进行连接。将载体和插入片段按1：1到1：9的摩尔比混合，加入等量的连接混合溶液，在22℃下连接1h或4℃过夜。然后转化E.coli DH5α感受态细胞(感受态制备方法详见TransGen Biotechn大肠杆菌感受态试剂盒说明书)。挑选菌落PCR正确的转化子进行测序验证，得到重组质粒pEC-XK99E-cgR0949-UQ68J SIase(图3)。
实施例3重组谷氨酸棒杆菌的制备
分别将实施例1获得的重组质粒pEC-XK99E-UQ68J SIase和实施例2获得的重组质粒pEC-XK99E-cgR0949-UQ68J SIase通过电击转化法转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株中，获得不同的重组谷氨酸棒杆菌。
谷氨酸棒杆菌电转化感受态的制备：
(1)谷氨酸棒杆菌ATCC13032接种于LBB培养基，置于往复式摇床(180rpm)上，30℃培养20h，OD562达到3.0。
(2)10％转接入感受态培养基(LBHI)OD562达到0.3，置于往复式摇床(200rpm)上，30℃培养4h，OD562达到0.8-1.0。
(3)收集菌液，并冰浴20min，6000rpm，4℃离心10min，弃上清。
(4)用50mL预冷10％充分悬浮菌体，6000rpm，4℃离心10min，弃上清，重复洗涤3次。
(5)用500μL预冷10％甘油重悬细胞，1.5mL无菌离心管分装，每管约100μL。
(6)-80℃保持备用，为保证感受态的转化效率最好现配现用，且放置时间不超过1周。
谷氨酸棒杆菌的电击转化：
(1)-80℃保存的谷氨酸棒杆菌感受态，冰浴中融化。
(2)分别加入0.5-2μL上述两种质粒与之混匀，冰浴20min。
(3)加入预冷的0.2cm电击杯中，EcN2模式下电击1次。
(4)迅速加入46℃预热的LBHIS 0.5mL混匀并转移到新的1.5mL无菌离心管中，46℃水浴6min，后立即置于冰中10min。
(5)将菌体置于往复式摇床以150rpm，30℃培养1.5-2.0h。
(6)8000rpm，离心1min，涂布到加有卡那霉素抗性的转化子检出平板中，于30℃恒温培养箱中培养24h。
(7)感受态效率验证：加入10μL无菌水作为阴性对照，无菌落，阳性对照1μL质粒pEC-XK99E，长出大量菌落。
实施例4信号肽对重组谷氨酸棒杆菌生产异麦芽酮糖产量的影响
将测序结果正确的分别含有质粒pEC-XK99E-UQ68J SIase和pEC-XK99E-cgR0949-UQ68J SIase的重组谷氨酸棒杆菌菌株于甘油管分别接种划线LBB平板(添加硫酸卡那霉素50mg/mL)，30℃下200rpm培养20h后挑选单菌落重新划线LBB平板直至长出大量菌落。
接种一环单菌落至种子培养基，30℃下200rpm培养20h。按10％的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，以含有质粒pEC-XK99E-UQ68J SIase的重组菌为对照，并设置6次重复，30℃下200rpm培养80h。每隔10h取一次菌液，测定OD562及异麦芽酮糖生成量，测定方法及计算公式参考文献Su H H,Xu R Y,Yang Z D,et al.Green synthesisofIsomaltulose from Cane Molasses by an Immobilized Recombinant Escherichiacoli strain and Its Prebiotic Activity[J].LWT-Food Science andTechnology,2021,143(43):111054.。
由图4可以看出80h内不同菌株摇瓶发酵的细胞生长趋势相似。
如图5所示，同样条件下，含有信号肽序列的质粒pEC-XK99E-cgR0949-UQ68JSIase的菌株80h异麦芽酮糖产量为64g/L，相比对照菌株异麦芽酮糖的产量56g/L，提高了14.28％。
实施例5发酵条件优化对重组谷氨酸棒杆菌生产异麦芽酮糖产量的影响
发酵培养基的成分配比及接种量比例对菌株生长和代谢产物的积累影响很大，因此在实施例4的基础上将培养基成分改为(g/L):糖蜜150，玉米浆20，pH6.8-7.2，其发酵培养基接种量调整为接种后使其OD562为1.8。将pEC-XK99E-cgR0949-UQ68J SIase的重组谷氨酸棒杆菌进行试验，以含有质粒pEC-XK99E-UQ68J SIase的重组菌为对照。其他培养条件及发酵后检出方法同实施例4一致。
由图6可以看出80h内不同菌株摇瓶发酵的细胞生长趋势相似。
如图7所示，发酵条件优化后，重组菌80h异麦芽酮糖产量均有所提高。相同条件下，含有信号肽序列的质粒pEC-XK99E-cgR0949-UQ68J SIase的菌株80h异麦芽酮糖产量为73g/L，相比对照菌株异麦芽酮糖的产量62g/L，提高了17.72％。
实施例6不同糖蜜种类对重组谷氨酸棒杆菌生长及产异麦芽酮糖产量的影响
发酵培养基的成分配比及接种量比例对菌株生长和代谢产物的积累影响很大，因此在实施例4的基础上将培养基成分改为(g/L):甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜，玉米浆。甘蔗糖蜜+玉米浆组设定甘蔗糖蜜初始含量350g/L，玉米浆初始含量10g/L；甜菜糖蜜+玉米浆组设定甜菜糖蜜初始含量400g/L，玉米浆初始含量10g/L。优化组分含量时，其初始含量替换为梯度含量。其发酵培养基接种量调整为接种后使其OD562为1.8。将pEC-XK99E-cgR0949-UQ68JSIase的重组谷氨酸棒杆菌进行试验。发酵72h后取样测定OD600及异麦芽酮糖生成量。
由图8可知，甘蔗糖蜜最优浓度为350g/L，玉米浆浓度为12g/L，本发明重组菌异麦芽酮糖产量达到168.88g/L，蔗糖转化率为96.5％，其时空产率为2.82g/(L·h)。
由图9可知，甜菜糖蜜最优浓度为400g/L，玉米浆浓度为15g/L，本发明重组菌异麦芽酮糖产量达到166.88g/L，蔗糖转化率为97％，其时空产率为2.78g/(L·h)。
分别以组合1：甘蔗糖蜜浓度为350g/L、玉米浆浓度为12g/L，组合2：甜菜糖蜜浓度为400g/L、玉米浆浓度为15g/L作为7L发酵罐培养基成分，发酵条件：30℃，pH6.0，溶氧位1.0vvm，转速为200rpm，每隔6h取一次菌液，测定OD600及异麦芽酮糖生成量。
图10可知，7L发酵罐中，本发明重组菌异麦芽酮糖产量达到169.29g/L，蔗糖转化率为96.7％，其时空产率为2.26g/(L·h)，纯度可达98％。
图11可知，7L发酵罐中，本发明重组菌异麦芽酮糖产量达到166.76g/L，蔗糖转化率为97％，其时空产率为2.32g/(L·h)，纯度可达98％。
进一步地，将本发明重组菌与现有的产异麦芽酮糖菌株比较，结果如表1所示。
表1不同产异麦芽酮糖菌株的比较
Figure BDA0003426589340000121
Figure BDA0003426589340000131
Figure BDA0003426589340000141
由表2可知，本发明重组菌生产的异麦芽酮糖是目前报道中得率和纯度同时最高的。
序列表
<110> 广东省科学院生物与医学工程研究所
<120> 一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 114
<212> DNA
<213> 分散泛菌(Pantoea dispersa)
<400> 1
atgggtaagc accgtcgcaa caattcaaac gcaactcgca aggctgtagc agcatctgca 60
gttgcgcttg gaccaaccgc agctatcgcc tccccagcac aggcagctga ggtt 114

