CN111087476A

CN111087476A - 一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途

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Publication number: CN111087476A
Application number: CN201911407764.1A
Authority: CN
Inventors: 李玉; 路福平; 李登科; 王兴吉; 彭冲; 刘逸寒; 王克芬; 张会图; 刘文龙; 刘夫锋; 张�杰; 佟新伟
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111087476B

Abstract

本发明公开了一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途，属于基因工程技术领域。所述双信号肽来源于芽孢杆菌Sec途径中不同的信号肽的组合。本发明通过从枯草芽孢杆菌信号肽库中，构建双信号肽组合与目的蛋白即蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶基因相结合的表达载体，实现了外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的表达元件及其组合方法。

Description

一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)是原核生物研究领域中的重要模式菌，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌(Escherichia coli)。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。该宿主的优点是：公认的安全菌株，分泌表达，无明显的密码偏爱性；生长快，易培养，表达量高，遗传背景清楚以及分子操作简单的特点，且适合进行工程菌株改造等显著优势。

基因工程中，信号肽是实现外源蛋白分泌表达的重要组成元件。信号肽的选择及其与成熟蛋白的融合，信号肽的功能在于引导前提蛋白与易位复合体结合并调节前体蛋白的折叠，对在蛋白分泌过程中起着重要作用。信号肽是一类具有 15-60个氨基酸的多肽，一般定位于分泌蛋白的N端。一般是将编码目的蛋白的基因序列克隆至信号肽的C端，从而在宿主菌中实现目的基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合。信号肽引导整个多肽链与胞内分子伴侣或者分泌信号识别位点相结合，进而跨膜转运至胞外。因此，研究不同类型的信号肽对于实现外源基因的高效表达及分泌机制等均有重要意义。

发明内容

本发明以Sec途径的信号肽为主，进行随机组合，以蔗糖异构酶、角蛋白酶和果聚糖蔗糖酶为目的蛋白进行表达。

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，本发明的第一个目的是提供一种提高外源蛋白表达量的双信号肽组合，所述双信号肽来源于芽孢杆菌 Sec途径中不同的信号肽的串联组合。

优选地，所述来源于芽孢杆菌的Sec途径的信号肽为SP_DacB、SP_amyE或SP_L。

优选地，所述信号肽SP_DacB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于枯草芽孢杆菌1A747。

优选地，所述信号肽SP_amyE的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，来源于枯草芽孢杆菌168，其Gene ID:938356GenBank:NC_000964.3(327618..329597)。

优选地，所述信号肽SP_L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，来源于地衣芽孢杆菌，其GenBank:CP034569.1，SP_L是来源于果聚糖蔗糖酶自身的信号肽。

本发明的第二个目的是提供编码所述信号肽突变体的基因。

优选地，编码所述信号肽SP_DacB基因的的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，编码所述信号肽SP_amyE基因的的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选地，编码所述信号肽SP_L基因的的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第三个目的是提供所述双信号肽在提高外源蛋白表达量中的用途。

优选地，所述外源蛋白为蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶。

优选地，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，来源于解淀粉芽孢杆菌。

优选地，所述角蛋白酶的编码基因为kerK，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10 所示。

优选地，所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，来源于分散泛菌。

优选地，所述蔗糖异构酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其GenBank：AY223549.1。

优选地，所述果聚糖蔗糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，来源于地衣芽孢杆菌。

优选地，所述果聚糖蔗糖酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其GenBank:CP034569.1。

本发明的第四个目的是提供一种含有所述双信号肽的编码基因的重组载体。

优选地，所述重组载体所用的表达载体为pWB980。

本发明的第五个目的是提供一种含有所述重组载体或所述双信号肽编码基因的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)。

更优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。所述菌株来源于文献(史超硕、李登科等。两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响[J]. 中国生物工程杂志.2019,39(10)：17-23。

本发明的第六个目的是提供一种基因工程菌，以枯草芽孢杆菌为宿主细胞，通过载体表达连接有所述双信号肽编码基因和外源蛋白基因。

本发明的第七个目的是提供双信号肽的构建方法，步骤如下：构建包含所述双信号肽的编码基因和蛋白基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。

优选地，所述双信号肽的构建方法，步骤如下：

将双信号肽的编码基因与含有外源蛋白基因的载体用相同的限制性内切酶进行双酶切，切胶回收，通过构建包含所述双信号肽的编码基因和蛋白基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。

本发明的第八个目的是提供所述蛋白的生产方法，步骤如下：

将连接有所述双信号肽的基因工程菌经活化后，以1.5-2.5％的接种量转接于发酵培养基中，于35-40℃、215-225r/min发酵培养15-50h。

所述发酵产角蛋白酶的发酵培养基组成为：玉米粉60-70g/L，豆饼粉30-50 g/L，磷酸氢二钠2-8g/L，磷酸二氢钾0.1-0.6g/L，高温淀粉酶0.5-1.0g/L，余量为水。

所述发酵产蔗糖异构酶和果聚糖蔗糖酶的发酵培养基组成为：酵母粉4-6 g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠4-6g/L，余量为水。

优选地，所述基因工程菌的活化步骤为：将所述基因工程菌接种于种子培养基中，35-40℃、215-225r/min振荡培养10-14h。

所述种子培养基组成为：卡那霉素45-55mg/L，酵母粉4-6g/L，蛋白胨8-12 g/L，氯化钠4-6g/L，余量为水。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明通过从枯草芽孢杆菌信号肽库中，构建双信号肽串联组合与目的蛋白即蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶基因相结合的表达载体，实现了外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的表达元件及其组合方法。

2、本发明通过双信号肽串联组合，可以使蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶分泌量增加，酶活得到进一步提高。

