JP3183622B2 - 鱗翅類に対して幼虫殺虫活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 - Google Patents

鱗翅類に対して幼虫殺虫活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列

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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、鱗翅類に対して幼
虫殺虫活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列に係る。
【０００２】本発明はより特定的には、そのための手段
特にヌクレオチド配列、ポリペプチドもしくはベクタ
ー、又はこれらの配列により修飾され、鱗翅類、好まし
くはSpodoptera littoralis （以下、S.littoralisと呼
称する）もしくはMamestra brassicae（以下、M.brassi
cae と呼称する）に対して幼虫殺虫の組成物を調製し得
るポリペプチドを発現するか、又は処理すべき植物にこ
の型の活性を与えることにより該植物を形質転換するこ
とが可能な細菌株に係る。
【０００３】
【従来の技術】大部分のB.thuringiensis の単離物は10
0 種を越える鱗翅類の幼虫に対して毒性活性を有するこ
とが知られている。
【０００４】この活性は、B.thuringiensis 株が胞子形
成時に１又は数種の型の遺伝子の制御下でタンパク性の
結晶含有物又はδ- エンドトキシンを合成する能力を有
することに起因する。
【０００５】これらのポリペプチドの活性はタンパク質
のNH2 末端又はN 末端部分に含まれることが明らかにさ
れている。
【０００６】研究の結果、δ- エンドトキシンは所与の
種の幼虫に対して高い特異性を有することが明らかにな
った。
【０００７】この高い特異性により、多くの種類の鱗翅
類、特にヤガ科は市販のB.thuringiensis 調剤に対して
弱い反応しか示さない。
【０００８】ちなみに、綿花や他の産業上重要な栽培物
の主要な寄生動物を構成するのは特に雑食性昆虫である
S.littoralis種である。これらの栽培物としては、トウ
モロコシ、ヒマ、タバコ、落花生、飼葉用植物（例えば
クローバー又はムラサキウマゴヤシ）、又は野菜（例え
ばキャベツ又はトマト）を挙げることができる。
【０００９】従って、ヤガ科、特にS.littoralis又はM.
brassicae を特異的且つ有効に標的とする手段を利用で
きるならば有利である。
【００１０】今日までに同定されているδ- エンドトキ
シンの遺伝子は、S.littoralisに対して優先的に活性な
ポリペプチドをコードしない。
【００１１】本発明者らは、好ましくはヤガ科、特にS.
littoralisに対して活性なポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を追及するうちに、S.littoralisに対す
る幼虫殺虫活性が他のB.thuringiensis 株から調製され
た工業的調剤よりも高いと思われる２種のB.thuringien
sis 株の天然単離物について検討するに至った。
【００１２】この２種の株はaizawai 7-29 及びentomo
cidus 6-01 である。
【００１３】これらの単離物の研究の結果、異なる構造
と異なる特異性とを有するδ- エンドトキシンの複数の
遺伝子の存在を解明することができ、このうち２つの遺
伝子はP.brassicae に対して優先的に活性であるが、綿
花のヤガに対しては低活性であり、１つの遺伝子はP.br
assicae 及びS.littoralisに対して不活性であッた。
【００１４】本発明者らはこれらの単離物の全DNA を検
討し、適当なハイブリダイゼーションを実施し、その
後、ハイブリダイゼーションにより確認されたフラグメ
ントをクローニングすることにより、好ましくはS.litt
oralisに対して活性なポリペプチドをコードするδ- エ
ンドトキシンの遺伝子に含まれるヌクレオチド配列を単
離することが可能であることを確証した。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ヤガ、好ましくはS.littoralis又はM.brassicae に
対して毒性のδ- エンドトキシンの少なくともNH2 末端
部分をコードすることが可能なヌクレオチド配列を提供
することである。
【００１６】本発明の別の目的は、ヤガに対して毒性の
ポリペプチドを提供することである。
【００１７】本発明の更に別の目的は、このような配列
及び所望の活性を有するポリペプチドの獲得方法、並び
に前記ポリペプチドを獲得するために使用可能なベクタ
ーや細菌株のような中間手段を提供することである。
【００１８】本発明は更に、ヤガ、特にS.littoralisに
対して幼虫殺虫性の組成物を製造し、これらの幼虫に感
染され易い植物を形質転換するための、これらの配列及
びポリペプチドの適用に係る。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヤガ科の鱗翅
類の幼虫、好ましくはS.littoralisに対して特異的に毒
性のポリペプチドのN 末端領域の少なくとも一部をコー
ドするヌクレオチド配列に係り、該配列は、S.littoral
isの幼虫に対して毒性のポリペプチドを発現することが
可能な遺伝子とハイブリダイズする能力を有することを
特徴とする。
【００２０】本発明の別の態様によると、ヌクレオチド
配列は第２図に示すpHTA2 のプローブ１、２及び３とハ
イブリダイズすることが可能なB.thuringiensis のヌク
レオチド配列のin vitro 遺伝子組換により得られるよ
うな約3kb のヌクレオチド配列により担持されることを
特徴とする。3kb のフラグメントはより特定的にはHind
III -PstＩ制限フラグメントに対応する。
【００２１】本発明のヌクレオチド配列は更に、HindII
I - HincII - BglII - KpnＩ - Hind III -PstＩ部位を
この順序で含むことを特徴とする。
【００２２】好適なことに、これらのヌクレオチド配列
はB.thuringiensis の少なくとも１種の株に由来するDN
A 配列のin vitro遺伝子組換により得られる。本発明の
変形例ではB.thuringiensis の２種の異なる株を使用す
る。
【００２３】これらのヌクレオチド配列を獲得するため
に特に適当なB.thuringiensis 株は、パリに所在のColl
ection nationale de Culture de Microorganismes(C.
