FR2643646A1 - Expression de sequences de nucleotides codant pour des vesicules a gaz - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des cellules recombinantes différentes de E.coli comprenant au moins une séquence de nucléotides correspondant à une protéine GV de structure d'une vésicule à gaz ou d'un variant de cette séquence ayant conservé sa capacité de synthèse de ladite protéine GV. Ces cellules recombinantes permettent l'expression de ladite séquence de nucléotides dans des conditions permettant d'améliorer les propriétés de flottaison des cellules transformées. L'invention concerne aussi un vecteur recombinant contenant les séquences ci-dessus et un procédé de transformation de cellules.
Description
EXPRESSION DE SEQUENCES DE NUCLEOTIDES CODANT POUR DES
VESICULES A GAZ.
VESICULES A GAZ.
La présente invention concerne l'expression de séquences de nucléotides codant pour des vésicules à gaz.
L'invention vise à cet effet des cellules recombinantes transformées génétiquement par l'insertion d'une ou plusieurs séquence(s) de nucléotides responsables de la formation des protéines de structure de vésicules à gaz (GV), ou impliquées dans leur élaboration, leur composition ou leur fonctionnement.
L'invention vise également des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression, susceptibles de contenir des insérats formés par les susdites séquences, éventuellement placés sous le contrôle d'éléments de régulation pourvus d'un ou plusieurs promoteur(s) compatible(s) avec l'expression du ou des gènes de l'insérat dans les cellules utilisées comme hôte.
On a déjà mis en évidence la présence de vésicules à gaz chez différents microorganismes procaryotes aquatiques notamment chez des bactéries du type Archaebactéries ou Cyanobactéries.
Ces vésicules à gaz constituent des inclusions cellulaires spécifiques, capables de conférer aux cellules, chez lesquelles elles sont produites naturellement, des propriétés de flottaison ou à tout le moins une diminution de leur capacité à sédimenter en milieu aquatique, (cette propriété est parfois qualifiée par le terme "allégement" dans la suite).
Ces vésicules à gaz (également désignées par GV) comportent une enveloppe de protéines sous forme d'une couche moléculaire, elles sont imperméables ê l'eau, mais perméables aux gaz. Leur protéine de structure peut résulter de l'expression d'un gène appartenant à une famille multigénique. Cette famille peut par exemple être définie par référence à des observations faites chez des bactéries de la famille des
Cyanobactéries. En particulier on a identifié chez une
Cyanobactérie, Calothrix, PCC n 7601, @ un gène de structure des vésicules à gaz désigné par gvpA (ou parfois gvpA1). Ce gêne a été cloné, séquence, puis analysé.La description de la souche Calothrix cidessus est donnée dans la publication de Tandeau de
Marsac et al (1985-Nucl.Acids Res. 13:7223-7236) dont le contenu doit être incorporé à la présente demande.
Cyanobactéries. En particulier on a identifié chez une
Cyanobactérie, Calothrix, PCC n 7601, @ un gène de structure des vésicules à gaz désigné par gvpA (ou parfois gvpA1). Ce gêne a été cloné, séquence, puis analysé.La description de la souche Calothrix cidessus est donnée dans la publication de Tandeau de
Marsac et al (1985-Nucl.Acids Res. 13:7223-7236) dont le contenu doit être incorporé à la présente demande.
Des analyses ultérieures ont permis d'identifier un autre gène nommé gvpB (ou gvpA2) conduisant à l'expression d'une protéine identique (Damerval et al ; Gene, 54 (1987)83-92). Un gène désigné par gvpD a par ailleurs été identifié, dont le produit est voisin (identité d'environ 83%) de la protéine GVPa.
Un autre gène gvpC, codant pour un produit différent des précédents, a pu être détecté et caractérisé. Un représentant de ce gène formant un opéron avec gvDA et ovPB (opéron gvt > ABC) a été décrit dans la publication de Damerval et al. (Gene 54) mentionnée ci-dessus. Un autre représentant de ce gène a été décrit par Hayes et al dans (Molecular
Microbiology (1988) 2(5) 545-552).
Microbiology (1988) 2(5) 545-552).
Les études effectuées jusqu'alors révélaient la présence de plusieurs gènes associés, chez certaines bactéries productrices de vésicules à gaz et conduisaient à penser que le mécanismè de formation des vésicules à gaz pouvait être complexe.
Les inventeurs ont maintenant mis au point des moyens permettant d'obtenir l'expression des séquences codant pour les protéines de structure des vésicules à gaz (protéines GV) chez différentes cellules jouant le rôle de cellules hôte.
L'invention concerne à cet égard des cellules recombinantes . différentes de E.coli, génétiquement transformées, caractérisées en ce qu'elles comprennent parmi le matériel génétique qui se réplique avec elles au cours des générations successives, au moins une séquence de nucléotides hétérologue ' vis-å-vis de la cellule hôte, correspondant à tout ou partie de la séquence en acides aminés d'une protéine GV de structure d'une vésicule à gaz, placée sous le contrôle d'éléments de régulation permettant l'expression de ladite séquence de nucléotides et la production de vésicules à gaz améliorant les propriétés de flottaison des cellules.