附图说明

图1是角蛋白酶的PCR产物电泳图；

图2是合成的果聚糖蔗糖酶基因双酶切示意图；

图3是合成的蔗糖异构酶基因双酶切示意图；

图4是外源蛋白的目的基因构建示意图；

图5是信号肽构建示意图，其中SP_N代表单、双、三信号肽串联组合；

图6是中B.subtilis WB600表达角蛋白酶的SDS-PAGE电泳胶图；箭头表示目的蛋白的位置，其中SPD为利用单信号肽表达的角蛋白酶、SP-D-A为利用双信号肽串联组合表达的角蛋白酶；

图7是角蛋白酶单双信号肽酶活示意图，其中SPD为利用单信号肽表达的角蛋白酶、SP-D-A为利用双信号肽串联组合表达的角蛋白酶；

图8是B.subtilis WB600表达蔗糖异构酶的SDS-PAGE电泳胶图；箭头表示目的蛋白的位置，其中SP-D2为利用单信号肽表达的蔗糖异构酶、SP-A-D2为利用双信号肽串联组合表达的蔗糖异构酶；

图9是蔗糖异构酶单双信号肽酶活示意图，其中SP-D2为利用单信号肽表达的蔗糖异构酶、SP-A-D2为利用双信号肽串联组合表达的蔗糖异构酶；

图10是B.subtilis WB600表达果聚糖蔗糖酶的SDS-PAGE电泳胶图；箭头表示目的蛋白的位置，其中SPL为利用单信号肽表达的果聚糖蔗糖酶、SP-A-L为利用双信号肽串联组合表达的果聚糖蔗糖酶、SP-A-D-L为利用三个信号肽串联组合表达的果聚糖蔗糖酶；

图11是果聚糖蔗糖酶单/双/三信号肽酶活示意图，其中SPL为利用单信号肽表达的果聚糖蔗糖酶、SP-A-L为利用双信号肽串联组合表达的果聚糖蔗糖酶、 SP-A-D-L为利用三个信号肽串联组合表达的果聚糖蔗糖酶。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA 片段酶切、连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW,Janssen K,Argentine J.黄培堂等译,2002,北京:科学出版社)。

本发明所用培养基及酶活测定方法：

种子培养基组成为：卡那霉素45-55mg/L，酵母粉4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠4-6g/L，余量为水。

枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：

SP-A盐溶液：(NH₄)₂SO₄ 4g/L，K₂HPO₄·3H₂O 28g/L，KH₂PO₄ 12g/L，柠檬酸钠2g/L，余量为水；

SP-B盐溶液：MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，余量为水；

100×CAYE溶液：酪蛋白水解物20g/L，酵母粉100g/L，余量为水；

SPI(200mL)：SP-A盐溶液98mL，SP-B盐溶液98mL，50％葡萄糖2mL， 100×CAYE2mL；

SPII培养基(600mL)：SPI 588mL，50mmol/L CaCl₂ 6mL，250mmol/L MgCl₂ 6mL；

100×EGTA溶液：10mmol/L EGTA溶液。

实施例1蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶和角蛋白酶基因的获得与构建

根据实验室筛选出来的解淀粉芽孢杆菌菌株的基因组，通过PCR扩增得到角蛋白酶基因，扩增的到目的基因产物测序结果与B.amyloliquefaciens K11角蛋白酶基因(GenBank：KR868996.1)相似性达到了97.63％，将该扩增的角蛋白酶基因命名为角蛋白酶基因kerK，角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，角蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.10所示。

上述扩增所用引物为：

引物F：5'-CGCGGATCCAATTTAAATATTTCGGGTTCCTATTAAAC-3'(核苷酸序列如SEQID NO.13)；

引物-R：5'-CATGCATGCTAAAAAAACCGGCGGGGC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.14)。

其中，蔗糖异构酶来源于分散泛菌的蔗糖异构酶，蔗糖异构酶的GenBank：AY223549.1，所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，蔗糖异构酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。由苏州金维智公司合成。

其中，果聚糖蔗糖酶来源于地衣芽孢杆菌，其GenBank:CP034569.1，所述果聚糖蔗糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。由苏州金维智公司合成。

分别以蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶和角蛋白酶基因为报告基因，获得一种能够提高外分泌蛋白的信号肽的突变体，以实现蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶和角蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌宿主中的高效异源表达。

具体包括以下步骤：

(1)分别构建角蛋白酶、蔗糖异构酶和果聚糖蔗糖酶载体：

角蛋白酶经过PCR扩增带有酶切位点HindⅢ和SphⅠ，用限制性内切酶 HindⅢ和SphⅠ将角蛋白酶进行双酶切并纯化，得到1278bp大小的角蛋白酶 PCR产物(如图1)，扩增的PCR片段碱基序列由苏州金维智测序确认。

蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶通过人工合成片段SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12 经过双酶切(HindⅢ和SphⅠ)，切胶回收分别获得2207bp(如图2)、1449bp大小的目的片段(如图3)。

将上述经过双酶切角蛋白酶、蔗糖异构酶和果聚糖蔗糖酶分别与经过Hind Ⅲ和SphⅠ双酶切，切胶回收的载体pWB980进行连接，得到分别含有蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶和角蛋白酶的质粒(如图4)(该构件方法详见于申请号为 201910332253.1的发明专利《高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》。

实施例2双信号肽的获得与构建

构建重组载体pWB980-SP(signal peptide)(以芽孢杆菌的Sec途径的信号肽SP_DacB、SP_amyE和SP_L为例)：以再上面给出氨基酸序列和碱基序列

利用NCBI数据库并通过在线分析软件SignalP 5.0Server和TatP 1.0Server预测获得芽孢杆菌来源的信号肽，启动子P_ly-2(核苷酸序列如SEQ ID NO.15)(启动子来源于枯草芽孢杆菌淀粉酶，构建方法来源于专利申请号为201910332240.4 的发明专利《一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》。序列与单、双信号肽基因由苏州金维智公司合成。

其中信号肽SP_DacB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于专利(路福平等一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法，201910332240.4.实施案例2中的SP_DacB,的质粒)其GenBank:JQ302239.1。