N.C.M.)に1987年4 月21日付けで夫々寄託番号1-661 及
びI-660 で寄託されたaizawai7-29 及びentomocidus 6
-01 に対応する株である。
【００２４】有利なことに、本発明のヌクレオチド配列
は、S.littoralisに対して幼虫殺虫活性を有するポリペ
プチドに対する抗体との間で免疫複合体を形成すること
が可能なポリペプチドをコードする。
【００２５】本発明のヌクレオチド配列は、次の連鎖を
示す配列（Ｉ）から形成されるプローブとハイブリダイ
ズする能力を有することを特徴とする。
【００２６】
【化１】
【００２７】ヤガ科の鱗翅類、好ましくはS.littoralis
の幼虫に対して特異的に毒性のポリペプチドのN 末端領
域の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、
上記連鎖（Ｉ）を含むことを特徴とする。
【００２８】有利なことに、上記連鎖により特徴付けら
れるヌクレオチド配列は、S.littoralisに対して有効で
あるとして現在知られている天然の単離物によりコード
されるポリペプチドよりも高い対S.littoralis幼虫殺虫
活性を有するポリペプチドの一部をコードする。
【００２９】このヌクレオチド配列を検討した処、該配
列は241 位に位置するATG 開始コドンから750 個のヌク
レオチドの解読枠(open reading frame)を有することが
判明した。
【００３０】この配列は更に、230 〜234 位にリボソー
ムの結合部位GGAGG を有することを特徴とする。
【００３１】別の態様によると本発明のヌクレオチド配
列は、(16)により記載されているようにWong他(1983)に
よりkurstaki HD1 Dipel (BTK)株の結晶遺伝子の上流に
見いだされた領域（著者はこの領域が夫々B.thuringien
sis 及び大腸菌において機能的な３つのプロモーターBt
Ｉ、BtII及びEcを含むことを示した）に著しく相同の配
列を、ATG コドンの上流の137 位のヌクレオチドから17
7 位のヌクレオチドの間に含むことを特徴とする。これ
らの配列の相同度は約70％である。
【００３２】本発明は更に、次のアミノ酸配列（II）を
コードするヌクレオチド配列に係る。
【００３３】
【化２】
【００３４】CNCMに寄託されている上記株から単離され
たヌクレオチド配列を厳密に同定した処、273 位に位置
するヌクレオチドはグアニン(G) であり、従ってGTA コ
ドンに起因するアミノ酸はバリンであることを確認する
ことができた。
【００３５】ところで、1987年6 月10日付け仏国特許出
願第8708090 号ではこの273 位に対応するヌクレオチド
を解読した処、チミン(T) であり、そのTTA コドンに起
因するアミノ酸がロイシンであるとしている。
【００３６】本発明の別のヌクレオチド配列は、次の連
鎖を有する配列（III ）から形成されるプローブとハイ
ブリダイズする能力を有することを特徴とする。
【００３７】
【化３】
【００３８】
【化４】
【００３９】
【化５】
【００４０】
【化６】
【００４１】
【化７】
【００４２】特に、ヤガ科の鱗翅類の幼虫、好ましくは
S.littoralisに対して特異的に毒性のポリペプチドをコ
ードする本発明のヌクレオチド配列は、上記連鎖（III
）を含むか又はこの連鎖により構成される。
【００４３】本発明のヌクレオチド配列に含まれる連鎖
（III ）は2711個のヌクレオチドを含む。このフラグメ
ントは特に、S.littoralisに対して活性なδ- エンドト
キシンの遺伝子の潜在的なプロモーターを含む。
【００４４】修飾配列によりコードされるポリペプチド
の、S.littoralisに対する毒性が著しく変化しない限
り、上記連鎖（Ｉ）又は（III ）に比較して修飾された
ヌクレオチド配列も当然本発明の範囲に含まれる。
【００４５】これらの修飾は例えば欠失、置換、組換か
ら構成され得る。
【００４６】即ちヌクレオチド配列（Ｉ）及び（III ）
は、配列（Ｉ）のアデニン(A) と配列（III ）のシトシ
ン(C) とに対応する可変ヌクレオチドを611 位に含む。
これらのヌクレオチドは、配列夫々II及びIVのアミノ酸
であるグルタミン酸(GLU) 及びアラニン(ALA) を夫々コ
ードする夫々のコドンGAA 及びGCA の組成に含まれる。
【００４７】更に、連鎖（Ｉ）又は（III ）ヌクレオチ
ド配列とハイブリダイズ可能であり、対応するRNA の逆
転写酵素又は化学的合成により得られるような全ヌクレ
オチド配列も本発明の定義の範囲に含まれる。
【００４８】式（III ）ヌクレオチド配列は、2470個の
ヌクレオチドの解読枠の起点を表す241 位に配置された
ATG 開始コドンから始まる。
【００４９】本発明は更に、以下のアミノ酸配列（IV）
を含むポリペプチドをコードすることを特徴とするヌク
レオチド配列にも係る。
【００５０】
【化８】
【００５１】
【化９】
【００５２】
【化１０】
【００５３】
【化１１】
【００５４】
【化１２】
【００５５】本発明は更に、より特定的には上記のよう
な少なくとも1 つのヌクレオチド配列、特に約3kb の配
列の少なくとも一部を含む発現及びクローニング用組換
体ベクターにも係る。
【００５６】特定の組換体ベクターは、例えば本発明の
ヌクレオチド配列のHindIII -PstＩフラグメントをベク
ターpUC9に挿入して成るプラスミドである。ベクターの
第１の好適例は、aizawai 7-29 株に由来するDNA のみ
から構成される本発明のDNAフラグメントHind III -Pst
Ｉを含むプラスミドpHT71 である（構築については後
述する）。
【００５７】別の組換体ベクターは、第４図に示すよう
に構築されるプラスミドpHT671により構成される。この
プラスミドは、entomocidus 6-01 株に由来する1.1kb
のHindIII - HindIIのDNA フラグメントをaizawai 7-2
9 株に由来する1.9kb のHincII-PstＩフラグメントと融
合することにより得られるHindIII - Pst Ｉキメラフラ