La séquence de nucléotides introduite peut également être constituée par une variante de la précédente, modifiée au niveau de certains nucléotides, dès lors qu'elle permet la synthèse de vésicules à gaz ayant les propriétés ci-dessus.
La séquence de nucléotides introduite dans les cellules, encore appelée insérat, peut être obtenue à partir d'organismes ayant la propriété de synthétiser naturellement la(les) protéine(s) de structure des vésicules à gaz. On peut, par exemple, avoir recours à la séquence de nucléotides correspondant à la protéine
GV présente chez des Cyanobactéries ou chez des
Archaebactéries. Ces séquences de nucléotides pourront être obtenues à l'aide de sondes d'hybridation telles que celles décrites par Damerval et al. (Gene, 54 (1987) 83-92) ou encore par synthèse chimique, par exemple par la méthode de synthèse automatisée en phase solide décrite par Barone A.D et al. (Nucleic
Acids Research 12, 4051-4060 (1984)).
GV présente chez des Cyanobactéries ou chez des
Archaebactéries. Ces séquences de nucléotides pourront être obtenues à l'aide de sondes d'hybridation telles que celles décrites par Damerval et al. (Gene, 54 (1987) 83-92) ou encore par synthèse chimique, par exemple par la méthode de synthèse automatisée en phase solide décrite par Barone A.D et al. (Nucleic
Acids Research 12, 4051-4060 (1984)).
L'invention vise en particulier des cellules recombinantes répondant à la définition précédente, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence de nucléotides issue de la séquence codante du gène gvpA.
La séquence du gène gvpA peut, par exemle, être obtenue grâce à l'utilisation d'une sonde qvDA correspondant à un fragment HincII-HindIII de 237pb contenant 186pb du gène qvpA de Calothrix 7601 et 51pb de la région terminale de la séquence en aval de ce gène. Cette sonde est décrite -dans l'article de
Tandeau de Marsac et al (-1985 Nucl.Acids Res.13:7223-7236).
Tandeau de Marsac et al (-1985 Nucl.Acids Res.13:7223-7236).
L'invention concerne aussi des cellules recombinantes transformées par un variant de la séquence codante du gène qvDA, constitué par une séquence d'origine choisie modifiée au niveau de certains nucléotides, soit par remplacement de nucléotides, soit par délétion ou introduction de nucléotides, à condition que ces modifications n' entraînent pas la perte des propriétés fonctionnelles de la séquence d'origine, à savoir sa capacité à synthétiser des protéines GV de structure des vésicules à gaz.
D'autres modifications réalisées peuvent consister en l'adjonction à la séquence codante choisie de séquence(s) nucléotidique(s) indirectement impliquées dans la formation des vésicules à gaz ou dont l'expression conjointement à celle des séquences codant pour les vésicules à gaz, est recherchée.
De façon avantageuse, on associera dans un acide nucléique recombinant, la séquence codante des vésicules à gaz choisie à un gène ou à une séquence codant pour un produit dont l'expression est recherchée, notamment une protéine déterminée, par exemple l'interleukine.
L'invention concerne à cet effet une séquence de nucléotides recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend en combinaison la séquence codante de la protéine GV telle que décrite ci-dessus, et au moins un gène ou une séquence de nucléotides codant pour une protéine déterminée, notamment l'interleukine.
Des insérats particuliers adaptés à la transformation de cellules déterminées, répondant aux définitions précédentes, sont par exemple constitués par l'association en tandem des séquences de nucléotides décrites dans les pages précédentes.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence codante du gène ovPA est issue du gène gvpA de Cyanobactéries, notamment de la souche Pseudanabaena, PCC nO 6901 (Pseudanabaena 6901).
Dans un autre mode de réalisation de l'invention l'insérat est issu du gène gvpA d'Archaebactéries notamment d'Halobactéries.
On pourra également faire appel à des bactéries telles que Microcvstis, Oscillatoria, Nostoc ou d'autres bactéries pour la préparation de la séquence codante adaptée à la transformation de cellules choisies.
L'invention vise également des cellules recombinantes comprenant un enchaînement de nucléotides distinct supplémentaire correspondant à tout ou partie d'un gène susceptible de participer à la formation des vésicules à gaz, éventuellement sous le contrôle d'une séquence de régulation compatible avec l'expression dans la cellule.
Cet enchaînement de nucléotides distinct supplémentaire peut consister en une séquence codant directement ou indirectement pour la formation d'un produit ayant un rôle dans la régulation de la production des vésicules à gaz. Cet enchaînement distinct peut également consister en une séquence codant pour un facteur d'accroissement de la solidité des vésicules à gaz ou d'amélioration de l'assemblage des protéines de structure des vésicules à gaz dans une conformation fonctionnelle.