其中信号肽SP_amyE的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，来源于枯草芽孢杆菌 168，其NCBI Reference Sequence:NC_000964.3。

其中，信号肽SP_L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，来源于地衣芽孢杆菌，其GenBank:CP034569.1。

其中信号肽SP_DacB和SP_amyE的酶切位点为均为EcoRI和HindIIⅠ。将信号肽 SP_DacB和SP_amyE分别经过EcoRI和HindIIⅠ的双酶切，经过切胶回收，将回收以后的条带分别连接到上述构建好的含有蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶和角蛋白酶基因的重组载体中，详细步骤如下：

分别将构建不同的信号肽载体进行以下分组：

对照组：

(1)构建单信号肽载体的方法：

通过实验室的筛选选择出表达碱性蛋白酶效果比较好的信号肽进行串联组合，并作为单信号肽的对照实验。SP_amyE表达碱性蛋白酶酶活在10000U/mL.SP_DacB表达碱性蛋白酶酶活在18000U/mL，在相同的载体和宿主菌中，上述两种信号肽在表达碱性蛋白酶酶活时更为显著，由此说明上述信号肽在提高蛋白表达量上具有显著的功能，因此以此作为单信号肽的对照实验

分别将P_ly-2启动子和信号肽SP_DacB的碱基序列进行依次连接，合成含由P_ly-2启动子和信号肽SP_DacB的串联基因，经过EcoRI和HindIIⅠ的双酶切后，共同连接到与同样经过EcoRI和HindIIⅠ酶切的含有角蛋白酶的重组载体中，获得重组载体SPD；

分别将P_ly-2启动子和信号肽SP_DacB的碱基序列进行依次连接，合成含由P_ly-2启动子和信号肽SP_DacB的串联基因，经过EcoRI和HindIIⅠ的双酶切后，共同连接到与同样经过EcoRI和HindIIⅠ酶切的含有蔗糖异构酶的重组载体中，获得重组载体SPD2；

分别将P_ly-2启动子和信号肽SP_amyE的碱基序列进行依次连接，合成含有P_ly-2 启动子和信号肽SP_amyE的串联基因，经过EcoRI和HindIIⅠ的双酶切后，共同连接到与同样经过EcoRI和HindIIⅠ酶切的含有果聚糖蔗糖酶的重组载体中，获得重组载体SPL；

(2)构建三信号肽载体的方法：

将P_ly-2启动子、信号肽SP_amyE、SP_DacB、SP_L的核苷酸序列依次连接，合成一条含有三个信号肽串联组合的基因(基因由苏州金维智公司合成)，经过EcoRI 和HindIIⅠ的双酶切后，共同连接到与同样经过EcoRI和HindIIⅠ酶切的含有果聚糖蔗糖酶的重组载体中，获得重组载体SP-A-D-L。

实验组：

构建双信号肽载体的方法：

将P_ly-2启动子、信号肽SP_DacB、SP_amyE的核苷酸序列依次连接，合成一条含有双信号肽串联组合的基因(基因由苏州金维智公司合成)，在经过EcoRI和 HindIIⅠ的双酶切后，共同连接到与同样经过EcoRI和HindIIⅠ酶切的含有角蛋白酶的重组载体中，获得重组载体SP-D-A；

将P_ly-2启动子、信号肽SP_DacB、SP_amyE的核苷酸序列依次连接，合成一条含有双信号肽串联组合的基因(基因由苏州金维智公司合成)，经过EcoRI和HindIIⅠ 的双酶切后，连接到与同样经过EcoRI和HindIIⅠ酶切的含有蔗糖异构酶重组载体中，获得重组载体SP-D-A2。

将P_ly-2启动子、信号肽SP_amyE、SP_L的核苷酸序列依次连接，合成一条含有双信号肽串联组合的基因(基因由苏州金维智公司合成)，经过EcoRI和HindIIⅠ 的双酶切后，连接到与同样经过EcoRI和HindIIⅠ酶切的含有果聚糖蔗糖酶的重组载体中，获得重组载体SP-A-L。

综上，使用酶切位点为EcoRI和HindIIⅠ，构建成单、双、三信号肽载体(如图4)分别命名为角蛋白酶重组载体(SPD、SP-D-A)和蔗糖异构酶重组载体 (SPD2、SP-A-D2)、果聚糖蔗糖酶(SPL、SP-A-L、SP-A-D-L)。

实施例3重组基因工程菌的表达

将上述实施例2构建好的重组载体：角蛋白酶重组载体(SPD、SP-D-A)和蔗糖异构酶重组载体(SPD2、SP-A-D2)、果聚糖蔗糖酶重组载体(SPL、SP-A-L、 SP-A-D-L)通过化转到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600，具体方法参考专利文献 (申请号为201910332240.4的发明专利《一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》，实施案例2的化转到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600转步骤)，于抗性平板(卡那霉素50μg/mL)上获得克隆子，分别为重组菌1(含角蛋白酶，单信号肽SP_DacB)、重组菌2(含角蛋白酶，双信号肽SP_DacB和SP_amyE)、重组菌3(含果聚糖蔗糖酶，单信号肽SP_DacB)、重组菌4(含蔗糖异构酶，双信号肽SP_amyE和SP_DacB)、重组菌5(含果聚糖蔗糖酶，单信号肽SP_amyE)、重组菌6(含果聚糖蔗糖酶，双信号肽SP_amyE和SP_L)、重组菌7(含有果聚糖蔗糖酶，三个信号肽的SP_amyE、SP_DacB和SP_L)。

将新鲜平板上的重组基因工程菌的单菌落分别接入种子培养基中，37℃、 220r/min振荡培养12h，以2％(v/v)的接种量转接于发酵产角蛋白酶的发酵培养基中，于37℃、220r/min发酵培养，其中重组菌株1、2的培养时间为48h，重组菌株3、4、5、6、7单菌落分别接入种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养 12h，以2％(v/v)的接种量转接于发酵产蔗糖异构酶和果聚糖蔗糖酶的发酵培养基中，培养时间为16h，测定酶活。

其中角蛋白酶的酶活测定方法：

取重组菌株1、2的发酵液，经过离心取上清液，进行角蛋白酶的酶活测定，角蛋白酶的测定方法：

将发酵液4℃、12 000r/min，离心10min，取250μL粗酶液，加入250μL 0.05mol/LGly-NaOH缓冲液(pH 10.0)溶解1％的底物(角蛋白)， 60℃反应10min，加入500μL 0.4mol/L三氯乙酸溶液终止反应(对照组先加入三氯乙酸)。12 000r/min，离心5min，取上清500μL，加入2.5mL 0.4mol/L Na₂CO₃溶液和500μL福林酚试剂(1∶2V/V)混合，60℃显色20min。在波长680nm下检测吸光值。

酶活力定义：1g固体酶粉(或者1mL液体酶)，在60℃，pH 10.0条件下，1min水解角蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g(U/mL) 表示。

酶活力的计算，得到测酶活的标准曲线的回归方程：y＝0.01x+0.0007，R²

＝0.999 7酶活计算公式：X＝A×K×1/10×n×4

式中：X为样品的酶活力，U/g(U/mL)；A为样品平行试验的平均吸光度；K为吸光常数；1为反应试剂的总体积(mL)；10为反应时间10min，以1min计；n为稀释倍数。

通过测定角蛋白酶的酶活，结果如图7表明，重组菌株2，即通过双信号肽分泌的角蛋白酶表达，酶活在48h的表达最高，其中48h达到最高酶活为 226.34U/mL,是重组菌株1，利用单个信号肽表达的酶活(酶活为68.15U/mL)的 3.32倍。

SDS-PAGE：将重组菌株1、2分别培养了48h的发酵液离心取上清，上清液跑 SDS-PAGE电泳，从蛋白胶图(见图6)可以看出双信号肽的蛋白条带比单信号肽的条带粗，说明双信号肽表达量明显多于单个信号肽。

SDS-PAGE电泳缓冲液(5×)：每升含Tris 15.1g、Glycine 94g、SDS 5.0g，去离子水搅拌溶解，使用时稀释成1×；

10％SDS：每升含100g SDS，去离子水中充分溶解，室温下保存备用；

30％丙烯酰胺：称取30g丙烯酰胺、0.8g N，N’-二甲基丙烯酰胺，加去离子水充分搅拌溶解，定容至100mL，用0.45μm滤膜滤去杂质，于棕色瓶中4℃保存。

10％过硫酸铵(10mL)：称取1g过硫酸铵充分溶解于10mL去离子水中，4℃ 保存。注意：10％过硫酸铵溶液在4℃保存时可使用2周左右，超过期限会失去催化作用。

1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：称取18.15g Tris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH 8.8，让溶液冷却至室温，pH将会升高，然后再调至pH 8.8，加蒸馏水至100mL，高温高压灭菌后4℃保存。

0.5M Tris-HCl(pH 6.8)：称取6.05g Tris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH 8.8，让溶液冷却至室温，pH将会升高，然后再调至pH 8.8，加蒸馏水至100mL，高温高压灭菌后4℃保存。

2×SDS-PAGE上样缓冲液：1.25mL 0.5M Tris-HCl(pH 6.8)，0.2g SDS， 0.1mL巯基乙醇，0.5mg溴酚蓝，定容至5mL，室温存放。

考马斯亮蓝R250染色液：取0.25g考马斯亮蓝(Coomassie blue)R250溶解于90mL的甲醇：水(1:1)和10mL冰醋酸混合液中，过滤除去颗粒杂质。

考马斯亮蓝脱色液：醋酸:乙醇:水体积比为10:5:85。

采用SDS-PAGE法检测重组蛋白的表达，按照表2-7配置聚丙烯酰胺凝胶，其中分离胶为浓度为12％的聚丙烯酰胺。

表1 SDS-PAGE凝胶配制方法

(1)12％分离胶的配制

按要求组装凝胶电泳模具，添加水测试胶板是否会出现漏胶现象；按照表2-7 所述12％胶配方配制SDS-PAGE凝胶，首先配置下层分离胶，按从上到下依次添加各组分，震荡充分混匀，缓慢加入到模具内，大约加整个胶板面积的2/3，用 500μL异丙醇压实。常温下放置至凝胶充分凝固聚合，大约40min；

(2)浓缩胶的配制

倒掉分离胶上的异丙醇。按照表2-7 5％浓缩胶的配方，按从上到下依次添加各组分，快速震荡充分混匀，用移液枪缓慢加到分离胶上，直至与玻璃板顶端平齐。立即将干净的、厚度合适的梳子插入浓缩胶中。待浓缩胶充分凝固后(约30 min)，拔出梳子，将配置好的蛋白胶放入相对应的电泳槽中，倒入1×SDS蛋白电泳缓冲液浸没胶块；

(3)上样

20μL样品，加入5μL 5×Loading buffer，沸水浴10min；快速离心后进行上样。

(4)电泳、染色和脱色

上样完成后，连接电极，80V恒压电泳约15min，直至Loading buffer指示剂进入分离胶，换150V电压，直至Loading buffer指示剂前沿迁移至凝胶底部时，结束电泳。电泳完毕，将胶放入考马斯亮蓝染色液中，染色30min。染色结束后，弃去染液，去离子水冲洗两次，加入脱色液，进行脱色，直至脱色干净。然后观察蛋白电泳结果。

果聚糖蔗糖酶的测定方法：

取重组菌株3、4的发酵液，经过离心取上清液，进行蔗糖异构酶的酶活测定，蔗糖异构酶的测定方法参照：DNS法：

DNS：①称10g 3，5-二硝基水杨酸溶于600mL蒸馏水中，45℃水浴；②称 10g NaOH，先将其溶于水，再加入上述溶液。③称取200g酒石酸钠，2g苯酚， 5g亚硫酸钠，逐次溶于上述溶液中(避光操作)。④溶液温度至室温后，定容至1L，混匀。分装在棕色瓶中，一周后使用。

葡萄糖标准曲线的绘制

取1.0mg/mL葡萄糖标准溶液，按表2-8加入试剂。沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25mL摇匀，在520nm波长下测定吸光度。

表2葡萄糖标准溶液的配制

②还原糖的测定

取适当稀释的糖液2mL，加入1.5mL DNS试剂，沸水浴中加热5min，冷水冷却后，定容至25mL摇匀，在520nm波长下测定其吸光度值。(数值在0.2-0.7 为可信区间)

通过蔗糖异构酶的测定：结果表明重组菌株4，即通过双信号肽串联组合分泌的蔗糖异构酶表达，酶活在16h的表达最高，酶活为24U/mL，是重组菌株3，即是单信号肽(酶活为12U/mL)表达量的2倍(参照附图7)。

SDS-PAGE：将含有蔗糖异构酶重组菌株16h的发酵液离心取上清，上清液跑SDS-PAGE电泳，与单信号肽作为对照，蛋白胶图显示(如图8)明显看出重组菌株4的双信号肽在表达果聚糖蔗糖酶的条带明显粗于重组菌株3的单个信号肽.实验结果说明双信号肽能够有效的高表达蔗糖异构酶。

果聚糖蔗糖酶重组菌株发酵16h,通过果聚糖蔗糖酶的测定：结果表明重组菌株6，即通过双信号肽串联组合分泌的果聚糖蔗糖酶表达，酶活在16h的表达最高，酶活为80.86U/mL，是重组菌株5，即通过单信号肽(酶活为57.39U/mL)表达量的1.4倍，参照附图11。

SDS-PAGE：将含有果聚糖蔗糖酶重组菌株经不同发酵时间(6h、8h、10h、 13h、16h)的发酵液离心取上清，上清液跑SDS-PAGE电泳，与单信号肽作为对照，蛋白胶图显示(参照附图10)明显看出重组菌株4的双信号肽在表达果聚糖蔗糖酶的条带明显粗于重组菌株5的单个信号肽.实验结果说明双信号肽能够有效的高表达果聚糖蔗糖酶。

可见，通过信号肽的串联组合能够有效的提高异源蛋白的表达。

此外，通过双信号肽串联组合和三信号肽串联组合的对比可以看出，通过双信号肽串联组合分泌的果聚糖蔗糖酶表达，酶活在16h的表达最高，酶活为80.86 U/mL，是重组菌株7(SP-A-D-L)，即通过三信号肽(酶活为56U/mL)表达量的1.4倍，参照附图11。

SDS-PAGE：将含有果聚糖蔗糖酶重组菌株经不同发酵时间(6h、8h、10h、 13h、16h)的发酵液离心取上清，上清液跑SDS-PAGE电泳，三信号肽与双信号肽串联组合相比，蛋白胶图显示(参照附图10)明显看出重组菌株4的双信号肽在表达果聚糖蔗糖酶的条带明显粗于重组菌株7的三信号肽.实验结果说明双信号肽能够有效的高表达果聚糖蔗糖酶，显著高于单信号肽和三信号肽的表达。同理，在利用三信号肽SP_DacB、SP_amyE和SP_L表达角蛋白酶和蔗糖异构酶时，其表达的酶活同样低于上述利用双信号肽表达的酶活。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途

<130> 1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌1A747

<400> 1

Met Arg Ile Phe Lys Lys Ala Val Phe Val Ile Met Ile Ser Phe Leu

1 5 10 15

Ile Ala Thr Val Asn Val Asn Thr Ala His Ala

20 25

<210> 2

<211> 43

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌168

<400> 2

Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly

1 5 10 15

Phe Leu Leu Leu Phe His Leu Val Leu Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ser

20 25 30

Ala Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu Leu Thr

35 40

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 3

Met Asn Ile Lys Asn Ile Ala Lys Lys Ala Ser Ala Leu Thr Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Pro Gln Thr Phe Ala Lys Glu

20 25 30

<210> 4

<211> 81

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌1A747

<400> 4

atgcgcattt tcaaaaaagc agtattcgtg atcatgattt cttttcttat tgcaaccgta 60

aatgtgaata cagcacatgc t 81

<210> 5

<211> 129

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌168

<400> 5

atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60

tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgctg aaacggcgaa caaatcgaat 120

gagcttaca 129

<210> 6

<211> 90

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 6

atgaacatca aaaacattgc taaaaaagcg tcagccttaa ccgttgctgc ggcactgctg 60

gccggaggtg cgccgcaaac ctttgcaaaa 90

<210> 7

<211> 382

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 7

Met Arg Gly Lys Lys Val Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ile Phe Thr Met Ala Phe Gly Ser Thr Ser Pro Ala Gln Ala Ala Gly

20 25 30

Lys Ser Asn Gly Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met

35 40 45

Ser Thr Met Ser Ala Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly

50 55 60

Gly Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asp Ala Ala Ser Ala Thr

65 70 75 80

Leu Asn Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala

85 90 95

Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala Lys Ala Tyr Ala Gln Ser Val Pro

100 105 110

Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Phe

115 120 125

Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser

130 135 140

Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser

145 150 155 160

Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Tyr Asn Ser His Gly Thr His Val Ala