Claims (10)

1.一种高产异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其特征在于，整合有异麦芽酮糖合成酶基因，所述的异麦芽酮糖合成酶基因如NCBI Gene ID:AY223549.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在异麦芽酮糖合成酶基因前整合有信号肽基因，所述信号肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌的出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
4.一种高产异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽基因和如NCBI Gene ID:AY223549.1所示的异麦芽酮糖合成酶基因分别连接至表达载体上获得重组载体，将所述重组载体转入谷氨酸棒杆菌中，获得高产异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的表达载体为pEC-XK99E，以启动子Ptrc控制异麦芽酮糖合成酶基因的表达。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述异麦芽酮糖合成酶基因插入至pEC-XK99E的BamHI与XbaI酶位点间，所述信号肽基因插入至pEC-XK99E的EcoRI与KpnI酶位点间。
7.权利要求1-3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌在制备以下任一所述中的应用：
(1)异麦芽酮糖合成酶或其制剂；
(2)产异麦芽酮糖及其衍生物；
(3)含异麦芽酮糖的功能性食品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述的重组谷氨酸棒杆菌单菌落接种至CGXII培养基，25-35℃、200-250rpm培养18-24h得到种子液，然后将种子液按培养基体积的5-10％添加至CGXII培养基中，在25-35℃、200-250rpm下培养不少于18-24h；或将种子液按培养基体积的5-10％添加至含糖蜜和玉米浆的发酵罐中的发酵培养基中，在25-35℃、pH为5-7下发酵，控制溶氧大于30％。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基含有糖蜜100-500g/L，玉米浆1-25g/L。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基含有甘蔗糖蜜350g/L，玉米浆12g/L；或甜菜糖蜜400g/L，玉米浆15g/L。
CN202111579636.2A 2021-12-22 2021-12-22 一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 Active CN114107158B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111579636.2A CN114107158B (zh) 2021-12-22 2021-12-22 一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
AU2022422808A AU2022422808A1 (en) 2021-12-22 2022-08-16 Recombinant corynebacterium glutamicum for producing high-purity isomaltulose at high yield, and application thereof
PCT/CN2022/112647 WO2023115997A1 (zh) 2021-12-22 2022-08-16 一种用于生产异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111579636.2A CN114107158B (zh) 2021-12-22 2021-12-22 一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114107158A true CN114107158A (zh) 2022-03-01
CN114107158B CN114107158B (zh) 2022-07-26