Cet enchaînement de nucléotides distinct peut par exemple être issu du gène qvC présent chez plusieurs bactéries de la famille des Cyanobactéries ou de tout gène fonctionnellement analogue à pvDC et présent chez d'autres bactéries ou organismes. Les mêmes moyens que ceux précédemment définis pourront être mis en oeuvre pour l'obtention de ce gène ou ces gênes. Le gène gvpC pourra être obtenu chez différentes bactéries à l'aide d'une sonde correspondant à un fragment EcoRI-EcoRI de 263pb situé à l'intérieur du gène gvnC de Calothrix 7601. Cette sonde a été décrite dans la publication de
Damerval et al (1987 Gene 54:83-92).
Damerval et al (1987 Gene 54:83-92).
Les cellules recombinantes peuvent, dans ce cas, contenir le gène ovD: décrit ci-dessus ou sa séquence codante, éventuellement placée sous le contrôle d'une séquence de régulation contenant au moins un promoteur.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les cellules recombinantes résultent de la transformation de bactéries appartenant à la famille des Bacillacées. De manière avantageuse, des cellules recombinantes répondant aux définitions de l'invention sont celles de Bacillus thuringiensis (Bt) notamment Bacillus thurinsiensis israelensis (BtiX, de
Bacillus sDhaericus ou d'autres bactéries présentes en milieu aquatique et ayant des propriétés biologiques intéressantes telles que par exemple une activité larvicide.
Bacillus sDhaericus ou d'autres bactéries présentes en milieu aquatique et ayant des propriétés biologiques intéressantes telles que par exemple une activité larvicide.
Des Bacillacées particulièrement intéressantes dans le cadre de la réalisation de l'invention sont par exemple des bactéries sporulantes à tout le moins capables d'effectuer les premiers stades de sporulation, nécessaires à la -production de cristaux contenant les toxines larvicides de la bactérie choisie. Ces bactéries peuvent aussi être des bactéries asporogènes bloquées au stade II de la sporulation, capables de synthétiser les toxines larvicides et permettant l'expression de la séquence codant pour la protéine GV. Dans ces conditions, la séquence codant pour la protéine GV est placée sous le contrôle d'un promoteur végétatif compatible avec l'expression de la séquence dans la bactérie.
Les Bacillacées ainsi transformées permettent de remédier au problème lié à l'absence de persistance de ces bactéries larvicides natives dans les gîtes larvaires, due à leur trop grande capacité de sédimentation.
Des bactéries Bti transformées particulièrement avantageuses pour la réalisation de l'invention sont les clones 4Q2-72/pPGVA28.
D'autres Bacillacées transformées sont les bactéries B.sDhaericus rendues capables de synthétiser des protéines GV. De façon avantageuse, ces bactéries transformées synthétisent la protéine GV dans l'exosporium contenant la spore et les cristaux larvicides notamment ceux des cristaux naturellement produits par B.sphaericus.
D'autres bactéries avantageusement transformées sont les Cyanobactéries, notamment les Cyanobactéries naturellement dépourvues de la protéine GV ou tous organismes ayant un intérêt économique en milieu aqueux ou aquatique tels que par exemple ceux qui dégradent les déchets organiques, ceux qui produisent des substances d'intérêt médical ou agronomique.
D'autres cellules recombinantes susceptibles d'être transformées sont par exemple les baculovirus tels que décrits dans la demande EP.273.366 ou l'article de Journal of VirologyNov.87 p3617-3620).
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention les cellules recombinantes sont des cellules eucaryotes animales ou végétales transformées par les séquences définies plus haut.
A titre d'exemple des cellules eucaryotes intéressantes sont des c llules de levures.
D'autres cellules recombinantes sont par exemple des cellules de mammifères, d'insectes, de plantes, d'algues.
Pour obtenir l'expression des séquences de nucléotides insérées dans les cellules ci-dessus décrites, des séquences dé régulation reconnues par les polymérases de l'hôte cellulaire, sont placées en amont des séquences codantes. D'autres séquences avantageuses peuvent être placées en amont ou en aval, lorsqu'elles sont susceptibles de moduler l'expression des gènes portés par l'insérat.
A titre d'exemple, lorsque les cellules recombinantes sont des bactéries, on peut utiliser des séquences régulatrices comprenant les promoteurs spac, le promoteur du gène sacB de B.subtilis ou le bactériophage T5 ou le promoteur tac utilisable chez diverses bactéries.
Lorsque les cellules recombinantes sont des cellules eucaryotes, les systèmes de régulation utilisables sont par exemple les promoteurs d'origine virale (par exemple SV40) ou bactérienne < Aqrobactérium tumefaciens) ou toute séquence capable de moduler l'expression du ou des gènes porté(s) par l'insérat.
L'invention concerne également un vecteur recombinant' comprenant au moins une séquence de nucléotides correspondant à la séquence en acides aminés d'une protéine de structure GV des vésicules à gaz, ladite séquence de nucléotides étant placée sous le contrôle d'au moins une séquence de régulation comprenant un promoteur compatible avec son expression dans une cellule déterminée, à un temps déterminé.
Les vecteurs selon l'invention sont élaborés à partir de l'insertion de séquences de nucléotides répondant aux définitions données dans les pages précédentes. Ils sont adaptés à l'expression des séquences de nucléotides précédentes dans les cellules décrites ci-dessus.
Des vecteurs particulièrement avantageux pour la réalisation de l'invention -sont par exemple des vecteurs multifonctionnels capables de s'exprimer chez plusieurs types de cellules hôte.
Un vecteur recombinant satisfaisant les critères ci-dessus est, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, caractérisé en ce que une partie de la séquence de nucléotides qu'il comporte est obtenue à partir du gène qvt > A d'une bactérie de la famille des
Cyanobactéries ou des Archaebactéries.
Cyanobactéries ou des Archaebactéries.
Les définitions données plus haut, qui. concernent les séquences transformantes des cellules recombinantes selon l'invention, sont applicables à la construction des vecteurs ci-dessus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur recombinant est caractérisé en ce que la séquence de nucléotides est associée à un enchaînement de nucléotides distinct, répondant aux critères donnés dans les pages précédentes éventuellement placé sous le contrôle d'un promoteur dont le produit d'expression est capable de participer à la formation des vésicules à gaz.
Un vecteur particulièrement avantageux est le vecteur plasmidique pPGVA28 qui fait l'objet des exemples qui suivent. pPGVA28 résulte de l'association d'un fragment purifié EcoRV-HaeIII isolé du plasmide pCB4 contenant la région promotrice de la protéine p28 (poids moléculaire de 28Kda) de Bti d'une part et du fragment StvI-BamHI issu de pPM103 contenant le gêne gvpA de Pseudanabaena. Ce plasmide est représenté à la figure 2.
Le plasmide pPM103 a fait l'objet d'un dépôt à la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'institut Pasteur de Paris, le 17 Février 1989 sous le numéro I-835t
L'invention concerne également un vecteur contenant un acide nucléique recombinant comprenant la séquence codante des vésicules à gaz choisie, associée à un gène ou à une séquence codant pour une protéine déterminée.
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'institut Pasteur de Paris, le 17 Février 1989 sous le numéro I-835t
L'invention concerne également un vecteur contenant un acide nucléique recombinant comprenant la séquence codante des vésicules à gaz choisie, associée à un gène ou à une séquence codant pour une protéine déterminée.
Entrent également dans le cadre de l'invention les produits constitués par l'association des vésicules à gaz formées dans les cellules recombinantes, avec des produits de synthèse propres à ces cellules recombinantes.
De tels produits d'association peuvent être sous forme d'inclusions cellulaires ou au contraire peuvent être excrétés dans le milieu extérieur à la cellule.
L'invention concerne en outre des compositions comprenant des cellules recombinantes selon l'invention.
De telles compositions comprennent par exemple des bactéries recombinantes Bti, ayant une activité larvicide, notamment vis-à-vis des larves de Diptères.
Ces compositions peuvent être présentées sous forme de poudre, de suspensions, de briquettes en vue de leur administration en milieu aquatique.
D'autres compositions selon l'invention comprennent des cellules eucaryotes du type de celles données plus haut, notamment des levures. Ces cellules sont avantageusement utilisables pour la réalisation de culture en masse. Elles permettent en effet de diminuer les problèmes de sédimentation des cellules dans les réacteurs.
L'invention vise aussi des compositions comprenant des produits d'association avec les vésicules à gaz formées ainsi que de produits dont la synthèse est obtenue simultanément dans les cellules recombinantes, décrits ci-dessus.
L'invention vise également un procédé de transformation de cellules, pour la production de vésicules à gaz, comprenant les étapes suivantes - mise en contact d'un vecteur recombinant défini plus haut, avec des cellules déterminées compatibles avec l'expression de la séquence de nucléotides contenue dans le vecteur, dans des conditions permettant la transformation desdites cellules par le vecteur recombinant, - sélection et récupération des bactéries recombinantes formées, par tout moyen physique ou chimique approprié.
Le transfert d'ADN dans les cellules peut être réalisé par diverses techniques telles que la conjugaison, la transformation, l'électroporation, par exemple selon des techniques telles que celles décrites par Luchansky et al. (1988 Mol.Microbiol., 2:637-646) la transfection ou l'infection virale.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont illustrés par les exemples qui suivent et dans les figures.
La figure 1 représente le gène gvpA de la souche
Pseudanabaena 6901.
Pseudanabaena 6901.
La figure 2 représente les plasmides pBU4, pPGVA et pPGVA28.
La figure 3 représente les résultats de 1'expression du gène ovDA chez B.thurinaiensis israelensis, avec les indications suivantes
A et B : Marqueurs de taille 1 et 2 : Bti souche 4 Q2 81 / pPGVA28 3 : Bti souche 4Q2-81 / pPGVA 4 : Bti souche 4Q2-81 / pBU4.
A et B : Marqueurs de taille 1 et 2 : Bti souche 4 Q2 81 / pPGVA28 3 : Bti souche 4Q2-81 / pPGVA 4 : Bti souche 4Q2-81 / pBU4.
La figure 4 représente le plasmide pPM103 comprenant le vecteur pTZ 18 R (Pharmacia - réf.27-4984-01) 2,871 kb,clonage aux sites EcoRI et Batik et un insert constitué par un fragment 0,73 kb portant gvpA de Pseudanabaena 6901.
EXEMPLE 1
ISOLEMENT DE L'ADN DES GENES gvpA et qvDC CHEZ
DIFFERENTES SOUCHES DE CYANOBACTERIES.
ISOLEMENT DE L'ADN DES GENES gvpA et qvDC CHEZ
DIFFERENTES SOUCHES DE CYANOBACTERIES.
1/ Souches de Cvanobactéries et conditions de cultures.
Toutes les souches de Cyanobactéries utilisées dans cet exemple sont issues d'une Collection de
Cultures de l'institut Pasteur (PCC) et sont désignées dans la suite par leur nom suivi de leur numéro de collection.
Cultures de l'institut Pasteur (PCC) et sont désignées dans la suite par leur nom suivi de leur numéro de collection.
Les souches et les milieux de culture utilisés sont donnés dans le tableau I, dans lequel les lettres (a) à (g) ont la signification suivante (a) Désignation des souches conformément à Rippka et al (1979, J. Gen. Microbiol. 111 : 1-61) (b) Numéro de dépôt donné par la PCC (c) Les compositions des milieux sont données dans l'article de Rippka et al. précité l:BG11 ; 2:BG11 sans NaNO3 ; 3:BG11 complété avec 3mM de Na:COa ; 4:ASNIII.
(d) U:souche unicellulaire, F:souche filamenteuse,
FH : souche hétérocystée filamenteuse.
FH : souche hétérocystée filamenteuse.
(e) La capacité à former des hormogonies est donnée conformément à ce qui est indiqué dans l'article de
Rippka et al ci-dessus.
Rippka et al ci-dessus.
(f) -:pas de vésicule à gaz ; +:vésicules à gaz polaires ; ++:vésicules à gaz abondantes.
Dans les souches formant des hormogonies, les vésicules à gaz sont formées uniquement pendant la différenciation des hormogonies.
les nombres entre parenthèses indiquent le nombre de gènes, déduit des expériences de Southern après hybridation avec une sonde avDA de Calothrix (1+: un gène ou deux copies adjacentes).
Les cultures ont été placées dans 40ml d'un milieu choisi conformément à ce qui précède à 250C, sans agitation, sous une lumière -blanche, fluorescente, de lOuEm-2s-t. Lorsque c'était nécessaire, 2 litres de culture ont été placés dans le milieu approprié avec 0,2gl-Na2CO3 sous agitation continue et gazés par un mélange constitué par 1%CO2/99% air, sous une lumière de 50uEm-2s-1.
2/ Extraction de 1'ADN.
L'ADN chromosomique a été purifié de la façon suivante -les cellules (2-3g-, masse de matière fraiche ) ont été resuspendues dans 5ml de saccharose 10% (p/vol)/50mM Tris-HCl pH8/100mM Na : EDTA pH8. Du lysozyme (lOmg/ml, concentration finale) a été ajouté et la suspension a été incubée pendant 1 heure à 370C. Après addition de sarkosyl (2%p/vol, concentration finale) et incubation pendant 45mn à 500C, le lysat a été traité avec de la protéinase K (lOOug/ml) pendant 30mn à 37 C. La suspension a été soumise deux fois à extraction avec un même volume de phénol et une fois avec un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique 50/48/2 (vol/vol/vol). Le volume de la phase aqueuse a été ajusté à 9ml et 9g de chlorure de cesium et 0,2ml de bromure d'éthidium (IOmg/ml) ont été ajoutés.Ce mélange a été clarifié par centrifugation à 12.000g pendant lOmn à 40C. Les agrégats présents dans le haut du tube ont été éliminés et le surnageant a été soumis à centrifugation, à 140.000g, pendant 24h à 150C. Tous les produits chimiques étaient des réactifs conventionnels.
3/ Analyses par hybridation (Southern)
Des enzymes de restriction EcoRI, HindIII,
HincII, fournies soit par Boehringer (F-38242,
Meylan), Genofit (CH-1212, Genêve) ou Amersham (F-91943, Les Ulis) ont été utilisées conformément aux instructions du fabricant. L'ADN obtenu après hydrolyse par ces enzymes a subi une électrophorèse en gels d'agarose 0f7%-(p/v), dans un tampon Tris-borate comme décrit dans le manuel de Maniatis et al. (1982molecular cloning : Laboratory Manuel Cold Spring
Harbor Laboratory), dénaturé et transféré sur des filtres de nitrocellulose (Southern 1975 J.Mol Biol, 98:503-517).Des expériences de préhybridation et d'hybridation ont été réalisés ê 500C ou 60 C dans une solution contenant 0,95M de sels de sodium comme décrit par Tandeau de Marsac et al. (1985, Nucl.Acids.Res.13:7223-7236). Les filtres ont été lavés à température ambiante dans une solution contenant des sels de sodium (0,95M) avant fluoroautoradiographie.
Des enzymes de restriction EcoRI, HindIII,
HincII, fournies soit par Boehringer (F-38242,
Meylan), Genofit (CH-1212, Genêve) ou Amersham (F-91943, Les Ulis) ont été utilisées conformément aux instructions du fabricant. L'ADN obtenu après hydrolyse par ces enzymes a subi une électrophorèse en gels d'agarose 0f7%-(p/v), dans un tampon Tris-borate comme décrit dans le manuel de Maniatis et al. (1982molecular cloning : Laboratory Manuel Cold Spring
Harbor Laboratory), dénaturé et transféré sur des filtres de nitrocellulose (Southern 1975 J.Mol Biol, 98:503-517).Des expériences de préhybridation et d'hybridation ont été réalisés ê 500C ou 60 C dans une solution contenant 0,95M de sels de sodium comme décrit par Tandeau de Marsac et al. (1985, Nucl.Acids.Res.13:7223-7236). Les filtres ont été lavés à température ambiante dans une solution contenant des sels de sodium (0,95M) avant fluoroautoradiographie.
Une sonde avDA, correspondant à un fragment Hincii-Hindiii d'une longueur de 237 paires de bases (237bp), contenant 186bp du gène aval de Calothrix 7601 et 51bp de la région en aval a été utilisée (voir l'article de Tandeau de Marsac et al. précité). Une sonde avec était constituée par un fragment
EcoRI-EcoRI de 263pb interne au gène correspondant de
Calothrix 7601 (Damerval et al 1987, Gene 54 : 83-92).
EcoRI-EcoRI de 263pb interne au gène correspondant de
Calothrix 7601 (Damerval et al 1987, Gene 54 : 83-92).
Les fragments d'ADN ont été purifiés par électrophorèse à bas point de fusion sur agarose selon la méthode decrite par Maniatis (1982,Molecular
Cloning Laboratory Manuel Cold Spring Harbor
Laboratory). Ces fragments d'ADN ont été marqués au phosphore 32 en utilisant un kit de déplacement de coupure et du [aa2PjdCTP obtenu chez Amersham. Avant la réhybridation, les filtres ont été déshybridés en utilisant la technique SSPE/SDS décrite par Meinkoth et al. (Anal. Biochem.138:267-284) et l'absence de sondes d'ADN restantes a été vérifiée par fluoroautoradiographie avant la réutilisation des filtres.
Cloning Laboratory Manuel Cold Spring Harbor
Laboratory). Ces fragments d'ADN ont été marqués au phosphore 32 en utilisant un kit de déplacement de coupure et du [aa2PjdCTP obtenu chez Amersham. Avant la réhybridation, les filtres ont été déshybridés en utilisant la technique SSPE/SDS décrite par Meinkoth et al. (Anal. Biochem.138:267-284) et l'absence de sondes d'ADN restantes a été vérifiée par fluoroautoradiographie avant la réutilisation des filtres.
RESULTATS
Parmi les 30 souches testées, 20 d'entre-elles permettent la production de vésicules à gaz Microcystis 7806GV+ et 7820, Oscillatoria 6412 et 6506, toutes les souches Pseudanabaena, Nostoc 6705, 6719, 6720, 73102 et 8009, les souches Calothrix 7504 and 7601. Chacune de ces souches présente un signal de forte hybridation avec le gène qvPA de Calothrix 7601 à 600C dans des conditions permettant un mésappariement de 35-40%. Aucune hybridation n'a pu être détectée, même dans des conditions de faible stringence (500C, autorisant des mésappariements de 45-50%) avec l'ADN isolé à partir de souches incapables de former des vésicules à gaz (Synechococcus 6911, Nostoc 7413, CvlindrosPermum 73101).
Parmi les 30 souches testées, 20 d'entre-elles permettent la production de vésicules à gaz Microcystis 7806GV+ et 7820, Oscillatoria 6412 et 6506, toutes les souches Pseudanabaena, Nostoc 6705, 6719, 6720, 73102 et 8009, les souches Calothrix 7504 and 7601. Chacune de ces souches présente un signal de forte hybridation avec le gène qvPA de Calothrix 7601 à 600C dans des conditions permettant un mésappariement de 35-40%. Aucune hybridation n'a pu être détectée, même dans des conditions de faible stringence (500C, autorisant des mésappariements de 45-50%) avec l'ADN isolé à partir de souches incapables de former des vésicules à gaz (Synechococcus 6911, Nostoc 7413, CvlindrosPermum 73101).
Dans 12 souches, des copies multiples du gène qvPA ont été détectées : cette observation a été prise en compte dans le tableau I, dans la colonne qvPA.
Les tailles des fragments hybridants avec gvpA après digestion de ltADN avec HindIII, HincII, EcoRI et après des digestions doubles sont données dans le tableau II. Ce tableau correspond à la représentation schématique des fragments de restriction obtenus après des digestions simples ou doubles de 1'ADN total par
EcoRI, HindIII, HincII et des hybridations avec une sonde ADN marquée au P portant le gène gvpA de
Calothrix 7601. Les tailles de ces fragments sont établies suivant une échelle logarithmique et exprimées en kilobase.
EcoRI, HindIII, HincII et des hybridations avec une sonde ADN marquée au P portant le gène gvpA de
Calothrix 7601. Les tailles de ces fragments sont établies suivant une échelle logarithmique et exprimées en kilobase.
# EcoRI,
O HindIII,
# HincII,
EcoRI-HindIII,
# EcoRI-HincII, HindIII-HincII.
O HindIII,
# HincII,
EcoRI-HindIII,
# EcoRI-HincII, HindIII-HincII.
18 des souches examinées n'ont pas permis la détection d'une hybridation avec la sonde gvpC, même en condition de faible stringence (50 C) autorisant 45-50% de mésappariement). Ce résultat suggère que ces souches ne possèdent pas de séquences homologues au gène gvpC de Calothrix.
Toutes les Cyanobactéries capables de synthétiser les protéines GV qui ont été examinées, possèdent au moins un gène fortement homologue au gène gvpA de
Calothrix. La protéine GVPa correspondante semble donc être fortement conservée parmi les organismes susceptibles de synthétiser des vésicules à gaz. Le clonage récent du gène gvpA de Halobacterium halobium (DasSarma et al.1987 Mol.Microbiol.1:365-370) a montré que la structure primaire de la protéine GVPa des
Archaebactéries est environ 58% identique à la protéine correspondante des Cyanobactéries.
Calothrix. La protéine GVPa correspondante semble donc être fortement conservée parmi les organismes susceptibles de synthétiser des vésicules à gaz. Le clonage récent du gène gvpA de Halobacterium halobium (DasSarma et al.1987 Mol.Microbiol.1:365-370) a montré que la structure primaire de la protéine GVPa des
Archaebactéries est environ 58% identique à la protéine correspondante des Cyanobactéries.
SOUCHES DE CYANOBACTERIES
Designation (a) Numéro dans Milieu de Morophologie Hormogonie Vésicules gvpA gvpC
la collection culture (d) (e) à gaz (f) (g)
PCC (b) (c)
Synechococcus 6911 1 U - - -
Microcystis 7806 GV+ 3 U - ++ +(2) +
7806 GV- 3 U - - +(2) +
7813 3 U - - +(2) +
7820 3 U - ++ +(2) +
Oscillatoria 6412 1 F - + +(1+)
6506 1 F - + +(1+)
Pseudanabaena 6406 1 F - + +(1+)
6802 1 #U - + +(1+)
6901 1 F - + +(1+)
6903 1 F - + +(2)
7367 1 F - + +(1+)
7402 1 F - + +(2)
7403 1 F - + +(1+)
7429 1 F - + +(1+)
7955 1 F - + +(1+)
LPP 7409 1 F - - +(1+)
TABLEAU 1 TABLEAU 1 (suite)
Anabaena 6411 2 FH - ++ +(2) +
7118 2 FH - ++ +(2) +
7119 2 FH - ++ +(2) +
7120 2 FH - ++ +(2) +
Nostoc 6705 2 FH + ++ +(2) +
6719 2 FH + ++ +(2) +
6720 2 FH + + +(1)
73102 2 FH + + +(1)
7413 2 FH - - -
8009 1 F(*) + + +(1)
Cylindrospermum 73101 2 FH + - -
Calothrix 7504 2 FH + ++ +(3) +
7601 1 F(*) + ++ +(3) + TABLEAU 2