165 170 175

Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Val Gly Val Leu Gly Val Ala

180 185 190

Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser

195 200 205

Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn

210 215 220

Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala

225 230 235 240

Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val

245 250 255

Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Val

260 265 270

Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asn

275 280 285

Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ser Glu Leu Asp

290 295 300

Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Asn Lys

305 310 315 320

Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly

325 330 335

Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln

340 345 350

Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ala Phe

355 360 365

Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln

370 375 380

<210> 8

<211> 598

<212> PRT

<213> 分散泛菌

<400> 8

Met Phe Leu Asn Gly Phe Lys Thr Val Ile Ala Leu Thr Met Ala Ser

1 5 10 15

Ser Phe Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Thr Pro Ile

20 25 30

Ala Ala Thr Asn Ile Gln Lys Ser Ala Asp Phe Pro Ile Trp Trp Lys

35 40 45

Gln Ala Val Phe Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn

50 55 60

Gly Asp Gly Ile Gly Asp Ile Pro Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Leu Lys Met Leu Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Glu

85 90 95

Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Lys Ile

100 105 110

Met Lys Glu Tyr Gly Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu

115 120 125

Met Asn Lys Arg Gly Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn His

130 135 140

Thr Ser Asp Arg His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gly Lys Asp

145 150 155 160

Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Gln Gly Gln

165 170 175

Ala Pro Asn Asn Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Leu

180 185 190

Asp Lys Gln Thr Asp Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Pro Gln Gln

195 200 205

Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Ala Glu Leu Tyr Asp

210 215 220

Ile Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp

225 230 235 240

Thr Val Ala Thr Phe Ser Lys Ile Pro Gly Phe Pro Asp Leu Ser Lys

245 250 255

Ala Gln Leu Lys Asn Phe Ala Glu Ala Tyr Thr Glu Gly Pro Asn Ile

260 265 270

His Lys Tyr Ile His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lys Tyr Asn

275 280 285

Val Ala Thr Ala Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Val Ser Ala Met Pro

290 295 300

Asp Tyr Phe Asp Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr Phe

305 310 315 320

Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg Tyr Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lys

325 330 335

Pro Trp Thr Leu Ser Gln Phe Arg Gln Val Ile Ser Gln Thr Asp Arg

340 345 350

Ala Ala Gly Glu Phe Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp

355 360 365

Asn Pro Arg Gln Val Ser His Phe Gly Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg

370 375 380

Glu Arg Ser Ala Lys Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala

385 390 395 400

Thr Pro Phe Ile Phe Gln Gly Ala Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro

405 410 415

Phe Lys Asn Ile Glu Glu Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp

420 425 430

Asn Asp Tyr Val Ala Ser Gly Lys Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln

435 440 445

Glu Val Arg Met Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp

450 455 460

Asn Asp Ser Val Asn Ala Gly Phe Thr Gln Gly Lys Pro Trp Phe His

465 470 475 480

Leu Asn Pro Asn Tyr Lys Gln Ile Asn Ala Ala Arg Glu Val Asn Lys

485 490 495

Pro Asp Ser Val Phe Ser Tyr Tyr Arg Gln Leu Ile Asn Leu Arg His

500 505 510

Gln Ile Pro Ala Leu Thr Ser Gly Glu Tyr Arg Asp Leu Asp Pro Gln

515 520 525

Asn Asn Gln Val Tyr Ala Tyr Thr Arg Ile Leu Asp Asn Glu Lys Tyr

530 535 540

Leu Val Val Val Asn Phe Lys Pro Glu Gln Leu His Tyr Ala Leu Pro

545 550 555 560

Asp Asn Leu Thr Ile Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro

565 570 575

Ser Leu Gln Glu Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala

580 585 590

Gly Ile Tyr Lys Leu Asn

595

<210> 9

<211> 482

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 9

Met Asn Ile Lys Asn Ile Ala Lys Lys Ala Ser Ala Leu Thr Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Pro Gln Thr Phe Ala Lys Glu Thr

20 25 30

Gln Asp Tyr Lys Lys Ser Tyr Gly Phe Ser His Ile Thr Arg His Asp

35 40 45

Met Leu Lys Ile Pro Glu Gln Gln Lys Ser Glu Gln Phe Lys Val Pro

50 55 60

Gln Phe Asp Pro Lys Thr Ile Lys Asn Ile Pro Ser Ala Lys Gly Tyr

65 70 75 80

Asn Lys Asn Gly Glu Leu Ile Asp Leu Asp Val Trp Asp Ser Trp Pro

85 90 95

Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Val Ala Thr Tyr His Gly Tyr Asn Leu

100 105 110

Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asp Val Asp Asp Thr Ser Ile

115 120 125

Tyr Leu Phe Tyr Gln Lys Lys Gly Glu Thr Ser Ile Asp Ser Trp Lys

130 135 140

Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys Asp Ser Asp Lys Phe Val Pro Asp Asp

145 150 155 160

Pro Tyr Leu Lys His Gln Thr Gln Glu Trp Ser Gly Ser Ala Thr Leu

165 170 175

Thr Lys Asp Gly Lys Val Arg Leu Phe Tyr Thr Ala Phe Ser Gly Thr

180 185 190

Gln Tyr Gly Lys Gln Thr Leu Thr Thr Ala Gln Val Asn Phe Ser Gln

195 200 205

Pro Asp Ser Asp Thr Leu Lys Ile Asp Gly Val Glu Asp His Lys Ser

210 215 220

Val Phe Asp Gly Ala Asp Gly Thr Val Tyr Gln Asn Val Gln Gln Phe

225 230 235 240

Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly Asp Asn His Thr Met Arg Asp

245 250 255

Pro His Tyr Val Glu Asp Arg Gly His Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala

260 265 270

Asn Thr Gly Thr Lys Thr Gly Tyr Gln Gly Glu Asp Ser Leu Phe Asn

275 280 285

Arg Ala Tyr Tyr Gly Gly Ser Lys Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ser Ser

290 295 300

Lys Leu Leu Gln Gly Ala Asn Lys Lys Asn Ala Ser Leu Ala Asn Gly

305 310 315 320

Ala Leu Gly Ile Ile Glu Leu Asn Asn Asp Tyr Thr Leu Lys Lys Val

325 330 335

Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr Val Thr Asp Glu Ile Glu Arg

340 345 350

Ala Asn Leu Phe Lys Met Asn Gly Lys Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser

355 360 365

Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly Ile Gly Ser Lys Asp Ile Tyr

370 375 380

Met Leu Gly Tyr Val Ser Gly Ser Leu Thr Gly Pro Phe Lys Pro Leu

385 390 395 400

Asn Lys Ser Gly Leu Val Leu His Met Asp Gln Asp Tyr Asn Asp Ile

405 410 415

Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val Pro Gln Lys Lys Gly Asp Glu

420 425 430

Val Val Ile Thr Ser Tyr Ile Thr Asn Arg Gly Ile Ser Asn Glu His

435 440 445

His Ala Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu Leu Lys Ile Lys Gly Ser Lys

450 455 460

Thr Ser Val Val Lys Asn Ser Ile Leu Glu Gln Gly Gln Leu Thr Val

465 470 475 480

Asn Lys

<210> 10

<211> 1278

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 10

ctaaatagaa ataaaacaaa ttgaaaaaaa ttgggtctac taaaatatta ttccatgcta 60

tacaattaat ccacagaata atctgtttat tggttgttct gcaaatgaaa aaaaggagag 120

gataaagagt gagaggcaaa aaggtatgga tcagtttgct gtttgcttta gcgttaatct 180

ttacgatggc gttcggcagc acgtctcctg cccaggcggc agggaaatca aacggggaaa 240

agaaatacat tgtcggattt aaacagacaa tgagcacgat gagcgccgct aagaaaaaag 300

atgtcatttc tgaaaaaggc gggaaagtgc aaaagcaatt caaatatgta gacgcagctt 360

cagctacatt aaatgaaaaa gctgtaaaag agctgaaaaa agacccaagc gtcgcttacg 420

ttgaagaaga tcacgttgca aaagcgtacg cgcagtccgt gccttacggc gtatcacaaa 480

ttaaagcccc tgctctgcac tctcaaggct tcactggatc aaatgtgaaa gtagcggtta 540

tcgacagcgg tatcgattct tctcatcctg atttaaaagt agcaggcgga gccagcatgg 600

ttccttctga aacaaatcct ttccaagact acaactctca cggaactcac gttgccggta 660

cagttgcggc tcttaataac tcagtcggtg tattaggcgt tgcgccaagc gcatctcttt 720

acgctgtaaa agttctcggc gctgacggtt ccggccagta cagctggatc attaacggaa 780

ttgagtgggc gatcgcaaac aatatggacg ttattaacat gagcctcggc ggaccttctg 840

gttctgcagc gttaaaagcg gcagttgaca aagccgttgc ttccggcgtc gtagtcgtag 900

cggcagccgg taacgaaggc acttccggcg gttcaagcac agtgggctac cctggtaaat 960

acccttctgt cattgcggta ggcgctgtta acagcagcaa ccaaagagca tctttctcaa 1020

gcgtaggttc tgagcttgat gtcatggcac caggcgtctc tatccaaagc acgcttcctg 1080

gaaacaaata cggcgcgtac aatggtacgt caatggcatc tccgcacgtt gccggagcgg 1140

ctgctttgat tctttctaag cacccgaact ggacaaacac tcaagtccgc agcagtttag 1200

aaaacaccac tacaaaactt ggtgatgctt tctactacgg aaaagggctg atcaacgtac 1260

aggcggcagc tcagtaaa 1278

<210> 11

<211> 1797

<212> DNA

<213> 分散泛菌

<400> 11

atgtttctta atggatttaa gacagttatt gctctgacta tggcaagctc gttttatctt 60

gccgccagcc cgttaactaa gccatcgacc cctattgccg caacgaatat acaaaagtcc 120

gctgattttc ccatttggtg gaaacaggca gtattttacc agatttatcc ccgctcattt 180

aaagatagca atggtgatgg tatcggcgat attcccggta tcattgagaa actggactat 240

ttaaaaatgc tgggagttga tgctatctgg ataaacccgc actatgagtc tcctaacacc 300

gacaatggtt acgatattag tgattatcgt aaaatcatga aggagtacgg cagcatggct 360

gactttgacc gtctggttgc cgaaatgaat aaacgtggta tgcgcctgat gattgatatt 420

gttatcaatc ataccagcga tcgtcaccgc tggtttgtgc agagccgttc aggtaaagat 480

aatccttacc gcgactatta tttctggcgt gatggtaaac agggacaggc tcccaataac 540

tatccctctt tctttggcgg ttcagcctgg caactggata aacagactga ccagtattat 600

ctgcactatt ttgcaccaca gcagccggat ctgaactggg ataacccaaa agttcgggct 660

gaactctacg atattctgcg tttctggctg gataaaggcg tatccggact acgttttgat 720

accgtggcta ctttctccaa aattcctggc ttcccggacc tgtcaaaagc gcagctgaag 780

aattttgccg aagcttatac tgaggggccg aatattcata aatatatcca tgaaatgaac 840

cgccaggtac tgtctaaata taatgttgcc accgctggtg aaatcttcgg tgtgccagtg 900

agtgctatgc cggattattt tgaccggcgg cgtgaagaac tcaatattgc tttcaccttt 960

gatttgatca ggctcgatcg ttatcccgat cagcgctggc gtcgtaaacc atggacatta 1020

agccagtttc gtcaagttat ctctcagact gaccgtgccg ccggtgaatt tggctggaac 1080

gcctttttcc ttgataacca tgataacccg cgccaggtct cacactttgg tgacgacagc 1140

ccacaatggc gcgaacgctc ggcaaaagca ctggcaacgc tgctgctgac gcagcgtgcc 1200

acgccgttta tctttcaggg ggcggagttg ggaatgacta attacccctt taaaaatata 1260

gaggaatttg atgatattga ggttaaaggc ttctggaacg actatgtagc cagcggaaaa 1320

gtaaacgctg ctgaattttt acaggaggtt cgcatgacca gccgcgataa cagccgaaca 1380

ccaatgcagt ggaacgactc tgttaatgcc ggattcaccc agggcaaacc ctggtttcac 1440

ctcaatccca actataagca aatcaatgcc gccagggagg tgaataaacc cgactcggta 1500

ttcagttact accgtcaact gatcaacctg cgtcaccaga tcccggcact gaccagtggt 1560

gaataccgtg atctcgatcc gcagaataac caggtctatg cctatacccg tatactggat 1620

aatgaaaaat atctggtggt agttaatttt aaacctgagc agctgcatta cgctctgcca 1680

gataatctga ctattgccag cagtctgctg gaaaatgtcc accaaccatc actgcaagaa 1740

aatgcctcca cgctgactct tgctccgtgg caagccggga tctataagct gaactga 1797

<210> 12

<211> 1449

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 12

atgaacatca aaaacattgc taaaaaagcg tcagccttaa ccgttgctgc ggcactgctg 60

gccggaggtg cgccgcaaac ctttgcaaaa gaaacgcagg attacaagaa aagctacgga 120

ttttctcata tcacaagaca tgacatgctg aaaattcccg agcagcaaaa gagcgaacaa 180

tttaaagttc ctcaattcga tccgaaaaca atcaaaaaca tcccttctgc aaaagggtat 240

aacaaaaatg gagagctgat cgatttagac gtatgggaca gctggccgct gcaaaatgcc 300

gacgggacgg ttgctacata ccacggctac aatcttgttt tcgcgctggc gggcgatccg 360

aaagacgtcg atgacacatc catctatttg ttctatcaaa agaaaggcga aacttctatc 420

gacagctgga aaaacgccgg cagagtgttt aaagacagcg acaaatttgt tccagacgat 480

ccgtacctca aacatcaaac acaggaatgg tcaggttctg ccacgctgac aaaagacgga 540

aaagtccgac tgttttacac agctttttcc ggcacgcaat acggcaagca gacgctgaca 600

acagctcagg tcaatttctc tcagccggat tcggacacgc tcaaaattga cggtgtagaa 660

gatcataaat cggtctttga cggcgccgac ggcacggtat accaaaacgt tcagcaattc 720

attgacgaag gaaactacag ctccggcgac aaccatacga tgagagaccc gcattatgtg 780

gaagaccgcg gccataaata tctcgtattt gaagccaata cgggaacaaa aaccggctac 840

caaggagaag actccctatt caacagagcc tactacgggg gcagcaagaa gttctttaaa 900

gaagaaagca gcaagctgct gcaaggtgcg aacaaaaaga acgcttcgct ggctaacggc 960

gctctcggaa tcatcgaatt aaataacgat tatacactga aaaaagtcat gaagcctttg 1020

atcgcctcca atacggtgac agatgaaatc gaacgggcca acctcttcaa aatgaatgga 1080

aaatggtatc tgttcacaga ttcaagagga tcaaaaatga caattgacgg catcggttca 1140

aaagacattt atatgctcgg ctatgtatca ggttcattaa ccggaccatt caagccttta 1200

aacaaatccg gacttgtttt gcatatggac caggattaca atgacatcac gtttacttat 1260

tcacactttg ccgtaccgca gaaaaaaggc gacgaagtcg tcattacaag ctacatcaca 1320

aacagaggga tttcgaacga gcatcacgcc acgtttgcac caagcttttt gctgaagatc 1380

aaaggatcaa aaacatccgt tgtcaaaaac agcatccttg aacagggaca actaacggta 1440

aacaaataa 1449

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgcggatcca atttaaatat ttcgggttcc tattaaac 38

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

catgcatgct aaaaaaaccg gcggggc 27

<210> 15

<211> 596

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 15

cattatgttt gaatttccgt ttaaagaatg ggctgcaagc cttgtgtttt tgttcatcat 60

tatcttatat tactgcatca gggctgcggc atccggaatg ctcatgccga gaatagacac 120

caaagaagaa ctgcaaaaac gggtgaagca gcagcgaata gaatcaattg cggtcgcctt 180

tgcggtagtg gtgcttacga tgtacgacag ggggattccc catacattct tcgcttggct 240

gaaaatgatt cttcttttta tcgtctgcgg cggcgttctg tttctgcttc ggtatgtgat 300

tgtgaagctg gcttacagaa gagcggtaaa agaagaaata aaaaagaaat catctttttt 360

gtttggaaag cgagggaagc gttcacagtt tcgggcagct ttttttatag gaacattgat 420

ttgtattcac tctgccaagt tgttttgata gagtgattgt gataatttta aatgtaagcg 480

ttaacaaaat tctccagtct tcacatcggt ttgaaaggag gaagcggaag aatgaagtaa 540

gagggatttt tgactccgaa gtaagtcttc aaaaaatcaa ataaggagtg tcaaga 596

Claims

1.一种提高外源蛋白表达量的双信号肽组合，其特征在于：所述双信号肽组合是由氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的信号肽中的任意两种不同信号肽的串联组合。

2.编码权利要求1所述信号肽的基因。

3.权利要求1所述双信号肽组合在提高蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶表达量中的用途。

4.如权利要求3所述双信号肽组合在提高蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶表达量中的用途，其特征在于：

所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQID NO.8所示；所述果聚糖蔗糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

5.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求1所述双信号肽组合的编码基因。

6.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求1所述双信号肽组合的编码基因或权利要求6所述的重组载体。

7.权利要求1所述双信号肽组合的构建方法，其特征在于：构建包含所述双信号肽组合的编码基因和外源蛋白基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。

8.一种外源蛋白的生产方法，其特征在于：将含有所述权利要求1的双信号肽组合的基因工程菌经活化后，以1.5-2.5％的接种量转接于发酵培养基中，于35-40℃、215-225r/min发酵培养15-50h。