グメントを含む。
【００５８】上記ヌクレオチド配列の１つ、又は上記発
現及びクローニング用組換体ベクター、好ましくはプラ
スミドpHT671もしくはプラスミドpHT71 を含む修飾細菌
株も本発明の範囲に含まれる。
【００５９】本発明は更に、綿花又は上記に列挙したよ
うな他の栽培物の葉を侵食する鱗翅類の幼虫、好ましく
はS.littoralisに対して毒性のポリペプチドに係り、該
ポリペプチドはS.littoralisに対して幼虫殺虫活性を有
するポリペプチドに対する抗体との間で免疫複合体を形
成することが可能であることを特徴とする。
【００６０】本発明はより特定的には、幼虫殺虫活性を
有するこのポリペプチドのNH2 末端部分に係る。
【００６１】活性なNH2 末端部分の端部は上記アミノ酸
配列（II）に合致する。
【００６２】本発明の好適なポリペプチドは、この配列
（II）に合致し且つ上記アミノ酸配列（IV）に合致する
ポリペプチドである。配列（IV）に合致するこのポリペ
プチドは、823 個のアミノ酸を含む。分子量の計算値は
92906Da である。
【００６３】このδ- エンドトキシンの配列を、鱗翅類
に対して活性であり且つ先に単離及び配列決定されてい
る遺伝子を有する他のB.thuringiensis 株に由来するδ
- エンドトキシン、即ちkurstaki HD1(19)、kurstaki H
D73(20) 、berliner 1715((21)及び(22)) 、Sotto (23)
並びにaizawai IPL7 (24) 株のδ- エンドトキシンの
アミノ酸配列に比較した。
【００６４】これらの比較の結果、分子の第２番目の4
分の1 （281 〜620 位のアミノ酸）は全く変異し、タン
パク質のNH2 末端（1 〜280 位のアミノ酸）及びCOOH末
端領域（621 〜1175位のアミノ酸）は高度に維持され、
数個のアミノ酸しか変異しないことが判明した。一方、
上記配列（IV）に対応するδ- エンドトキシンは、NH2
末端部分（１〜280 位のアミノ酸）及び分子の第２番目
の４分の１（281 〜620 位のアミノ酸）の双方において
他のδ- エンドトキシンと著しい相異を示す。これらの
比較の結果から更に、タンパク質の毒性フラクションに
対応する分子のNH2 末端部分（１〜620 位のアミノ酸）
は他のδ- エンドトキシンとの相同度が46％に過ぎない
ことが判明した。最大の相異は、分子の毒性部分の第２
番目の２分の１（281 〜620 位のアミノ酸）に位置し、
同一のアミノ酸は36％に過ぎず、一方、NH2 末端部分
（１〜280 位のアミノ酸）は他のδ- エンドトキシンと
同一のアミノ酸を58％含む。鱗翅類に対して活性なδ-
エンドトキシンのうちの分子の毒性フラクションのNH2
末端部分に、このような大きな相異は従来観察されなか
った。
【００６５】本発明によると、ヤガ科の鱗翅類の幼虫、
好ましくはS.littoralisに対して特異的毒性を有するポ
リペプチドの少なくとも活性部分をコードする、本発明
の範囲に含まれるヌクレオチド配列を得るために、S.li
ttoralisに対して活性なB.thuringiensis 株のヌクレオ
チド配列と、B.thuringiensis のδ- エンドトキシンの
遺伝子の制限フラグメントの5'部分（即ち鱗翅類の幼虫
に活性なポリペプチドのNH2 末端部分をコードする部
分）及びポリペプチドのCOOH部分をコードするこのフラ
グメントの3'部分に由来するプローブとして使用される
少なくとも2 つのヌクレオチド配列の間で分子ハイブリ
ダイゼーションを実施する段階と、ハイブリダイズした
フラグメントを単離する段階と、該フラグメントをベク
ターにクローニングし、その後、精製する段階とを使用
する。
【００６６】有利なことに、使用されるハイブリダイゼ
ーションプローブは、P.brassicaeに対して活性であり且
つS.littoralisに対して不活性な130kDaのタンパク質を
コードするaizawai 7-29 株に由来するδ- エンドトキ
シンの遺伝子を組換体プラスミドpHTA2 にクローニング
することにより得られる。
【００６７】本発明の方法の上記実施態様において、ク
ローニング段階でベクターに再結合されるフラグメント
は、単一のB.thuringiensis 株、好ましくはaizawai 7
-29に由来する制限フラグメントHindIII-Pst Ｉから作
製される。特に、このフラグメントは鱗翅類、特にS.li
ttoralisの幼虫に対して活性なB.thuringiensis 株に由
来するヌクレオチド配列を含む形質転換クローンから、
berliner 1715 株の染色体結晶の遺伝子の内側部分に対
応するプラスミドpBT15-88の2kb のPvu IIフラグメント
により構成されるプローブを用いて単離されるような組
換体プラスミドpHTA6 により優先的に担持される。
【００６８】本発明の別の実施態様によると、クローニ
ング段階でベクターに再結合されるフラグメントは、少
なくとも２種の異なるB.thuringiensis 株のヌクレオチ
ド配列を含み、同一の制限地図を有しており、それ自体
S.littoralisに対して優先的に活性なポリペプチドをコ
ードすることが可能なヌクレオチド配列の全部又は一部
を含む組換体ベクターに由来する複数のヌクレオチド配
列から作製される。
【００６９】この場合、クローニング段階で使用される
組換フラグメントは、有利にはentomocidus 6-01 株に
由来する約1.1kb のHindIII-HincII制限フラグメント
と、aizawai 7-29 株の約1.9kb のHincII-PstＩフラグ
メントとから作製される約3kbのフラグメントである。
該組換フラグメントはδ- エンドトキシンの截頭遺伝子
に対応する。
【００７０】制限フラグメントHindIII-HincII及びHinc
II-PstＩは特に、上記Pvu IIフラグメントにより構成さ
れるプローブを用いて単離されるような組換体プラスミ
ド夫々pHTE6 及びpHTA6 により担持される。
【００７１】上記ヌクレオチド配列により修飾した細菌
株の、鱗翅類の幼虫に対する毒性を検討した処、特にS.
littoralisの幼虫に対する高い毒性活性を立証すること
ができた。
【００７２】この活性を比：
【００７３】
【数１】
【００７４】（式中、LC50は72時間以内に幼虫の50％を
死滅させる致死濃度を表す）に対応する特異性指数とし
て鑑定した。
【００７５】このような指数を使用することにより、ポ
リペプチドの発現率を考慮する必要なしに細菌株の活性
を算定することができる。
【００７６】以下の実施例中に報告するような結果が得
られ、この結果からLD50を計算した処、本発明に従って
修飾された細菌株はS.littoralisに対してaizawai 7-2
9 又はberliner 1715 株の天然の結晶タンパク質よりも
特異的な毒性活性を有する。
【００７７】従って本発明は、これらの修飾株、上記ヌ
クレオチド配列を含む組換体ベクター、特にプラスミド
pHT671及びプラスミドpHT71 、並びにこれらの配列自体
の、好ましくはS.littoralisに対して毒性の幼虫殺虫性
組成物の製造のための適用に係る。
【００７８】従って本発明の幼虫殺虫組成物は、上記に
定義したようなポリペプチド、又は上記ヌクレオチド配
列により発現されるようなポリペプチドを有効量含むこ
とを特徴とする。
【００７９】これらのポリペプチドを製造するために
は、本発明のヌクレオチド配列に対応するδ- エンドト
キシンの截頭遺伝子を使用すると有利である。
【００８０】これらの遺伝子は上記組換体ベクターの発
現を可能にする微生物中で毒性ポリペプチドを過剰に産
生させるために使用され得る。適当な微生物株は大腸菌
又は枯草菌を含む。
【００８１】これらの截頭遺伝子は、従来技術に従って
例えば形質転換、接合又はトランスダクションにより、
B.thuringiensis株又はB.cereusのような同族種に再導
入され得る。これらの技術により、B.thuringiensis の
δ- エンドトキシン遺伝子のプロモーターの天然領域を
予め修飾する必要なく、毒性ポリペプチドを大量に製造
することができる。
【００８２】この形質転換は、(11)に従って枯草菌のプ
ロトプラスト又は(12)に記載されているようにB.thurin
giensis の植物細胞の形質転換から誘導される方法を使
用することにより実施され得る。
【００８３】接合型のシステムにより組換体プラスミド
を導入するには、(13)及び(14)に従って操作することに
より、宿主株としてB.thuringiensis 及び供与型の株と
してStreptococcus faecalisを使用することができる。
【００８４】変形例として、環境中に生息するか又は植
物と共生し且つこれらの配列を含む組換体ベクターを発
現することが可能な微生物中にヌクレオチド配列を導入
する。この場合、(17)に記載されている方法に従って操
作することにより、トランスポゾンTn5 及び毒素の遺伝
子を含むプラスミドベクターを介してPseudomonas のよ
うな微生物中に導入してもよいし、あるいは(18)に記載
の方法に従ってプラスミドRP4 から誘導される自殺ベク
ター及びグラム陰性細菌中で機能的な可動化プラスミド
（例えばpRK2013 ）を介してAzospirillum又はRhizobiu
m のような微生物中に導入してもよい。
【００８５】截頭遺伝子はBacilli 株に単独で存在し、
あるいは変形例においては種々のδ- エンドトキシン遺
伝子と共に存在し、従って、所与の種のヤガに対して特
異的に毒性であるか、又はヤガ及び他のδ- エンドトキ
シンに感受性の昆虫に同時に毒性であるこれらの株によ
り合成された結晶を得ることができる。このように本発
明のヌクレオチド配列及び異なる毒性特異性を有する他
のδ- エンドトキシンの遺伝子とin vitro又はin vivo
で組換を行うことにより、昆虫に対して広い活性スペク
トルを有する新規ハイブリッド毒性タンパク質をコード
する新規遺伝子を構築することができる。これらの新規
遺伝子及びこれらの新規タンパク質も本発明の範囲に含
まれる。
【００８６】これらの適用において、これらの昆虫によ
り生じる損害を減少させるために、本発明のヌクレオチ
ド配列はS.littoralisに感受性の植物に伝達され、該植
物中で発現され得る。
【００８７】保護すべき植物としては綿花、クローバ
ー、トマト及びムラサキウマゴヤシを挙げることができ
る。
【００８８】綿花の木に截頭遺伝子を伝達するには、(1
5)に記載されているようにAgrobacterium のような株を
使用して形質転換を行うことができる。
【００８９】本発明は更に、上記ヌクレオチド配列を含
む植物細胞、植物及び種子に係る。
【００９０】本発明の植物細胞は、本質的には非生物学
的な方法による形質転換後にS.littoralisに対して毒性
のポリペプチドを発現することが可能な上記のようなヌ
クレオチド配列を安定的に保有するゲノムを有する細胞
である。本発明はこれらの細胞の分裂により得られる植
物細胞にも係る。
【００９１】本発明の植物は、本質的には非生物学的な
方法により形質転換された特にS.littoralisを補食動物
とする植物であり、該植物のゲノムはS.littoralisに対
して毒性のポリペプチドを発現することが可能な上記の
ようなヌクレオチド配列を安定的に保有する。該植物
は、生殖、増殖又は交雑により得られた植物も含む。
【００９２】他の態様によると、本発明は本来の遺伝子
型及び表現型以外に、S.littoralisに対して優先的に毒
性のポリペプチドを発現する特性を有する、特にS.litt
oralisを補食動物とする植物に係り、該特性は、該ポリ
ペプチドを発現することが可能なヌクレオチド配列を遺
伝子操作によりゲノムに挿入することにより得られる。
【００９３】本発明は更に、上記植物を与えることが可
能な種子又はこのような植物から得られる種子に係り、
該種子は遺伝子操作により上記ヌクレオチド配列をゲノ
ム中に取り込んだものであることを特徴とする。
【００９４】
【実施例】本発明の他の特徴及び利点は実施例に関する
以下の記載から明らかになろう。
【００９５】尚、第１図はプラスミドpHTA6 及びpHTE6
の制限地図を示し、第２図はプラスミドpHTA2 にクロー
ニングされたaizawai 7.29 株の結晶タンパク質の遺伝
子の制限地図であり、プローブとして使用されるDNA フ
ラグメントを規定し、第３図は、pHTA6 にクローニング
された6.6kb のフラグメント、及びこのフラグメントと
第２図のプローブとの間に実施されるハイブリダイゼー
ションの結果を示し、第４図はプラスミドpHT671の制限
地図、並びに第５図は免疫拡散試験の写真である。
【００９６】本発明を実施するために行ったハイブリダ
イゼーション実験は、32Ｐで標識したDNA プローブの存
在下で５×SSC 、30％のホルムアミド及び１×Denhardt
(7)を含有する溶液中で42℃で24時間実施した。室温で
乾燥する以前に、30％ホルムアミド中の５×SSC 、５×
SSC 、２×SSC 、１×SSC 及び 0.5×SCC の溶液を順次
使用することにより、フィルターを42℃で20分間洗っ
た。
【００９７】実施例Ｉ - 殺虫性毒素のキメラ遺伝子を
含む約3kb のDNA 配列の構築 この構築は、 1/ B.thuringiensisの遺伝子バンクを作製する段階と、 2/ 結晶タンパク質の遺伝子と幼虫殺虫活性に関与する
ヌクレオチド配列とを含む形質転換クローンを選択及び
特徴付けする段階と、 3/ これらの配列をクローニングベクター中にin vitro
で組換てプラスミドpHT671を構築する段階とを含む。
【００９８】これらの各段階は次のように実施される。
【００９９】1/ B.thuringiensisの遺伝子バンクの作製 (1) に記載の方法を使用することによりBacillus thuri
ngiensisのaizawai 7-29 株及びentomocidus 6-01 株
の全DNA を精製し、精製した各DNA 50μｇを制限酵素Ps
t Ｉで完全に消化する。
【０１００】Pst Ｉにより消化したDNA を、0.8 ％のア
ガロースゲル上で水平電気泳動により分析し、(2) に記
載されているように電気溶離によりアガロースゲルから
５〜8kb の寸法のDNA フラグメントを回収する。
【０１０１】aizawai 7-29 株の５〜8kb から精製した
DNA フラグメントを(3) に従ってPst Ｉにより消化した
クローニングベクターpUC18 のDNA に連結する。
【０１０２】entomocidus 6-01 鎖の5 〜8kb から精製
したDNA フラグメントを、Pst Ｉにより消化したクロー
ニングベクターpUC9のDNA に連結する。大腸菌JM83の細
胞を(4) に記載されているように連結混合物で形質転換
する。
【０１０３】100 μg/mlのアンピシリンを含むLB培地上
で大腸菌の形質転換クローンを選択する。
【０１０４】2/ 結晶タンパク質の遺伝子を含む形質転
換クローンの単離及び特徴付け A/ 32Ｐで標識した結晶タンパク質の遺伝子の内部フラ
グメントをプローブとして使用することによる、形質転
換大腸菌の細胞のスクリーニング。
【０１０５】berliner 1715 株の染色体上に位置する結
晶タンパク質の遺伝子の内側部分に対応するプラスミド
pBT 15-88 の2kb のフラグメントPvu IIをプローブとし
て使用することにより、(5) に記載の方法に従って、コ
ロニー上のハイブリダイゼーションにより、結晶遺伝子
を担持する組換体プラスミドを含む形質転換クローンを
検出する。
【０１０６】B/ 上記プローブと反応するクローン中に
存在する組換体プラスミドの特徴付け。
【０１０７】aizawai 7-29 及びentomocidus 6-01 株
から構築された遺伝子バンクから夫々単離された2 種の
組換体プラスミドpHTA6 及びpHTE6 はこのプローブと相
同性を有する。いずれの場合も約6.6kb のDNA フラグメ
ントをクローニングした。
【０１０８】2 種のプラスミドの制限地図を第１図に示
す。制限部位を比較すると、クローニングした２つのDN
A フラグメントは同一であると思われる。
【０１０９】δ- エンドトキシンの遺伝子に対応する配
列の境界を定めるために、先に特徴付けされた結晶の遺
伝子に由来し且つ組換体プラスミドpHTA2 にクローニン
グした32Ｐで標識した種々のDNA フラグメントをプロー
ブとして使用する。同様にaizawai 7-29 株に由来する
この結晶遺伝子は、S.littoralisでなくP.brassicaeに
対して活性な130kb のタンパク質をコードする。この型
の遺伝子は、berliner1715株に由来するδ- エンドトキ
シンの遺伝子と同一の制限地図を有する。第２図には、
プラスミドpHTA2 にクローニングしたaizawai 7.29 株
の結晶タンパク質のこの遺伝子の制限地図を示した。地
図の上部に示した濃い線はハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用したフラグメントに対応する。
【０１１０】プラスミドpHTA6 及びpHTE6 を異なる制限
エンドヌクレアーゼにより加水分解し、0.8 ％のアガロ
ースゲル上で水平電気泳動により分析し、種々のプロー
ブとハイブリダイズする。
【０１１１】(6) に記載のサザン法によりDNA をニトロ
セルロースフィルターに移す。ハイブリダイゼーション
は、32Ｐで標識したDNA プローブの存在下で５×SSC 、
30％ホルムアミド及び(7) に記載の１×Denhardt混合物
を含む溶液中で42℃で24時間実施する。次に、室温で乾
燥する前に50％ホルムアミド中の５×SSC 、５×SSC、
２×SSC 、１×SSC 及び 0.5×SSC の溶液を順次使用す
ることにより、フィルターを42℃で20分間洗浄する。
【０１１２】これらのハイブリダイゼーション実験の結
果を第３図に要約する。クローニングした6.6kb のDNA
フラグメントの各端部がプローブと相同性を有すること
は明白である。プローブ３と反応する1.5kb のPst Ｉ-K
pnＩフラグメントは、aizawai 7-29 株及びentomocidu
s 6-01 株中に同時に存在する結晶タンパク質の遺伝子
の3'末端に対応する。第３図に示すように、pHTA2 のδ
- エンドトキシンの遺伝子の5'末端に対応するプローブ
1 及び2 は、プラスミドpHTA6 に含まれる1.1kb のHind
III-HincIIフラグメントとハイブリダイズする。pHTA2
のδ- エンドトキシンの遺伝子の3'末端を覆うプローブ
3 は、プラスミドpHTA6 に含まれる0.4kb のHindIII-Ps
t Ｉフラグメントとハイブリダイズする。プローブ２と
の間には弱いハイブリダイゼーション信号しか得られな
いが、他の2 つのプローブは容易に検出可能な信号を与
えることに留意すべきである。
【０１１３】これらの結果に基づいて本発明者らは、3k
b のDNA フラグメントHindIII-PstＩが中心のHindIII
部位の近傍で開始するδ- エンドトキシンの遺伝子の大
部分に対応することを立証した。ハイブリダイゼーショ
ン実験の結果から明らかなように、δ- エンドトキシン
の遺伝子は従来技術で特徴付けられたものと実質的な差
異を有する。これらの結果に基づき、3kb のフラグメン
トHindIII-Pst ＩフラグメントをベクターpUC9にクロー
ニングすることに決定した。
【０１１４】3/ 再構築した殺虫性毒素のキメラ遺伝子
を含むプラスミドpHT671の構築 プラスミドpHTE6 に由来する1.1kb のDNA フラグメント
HindIII-HincII及びプラスミドpHTA6 に由来する1.9kb
のDNA フラグメントHincII-PstＩをアガロースゲル上で
精製する。
【０１１５】精製した2 つのDNA フラグメントと、Hind
III 及びPst Ｉで消化したpUC9のDNA とを等量ずつ混合
及び連結する。連結混合物を使用して大腸菌JM83のコン
ピテント細胞を形質転換し、次に大腸菌の形質転換細胞
を、アンピシリンを含むLB培地上で選択する。試験した
該当する組換体クローンの1 つは、pHT671と命名される
プラスミドを含んでおり、このプラスミドの制限地図を
決定し、第４図に示す。このプラスミド(pHT671)は、ベ
クターpUC9に挿入した3kb のDNA フラグメントを含む。
このDNA 配列はプラスミドpHTA6 及びpHTE6 に含まれる
3kb のHindIII-Pst Ｉフラグメントと同一の制限地図を
有するが、aizawai 7-29 株及びentomocidus 6-01 株
に由来するDNA 配列からin vitro組換により構築された
再構成DNA 分子に対応する。
【０１１６】実施例II：プロモーター領域と、ヤガに対
して活性なδ- エンドトキシンのNH 2末端部分をコード
する領域とのヌクレオチド配列の検討 M13 系を使用することにより(8) に記載の方法に従っ
て、pHT671のHindIII-HincIIフラグメントを配列決定し
た。DNA の配列決定に使用される部分的に重複するクロ
ーン化DNA フラグメントを得るために、DALE他(9) によ
り開発された、M13 の欠失によるサブクローニング法を
使用した。
【０１１７】約1kb の長さを有するHindIII-HincIIフラ
グメントの940 個のヌクレオチドの配列は上記連鎖Ｉに
対応する。
【０１１８】この配列を分析した処、最大の解読枠は24
1 位から始まり、リボソームとの潜在的結合部位GGAGG
はこのATG コドンの6 塩基対上流（230 〜235 位）に位
置することが判明した。137 〜177 位のヌクレオチド領
域（ATG コドンの上流の−103 〜−63位）は、WONG他(1
983)により配列決定され且つ(16)に記載されているkurs
taki HD1 Dipel(BTK) 株（著者は、夫々B.thuringiensi
s 及び大腸菌で機能的な3 つのプロモーターBtＩ、BtII
及びEcを含むことを示した）の結晶遺伝子の上流に存在
する領域に著しく相同である。BTK 及びpHT671の遺伝子
の最初から750個のヌクレオチドから推定されるアミノ
酸配列を比較すると、これらのポリペプチドはプロトキ
シンに由来する活性部分のN 末端部分のレベルに顕著な
変異を示すことが判明した（厳密な相同度は66％に過ぎ
ない）。鱗翅類に対して活性な株から単離されたδ- エ
ンドトキシンの遺伝子がこの領域で実質的な変異を示す
ポリペプチドをコードするのは、これが最初であること
に留意すべきである。実際に、このN 末端領域は従来配
列決定されている鱗翅類に対して活性な全結晶遺伝子の
うちで高度に維持されたものであると思われる（厳密な
相同度は97％を越える）。更に、本発明者らは、pHT671
及び鱗翅類型の他の遺伝子のヌクレオチド配列を考慮す
る場合に変異度は同程度であることを立証した。
【０１１９】実施例III ：幼虫殺虫性毒素の遺伝子を含
む約2.7kb のDNA 配列の構築 この構築を行うために、実施例Ｉに記載したようなプラ
スミドpHTA6 の作製段階までB.thuringiensis のaizawa
i 7.29株のDNA を使用した。
【０１２０】プラスミドpHTA6 から得られた約2.7kb の
HindIII-Pst Ｉフラグメントを次に、プラスミドpHT71
を得るために制限酵素HindIII-Pst Ｉにより予め加水分
解したベクターpUC9にサブクローニングした。
【０１２１】実施例IV：ヤガ科の鱗翅類の幼虫に対して
毒性なポリペプチドをコードするプラスミドpHT71 を構
成するヌクレオチド配列の検討 pHT71 にサブクローニングしたpHTA6 の2.7kb のHindII
I-Pst Ｉフラグメントを、ファージM13mp19 及びDale他
(9) により開発された欠失によるサブクローニングシス
テムを使用してSanger他(8) の方法により配列決定し
た。このシステムにより、部分的に重複し且つDNA の配
列決定に使用され得るDNA フラグメント系列を含むファ
ージM13 を得ることができる。
【０１２２】上記連鎖（III ）に対応する2.7kb のこの
フラグメントのヌクレオチド配列を2 本のDNA 鎖で決定
した。ただし最後の212 個のヌクレオチド(2500 〜2711
位)については1 本の鎖だけで配列決定した。
【０１２３】このHindIII-Pst Ｉフラグメントのヌクレ
オチド配列は2711個のヌクレオチドの長さを有する。こ
のフラグメントは潜在的プロモーターと、S.littoralis
に対して活性なδ- エンドトキシンの遺伝子の最大部分
とを含む。
【０１２４】実施例Ｖ：S.littoralisに対する大腸菌JM
83(pHT761)及びJM83(pHT71) の組換体クローンの特異的
毒性の検討 LECADET 及びMARTOURET により(10)に記載されているよ
うにP.brassicae 及びS.littoralis種の幼虫の生物試験
を実施することにより、pHT671を含む大腸菌JM83及びpH
T71 を含む大腸菌JM83の組換体クローンの毒性を決定し
た。結果を、2種の昆虫に対するberliner 1715 株及びa
izawai 7-29 株、entomocidus 6.01株、B.cereus 569
株（プラスミドpBT45 、pAM β1 を含む）から精製され
た天然の結晶タンパク質の特異的毒性に比較した。組換
体クローン及びB.thuringiensis 株の特異的毒性を、上
記に定義した「特異性指数」として換算した。
【０１２５】得られた結果を下記第１表に示す。
【０１２６】この表中、大腸菌株の濃度1 は14時間培養
し、20倍に濃縮し、超音波により崩壊させた細菌培養物
に対応し、B.thuringiensis 株の濃度は、調製物１μl
当たりの結晶タンパク質のμg で表す。第５成長段階の
幼虫に調製物５μl を強制的に摂取させるか又は第２成
長段階の幼虫を使用する自由摂取方法により、調製物の
毒性活性を試験した。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】第１表に要約したLC50の値を検討した処、
組換体クローンJM83(pHT671)及びJM83(pHT71) のタンパ
ク質抽出物はS.littoralisに対して優先的に毒性である
ことが判明した。第２に、特異性指数の値を比較した
処、S.littoralisに対する組換体クローンの幼虫殺虫活
性は、aizawai 株の天然結晶のタンパク質の約2.5 倍特
異性であることが判明した。一方、JM83(pHT671)及びJM
83(pHT71) の組換体クローンはヤガ科の別の昆虫Mamest
ra brassicaeに対して非常に活性である（例えばクロー
ンJM83(pHT671)のLC50値は、第２成長段階の幼虫を使用
すると0.02である）。
【０１２９】これらの２つの結果から明らかなように、
プラスミドpHT671及びpHT71 で構築及びクローニングし
た幼虫殺虫毒素の遺伝子はS.littoralisに対して特異的
に活性なタンパク質をコードする。
【０１３０】他の型のδ- エンドトキシンをコードする
遺伝子を担持するプラスミド(pHTA2及びpHTA4)を含む組
換体クローンから得られた他の調製物はS.littoralisに
対して活性ではない。プラスミドpHTA2 はP.brassicae
に対して特異的に活性なδ-エンドトキシンをコード
し、プラスミドpHTA4 はまだ標的昆虫が同定されていな
いδ- エンドトキシンをコードすることが理解されよ
う。また、同様にδ- エンドトキシン遺伝子(aizawai 7
-29 株のプラスミド起源の遺伝子）を担持するaizawai
7-29株のプラスミドの１つであるプラスミドpBT45 を受
容したBacillus cereus 株により産生される結晶含有物
も、P.brassicae に対して特異的に活性であることが理
解されよう。
【０１３１】粗細菌抽出物の代わりに、大腸菌の種々の
組換体クローンから調製された可溶性タンパク抽出物を
使用した場合も同様の結果が得られる。
【０１３２】上記表に示したLC50の値とS.littoralisの
幼虫L5（幼虫第５段階）当たり41mgの平均個体体重とに
基づいて換算すると、aizawai 7-29 株の天然結晶のLD
50の値は 2.4μg/g 幼虫であった。
【０１３３】これらと同一の基準及び全細菌質量を特異
的タンパク質の量に結び付けることが可能な等価係数
（大腸菌JM83(pHT671)の全タンパク質の約２％）に基づ
いて、プラスミドpHT671にクローニングした本発明の遺
伝子を大腸菌JM83で発現させることにより生成される毒
素に対応するLD50を決定及び換算した処、約 5.5〜６μ
g/g 幼虫の値であった。
【０１３４】これらと同一の基準に基づき、大腸菌JM83
(pHT671)の粉砕培養物から調製した可溶性タンパク抽出
物のLC50を決定後、これら抽出物中に存在する毒素に対
応するLD50の値は4.15μg/g 幼虫であった。
【０１３５】前記２者の場合、特に大腸菌の粉砕物の場
合、LD50の計算値は天然結晶にほぼ等しく、これは精製
した毒素ではないのであるから天然以上のLD50である。
しかしながら、これらのデータは、pHT 671 により発現
される遺伝子がS.littoralisに対する特異性を有するδ
- エンドトキシンを決定することを明らかに示してい
る。実際に、異なる特異性のδ- エンドトキシン遺伝子
を担持する大腸菌JM83(pHTA2) 抽出物で同一の型の計算
を行うと、S.littoralisに対するLD50値は可溶性抽出物
のLD50の30〜50倍(135〜350 μg/g 幼虫) である。
【０１３６】以上のデータに鑑み、当業者は本発明のタ
ンパク質を含む活性な幼虫殺虫組成物を容易に製造する
ことができよう。
【０１３７】M.brassicae 、S.frugiperda及びS.littor
alisの幼虫第２段階の幼虫を使用することにより別の毒
性実験を実施した。得られた結果を第１表に規定するよ
うにLC50として換算し、第２表に示す。
【０１３８】
【表２】
【０１３９】第２表から明らかなように、組換体クロー
ンJM83(pHT 671) の粗細菌抽出物はM.brassicae 及びS.