Family

ID=80362736

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111579636.2A Active CN114107158B (zh) 2021-12-22 2021-12-22 一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN114107158B (zh)
AU (1) AU2022422808A1 (zh)
WO (1) WO2023115997A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023115997A1 (zh) * 2021-12-22 2023-06-29 广东省科学院生物与医学工程研究所 一种用于生产异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040064851A1 (en) * 2000-09-20 2004-04-01 Markwart Kunz Transgenic plants which produce isomalt
CN107922954A (zh) * 2015-07-03 2018-04-17 Cj第制糖株式会社 具有l‑赖氨酸生产力的微生物和使用其生产l‑赖氨酸的方法
CN109929863A (zh) * 2019-03-19 2019-06-25 江南大学 一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法
CN111087476A (zh) * 2019-12-31 2020-05-01 天津科技大学 一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途
CN113151237A (zh) * 2021-05-21 2021-07-23 江南大学 一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10139062A1 (de) * 2001-08-09 2003-04-30 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE102010003419B4 (de) * 2010-03-30 2019-09-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Ornithin
CN102399835A (zh) * 2011-10-14 2012-04-04 江南大学 一种微生物发酵生产l-苯丙氨酸的方法
CN107142234B (zh) * 2017-05-12 2020-09-15 清华大学 一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法
CN114107158B (zh) * 2021-12-22 2022-07-26 广东省科学院生物与医学工程研究所 一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040064851A1 (en) * 2000-09-20 2004-04-01 Markwart Kunz Transgenic plants which produce isomalt
CN107922954A (zh) * 2015-07-03 2018-04-17 Cj第制糖株式会社 具有l‑赖氨酸生产力的微生物和使用其生产l‑赖氨酸的方法
CN109929863A (zh) * 2019-03-19 2019-06-25 江南大学 一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法
CN111087476A (zh) * 2019-12-31 2020-05-01 天津科技大学 一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途
CN113151237A (zh) * 2021-05-21 2021-07-23 江南大学 一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIRONG ZHANG等: "Construction of a novel twin-arginine translocation (Tat)-dependent type expression vector for secretory production of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum", 《PLASMID》 *
刘军彤: "Pantoea dispersa 蔗糖异构酶的重组表达及应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023115997A1 (zh) * 2021-12-22 2023-06-29 广东省科学院生物与医学工程研究所 一种用于生产异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023115997A1 (zh) 2023-06-29
CN114107158B (zh) 2022-07-26
AU2022422808A1 (en) 2023-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11512333B2 (en) Method for producing tetrahydropyrimidine by fermenting recombinant Corynebacterium glutamicum
CN109536428B (zh) 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN114774343A (zh) 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
AU2011296791B2 (en) Novel mutant microorganism producing succinic acid simultaneously using sucrose and glycerol, and method for preparing succinic acid using same
WO2024108460A1 (zh) 一种枯草芽孢杆菌发酵异构生产阿洛酮糖的方法
CN115074376B (zh) 一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法
CN114874964A (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN114107158B (zh) 一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
CN113249287B (zh) 一株表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株及其应用
CN114874959A (zh) 一种利用葡萄糖从头发酵生产l-茶氨酸的基因工程菌、方法及应用
CN112375723B (zh) 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用
CN111154748B (zh) 一种提高l-异亮氨酸合成纯度的乙酰羟酸合酶突变体
CN111206009B (zh) 一种高产d-阿洛酮糖的基因工程菌及其应用
CN117305211A (zh) 一种高效合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌的构建及其应用
CN113403239B (zh) 一株谷氨酸棒杆菌株及其应用
WO2021128464A1 (zh) 一种转录因子SugR编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用
CN115725484A (zh) 合成d-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌及应用
CN110964090B (zh) 一种促进n-乙酰氨基葡萄糖生产的蛋白质起始因子if3突变体及其应用
CN118726218A (zh) 一种重组谷氨酸棒杆菌及其以葡萄糖为原料发酵生产亚精胺的方法
CN117487728A (zh) 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株的应用
CN112522171A (zh) 一种工程菌、含鸟氨酸溶液的处理方法及试剂盒
CN118165905A (zh) 一株产l-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
CN117417871A (zh) 一种重组钝齿棒杆菌及生产l-精氨酸的方法
CN116445384A (zh) 一种利用简单脱毒的玉米芯纤维素水解液发酵生产bt的方法
CN117343888A (zh) 一种高效合成乳糖-n-二岩藻四糖的基因工程菌及生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant