JPH08510637A

JPH08510637A - バチルス・チュリンゲンシスの新菌株及びその殺虫性タンパク質

Info

Publication number: JPH08510637A
Application number: JP6522657A
Authority: JP
Inventors: ランベルト，バルト; ヤンセンス，ステファン; ファン・アウデンホーフェ，カトリエン; ペフェロエン，マルニクス; ファン・リー，イェルーン; ファン・アールセン，ルール
Original assignee: Plant Genetic Systems NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 1996-11-12

Abstract

(57)【要約】受託番号ＬＭＧＰ−１２５９２号、ＬＭＧＰ−１２５９３号、ＬＭＧＰ−１２５９４号及びＬＭＧＰ−１３２９３号の下に、ＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託されている４種類の新規なバチルス・チュリンゲンシス（Bacill us thuringiensis）の菌株は、鱗翅類に、より詳しくはスポドプテラ属（Spodoptera）の種やアグロチス属（Ag rotis）の種のようなヤガ科、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）のようなメイガ科、フトリメーア・オペルキュレラ（Phthorimaea operculella）のようなキバガ科、及びプルテラ・キシロステラ（Plutel la xylostella）のようなスガ科に対して有毒であり、新規遺伝子によってエンコードされている新規結晶タンパク質を胞子形成の際に生産する。該結晶タンパク質は、トリプシン消化生成物としてトキシンを生じ得るプロトキシンを含有する。該菌株のいずれか１株から得られ、そのそれぞれのトキシンをエンコードしているＤＮＡ配列でゲノムが形質転換された植物は、鱗翅類に耐性である。各菌株自体、又はその結晶、結晶タンパク質、プロトキシンもしくはトキシンを、鱗翅類害虫を駆除するための殺虫組成物に活性成分として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】バチルス・チュリンゲンシスの新菌株及びその殺虫性タンパク質本発明は、バチルス・チュリンゲンシスBacillus thuringiensisの新規な４菌株（ＢＴＳ０２６１７Ａ株、ＢＴＳ０２６１８Ａ株、ＢＴＳ０２６５４Ｂ株及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株）に関し、それぞれ、胞子形成の際に結晶（それぞれＢＴＳ０２６１７Ａ結晶、ＢＴＳ０２６１８Ａ結晶、ＢＴＳ０２６５４Ｂ結晶及びＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶）にパッケージされている、結晶タンパク質（それぞれ、ＢＴＳ０２６１７Ａ結晶タンパク質、ＢＴＳ０２６１８Ａ結晶タンパク質、ＢＴＳ０２６５４Ｂ結晶タンパク質及びＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶タンパク質）を生成する菌株に関する。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株は、ブダペスト条約の規定に従って、ベルギー国、B-9000、Gent市、K．Ledeganckstraat３５番地、R.U.GのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms-Collection Laboratorium voor Microbiologi e Belgium（「ＢＣＣＭ−ＬＭＧ」）に寄託されている。本発明はまた、鱗翅類に対して活性であり、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株それ自体、好ましくはＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶、結晶タンパク質、又はそれらの活性要素を活性成分として含む殺虫組成物にも関する。更に本発明は、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株のゲノム中に存在し、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶中に見い出される殺虫性タンパク質「ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン」をエンコードしている遺伝子「ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子」にも関する。ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンは、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶にパッケージされる前に、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株により生成されるタンパク質である。また更に本発明は、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンから（例えばトリプシン消化によって）得ることができるトキシン「ＢＴＳ０２６１８Ａトキシン」にも関する。ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンは、それぞれＢＴＳ０２６１７Ａ株、ＢＴＳ０２６１８Ａ株、ＢＴＳ０２６５４Ｂ株及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株が生成するＢＴＳ０２６１７Ａ結晶、ＢＴＳ０２６１８Ａ結晶、ＢＴＳ０２６５４Ｂ結晶及びＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶から分離できる殺虫活性を有するタンパク質である。このトキシン及びそのプロトキシンは、広範囲の鱗翅類の昆虫、とりわけヤガ科（Noctuidae）、特にSpodoptera属やAgrotis属の種に対して高活性を有するが、他の重要な鱗翅類の昆虫、例えばメイガ科（Pyralidae）、とりわけアワノメイガ、すなわちOstrinia nubilalis、Phthorimaea operculellaのようなキバガ科（Gelechiidae）、及びPlutella xylostellaのようなスガ科（Yponomeutidae）に対しても有効である。その上、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質は、Agrotis segetumに対して著しい活性を有する最初のＢｔタンパク質である。ＢＴＳ０２６１８Ａのプロトキシンやトキシン（プロトキシン／トキシン）のこの新しい特性、すなわち、ヤガ科、スガ科、キバガ科及びメイガ科のような経済的に重要な異なる鱗翅類の科に対する活性の結合により、このプロトキシン／トキシンは、例えば噴霧により、又は植物に寄生する細菌もしくは植物中でｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を発現させて、広範囲の害虫をプロトキシン／トキシンに接触させることによって、これらの害虫を駆除するのに理想的に適した化合物にする。ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンは、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンが、鱗翅類に対して殺虫効果を示す最小単位を表すと考えられている。本発明はまた、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質、又は実質的に同じ殺虫活性を有するその変異体をエンコードしているＤＮＡ配列を含む、形質転換されたバチルス・チュリンゲンシス株にも関する。更に本発明は、植物細胞を形質転換するのに用いることができ、そして作用することができるように結合された下記のＤＮＡ断片を含むキメラ遺伝子にも関する：（１）ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫効果を示す部分をエンコードしているｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の一部（「殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分」）、好ましくは、ＢＴＳ０２６１８ＡトキシンのみをエンコードしているｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のトランケートされた部分（「トランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子」）；（２）植物細胞での殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分の転写に適したプロモーター；及び（３）殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を植物細胞内で発現するのに適した３’末端転写形成やボリアデニル化のシグナル。以後、このキメラ遺伝子を一般的に「ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子」と称する。本発明は、（１）殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくはｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子でゲノムを形質転換した植物、例えばトウモロコシ又はワタの細胞（「形質転換植物細胞」）；及び（２）殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくはｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子をゲノムが含み、鱗翅類に耐性である形質転換植物細胞から再生され、又はそのように再生された植物やそれらの種子から生産された植物（「形質転換植物」）にも関する。また更に本発明は、（１）ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は一部でゲノムを形質転換した微生物体、例えばバチルス・チュリンゲンシス又はプソイドモナス属（Pseudomonas ）の種；及び（２）ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は部分で形質転換されたゲノムを含む微生物の胞子にも関する。本発明のもう一つの実施態様は、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質をエンコードしている人為的に作成されたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、及び天然のＢｔタンパク質、より好ましくは天然のＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質よりプロテアーゼ耐性であるタンパク質に関する。よりプロテアーゼ耐性であるタンパク質の具体的な例は、ＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質である。その上、本発明は、ＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列にも関する。本発明の更に他の実施態様は、植物細胞を形質転換するのに用いることができ、（１）ＢＴＳ０２６１８Ａａプロトキシンの殺虫効果を示す部分をエンコードしているＤＮＡ配列、好ましくはＢＴＳ０２６１８ＡａトキシンのみをエンコードしているｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子のトランケートされた部分（「トランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子」）；（２）殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子部分の植物細胞での転写に適したプロモーター；及び（３）殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子部分を植物細胞で発現させるのに適した３’末端転写形成やポリアデニル化のシグナルを含むキメラ遺伝子に関する。以後、このキメラ遺伝子を一般的に「ｂＴＳ０２６１８Ａａキメラ遺伝子」と称する。更に本発明は、（１）殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子部分、好ましくはｂＴＳ０２６１８Ａａキメラ遺伝子でゲノムを形質転換した植物、例えばトウモロコシ又はワタの細胞（「形質転換植物細胞」）；及び（２）殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子部分、好ましくはｂＴＳ０２６１８Ａａキメラ遺伝子をゲノムが含み、鱗翅類に耐性である形質転換植物細胞から再生され、又はそのように再生された植物やそれらの種子から生産された植物（「形質転換植物」）にも関する。また更に本発明は、（１）ＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列の全部又は一部でゲノムを形質転換した微生物体、例えばバチルス・チュリンゲンシス又はプソイドモナス属の種；及び（２）ｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子の全部又は一部で形質転換したゲノムを含む微生物の胞子にも関する。本発明の更に他の実施態様は、鱗翅類に対して活性であり、そしてよりプロテアーゼ耐性であるＢｔタンパク質、より詳しくはＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質、又は実質的に同じ殺虫活性を有するその変異体を含む殺虫組成物に関する。［発明の背景］バチルス・チュリンゲンシス（「Ｂｔ」）は、胞子形成の際に内在性の結晶を生成するグラム陽性菌である。この結晶は、昆虫の幼虫に特異的に有毒であるタンパク質で構成されている。これらの結晶タンパク質及び対応する遺伝子は、それらの構造及び殺虫スペクの主な４分類群は、鱗翅類特異性（ｃｒｙＩ）、鱗翅類及び双翅類特異性（ｃｒｙII）、鞘翅類特異性（ｃｒｙIII）ならびに双翅類特異性（ｃｒｙIV）遺伝子である。Ｂｔ胞子を大規模に生産するのに慣用の液内発酵の手法を用い得ることから、Ｂｔ細菌は、殺虫組成物の入手源として商業的な関心を惹くことになった。殺虫性タンパク質をエンコードしているＢｔ株の遺伝子断片には、以前から同定されていて、植物を昆虫耐性にさせるために植物ゲノム中に組み込まれているものがある。しかしながら、植物でそのようなＢｔ遺伝子断片の発現を得ることは、容易な工程ではない。植物細胞での殺虫性タンパク質の最適な発現を達成するには、Ｂｔ遺伝子断片の各々を特異的な方法で加工して、Ｂｔプロトキシンの、その標的昆虫に対する実質的な毒性を保持する一部を、エンコードしているようにする必要があることが判明している［ヨーロッパ特許出願（「ＥＰＡ」）86 /300,291.1及び88/402,115.5；１９８６年１月２２日付け米国特許出願821,582 ］。［発明の要約］本発明によれば、４種類の新規なＢｔ株、すなわちＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株が提供される。胞子形成の際に菌株が生成するＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ及びＢＴＳ０２６５２Ｅの結晶及び結晶タンパク質、ＢＴＳ０２６１８Ａのプロトキシン及びトキシン、ならびにＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫効果を示す部分はもとより、これらの結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、トキシン、及びプロトキシンの殺虫効果を示す部分の等価物は、それぞれ殺虫活性を保有し、そのため、経済的に重要な様々な穀物、例えばトウモロコシ、ワタ、及びアブラナ類のような多くの野菜の主な害虫である鱗翅類一般に対して、特にヤガ科、例えばAgrotis属の種（Agrotis ipsil onやAgrotis segetumのようなヨトウムシ類）、Mamestra属の種（例えばコナガ、すなわちMamestra brassica）及びSpodoptera属の種（アワヨトウ類、例えばS podoptera exigua、Spodoptera frugiperda、Spodoptera littoralis及びSpodop tera litura）に、メイガ科（例えばアワノメイガ、すなわちOstrinia nubilali s）に、Phthorimaea operculellaのようなキバガ科に、ならびにスガ科（例えば Plutella xylostella）に対する殺虫組成物として製剤することができる。また、本発明によれば、殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくはトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、又は変更されたトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のようなその等価物で、植物細胞のゲノムが形質転換される。この形質転換は、ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子で実施するのが好ましい。得られる形質転換植物細胞は、形質転換植物、形質転換植物の種子、及び形質転換細胞を必須のものとして含む植物細胞の培養物を生産するのに用いることができる。形質転換植物の組織のいくらか又は全部の中の形質転換細胞は、（１）殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分をそれらのゲノム中の安定的な挿入断片として含み、（２）そのＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫効果を示す部分、好ましくはそのＢＴＳ０２６１８Ａトキシンを生成することによって殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を発現し、それによって植物を鱗翅類に耐性にさせる。本発明の形質転換植物細胞は、回収のために、そのような殺虫性Ｂｔタンパク質を生成するのに用いることもできる。更に本発明によれば、殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくはトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又はその等価物を用いて植物細胞のゲノムを形質転換することによって、植物を鱗翅類に耐性にさせる方法が提供される。これに関しては、ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子を用いて植物細胞を形質転換するのが好ましい。また更に本発明によれば、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、そのようなプロトキシンの殺虫効果を示す部分及びＢＴＳ０２６１８Ａトキシン、ならびにＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの機能性部分、ならびにｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、トランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及びキメラであるｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子はもとより、それらの等価物も提供される。また本発明によれば、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン又はその殺虫効果を示す部分、例えばトキシンをエンコードしている、天然もしくは人工のいずれかのＤＮＡ配列も提供される。また本発明によれば、鱗翅類、特にヤガ科、メイガ科、キバガ科及びスガ科に対する殺虫組成物であって、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４ＢもしくはＢＴＳ０２６５２Ｅ株、結晶及び／又は結晶タンパク質、あるいはＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン及び／又は殺虫効果を示すプロトキシン部分、あるいはそれらの等価物を含む殺虫組成物、ならびに該組成物を用いて鱗翅類、特にヤガ科、メイガ科、キバガ科及びスガ科を防除する方法も提供される。また本発明によれば、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の変異体、例えばＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質、又はより改良されたプロテアーゼ耐性Ｂｔタンパク質をエンコードしているＤＮＡを発現するように形質転換された細菌、特に大腸菌やバチルス・チュリンゲンシスも提供される。更に、本発明によれば、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質をエンコードしている人工のＤＮＡ配列はもとより、改良されたプロテアーゼ耐性を有するＢｔタンパク質の新規な形態、より詳しくはＢＴＳ０２６１８Ａａ又は変更されたＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質、及びこれらの新規タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列も提供される。更に提供されるのは、改良されたプロテアーゼ耐性を有するＢＴＳ０２６１８Ａトキシン又はＢｔトキシン、より好ましくはＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンをエンコードしている人工のＤＮＡ配列を発現する植物細胞である。更に提供されるのは、ＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質、又は実質的に同じ殺虫活性を有するその変異体を活性成分として含む殺虫組成物である。更に提供されるのは、改良されたプロテアーゼ耐性を有するＢｔタンパク質、より好ましくはＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質又はその変異体にこれらの昆虫を接触させることによって、鱗翅類の害虫を駆除するための方法である。より特別に提供されるのは、天然のＢｔタンパク質と実質的に同じ殺虫活性を有するが、約６０〜７０kDのトキシンの形態というそれ以上のタンパク質分解の裂開に対して更に耐性であることを特徴とする、新規Ｂｔタンパク質、好ましくは鱗翅類に活性を有するＢｔタンパク質である。そのような新規Ｂｔタンパク質は、内部の不活性化されたプロテアーゼ裂開部位を有するため、これらのタンパク質は、実質的に同じ殺虫活性を保持しつつ、増大された安定性を有する。したがって、これらの新規Ｂｔタンパク質は、プロテアーゼの存在下での長時間のインキュベーションでもそれらの殺虫活性が低下せず、より小さいタンパク質分解性フラグメントに容易に裂開されることがない。［発明の詳細な説明］本発明のＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンは、１９９２年７月２日に受託番号ＬＭＧＰ−１２５９２号の下にＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託されたＢＴＳ０２６１７Ａ株、１９９２年７月２日に受託番号ＬＭＧＰ−１２５９３号の下にＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託されたＢＴＳ０２６１８Ａ株、１９９２年７月２日に受託番号ＬＭＧＰ−１２５９４号の下にＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託されたＢＴＳ０２６５４Ｂ株、又は１９９３年３月１日に受託番号ＬＭＧＰ−１３４９３号の下にＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託されたＢＴＳ０２６５２Ｅ株から慣用の方法で単離できる。例えば、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ結晶は、それらのそれぞれの菌株の胞子を形成させた培養物から単離でき（Mahillon及びDelcour，1984）、０２６１８Ａプロトキシンを単離できる。プロトキシンは、そのプロトキシンに特異的なモノクローナル又はボリクローナル抗体 1988）。ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンは、プロテアーゼ（例えばトリプシン）によるＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの消化によって得ることができる。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は慣用の方法で単離できる。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は、１９８６年１月２２日付け米国特許出願821,582ならびにEPA 86/300,29 1.1号及び88/402,115.5（引用によりここに組み込まれる）に記載の手順を用いて、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株中に確認することができる。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を、上記菌株の一つから全ＤＮＡを制限酵素で消化し；そのように生成されたＤＮＡ断片を５〜１０kbのＤＮＡ断片にサイズ分画し；これらの分画をクローニングベクターに結合し；このクローニングベクターて形質転換した大月易菌を、ｃｒｙＩＧ遺伝子の領域から構成したＤＮＡプローブを用いてふるい分けることによって確認した（Smulevitch et al.，1991；Gleave et al.，1992）。ここで用いられる限りで、用語「ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子」は、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンもしくはトキシン、又は機能的に等価なその変異体をエンコードしているＤＮＡ配列を包含する。実際には、遺伝コードの縮退のため、いくつかのアミノ酸のコドンは、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、他のものと置き換えることができる。更に、いくつかのアミノ酸は、タンパク質の殺虫活性を著しく変化させることなく、他の等価アミノ酸で置換できる。また、分子の、結合及び毒性の原因となる領域とは異なる領域でのアミノ酸組成の変化は、タンパク質の殺虫活性に差異を生じる可能性が少ない。遺伝子のそのような等価物としては、本発明のSEQ ID No.4のＢＴＳ０２６１８Ａトキシン又はプロトキシンのＤＮＡ配列とハイブリッド形成し、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン／トキシンと同じ殺虫特性を有するタンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列がある。これに関連して、用語「ハイブリッド形成」とは、慣用のハイブリッド形成条件、最も好ましくは緊縮型ハイブリッド形成条件を指す。「ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質」とは、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、及び実質的に同じ殺虫活性を有するその変異体又は突然変異体、例えばＢＴＳ０２６１８Ａ又はＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンに対する一般的な用語である。ここで用いられる限りで、用語「より又は改良されたプロテアーゼ耐性タンパク質」とは、天然のプロトキシンのプロテアーゼ裂開から得られるＢｔタンパク質断片が、タンパク質の殺虫活性を有するトキシン部分のそれ以上の裂開に起因する殺虫活性の実質的な喪失を招かないことを意味する。タンパク質の殺虫活性を有するトキシン部分は約６０〜７０kDであること、及びより詳しくは、それ以上の裂開はトキシンのＮ末端部分においてであることが好ましい。タンパク質は鱗翅類に対して殺虫性であることも好ましい。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の「代替形態」の好ましい例は、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンをエンコードしている、SEQ ID No.6の人工のｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子である。人工ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の更に好ましい例は、明確にするために更に「ｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子」と名付けられた、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質に実質的に類似する殺虫活性を有する（似ているが異なる）タンパク質をエンコードしているSEQ ID No.8のＤＮＡ配列によって示される。言うまでもなく、本発明は、「代替変異体又は形態」としてここに記載の特定の好適実施態様に限定されない。実際は、それらのコドンの用い方は異なるが、同じタンパク質、又は実質的に同じ殺虫活性を有する類似のタンパク質をエンコードしている他のいかなるＤＮＡ配列も、当業者は構成することができる。例えば、原核細胞や真核細胞の発現系によっては、コドンの用い方をホスト細胞のそれに変えることが遺伝子発現を増大できるものもある（Bennetzen及びHall，198 2；Itakura et al.，1977）。その上、多くのＢｔ遺伝子には、真核細胞のコドンを指向する偏りがなく、ＡＴに非常に富む遺伝子があることが知られているため、コドンの用い方を変えることが、ときには有益である（Adang et al.，1985 ；Schnepf et al.，1985）。これを達成するため、文献（Wada et al.，1990；M urray et al.，1989）及び主なＤＮＡ配列データバンク（例えばドイツ国ハイデルベルクのＥＭＢＬ）で入手できるコドンの用い方の表を当業者は参照することが多い。上記により、同じか又は実質的に同じタンパク質が生成されるように、合成ＤＮＡ配列を構成することができる。例えば、 Cohen et al.，1973を参照されたい。タンパク質を指すときの用語「実質的に同じ」は、いくつかのアミノ酸が異なるか、又はいくつかのアミノ酸が付加（例えば融合タンパク質、Vaeck et al.， 1987を参照されたい）又は欠失（例えばＮ又はＣ末端のトランケーション）されているが、タンパク質の殺虫活性は保持されているタンパク質を包含する。当業者には、ポリペプチド鎖の多くの部分での一般的なアミノ酸置換は、該ポリペプチドの活性に重大な変更を与えずに実施し得ることが広く公知である（Watson e t al．：Molecular Biology of the Gene，1987，226-227）。ここで用いられる限りで、用語「ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの機能部分」とは、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの少なくとも一つの機能的特性（例えば結合及び／又は毒性特性）を有する新たなハイブリッドタンパク質を与えるために他の（Ｂｔ）タンパク質に伝達できる、特異的構造を有するトキシンの何らかの部分又は領域を意味する（Ge et al.，1991）。そのような部分は、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の結合及び／又は毒性特性を有するハイブリッドＢｔタンパク質の本質的な特徴を形成できる。そのようなハイブリッドタンパク質は、拡大されたホスト範囲と改良された毒性を有することができ、そして／又は昆虫の耐性の発生を防ぐための戦略に用いることができる（EP 408 403；Visser et al.，199 3）。ここで用いられる限りで、用語「ＢＴＳ０２６８Ａａトキシン」は、いくつかのアミノ酸が天然のＢＴＳ０２６１８Ａトキシンと異なる新規な形態のＢＴＳ０２６１８Ａトキシンを指す。実際には、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンは、プロテアーゼによって約６９kDのタンパク質、及び実質的により低い殺虫活性を有する約５５kDのタンパク質へと消化されることが判明している。プロテアーゼ消化が長ければそれだけ、より多量の約５５kDタンパク質が形成される。この５５kDタンパク質は、SEQ ID No.4に示されるアミノ酸１６４位のアルギニンで、消化によって裂開されることが判明した。このように、ＢＴＳ０２６８Ａａトキシンでは、この位置のアルギニンをリシンと置き換え、Ｎ末端の４３個のアミノ酸をＭｅｔ−Ａｌａというアミノ酸で置き換え、Ｃ末端の最後を第６６６アミノ酸までトランケートした（SEQ ID No.4において）。他のＢｔトキシンと同様に、ＢＴＳ０２６８ＡａトキシンのＣ末端の最後を、最小の有毒断片まで（SEQ ID No.4の第６５８アミノ酸まで）更にトランケートできる。ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質のもう一つの形態である「ＢＴＳ０２６１８Ａｂタンパク質」では、このアルギニンはアラニンで置換されている。ＢＴＳ０２６８Ａａ／ｂタンパク質は双方とも、プロテアーゼに対する感受性がより低く、なおも実質的に同じ殺虫活性を有する。ＢＴＳ０２６８Ａａ及びＢＴＳ０２６１８Ａｂの両プロトキシンの有毒断片からのＣ末端部分は、ＢＴＳ０２６１８ＡプロトキシンのＣ末端部分と１００％同一である。ここで用いられる限りで、「ｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子」及び「ｂＴＳ０２６１８Ａｂ遺伝子」は、それぞれＢＴＳ０２６８Ａａ及びＢＴＳ０２６１８Ａｂタンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を指す。ＢＴＳ０２６８Ａａ及びＢＴＳ０２６１８Ａｂタンパク質のアミノ酸配列を知りさえすれば、いくつかのＤＮＡ配列を考案できることは明白である。そのような別のＤＮＡ配列としては、例えば、ＰＣＴ公開WO 91/16432及びWO 93/09218に記載のとおり、天然の配列中に存在する一定の不顕性の調節もしくはプロセシング要素を選択的に不活化することによるか、又はコドンの用い方全体を、より関連の深い宿主生物のそれ、好ましくは発現が望ましい宿主生物のそれに適合させることによって遺伝子中の一定の部位を不活化するように変えた、合成もしくは半合成ＤＮＡ配列がある。そのようなＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の変更は、アミノ酸１２３位のアルギニンの欠失によるか、又は、新たなＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の殺虫活性が実質的に不変であるという条件でこのアミノ酸をもう一つのアミノ酸で置き換えることによって達成することもできる。プロテアーゼ裂開部位を囲む他のアミノ酸を、殺虫活性が実質的に不変であるようにして、変えることもできる。これらの新規タンパク質は、それらの毒性を天然のＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質のそれと比較する定型的生物検定法で試験することができる。そのようなタンパク質の全体的な毒性のパラメータは、天然のタンパク質のそれらと同様でなければならない。それらが殺虫活性を保持していることから、そのような新規タンパク質は、重要な害虫を駆除するのに非常に役立つ。プロテアーゼ活性についてのそれらの改良された耐性は、例えば、そのようなタンパク質をエンコードしているＤＮＡを異質のホスト、例えば細菌又は植物中で発現させることによって、それらを昆虫を駆除する選択的なトキシンにする。ＤＮＡ配列に対する上記のような僅かな変更は、ＰＣＲを介しての突然変異誘発（Ho et al，1989；White et al.，1989）によって定型的に実施される。上記変異体は、殺虫活性にいかなる実質的な変化も生起せずに、実際にＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質に変更を加え得ることを示す。Ｎ末端での４３アミノ酸までの欠失、及びＣ末端アミノ酸の多大な欠失に加え、内部に位置するいくつかのアミノ酸も、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンと実質的に同じ殺虫活性を保持しつつ、他のもので置き換えることができる。同様に、CryIBというプロトキシン（Brizzard及びWhiteley、1988年）、及び天然に産するその変異体（ヨーロッパ公開408 403）は、プロテアーゼ活性によって約６９kDのトキシン、及びより小さい約５５kDのトキシンへと裂開されることが判明している。このトキシンについても、Brizzard及びWhiteley（1988年）の配列又はEP 408 403の配列での（出発コドンに対する）アミノ酸１４４及び１４６位のアルギニンの変更は、昆虫の腸内でのタンパク質の安定性を増大させることができる。実際には、Ｂｔ株第４４１２号から得られたか、又は大腸菌で発現されたいずれのＣｒｙＩＢプロトキシンの長時間のプロテアーゼ処理でも、Ｎ末端の最後がアミノ酸１４５位で始まる（Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−）約５５kDのタンパク質、及び１４７位で始まる（Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−）約５５kDのもう一つのタンパク質を生じる。アミノ酸１４４及び１４６位のアルギニンの変更は、より安定的なトキシン形態へと導くが、なおも有毒である。この変更は、当業界に充分公知の手法を用いて、ＣｒｙＩＢタンパク質、又はEP 358 557のＢｔ１４トキシンのようなその変異体をエンコードしている天然もしくは合成ＤＮＡ配列に組み込んで、より安定的なＣｒｙＩＢタンパク質を生成することができる。そのようなＣｒｙＩＢタンパク質は、ＢＴＳ０２６１８Ａ又はＢＴＳ０２６８Ａａタンパク質及びＣｒｙＩＡｂタンパク質とともに、これらのタンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列をホスト細胞、特に植物細胞中で発現させることによって、鱗翅類の昆虫、特にOstrinia nubilalisを駆除するのに用いることができる。そのため、１個又はそれ以上のアミノ酸の変更は、やはりプロテアーゼによって更に裂開される他のＢｔタンパク質、特に抗鱗翅類Ｂｔタンパク質で役立つ。その上、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株の全ＤＮＡから調製した５〜１０kbの断片は、適切な発現ベクター中で結合させ、大腸菌内で形質転換させることができ、そうして、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンに対して出現させたモノクローナルもしくはポリクローナル抗体によるトキシンの発現のための慣用のコロニー免疫探査法（French et al.，1986）用いて、クローンをふるい分けることができる。また、ＢＴＳ０２６１７Ａ又はＢＴＳ０２６１８Ａ又はＢＴＳ０２６５４Ｂ又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株の全ＤＮＡから調製した５〜１０kbの断片は、Ｂｔの適切なシャトルベクター中で結合させ（Lereclus et al.，1992）、結晶性を欠くＢｔ突然変異体内で形質転換させることができる。そうして、結晶（顕微鏡で検出）又は結晶タンパク質（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出）の生産について、クローンをふるい分ける。そのようにして特定したｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を、慣用の方法で配列決定して（Maxam及びGilbert，1980）ＤＮＡ配列を得た。サザンブロット法でのハイブリッド形成、及び配列比較から、この遺伝子は、鱗翅類に対する活性を有するプロトキシンやトキシンを 1989）とは異なることが示された。そのプロトキシンの殺虫効果を示す部分をエンコードしているｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の殺虫効果を示す部分、及びそのトキシンのみをエンコードしている該遺伝子のトランケートされた部分は、遺伝子の配列解析の後に慣用の方法で作成することができる。ＢＴＳ０２６１８Ａのプロトキシン及びトキシンのアミノ酸配列を、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及びトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のＤＮＡ配列から決定した。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の「殺虫効果を示す部分」又は「一部」によって、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンより少ないアミノ酸を有するが、鱗翅類に対してなおも有毒であるポリペプチドをエンコードしているＤＮＡ配列を意味する。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部もしくは殺虫効果を示す部分、又は大陽菌における等価遺伝子を他のＢｔ株及び植物で発現させるために、遺伝子又は遺伝子の一部の各々に隣接する適切な制限部位を導入することができる。これは、周知の手順（Stanssens et al.，1989；White et al.，1989）を用いて、部位指向性の突然変異誘発によって実施できる。植物での改良された発現を得るには、ＰＣＴ公開91/16432及び93/09218；EP 0,358,962及び0,359,472に従って、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、又は殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分のコドンの用い方を変更して、同等の変更された、又は人工の遺伝子もしくは遺伝子部分を形成するのが好適である。トウモロコシのような単子葉植物で増進された発現を得るには、ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子に単子葉類のイントロンを付加することもでき、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分のＤＮＡ配列を翻訳上中立的な方法で更に変えて、イントロンの部位指向性の挿入、及び／又は、エンコードされているアミノ酸配列を著しく変えることなくコドンの用い方に変化を出すこと、例えば、コドンの用い方を特定の植物に最も好ましいとされるものに適合させること（Murray et a.，1989）によって、その遺伝子部分に存在するＤＮＡ配列をできれば阻害して変更することができる。変更されたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の好適な例を、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシン及びその変異体をエンコードしているＤＮＡ配列を例示するSEQ ID No.6及びNo.8に示す。これらのＤＮＡ配列は、全体的に変更された、植物、特にトウモロコシのような単子葉類のそれに適合させたコドンの用い方を有する。SEQ ID N o.6のＤＮＡは、天然のｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子とまさに同じトキシンをエンコードしているが、そのコドンの用い方が植物ホスト細胞のそれに適合しているために、より高い発現レベルを植物、特にトウモロコシのような単子葉類に生じる。更に、ＢＴＳ０２６８Ａａトキシンは、Ostrinia nubilalisの腸膜のＣｒｙＩＡｂトキシン受容体の集団とは異なる受容体に結合することが見出された。これは、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンには、それに感受性である昆虫に独自の受容体があることを示す。広いスペクトル、異なる受容体との結合、及び他のＢｔトキシンとの低い相同性は、ＢＴＳ０２６１８ＡトキシンがＢｔトキシンの新規な分類群を表していることを示している。異なる標的部位を明らかに認識することから、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンは、昆虫の耐性の発生を防止するのに、又は他のＢｔトキシンに耐性である昆虫と戦うのに特に役立つことが証明できる。特に、一つの宿主におけるｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子と、（EP 408 403に記載されたような）非競合的に結合するトキシンをエンコードしている他のＢｔ遺伝子との組み合わされた発現は、耐性の発生の防止、好ましくはＣｒｙＩＡｂとＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質との組み合わされた発現のために興味深い。感受性のある有害昆虫のスペクトルが広いため、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシン及びその変異体は、植物、例えばトウモロコシのような単子葉類や、アブラナ類のような野菜を形質転換して、昆虫による損傷からこれらの植物を保護するのに極めて役立つ。殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分又はその等価物、好ましくは、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫効果を示す部分をエンコードしているｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子は、慣用の方法で、単一の植物細胞の核のゲノムに安定的に挿入することができ、そのように形質転換した植物細胞は、慣用の方法で、昆虫に耐性である形質転換植物を生産するのに用いることができる。これに関して、Agrobacterium tumefaciens中の、殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を含む無力化したＴｉプラスミドを、植物細胞を形質転換するのに用いることができ、その後、例えばEP 0,116,718、0,270,822、ＰＣＴ公開84/02,913、及びヨーロッパ特許出願87/400,544.0（これらも参照によってここに組み込まれる）、ならびにGould et al．（1991年）に記載の手順を用いて、形質転換植物細胞から形質転換植物を再生できる。好ましいＴｉプラスミドベクターは、それぞれ、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界配列の間にか、又は少なくとも右側境界配列の左に位置して、殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を含む。言うまでもなく、（例えばEP 0,233,247に記載の）直接遺伝子伝達、（例えばEP 0,270,356、ＰＣＴ公開85/01856及び米国特許4,684,611 に記載の）花粉を介する形質転換、（例えばEP 0,067,553及び米国特許4,407,95 6に記載の）植物ＲＮＡウイルスを介する形質転換、（例えば米国特許4,536,475 に記載の）リポソームを介する形質転換、ならびに、ある種のトウモロコシ（Fr omm et al.，1990；Gordon-Kamm et al.，1009）やコメ（Shimamoto et al.，19 89；Datta et al.，1990）の系統を形質転換するための最近記載された方法、及び単子葉類を一般的に形質転換するための最近記載された方法（ＰＣＴ公開92/09696）のような手順を用いて、植物細胞を形質転換するのに他のタイプのベクターを用いることもできる。得られる形質転換植物は、通常の植物栽培計画に用いて、同一の特性を有するより大量の形質転換植物を得るか、或いは、同一又は関連する植物種のその他の変種に、殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を導入することができる。形質転換された植物から得られる種子は、安定したゲノム挿入物として、殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を含有する。形質転換植物の細胞は、通常の方法により培養して、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、好ましくはＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの殺虫効果を示す部分を生成することができ、これは、鱗翅類に対する通常の殺虫組成物として使用するため回収することができる（米国特許出願821,582；EPA 86/300291.1）。殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分、好ましくはトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を、その挿入される遺伝子が、その植物細胞における遺伝子部分の発現を司ることのできるプロモーターの下流となり（つまり３’ ）、そのコントロール下になるように、植物細胞ゲノムに挿入する。これは、好ましくは、植物細胞ゲノムに、ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子を挿入することによって行うことができる。好ましいプロモーターとしては、単離株ＣＭ１８４１（Gardner et al.，1981）、ＣａｂｂＢ−Ｓ（Frank et al.，1980）、及びＣａｂｂＢ−ＪＩ（Hull及びHowell，1987）のカリフラワーモザイクウイルスの有力な構成である３５Ｓプロモーター（「３５Ｓプロモーター」）；及びＴ−ＤＮＡ（Velten et al.，1984 ）の１’及び２’遺伝子の発現をそれぞれ導くＴＲ１’プロモーター及びＴＲ２ ’プロモーター（それぞれ、「ＴＲ１’プロモーター」及び「ＴＲ２’プロモーター」）が挙げられる。代わりに、構成ではなく、むしろ植物の一つ又はそれ以上の組織又は器官（例えば、葉及び／又は根）に特異的であるプロモーターを使用して、それにより、挿入されたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を、特異的な組織又は器官の細胞においてのみ発現することもできる。例えば、殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を、植物自身、又は米国特許出願821,582及びEPA 86/300,291.1に開示されているような、エンドウなどの別の植物のリブロース −１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーターなどの光誘発性プロモーターのコントロール下で、殺虫効果を示す遺伝子部分を配置することによって、植物の葉（例えば、トウモロコシ、綿）に、選択的に発現させることができる。別の方法は、その発現を（例えば、温度又は化学的因子により）誘発可能であるプロモーターを使用することである。殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分を、挿入される遺伝子部分が、適当な３’末端転写調節シグナル（つまり、転写形成及びポリアデニル化シグナル）の上流（つまり５’）になるように、植物ゲノムに挿入する。これは、ｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子を、植物細胞ゲノムに挿入することによって行うことができる。好ましいポリアデニル化及び転写形成シグナルとしては、形質転換植物細胞における３’−非翻訳ＤＮＡ配列として働くオクトピンシンターゼ遺伝子（Gielen et al.，1984）及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Velten 及びSchell，1985）のそれらが挙げられる。殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分は、カナマイシン耐性をエンコードするneo遺伝子（EP 0,242,236）などの選択的標識遺伝子と同一のプロモーターのコントロール下、植物が、融合タンパク質を発現するように、植物ゲノムに、ハイブリッド遺伝子（EPA 86/300,291.1；Vaeck et al.，1987）として、任意に挿入することができる。抗鱗翅類タンパク質をエンコードするｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は一部を、鱗翅類又は鞘翅類に対して殺虫活性を有するバチルス・チュリンゲンシスなどのその他の細菌を形質転換するために使用することもできる。それにより、広範囲の鱗翅類及び鞘翅類害虫の駆除、又は付加的な鱗翅類性害虫の駆除に有用である形質転換されたＢｔ株を、生産することができる。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は一部による、適当なクローニングビヒクルに取り込ませることによる細菌の形質転換は、通常の方法により、好ましくは、Mahillon et al．（19 89）及びＰＣＴ特許公開WO 90/06999に記載されているような通常の電気穿孔技術を用いて行うことができる。代わりに、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株を、ニトロソグアニジン又は紫外線などの突然変異誘発剤により処理する、つまり当業界における技術者に公知の方法により処理することによって、これらの株の突然変異株を得ることができる。また、エチルメタンスルホネートにより処理することによって、無胞子性突然変異株を得ることもできる。このような突然変異株は、実質的に同一の殺虫活性を保持しながらも、その改善された特徴（大規模発酵などに適しているなど）によりスクリーニングすることができる。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株は、ｂｔ１８遺伝子（EP 0,358,557）、又は抗鱗翅類タンパク質をコードする別のＢｔ遺伝子；及び抗鞘翅類タンパク質をコードするｂｔ１０９Ｐ遺伝子（ＰＣＴ公開WO 91/16433）などの、一つ又はそれ以上の外来Ｂｔ遺伝子の全部或いは殺虫効果を示す部分により、形質転換することもできる。それにより、はるかに広範囲の害虫（例えば、鞘翅類及び／又は付加的鱗翅類）の駆除に有用である形質転換Ｂｔ株を産生することができる。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株の、通常のクローニングベクターに取り込んだ外来Ｂｔ遺伝子の全部もしくは一部による形質転換は、公知の方法で、好ましくは通常の電気穿孔技術（Chassy et al.，1988）又はその他の方法、例えば、Lereclus et al．（1 992）記載の方法を用いて行うことができる。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株のそれぞれは、通常の方法（Dulmage，1981；Bernhard及びUtz， 1993）により培養して、高収量の細胞を得ることができる。良く理解された適当な条件下（Dulmage，1981）で、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株はそれぞれ胞子を形成して、ＢＴＳ０２１６８Ａプロトキシンを高収量で含有する結晶タンパク質を生成する。本発明の殺虫、特に抗鱗翅類組成物は、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株、或いは好ましくはそれぞれの結晶、結晶タンパク質、又はＢＴＳ０２１６８Ａプロトキシン、トキシン、もしくは殺虫効果を示すプロトキシンの部分を、活性成分として用い、適当な担体、希釈剤、乳化剤、及び／又は分散剤（例えば、Bernhard及びUtz，1993に記載されているように）と共に、通常の方法で処方化することができる。この殺虫組成物は、水和剤、ペレット、顆粒もしくは粉剤として、又は水性もしくは非水性溶媒による液状処方物として、泡沫剤、ゲル、懸濁剤、濃縮剤などとして処方化することができる。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、もしくはＢＴＳ０２６５２Ｅ株、結晶、結晶タンパク質、又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン、もしくは殺虫効果を示すプロトキシン部分の、このような組成物中の濃度は、その処方化の特性、及びその使用目的の形態により異なるであろう。一般的には、本発明の殺虫組成物は、本組成物を適用するごとに、鱗翅類から畑を２〜４週間保護するために使用することができる。より広範囲な保護効果を得る（例えば、成長期の間ずっと）には、本組成物の追加量を定期的に適用しなければならない。本発明により、昆虫、特に鱗翅類をコントロールする方法は、好ましくは、保護すべき箇所（地域）に、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、もしくはＢＴＳ０２６５２Ｅ株、胞子、結晶、結晶タンパク質、又はＢＴＳ０２１６８Ａプロトキシン、トキシンもしくは殺虫効果を示すプロトキシンの部分、好ましくはＢＴＳ２１６８Ａトキシン、の殺虫量を適用することからなる。保護すべき箇所としては、例えば、害虫もしくは成長する植物の生息場所、又は植物が成長する場所が挙げられる。ＢＳＴ０２６１８Ａプロトキシン又はトキシンを得るには、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株の細胞を、通常の方法で、適当な培養培地中で増殖させ、酵素分解又は洗剤などの通常の方法を用いて溶菌させる。次に、プロトキシンを分離し、クロマトグラフィー、抽出、電気泳動などの標準的な技術により精製する。次に、プロトキシンのトリプシンによる消化により、トキシンを得ることができる。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅ細胞を採取し、そのまま、生存した状態、又は死滅した状態で、好ましくは乾燥した状態で、保護すべき箇所に適用することができる。この点に関し、精製したＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株（生存した状態、又は死滅した状態のいずれであろうと）、好ましくは、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株を９０．０％〜９９．９％含む細胞塊を使用することが好ましい。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、もしくはＢＴＳ０２６５２Ｅ細胞、結晶もしくは結晶タンパク質、又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン、もしくは殺虫効果を示すプロトキシンの部分は、特異的用途に応じて、湿潤した状態又は乾燥した状態で、いかなる数の通常の添加剤をも用いて、各種方法により、殺虫組成物に処方化することができる。添加剤としては、湿潤剤、洗浄剤、安定化剤、付着剤、展着剤、及び増量剤が挙げられる。このような組成物の例としては、ペースト、粉剤、水和剤、顆粒、ベーツ、及びエアロゾルスプレーが挙げられる。その他のＢｔ細胞、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、トキシン、及び殺虫効果を示すプロトキシンの部分、並びにその他の殺虫剤、殺真菌剤、殺生物剤、除草剤、及び肥料は、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、もしくはＢＴＳ０２６５２Ｅ細胞、結晶もしくは結晶タンパク質、又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン、もしくは殺虫効果を示すプロトキシンの部分と共に使用して、更に利点又は利益を得ることができる。このような殺虫組成物は、通常の方法により調製することができ、用いるＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、もしくはＢＴＳ０２６５２Ｅ細胞、結晶もしくは結晶タンパク質、又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン、もしくは殺虫効果を示すプロトキシンの部分の量は、目的とする害虫、用いる組成物、組成物を適用する箇所の種類、及び主な天候条件などの各種因子に応じて異なる。一般的には、ＢＳＴ０２６１８Ａプロトキシン、殺虫効果を示すプロトキシンの部分、又はトキシンの濃度は、処方剤の少なくとも約０．１重量％から処方剤の約１００重量％、より好ましくは、処方剤の約０．１５重量％から約０．８重量％である。実際には、ある種の昆虫には、保護された地域内、つまりこのようなプロトキシン、トキシン、及び／又は殺虫効果を示すプロトキシンの部分が適用された地域内で、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、トキシン、殺虫効果を示すプロトキシンの部分、又はその混合物を与えることができる。また、ある種の昆虫には、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、もしくはＢＴＳ０２６５２Ｅ株、又はその形質転換株のそのままもしくは生きた細胞を与えることができ、その結果、昆虫は、これらの株のプロトキシンのあるものを摂取し、死亡するか、又は障害を受ける。昆虫を、例えば、形質転換された植物又は殺虫処方物などの形のＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質と接触させることによってこれらの昆虫を駆除する目的で、実質的に同一の殺虫活性を有するＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の上述の変異体のいずれか、好ましくは、ＢＴＳ０２６１８Ａａ及びＢＴＳ０２６１８Ａｂタンパク質を使用することができる。更に植物及び細菌を形質転換するための上述の方法のいずれも、ＢＴＳ０２６１８ＡａもしくはＢＴＳ０２６１８Ａｂタンパク質、又は天然のＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の代わりに、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質のよりプロテアーゼ耐性であるタンパク質変異体を用いて、昆虫を駆除するために使用することもできる。以下の実施例は、本発明を説明するものである。実施例に記載する図及び配列は、以下のとおりである。図１ｃｒｙＩＧプローブを含む、ｃｒｙＩ結晶タンパク質遺伝子に対するＤＮＡプローブ混合物を用いた、Ｂｔ株ＨＤ１２７（レーン１）、ＢＴＳ０２６１８Ａ株（レーン２）、Ｂｔ株ＢＴＳ０２４５９（ｃｒｙＩＡ（ｃ）、８１ｋ、ｃｒｙＩＣ、及びＣｒｙＩＥを含有、レーン３）、及びＢｔ株ＢＴＳ０２４８０Ｅ（ＨＤ −１２７と同一の遺伝子を含有、レーン４）の、ＡｌｕＩ−消化全ＤＮＡの、サザンブロット法（SEQ ID No.1）による解析。それぞれのバンドは、特定の結晶タンパク質遺伝子と対応する。これらのプローブにより、ＢＴＳ０２６１８Ａ株は、ｃｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子、及び約５３０ｂｐのＡｌｕＩ断片によりｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子であると確認され、SEQ ID No.1のｃｒｙＩＧプローブとハイブリッド形成する新規遺伝子を含むことが認められる。認識されたｃｒｙＩ遺伝子の名称は、ある種の断片のサイズと共に表示されている。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子は、３個のアステリスクにより表示されており；「？」は、未知の遺伝子断片を表示する。配列リスト SEQ ID No.1−ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を単離するために用いるＤＮＡプローブのヌクレオチド配列。本プローブは、ｃｒｙＩＧＤＮＡ配列の一部から誘導されたものであり、Smulevitch et al．（1991）記載のＤＮＡ配列のヌクレオチド２７３２−２７５０に相補的である。 SEQ ID No.2−ヌクレオチド１９５−１９７位における推定翻訳開始コドンからなるｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の５’部分ヌクレオチド配列。 SEQ ID No.3−ヌクレオチド１１４６−１１４８位における推定翻訳停止コドンからなるｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子（Ｎ：未知ヌクレオチド）の３’部分ヌクレオチド配列。 SEQ ID No.4−ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のヌクレオチド配列、及びＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの翻訳されたアミノ酸配列。プロトキシンのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド６６８からヌクレオチド４１４１に達する。翻訳開始コドンは、ヌクレオチド６６８−６７０位にあり、翻訳停止コドンは、ヌクレオチド４１３９−４１４１位にある。 SEQ ID No.5−ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質のアミノ酸配列。約６９kDのＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの配列は、アミノ酸４４からアミノ酸６５８に達する。 SEQ ID No.6−変更されたトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のヌクレオチド配列、及びＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの翻訳されたアミノ酸配列。 SEQ ID No.7−変更されたｂＴＳ０２６１８Ａトキシン遺伝子の翻訳されたアミノ酸配列。トキシンの一部のみを示すが、タンパク質の全体は、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質のアミノ酸配列（SEQ ID．No．5）と、１００％同一である。 SEQ ID No.8−変更されたｂＴＳ０２６１８Ａａトキシン遺伝子のヌクレオチド配列、及びＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンの翻訳されたアミノ酸配列。Ｎ−及びＣ−末端アミノ酸の欠失、及びＮ−末端メチオニンコドン後部へのアラニンコドンの付加のほか、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンは、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンとは、アミノ酸番号１２３（Ａｒｇコドンは、Ｌｙｓコドンに変更されている）において異なるのみである。 SEQ ID No.9−ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンのアミノ酸配列。ＢＴＳ０２６１８Ａａプロトキシンは、そのトキシン断片からのそのＣ−末端において、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンと、１００％同一である。実施例において、特にそうでないと記載しない限り、組換えＤＮＡを作成及び操作するための全ての操作は、Sambrook et al.，Molecular Cloning−A Labora tory Manual，Second Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY（1989）に記載された、標準化された操作により行う。実施例１：ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株の特徴ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、及びＢＴＳ０２６５４Ｂ株は、フィリピン、ビコール地方のカドランにおいて採取した穀類の粉より単離され、１９９２年７月２日に、それぞれ受託番号ＬＭＧＰ−１２５９２、ＬＭＧＰ− １２５９３、及びＬＭＧＰ−１２５９４として、ＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託された。ＢＴＳ０２６５２Ｅ株もまた、フィリピンの穀類の粉末から単離され、１９９３年３月１日、受託番号ＬＭＧＰ−１３４９３として、ＢＣＣＭ−ＬＭＧに寄託された。それぞれの株は、通常の標準的な培地、好ましくはＴ₃培地（トリプトン３g/l、トリプトース２g/l、酵母エキス１．５g/l、ＭｎＣｌ₂５mg 、０．０５ＭＮａ₂ＰＯ₄、pH６．８、及び寒天１．５％）において、好ましくは２８℃で培養することができる。長期保存のためには、等量の胞子−結晶懸濁液と、等量の５０％グリセロールとを混合して、−７０℃で保存するか、又は胞子−結晶懸濁液を凍結乾燥するのが好ましい。胞子形成には、２８℃で４８時間、Ｔ₃培地に増殖させ、その後、４℃で保存するのが好ましい。その栄養相の間、それぞれの株は、通性嫌気性条件下でも増殖することができるが、胞子形成は、好気性条件下でのみ起こる。各株の滅菌は、オートクレーブ中、１２０℃（１bar圧）で２０分間処理することによって行う。このような処理により、胞子、並びにＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅプロトキシンが全体的に非活性化される。紫外線（２５４nm）もまた、胞子を非活性化する。ニュートリエント・アガー（「ＮＡ」、Difco Laboratories、Detroit、MI、U SA）に１日培養後、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株のそれぞれのコロニーは、不規則な端部を有する不透明な白色コロニーを形成する。それぞれの株の細胞（１．７−２．４×５．６−７．７μmのグラム陽性桿菌）は、Ｔ₃寒天に２８℃で４８時間培養後、胞子を形成する。胞子形成の間に産生される結晶タンパク質は、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株の結晶中にパッケージされる。非常に顕著なことに、結晶は、胞子形成後も、胞子に付着したままである。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株のＢｔ血清型を、WHO Collaborating Center for Entomopathoge nic Bacillusにより行われているような通常の血清型識別法により調べたところ、これらの株の全てが、血清型tolworthi H9であった。実施例２：ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、並びにＢＴＳ０２６１８Ａａ及びＢＴＳ０２６１８Ａｂトキシン又はプロトキシンの、Noctuidae spp.、Gelechiidae spp.、Yponomeutidae spp.、及びPyralidae spp.に対する殺虫活性。ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株の一つ、又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンもしくはトキシン、又はＢＴＳ０２６１８Ａａ及びＢＴＳ０２６１８Ａｂトキシンもしくはプロトキシンより得た胞子−結晶混合物と層にした人工飼料により育成した新生幼虫（ Plutella xylostellaについては、第三齢の幼虫を使用した）に対する毒性試験を行った。人工飼料を、コスター（Costar）２４ウエルプレートのウエルに分配しした。飼料からは、ホルムアルデヒドを省略した。試料希釈液５０μｌを、飼料の表面に適用し、層空気流中で乾燥させた。ＬＣ₅₀の測定には、希釈液を、ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液で作成し、５回の希釈を行った。２匹の幼虫を、各ウエルに配置し、試料希釈毎に２４匹の幼虫を用いた。５日目に、M．brassica、S．fr ugiperda、H．virescens、O．nubilalis、Plutella xylostella、及びS．exigua の幼虫の生存数及び死亡数を数え、６日目に、A．ipsilon、A．seqetum、及びS ．littoralisの幼虫の生存数及び死亡数を数えた。ＬＣ₅₀及びＬＣ₉₅の値（試験を行った昆虫のそれぞれ５０％及び９５％を殺すのに必要であった濃度、胞子− 結晶数/cm²又はng（プロ）トキシン/cm²で表示する）を、プロビット解析（Finn ey，1971）を用いて算出し、結果を以下に表示する。ジャガイモガであるPhthorimaea operculellaを、以下の方法により試験した：バレイショの塊茎から切り出したディスクを、各種濃度のＢＴＳ０２１６Ａａタンパク質を含む溶液に浸した。乾燥させたこのようなディスクの３個を、２０匹のPhthorimaeaの幼虫を有するトレーに配置した。適用した各濃度について、４−５日後に死亡率を記録した。 Spodoptera littoralis 精製されたＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンによる実験により、本タンパク質のS．littoralisの幼虫に対する有意な毒性が示される。 Spodeptera exigua １．結晶／胞子混合物２．トキシン／プロトキシン測定 Mamestra brassica １．結晶／胞子混合物２．プロトキシンの測定 Agrotis ipsilon １．結晶／胞子混合物２．トキシン／プロトキシン測定 MacIntosh et al．（1990）は、A．ipsilonに対するＣｒｙＩＡｃトキシンの活性を記載しているため、精製したＣｒｙＩＡｃトキシンを、比較のために、この昆虫を用いて試験したが、A．ipsilonに有意な死亡率は認められなかった。 He1iothis virescens １．結晶／胞子混合物２．トキシン／プロトキシン測定 Ostrinia nubilalis １．結晶／胞子混合物２．精製プロトキシンの測定精製されたＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンは、Ostrinia nubilalisの幼虫に対しても、Ostriniaに対して最も活性であるＣｒｙＩトキシンと比較しても、有意な毒性を示した。 Plutella xylostella 数種の実験において、人工飼料中への精製ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの適用後、Plutella xylostellaの幼虫もまた、有意な死亡率を示した。 Spodoptera frugiperda ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子−形質転換結晶−マイナスＢｔ株（Mahillon et al.，1989）の結晶／胞子混合物もまた、昆虫飼育試験において、S．frugiperdaの幼虫の成長を有意に阻害することが認められた。 Agrotis segetum 根切り虫であるAgrotis segetumもまた、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンに感受性を有することが認められた。ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の変異体は、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシン９８０ng/cm²（＝ＬＣ₅₀）の濃度で、Agrotisの幼虫の５０％を殺虫した。比較試験では、試験を行った他の全てのＣｒｙＩトキシン（ＣｒｙＩＡｂ、ＣｒｙＩＡｃ、ＣｒｙＩＡａ、ＣｒｙＩＢ、ＣｒｙＩＣ、ＣｒｙＩＤ、及びＣｒｙＩＥ（Hofte & Whiteley1989；EP 358 557）が、この昆虫に対して、１５，０００ng/cm²以上のＬＣ₅₀を有することが認められた。Agroti s segetumは、各種穀類に対する重要な害虫である。 Phthorimaea operculella ジャガイモキバガであるPhthorimaea operculellaもまた、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンに感受性を有することが認められた。ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンを摂取した幼虫は、コントロールの幼虫よりも有意に高い死亡率を示した。更に、数種の昆虫について、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンの試験を行い、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質と実質的に同等の殺虫活性を有することが認められた。実際に、Heliothis virescens、Mamestra brassicae、Ostrinia nubilalis 、Spodoptera exigua、及びSpodoptera littoralisによりバイオアッセーを行い、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質と比較して、ＬＣ₅₀値については、ごくわずかな差しか示されなかった。これにより、新規ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンは、天然の形のものと、その殺虫活性については、ほとんど相違を有さないことが示される。また、ＢＴＳ０２６１８Ａトキシン及びプロトキシンのアラニン変異体、ＢＴＳ０２６１８Ａｂトキシン、及びＢＴＳ０２６１８Ａｂプロトキシンを、Ostrin ia nubilalisについて試験し、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシン又はプロトキシンとほぼ同等の毒性を有することが認められた。同時に、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンは、試験を行った鞘翅類の昆虫に対して、無毒であることが認められた：Leptinotarsa decemlineata及びDiabrotica undecimpunctata howardiは、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンによる影響を受けなかった。これらの昆虫については、当業界において良く知られている飼料適用法による試験を行った。例えば、Rupar et al.，1991を参照。最後に、本発明の株、並びに本発明のＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質及びその変異体は、現在入手可能である単一のＢｔタンパク質に感受性を示さない広範囲の昆虫に対して、殺虫活性を有し、そして少なくとも３種のSpodoptera属の種、そしてA．ipsilon、A．segetum、M．brassica、及びH．virescensなどのその他のヤガ科、並びにO．nubilalisなどのメイガ科、P．operculellaなどのキバガ科、及びPlutella xylostellaなどのスガ科に対しても、活性を有する。これらの結果を要約し、その他のＣｒｙＩ遺伝子（Van Frankenhuyzen，1993）による結果と、表１において比較したが、表１においては、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質に対して、独特の範囲の昆虫が感受性を示すことが示されている。同一のスペクトルが、ＢＴＳ０２６１８Ａａ及びＢＴＳ０２６１８Ａｂトキシンについても当てはまる。したがって、これらの新規トキシンは、昆虫の駆除に使用することができ、約５５kDのタンパク質がほとんど形成されないので、プロテアーゼ活性に対する感受性が低いため、これらがより安定であるという利点を更に有する。実施例３：ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の確認ＤＮＡプローブとして、SEQ ID No.1のＣｒｙＩＧ遺伝子（Gleave et al.，19 92）のＤＮＡ配列を用い、標準的なハイブリッド形成条件を用い、用いた株のＡｌｕＩにより消化された全ＤＮＡをサザンブロット法（図１）により解析することによって、ＢＴＳ０２６１８Ａ株中にｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子が確認された。その５’及び３’末端部を示す、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の部分的ＤＮＡ配列を、それぞれSEQ ID No.2及びNo.3に示し、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全ＤＮＡ配列、及びＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の全アミノ酸配列を、SEQ ID No. 4に示す。 SEQ ID No.2及びNo.3の部分的配列により、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子が、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株中に認められ、プローブの構成により、これら及びその他のＢｔ株中の全遺伝子配列を確認及び単離することが可能となる。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の翻訳開始コドンは、SEQ ID No.4におけるヌクレオチド６６８−６７０位と対応する、SEQ ID No.2におけるヌクレオチド１９５−１９７位において確認される。翻訳停止コドンは、SEQ ID No.4におけるヌクレオチド４１３９−４１４１位と対応する、SEQ ID No.3におけるヌクレオチド１１４６−１１４８位において確認される。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子もまた、プローブとしてSEQ ID No.1のＤＮＡ配列、及び保存されたｃｒｙＩ遺伝子のＤＮＡ断片の他のＤＮＡプローブを用いて、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株中に確認された。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部が、１２９．９kDのプロトキシンをエンコードすることが認められた。アミノ酸配列を、その他のＣｒｙＩタンパク質と比較したところ、Ｃ末端部（保存された配列ブロック５のＣ末端）が、ＣｒｙＩＧと相同である（８８％）ことが示された。Ｎ末端部に関する最大の相同性（トキシン）は、ＣｒｙＩＢトキシンにおいて認められたが、これは５０％未満であることが認められた（相同性は、完全に一致した数の、最長断片のアミノ酸数による商として示す）。最小の殺虫性タンパク質は、SEQ ID No.4におけるアミノ酸数４４からアミノ酸６５８に達する６９kd（６１５アミノ酸）のタンパク質であると考えられる。 SEQ ID No.4におけるアミノ酸数１６５からアミノ酸数６５８に達する、５５kD （４９４アミノ酸）のより小さいトリプシン断片は、S．exiguaに対して、まだ殺虫活性を有しているが、この活性は、有意に低減されている。したがって、トランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、又は同等にトランケートされた遺伝子は、上述したように、SEQ ID No.4のＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの６９kDのタンパク質をエンコードするのが好ましい。実施例４：ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のクローニング及び発現ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を単離するために、ＢＴＳ０２６１８Ａ株から全ＤＮＡを得、Ｓａｕ３Ａにより部分的に消化させた。消化させたＤＮＡを、シュクロースグラジエントで、サイズにより分別し、７Kbから１０Kbの範囲の断片を、ＢａｍＨ１−消化及びＢＡＰ−処理クローニングベクターｐＵＣ１９（Yannisch -Perron et al.，1985）に連結した。このベクターを含有する組換えE．coliクローンを次に、実施例３に記載したSEQ ID No.1のｃｒｙＩＧＤＮＡプローブによりスクリーニングして、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を含有するクローンを確認した。このように確認されたＤＮＡ断片の配列を次に、Maxam及びGilbert（1980）の方法により分析した。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の部分的配列を、SEQ ID No.2 及びNo.3に示し、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及びＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の全配列を、SEQ ID No.4に示す。ＤＮＡ配列の分析に基づき、適当な制限酵素により遺伝子を切断し、ＢＴＳ０２６１８ＡトキシンをエンコードするトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を得た。E．coliにおける遺伝子の発現は、標準的な操作法により誘発した（上記のSambrook et al.，1989）。ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子も、通常の方法により、適当なシャトルベクター（ Mahillon et al.，1988）を用いて、それ自身の細菌プロモーターのコントロール下、結晶−マイナスＢｔ１７１５ berliner株及びＢｔＨＤ−１kurstaki株（Dipel（商標）（Abbott Laboratori es）の産生株）に導入した。Ｂｔ株kurstaki HD-1（ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を含有する）の２種類の形質転換細胞、Ｂｔ kurstaki HD-1株の親株、野生種のＢＴ０２６１８Ａ株、Ｂｔ１７１５berliner結晶−マイナス株、及びＢｔ１７１５berliner結晶−マイナス（ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を含有する）の１種の形質転換細胞の胞子−結晶混合物に関して、ビートのヨトウガ（Spodoptera exigua）について、バイオアッセーを行った。バイオアッセーは、実施例２に記載したように行った。形質転換されたＢｔ１７１５berliner結晶−マイナス（ｂＴＳ０２６１８Ａを含有する）は、S．exiguaに対して高度に有毒であった（飼料寒天cm²当たり４×１０⁴胞子 −結晶で、死亡率１００％）が、Ｂｔ１７１５berliner結晶−マイナスは、無毒であった。Ｂｔ kurstaki ＨＤ−１（ｂＴＳ０２６１８Ａ）形質転換細胞は、ＨＤ−１親株と比較して、（平均）２２倍（ＬＣ₅₀−レベル）から７６倍（ＬＣ₉₅ −レベル）の毒性を示した。同様に、ＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質又はＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質のその他の変異体は、用いるベクターがＢｔホスト株と同等であり、細菌ホスト中で安定に保持されるのであれば、当業界で使用可能ないかなる方法（Baum et al.，1991；Gamel & Piot，1992；Lecadet et al.，1992）によっても、Ｂｔ株に導入し、発現させることができる。ホスト株とのレプリコン相同性を有するプラスミドベクターは、適当なベクターではないことは公知である（Gamel & Piot ，1992）。実施例５：ｂＴ０２６１８Ａ遺伝子及びトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子のE．coliへの挿入、及びトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の植物への挿入実施例４のｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、及びトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を、E．coli及び植物において発現させるために、EPA 86/300291.1 及びEPA 88/402115.5記載の方法により、異なる遺伝子カセットを、E．coliにおいて作成する。植物における有意な発現を可能とするために、ａ）トランケートされた遺伝子、又はｂ）ｉ）トランケートされた遺伝子、及びii）neo遺伝子の融合体であるハイブリッド遺伝子を含有するカセットをそれぞれ；EPA 86/300291.1記載の中間体植物発現ベクターのＴ−ＤＮＡの境界配列の間に挿入し；植物発現ベクターにおける転写形成及びポリアデニル化シグナルに融合し；３５Ｓ３転写（Hull及びHowell，1987）を導くカリフラワーモザイクウイルス由来の構成プロモーター、又はオクトピンＴｉ−プラスミドのＴＲ−ＤＮＡ（Velten et al.，1984）由来の２’プロモーターのコントロール下に配置し；オクトピンシンターゼ遺伝子の３’末端転写形成及びポリアデニル化シグナル（Gielenetal.，1984）に融合する。標準的な方法（Deblaere et al.，1985）を用い、トランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を含有する中間体植物発現ベクターを、無毒化されたＴｉ− プラスミドｐＧＶ２２６０（Vaeck et al.，1987）を有するAgrobacterium株Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆ（登録商標）（米国特許出願821,582；EPA 86/300,291.1）に導入する。スペクチノマイシン耐性について選択した結果、ｐＧＶ２２６０及びそれぞれの中間体植物発現ベクターからなるコインテグレートされたプラスミドが得られる。これらの組換えAgrobacterium株のそれぞれを次に、トランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子が、異なる植物細胞に含まれ、それにより発現されるように、異なる綿植物を形質転換するために用いる。実施例６：植物におけるトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の発現実施例５の形質転換された植物細胞から得られた、形質転換植物の葉における、トランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の発現生成物の鱗翅類に対する殺虫活性を、これらの葉を給餌したAgrotis及びSpodoptera spp．の幼虫の成長速度及び死亡率を記録することによって評価する。これらの結果を、形質転換されていない植物より得た葉を給餌した幼虫の成長速度と比較する。Agrotis及びS podoptera spp．に対する毒性を、EP 0,358,557、米国特許出願821,582、及びEP A 86/300,291.1に記載されたように評価する。トランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子及びトランケートされたｂＴＳ０２６１８−neoハイブリッド遺伝子を含有する形質転換植物の葉を給餌した幼虫においては、形質転換されていない植物の葉を給餌した幼虫よりも、有意に高い死亡率が得られる。形質転換植物は、また、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質を発現することによって、Ostrinia nubilalis、Mamestra brassica、Heliothis v irescens、及びPlutella xylostellaによる攻撃に対して、耐性であることが認められている。本発明は、ＢＴＳ０２６１７Ａ株（ＢＣＣＭ−ＬＭＧＰ−１２５９２）、ＢＴＳ０２６１８Ａ株（ＢＣＣＭ−ＬＭＧＰ−１２５９３）、ＢＴＳ０２６５４Ｂ株（ＢＣＣＭ−ＬＭＧＰ−１２５９４）、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ（ＢＣＣＭ−ＬＭＧＰ−１３４９３）株に限定されないことは言うまでもないことである。むしろ本発明は、それぞれのＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅの結晶もしくは結晶タンパク質、又はＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンもしくはトキシンと、実質的に同一の特性、特に抗鱗翅類性、更に特に抗Noctuidae、抗Yponomeutidae、抗Gelechiidae、及び抗Pyralidae性、特に抗Spodoptera、抗Plutella、抗Ostrinia、抗Mamestra；抗Heliothis、抗Phthorimaea、及び抗Agrotis性を有する結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、又はトキシンを産生するＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株の突然変異株又は変異体を包含する。本発明はまた、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、及びトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子と同様に、殺虫効果を示すそのいかなる部分をも包含する。この点に関し、ここで用いる語「ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子」は、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、又はＢＴＳ０２６５２Ｅ株より単離され、そしてSEQ ID No.1のヌクレオチド配列、及びＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンと実質的に同一のアミノ酸配列及び殺虫活性を有するプロトキシンをエンコードし、そして好ましくは、SEQ ID No.2及びNo.3に示されるヌクレオチド配列の一部、又は SEQ ID No.4に示される配列全体を含有する同等の遺伝子とハイブリッド形成する遺伝子を意味する。本発明はまた、トランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子により形質転換された綿植物に限定されるものではない。本発明は、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子、又はｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子などの、同等の遺伝子の殺虫効果を示す部分により形質転換されたトマト、タバコ、ナタネ、アルファルファ、ヒマワリ、レタス、バレイショ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、アブラナ、サトウダイコン、並びにその他のマメ類及び野菜類などのいかなる植物をも包含する。トウモロコシ細胞を形質転換し、トランスジェニック植物を再生させる方法は、すでに記載されている（D'Halluin et al.，1992；Fromm et al.，1990；Goul d et al.，1991；Koziel et al.，1993；Omirulleh et al.，1993；Spencer et al.，1992；Klein et al.，1992；Walters et al.，1992）。トウモロコシ細胞を形質転換するベクターは、３５Ｓプロモーター誘導体又はトウモロコシ遺伝子、好ましくは構成的に発現されたトウモロコシ遺伝子由来のプロモーターなどの適当なプロモーターからなる、ｂＴＳ０２６１８Ａタンパク質又はその変異体（例えば、ＢＴＳ０２６１８Ａａ）をエンコードするキメラ遺伝子；及び天然トウモロコシ遺伝子、又は３５Ｓ由来の遺伝子、遺伝子７、もしくはオクトピンシンターゼ遺伝子などの適当な３’末端形成配列を含有する（詳細な記載、及びMoge n et al 1990；Wu et al 1993を参照）。イントロンが、トウモロコシ細胞中に正しくスプライスされておれば、イントロンがキメラ遺伝子構築物（例えば、ＡｄｈＩイントロン（Callis et al.，1987；Maas et al.，1991を参照）などの天然トウモロコシ遺伝子イントロン）に導入されている場合、発現が増大する。プロモーター配列には、エンハンサー成分もまた、提供することができる（例えば、Omirulleh et al.，1993）。キメラ遺伝子として、除草剤耐性遺伝子又は抗生剤耐性遺伝子などの良く知られた選択的標識遺伝子を、形質転換ＤＮＡに含有させることによって、トランスジェニックトウモロコシ植物を選択培地に成長させる。Ostrinia nubilalisの幼虫を用いたバイオアッセーにより、その形質転換された表現型について、トランスジェニックトウモロコシ植物を選択する。これらの幼虫は、ｂＴＳ０２６１８Ａａにより形質転換されたトウモロコシを与えると、速やかに食べるのをやめ、トウモロコシ植物に対して大きな被害を及ぼさない。本発明は、植物細胞を、殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子部分により形質転換するために、Agrobacterium tumefaciens Ｔｉ−プラスミドを使用することに限定されない。リポゾームの使用、電気穿孔、又は植物ウイルスもしくは花粉に基づくベクター系などによる植物細胞形質転換のためのその他の公知の技術を、このような遺伝子部分により、モノコチレドン及びジコチレドンを形質転換するために使用することができる。更に、ＢＴＳ０２６１７Ａ、ＢＴＳ０２６１８Ａ、ＢＴＳ０２６５４Ｂ、及びＢＴＳ０２６５２Ｅ株に天然に存在する以外のＤＮＡ配列であって、ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン及びトキシンをエンコードするＤＮＡ配列を、植物及び細菌を形質転換するために使用することができる。この点に関し、これらの遺伝子の天然のＤＮＡ配列は、１）ある種のコドンを、同一又は異なるいずれか、好ましくは同一のアミノ酸をコードするその他のコドンと置換し；２）ある種のコドンを、欠失もしくは付加し；及び／又は３）Ge et al．（1991）により記載されているように、相互組換えを行うことによって、このような変更が、エンコードされているＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン（例えば、トキシン）の殺虫効果を示す部分の特性、詳細には殺虫性、特に抗鱗翅類性を実質的に変更するものでない限り、変更することができる。例えば、変更されたコドンを使用する本発明の人工ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又は遺伝子の一部は、上述したように、植物を形質転換するための本発明のｂＴＳ０２６１８Ａキメラ遺伝子において、天然の殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の代わりに、ある種の環境で使用することができた。また、その他の外来ＤＮＡ、詳細には、植物及びE．coli以外の微生物を形質転換するのに適当なベクターのＤＮＡと関連して、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は一部を含有するその他のＤＮＡ組換え体もまた、本発明に包含される。この点に関し、本発明は、これまで記載したｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子又はその一部を含有する特定のプラスミドに限定されるものではなく、むしろ本発明は、同等であるＤＮＡ配列を含有するいかなるＤＮＡ組換え体をも包含するものである。更に、本発明は、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の全部又は一部を含み、遺伝子の全部又は一部の発現を可能とし、微生物からの回収又は植物細胞への導入を可能とする条件下での微生物（例えば、その他のBacillus thuringiensis株、Bacillus subtili s、Pseudomonas、及びXanthomonasなどの細菌、又はStreptomyces cerevisiaeなどの酵母と関連した植物）の形質転換に適した全てのＤＮＡ組換え体に関する。実施例７：ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンをエンコードする人工ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の構築ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンのアミノ酸配列に基づき、実質的に同一のタンパク質をエンコードする人工ＤＮＡ配列をデザインした。最初に、トウモロコシ− 好ましいコドン（Murray et al.，1989）を用いて、人工ＢＴＳ０２６１８Ａトキシン遺伝子のＤＮＡ配列をデザインした。人工遺伝子のデザインの際、コドン２位及び３位におけるＴＡ及びＣＧダブレットを避けた。人工遺伝子はまた、局所的に高いＧＣ含有率（５bp以上のＧＣストレッチは避けた）についても、修正を行った。また、適当な制限部位を、遺伝子全体に取り込んだ。したがって、最終的な遺伝子は、常に最も好ましいトウモロコシコドンを使用したわけではなかった。人工遺伝子は、標準的なシアノエチルホスホルアミダイト化学を用いて、 Applied Biosystems 380B ＤＮＡシンセサイザーにより合成した。オリゴヌクレオチドは、ゲル精製し、公知の技術を用いて、全長断片で構成した。Davis et a l．（1991）の方法も参照。人工トキシン遺伝子ではまた、ＢＴＳ０２６１８Ａをコードする配列のコドン２からコドン４３が、欠失しており、コドン４４は、ＡＴＧ（開始）及びＧＣＴ（Ａｌａ）により先行されて、Joshi（1987）により提唱されているように、適当な翻訳開始条件を形成していた。人工ｂＴＳ０２６１８Ａトキシン遺伝子のＣ末端は、このＣ末端部に、適当なトウモロコシ翻訳停止条件があるために、所定の最小有毒遺伝子断片に加えて、ある種のコドンを含有していた。人工ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子を含有するキメラ遺伝子構築物を、上述したように、トウモロコシ細胞に導入する。これらの細胞より再生し、形質転換の確認されるトウモロコシ植物のほとんどは、ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の発現のため、殺虫効果を示す。ある種の選択されたトランスジェニックトウモロコシ植物を、ノーザンブロット及びサザンブロット法により分析すると、トランスジェンの安定した組込み、及び容易に検出可能なレベルのＢＴＳ０２６１８ＡｍＲＮＡの発現の存在が示される。これらの植物はまた、良好な昆虫コントロール性を示し、殺虫活性の程度は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、組織中に存在するＢｔタンパク質の量と関連している。トウモロコシが、十分なレベルで、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質を発現するように、トウモロコシを形質転換するためのいかなる公知の方法を使用して、昆虫耐性トウモロコシを開発することができると考えられる。この点に関し、昆虫における耐性の発生を予防するために、一つの植物に、ＣｒｙＩＡｂ及びＢＴＳ０２６１８Ａなどの少なくとも２種類の非競合的結合Ｂｔタンパク質を発現するのが、好ましいであろう。実施例８：ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の新規変異体のデザインＢＴＳ０２６１８Ａの、タンパク質分解性の裂開を予防するために、約６９kDトキシンである、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の新規変異体を作成した。このタンパク質のある新規変異体においては、SEQ ID No.6のアミノ酸１２３位におけるＡｒｇを、Ｌｙｓと置換した（ＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質）。別の変異体では、SEQ ID No.6における１２３位のＡｒｇを、Ａｌａと置換した（ＢＴＳ０２６１８Ａｂタンパク質）。これらのタンパク質は、プロテアーゼ処理に対しより耐性であることが認められ（つまり、本タンパク質により、約５５kDのタンパク質はまったく産生されなかった）、昆虫による評価の結果、それらの毒性が保持されていることが確認された。ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンのアミノ酸配列は、SEQ ID No.9に示す。プロテアーゼ裂開部位周辺にアミノ酸配列の変化を有するその他の例を調製すると、それはその殺虫活性は保持しながらも、プロテアーゼ活性に対してより耐性であることが認められる。また、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシン断片をエンコードする人工遺伝子をデザインした。Ｎ−及びＣ−末端の欠失、並びに１位及び２位におけるＭｅｔ及びＡｌａコドンの付加に加えて（SEQ ID No.6のＤＮＡに関し）、この遺伝子は、SEQ ID No.6の合成遺伝子とは、一つのコドンにおいて異なる：Ａｒｇコドン（ＣＧＣ）が、Ｌｙｓコドン（ＡＡＧ）と置換されていた。その他のヌクレオチドは、 SEQ ID No.6の人工ｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子と同一であった。このような変更は、適当なプリマーを用い、ｂＴＳ０２６１８Ａ人工遺伝子から出発して、ＰＣＲ−介在の突然変異誘発により行った。本質的には、ＰＣＲにより生成され、制限酵素により消化された、１２３位に突然変異コドンを有する断片を、SEQ ID No.6の消化されたｂＴＳ０２６１８Ａ遺伝子の対応する部位に挿入して、SEQ ID No.8 のＤＮＡを得た。トウモロコシ植物もまた、ｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子により形質転換し、その後、上述の操作を行う。選択したｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子を発現する形質転換トウモロコシ植物は、Ostrinia nubilalisの幼虫に殺虫効果を示す。詳細な説明中に記載したいかなる方法も、単独、又はその他のＢｔ遺伝子と併用して、形質転換トウモロコシ植物における上記のＢｔ遺伝子の発現に使用することができると考えられる。特に好ましい候補は、ＣｒｙＩＡｂタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列である。通常の操作後、所望の性質を有する適当なラインを、得られた再生物から選択することができる。実施例９：ＢＴＳ０２６１８Ａトキシンの、昆虫の腸膜への結合ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンは、ＣｒｙＩＡｂトキシンの、Ostrinia nubil alisの中腸膜小胞への結合を阻害しないことが認められた。本実験の装置においては、以下のタンパク質を用いた：ビオチン化されていないＢＴＳ０２６１８Ａのリジン突然変異株（ＢＴＳ０２６１８Ａａ）；ビオチン化されていないＣｒｙＩＡｂ；及びビオチン化された（そして、生物学的に活性である）ＣｒｙＩＡｂ。用いたいずれのＩＣＰも、トリプシン耐性トキシンであった。以下の組み合わせについて、試験を行った：ビオチン化されたＣｒｙＩＡｂ × 競合剤なし；ビオチン化されたＣｒｙＩＡｂ × １０００倍過剰のＣｒｙＩＡｂトキシン；ビオチン化されたＣｒｙＩＡｂ × １０００倍過剰のＢＴＳ０２６１８Ａａトキシン。これらの実験には、過剰量の非標識結晶タンパク質と共に、又は共に用いずに、ビオチン化されたＣｒｙＩＡｂ１０ngを、Ostrinia nubilalisの幼虫の中腸由来の刷子縁膜１０mgと混合した。これらの小胞は、Wolfersberger et al.，（19 87）による方法に従って調製した。これらの混合物は、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（８mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄、２mM ＫＨ₂ＰＯ₄、１５０mM ＮａＣｌ、pH７．４）中で作成した。本混合物を、室温で１時間インキュベートし、次に１０分間遠心分離した。ペレットを、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ５００μｌで洗浄後、ペレットを再び遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液に溶解した。試料を、１０％ポリアクリルアミドゲル上に配置した。ゲルを、室温で２時間、半乾燥ブロッティング装置で、ブロットした（LKB Novablot；使用したブロッティング緩衝液は、次の通りである：３９mM グリシン、４８mMトリス、０．０３７５％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム、２０％メタノール）。膜を、０．１％ＢＳＡを有するＴＢＳ（１０mM トリス、１５０mM ＮａＣｌ、pH７．６）中で少なくとも２時間ブロックし、その後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ抱合体と共にインキュベートし、ＴＢＳ−０．１％ＢＳＡにより、４５分間、1/1000に希釈した。膜を、ＴＢＳ−０．２％Tween ２０により、４回それぞれ５分間、更に１５分間かけて１回洗浄した。洗浄の工程の間に、ブロットを、流水下に完全に洗浄した。膜を、ＥＣＬ試薬（Amersham）中１分間インキュベートし、次にＸ線フィルムに暴露した。ビオチン化されたＣｒｙＩＡｂについては、結合したトキシンに対するバンドが、Ｘ線フィルム上に観察された。ビオチン化されたＣｒｙＩＡｂトキシンを、過剰量のＣｒｙＩＡｂトキシンの存在下でインキュベートしたところ、フィルム上に、バンドは観察されなかった：予想されたように、過剰量の非標識トキシンが、標識されたトキシンと置き換わってしまったのである。過剰量のＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンの存在下におけるビオチン化されたＣｒｙＩＡｂトキシンについては、結合したビオチン化されたＣｒｙＩＡｂと対応するバンドが見られた：非標識ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンは、小胞に対する結合について、ＣｒｙＩＡｂと競合することができないのは明らかであり、Ostrinia nubilalisにおいては、ＢＴＳ０２６１８Ａａが、ＣｒｙＩＡｂとは別の受容体と結合することが示された。同様な装置において、非標識ＣｒｙＩＡｂトキシンは、ビオチンにより標識され、生物学的に活性であるＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンの受容体に対して競合しなかったが、過剰量の非標識ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンについては、このような競合が観察された。したがって、ＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質は、Ostriniaの中腸膜における異なる受容体部位を認識するため、例えば、植物にＣｒｙＩＡｂ及びＢＴＳ０２６１８Ａトキシンを発現させることによって、昆虫の耐性の発生を遅延させる、又は予防するため、或いはＣｒｙＩａｂトキシンに対して耐性である昆虫を駆除するために使用することができる。両方のトキシンとも、主要害虫の群に高度に有効であり、異なる受容体分子を明らかに認識するため、トウモロコシ及び野菜などのトランスジェニック植物においてこれらを使用することによって、補助的な効果が得られる。トウモロコシ植物は、いずれかのトキシンを発現する植物と交雑させる当業界において実施可能な方法又はヨーロッパ特許公開408 403記載の方法により、ＣｒｙＩＡｂ及びｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子により形質転換することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/325 8517−4ＨＣ０７Ｋ 14/325 Ｃ１２Ｎ 5/10 9452−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 9281−4Ｂ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファン・アウデンホーフェ，カトリエンベルギー国、ベー―9000 ヘント、カプレイケストラート 29 (72)発明者ペフェロエン，マルニクスベルギー国、ベー―9000 ヘント、ベルナルド・スパエラーン 97 (72)発明者ファン・リー，イェルーンベルギー国、ベー―9900 エークロ、フラヴィン・ヨハンナラーン 10 (72)発明者ファン・アールセン，ルールベルギー国、ベー―9000 ヘント、ズバイナールツエステンウェフ 35 【要約の続き】るための殺虫組成物に活性成分として用いることができる。

Claims

【特許請求の範囲】１．ＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン又はその殺虫効果を示す部分を含むＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質の変異体であって、該プロトキシン又は該その殺虫効果を示す部分は、アミノ酸配列が変更され、そのために該変異体はプロテアーゼに更に耐性にされ、それによって該変異体がプロテアーゼ処理に対して実質的に殺虫活性を保持している変異体。２．該プロトキシンの殺虫効果を示す部分が、約６９kDのトキシンである、請求項１記載の変異体。３．該変異体が、ＢＴＳ０２６１８Ａａプロトキシン又はＢＴＳ０２６１８Ａｂプロトキシンである、請求項１記載の変異体。４．該トキシンが、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシン又はＢＴＳ０２６１８Ａｂトキシンである、請求項２記載の変異体。５．請求項１記載の変異体又はＢＴＳ０２６１８ＡａトキシンもしくはＢＴＳ０２６１８ＡｂトキシンをエンコードしているＤＮＡ配列。６．ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンが、SEQ ID No.8で示される、請求項５記載のＤＮＡ配列。７．ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンの遺伝子及び選択できる標識遺伝子をエンコードしているＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子。８．選択できる標識遺伝子がneo遺伝子であり、該ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシンの遺伝子をエンコードしているＤＮＡ配列がSEQ ID No.8で示される、請求項７記載のキメラ遺伝子。９．ＢＴＳ０２６１８ＡトキシンをエンコードしているSEQ ID No.6のＤＮＡ配列。１０．SEQ ID No.9で示されるアミノ酸配列を有するＢＴＳ０２６１８Ａａトキシン。１１．鱗翅類の昆虫に対する殺虫組成物であって、よりプロテアーゼ耐性であるＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシン、よりプロテアーゼ耐性であるＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンの殺虫効果を示す変異体、ＢＴＳ０２６１８Ａａプロトキシン、殺虫効果を示すＢＴＳ０２６１８Ａａプロトキシンの部分、ＢＴＳ０２６１８Ａａトキシン及びそれらの変異体からなる群から選ばれる活性成分を含む殺虫組成物。１２．該鱗翅類の昆虫が、アグロチス属（Agrotis）の種、スポドプテラ属（Spo doptera ）の種、プルテラ属（Plutella）の種、マメストラ属（Mamestra）の種、ヘリオチス属（Heliothis）の種、フトリメーア属（Phthorimaea）の種及びオストリニア属（Ostrinia）の種である、請求項１１記載の殺虫組成物。１３．よりプロテアーゼ耐性であるＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質もしくはＢＴＳ０２６１８ＡａプロトキシンもしくはＢＴＳ０２６１８Ａａトキシン、又はそれらの殺虫効果を示す変異体をエンコードしているＤＮＡ配列を含む形質転換された微生物。１４．該微生物がバチルス・チュリンゲンシス（B.thuringiensis）である、請求項１３記載の形質転換された微生物。１５．よりプロテアーゼ耐性であるＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列、又は殺虫効果を示すｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子部分、もしくはトランケートされたｂＴＳ０２６１８Ａａ遺伝子もしくはｂＴＳ０２６１８Ａａキメラ遺伝子、又はそれらのハイブリッド及び選択できる標識遺伝子を含む形質転換された植物細胞。１６．該植物がトウモロコシである、請求項１５記載の形質転換された植物。１７．該選択できる標識遺伝子が、neo遺伝子である、請求項１５又は１６記載の形質転換された植物細胞。１８．請求項１５又は１６記載の複数の植物細胞を含む植物又はその種子。１９．請求項５ないし１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列の１つがそれに組み込まれて含む、植物ゲノム。２０．該細胞が、請求項１８記載の植物ゲノムを有する植物組織。２１．植物を鱗翅類の昆虫に耐性にさせる方法であって、請求項１９記載の植物ゲノムを植物に付与させることを含む方法。２２．該鱗翅類の昆虫が、スポドプテラ属の種及びアグロチス属の種のようなヤガ科（Noctuidae）、オストリニア・ヌビラリス（O.nubilalis）のようなメイガ科（Pyralidae）、フトリメーア・オペルキュレラ（Phthorimaea operculella）のようなキバガ科（Gelechiidae）、ならびにプルテラ・キシロステラ（Plutell a xylostella）のようなスガ科（Yponomeutidae）である請求項２１記載の方法。２３．該植物のゲノム中に安定的に組み込まれ、昆虫に有毒なタンパク質の形態でその中で発現させることができる、非相同遺伝物質を含む植物及び該植物の繁殖物質を生産する方法であって、（ａ）該タンパク質を発現しない植物細胞又は植物組織から出発して、該非相同遺伝物質を含む形質転換された植物細胞又は植物組織を生産し；（ｂ）該非相同遺伝物質を含む該形質転換された植物細胞又は該植物組織から、再生された植物又は該植物の繁殖物質又はその両者を生産し；そして（ｃ）該再生された植物又は該植物の繁殖物質又はその両者を生物学的に複製する非生物学的工程を含み、該非相同遺伝物質を含む該形質転換された該植物細胞又は植物組織を生産する該工程が、よりプロテアーゼ耐性であるＢＴＳ０２６１８Ａタンパク質、ＢＴＳ０２６１８Ａａプロトキシン又はその殺虫効果を示す部分をエンコードしているＤＮＡ配列、及び該植物細胞又は植物組織での該ＤＮＡ配列の発現を可能にする調節要素を用いて、該出発植物細胞又は植物組織を形質転換し、形質転換された植物細胞又は植物組織におけるばかりでなく、何世代もの間にそれらから生産される該植物及び繁殖物質における遺伝子部分、又はトランケートされた遺伝子もしくはハイブリッドの安定的な組み込みを可能にすることを含む方法。２４．鱗翅類の害虫を防除する方法であって、該害虫をよりプロテアーゼ耐性であるＢＴＳ０２６１８Ａプロトキシンもしくはその殺虫効果を示す部分もしくはＢＴＳ０２６１８ＡａプロトキシンもしくはＢＴＳ０２６１８Ａａトキシン、又は請求項１１記載の殺虫組成物に接触させる段階を含む方法。２５．鱗翅類の昆虫が、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）、アグロチス・セゲタム（Agrotis segetum）、スポドプテラ・エキシグア（Spodoptera exigua ）、スポドプテラ・リットラリス（Spodoptera littoralis）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、マメストラ・ブラシカ（Mames tra brassica）、ヘリオチス・ビレスセンス（Heliothis virescens）、オストリニア・ヌビラリス、フトリメーア・オペルキュレラ及びプルテラ・キシロステラを包含する、請求項２４記載の方法。２６．バチルス・チュリンゲンシスの改良された結晶タンパク質であって、少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は置換によって、少なくとも１つの内部プロテアーゼの裂開部位が不活化される結果、該タンパク質の殺虫活性、及びそのようなタンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列がプロテアーゼ裂開の際に実質的に維持されている結晶タンパク質。２７．該タンパク質が、ＢＴＳ０２６１８Ａａタンパク質又はＢＴＳ０２６１８Ａｂタンパク質である、請求項２６記載の改良されたバチルス・チュリンゲンシスの結晶タンパク質。２８．アグロチス・セゲタム又はフトリメーア・オペルキュレラを防除する方法であって、該害虫を、ＢＴＳ０２６１８ＡプロトキシンもしくはＢＴＳ０２６１８Ａトキシンもしくはそれらの変異体もしくはＢＴＳ０２６１８ＡａプロトキシンもしくはＢＴＳ０２６１８Ａｂプロトキシン、又はその殺虫効果を示す部分と接触させる段階を含む方法。２９．SEQ ID No.9のＢＴＳ０２６１８ＡａトキシンをエンコードしているＤＮＡ配列、ならびにＣｒｙＩＡｂトキシンをエンコードしているＤＮＡ配列及び／又はＣｒｙＩＢトキシンをエンコードしているＤＮＡ配列を発現する植物。３０．該植物がトウモロコシである、請求項２９記載の植物。