littoralisに対して毒性(LC50 の値は夫々0.02及び0.0
3) であり、S.frugiperdaに対して弱毒性(LC50 ＝0.5)
である。
【０１４０】組換体クローン大腸菌JM83(pHTA2) の抽出
物は、S.frugiperda及びS.littoralisに対して弱活性で
あり、M.brassicae に対しては完全に非毒性である。組
換体クローンJM83(pHTA4) の抽出物はM.brassicae 及び
S.littoralisに対して毒性でなく、S.frugiperdaに対し
て弱毒性である。
【０１４１】これらの結果から、pHT71 及びpHT671から
得られるタンパク質はＳ．ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓに対し
て特異的に強い毒性を示すことが確認され、この類の結
晶タンパク質は同様にＭ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ に対し
ても著しく活性であることが分かる。
【０１４２】実施例VI：プラスミドpHT671及びpHT71 を
大腸菌に導入することにより形成されるクローンにより
発現されるポリペプチドの特異性の検討 この検討は免疫拡散試験により実施した。結果を第５図
（第5A図及び第5B図から成る）に示す。
【０１４３】免疫拡散実験は次のプロトコールに従って
実施した。
【０１４４】プラスミドpHT671、pHTA4 、pHTA2 又はpH
T71 、pUC18 を含む大腸菌クローンのタンパク質の可溶
性抽出物を夫々ウェル２、３、４、５、６に配置した。
陽性対照として使用するために、aizawai 7-29 の可溶
化精製結晶のサンプルをウェル1 に配置した。
【０１４５】第5A図に示す試験では、可溶化結晶のタン
パク質に対するウサギ抗体を含むaizawai 7-29 の全δ
- エンドトキシンに対する抗血清を使用し、中心ウェル
に配置した。
【０１４６】プラスミドベクターのみを含む大腸菌抽出
物（ウェル番号6)の場合を除く全ての場合に免疫沈降線
が観察された。
【０１４７】ウェル4 及び5 から得られた免疫沈降線は
相互に交差することが認められ、従って、プラスミドpH
TA2 及びpHT71 によりコードされた生成物が夫々異なる
抗原決定基を有することが明らかである。
【０１４８】第5B図に示す試験では、使用した抗血清は
berliner1715の結晶のタンパク質に対するウサギのポリ
クローナル抗体を含んでいた。
【０１４９】大腸菌JM83(pHTA4)(ウェル番号3)及びJM83
(pHTA2)(ウェル番号4)の抽出物で免疫沈降線が観察され
た。一方、クローン大腸菌JM83(pHT71)(ウェル番号5)、
JM83(pHT671)（ウェル番号2)又はJM83(pUC9)（ウェル番
号6)では免疫沈降は観察されなかった。
【０１５０】以上の結果から、pHTA4 及びpHTA2 で単離
された結晶の遺伝子は、S.littoralisに対して特異的に
活性ではない株であるberliner 1715 の結晶のタンパク
質と共通の抗原決定基を有するポリペプチドを発現する
と推論することができる。
【０１５１】これに対して、プラスミドpHT671及びpHT7
1 を含む大腸菌の粗抽出物は、berliner 1715 株の結晶
のタンパク質と免疫原性面上で結合されないaizawai
7.29株の結晶のタンパク質と共通の抗原決定基を有する
ポリペプチドを含む。
【０１５２】これらの結果は、プラスミドpHT71 及びpH
T671で単離された遺伝子の特異性に関して先に示した結
果を実証するものである。
【０１５３】抗原- 抗体沈降試験により、種々の組換体
クローンにおけるδ- エンドトキシン遺伝子の発現レベ
ルを決定することができた。
【０１５４】得られた結果によると、結晶タンパク質は
大腸菌JM83(pHTA2) の全細胞タンパク質の7 〜10％、大
腸菌JM83(pHT671)では２〜３％、大腸菌JM83(pHTA4) 及
び大腸菌JM83(pHT71) では0.5 〜1 ％であることが判明
した。
【０１５５】実施例中に引用した参考文献は以下の通り
である。
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on in Escherichia coli . Gene 53: 113-119.
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpHTA6 及びpHTE6 の制限地図を示
す。
【図２】プラスミドpHTA2 にクローニングされたaizawa
i 7.29 株の結晶タンパク質の遺伝子の制限地図を示
す。
【図３】pHTA6 にクローニングされた6.6kb のフラグメ
ント、及びこのフラグメントと図２のプローブとの間に
実施されるハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図４】プラスミドpHT671の制限地図を示す。
【図５】免疫拡散試験の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バンサン・サンシス フランス国、78390・ボワ−ダルシ、ア ブニユ・トウールーズ−ロートレツク、 15 (72)発明者 デイデイエ・ルルクリユ フランス国、75116・パリ、リユ・ロー リストン、16・ビス (72)発明者 ギスレーヌ・ムヌウ フランス国、75015・パリ、リユ・ロゼ ンバルド、22 (72)発明者 マルグリツト−マリー・ルカデ フランス国、75015・パリ、リユ・ニコ ラ−シヤルレ、10 (72)発明者 ダニエル・マルトウレ フランス国、78210・サン−シル−レコ ル、スクアール・ドウ・ロテル−ドウ− ビユ、６ (72)発明者 レイモン・ドウドンデル フランス国、92290・シヤトネー−マラ ブリ、アレ・デ・ペピニエール・３ (56)参考文献 欧州公開224331（ＥＰ，Ａ１) Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｈｏｃｈ ｅｔ ａ ｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｐｌ ｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄ ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」（Ａｍ ｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）（1984) ｐ．217−224

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 S.littoralisに対して優先的な活性を有
    する幼虫殺虫組成物であって、δ−エンドトキシンのN
    末端領域をコードする下記ヌクレオチド配列（III）ま
    たはS.littoralisまたはM.brassicaeに対して選択的に
    毒性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列であって下記ヌクレオチド配列（III）にストリンジ
    ェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
    によって発現されるポリペプチドの有効量を含むことを
    特徴とする上記組成物。 【化１】
  2. 【請求項２】 S.littoralisに対して優先的な活性を有
    する幼虫殺虫組成物であって、下記アミノ酸配列（IV）
    を含むポリペプチドの有効量を含むことを特徴とする組
    成物。 【化２】
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