Designation (a) Numéro dans Milieu de Morophologie Hormogonie Vésicules gvpA gvpC
la collection culture (d) (e) à gaz (f) (g)
PCC (b) (c)
Synechococcus 6911 1 U - - -
Microcystis 7806 GV+ 3 U - ++ +(2) +
7806 GV- 3 U - - +(2) +
7813 3 U - - +(2) +
7820 3 U - ++ +(2) +
Oscillatoria 6412 1 F - + +(1+)
6506 1 F - + +(1+)
Pseudanabaena 6406 1 F - + +(1+)
6802 1 #U - + +(1+)
6901 1 F - + +(1+)
6903 1 F - + +(2)
7367 1 F - + +(1+)
7402 1 F - + +(2)
7403 1 F - + +(1+)
7429 1 F - + +(1+)
7955 1 F - + +(1+)
LPP 7409 1 F - - +(1+)
TABLEAU 1 TABLEAU 1 (suite)
Anabaena 6411 2 FH - ++ +(2) +
7118 2 FH - ++ +(2) +
7119 2 FH - ++ +(2) +
7120 2 FH - ++ +(2) +
Nostoc 6705 2 FH + ++ +(2) +
6719 2 FH + ++ +(2) +
6720 2 FH + + +(1)
73102 2 FH + + +(1)
7413 2 FH - - -
8009 1 F(*) + + +(1)
Cylindrospermum 73101 2 FH + - -
Calothrix 7504 2 FH + ++ +(3) +
7601 1 F(*) + ++ +(3) + TABLEAU 2
<SEP> 7806
<tb> <SEP> 7806
<tb> <SEP> 7813
<tb> <SEP> 7820
<tb> <SEP> 6412
<tb> <SEP> 6506
<tb> <SEP> 6901
<tb> <SEP> 6903
<tb> <SEP> 7402
<tb> <SEP> 7429
<tb> <SEP> 7955
<tb> <SEP> 6406
<tb> <SEP> 6802
<tb> <SEP> 7367
<tb> <SEP> 7403
<tb> <SEP> 7409
<tb> <SEP> 6720
<tb> 73102
<tb> <SEP> 8009
<tb> <SEP> 6705
<tb> <SEP> 6719
<tb> <SEP> 6411
<tb> <SEP> 7118
<tb> <SEP> 7119
<tb> <SEP> 7120
<tb> <SEP> 7504
<tb> <SEP> 7601
<tb>
EXEMPLE 2 : Transformation de cellules de Bti avec la séquence codante du gène qvnA de Pseudanabaena 6901.
<tb> <SEP> 7806
<tb> <SEP> 7813
<tb> <SEP> 7820
<tb> <SEP> 6412
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<tb> <SEP> 6720
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<tb> <SEP> 6719
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EXEMPLE 2 : Transformation de cellules de Bti avec la séquence codante du gène qvnA de Pseudanabaena 6901.
SOUCHES BACTERIENNES ET PLAMIDES
Escherichia coli HB101 et JM83 ont été utilisées pour les expériences de clonage.
Escherichia coli HB101 et JM83 ont été utilisées pour les expériences de clonage.
B.thurinqiensis israelensis (Bti), 4Q2-81 et 4Q2-72 ont été utilisées en tant que souches réceptrices pour les expériences de transformation.
Ces deux souches données par H.D.DEAN, sont dérivées de la souche ne 4Q2 (Bacillus Genetic Stock Center the
Ohio State University, Columbus, USA). La souche 4Q2-81 est une souche cristal-déficiente, de laquelle on a éliminé tous les plasmides résidants, et la souche 4Q2-72 est une souche produisant un cristal, qui contient uniquement le plasmide de 72MDa, codant pour toutes les protéines du cristal de Bti,
Le plasmide pPM103, décrit ci-après, est utilisé comme source contenant le gène gvpA de Pseudanabaena et le plasmide pCB4 décrit par Bourgouin et al.(Mol.Gen.Genet.(1986)205:390-397) contient la région promoteur du gène codant pour la protéine cytolytique de 28 Kda de Bti.
Ohio State University, Columbus, USA). La souche 4Q2-81 est une souche cristal-déficiente, de laquelle on a éliminé tous les plasmides résidants, et la souche 4Q2-72 est une souche produisant un cristal, qui contient uniquement le plasmide de 72MDa, codant pour toutes les protéines du cristal de Bti,
Le plasmide pPM103, décrit ci-après, est utilisé comme source contenant le gène gvpA de Pseudanabaena et le plasmide pCB4 décrit par Bourgouin et al.(Mol.Gen.Genet.(1986)205:390-397) contient la région promoteur du gène codant pour la protéine cytolytique de 28 Kda de Bti.
Les plasmides pUC19 et pBCl6-1 dérivé de pBC16 isolé à partir de B.cereus (Bernhard et al.1978)] ont été utilisés pour la construction du vecteur bifonctionnel pBU4 (figure 2 > . Le plasmide pBU4 a été obtenu par ligation des sites de restriction Eco0109 de pUC19 et EcoRI de pBC16-1 après avoir complété les extrémités cohésives.
L'orientation relative des vecteurs pUCl9 et pBC16-1 a été déterminée grâce à leurs cartes de restriction.
Le plasmide formé a été utilisé comme vecteur dans les expériences de transformation
TECHNIOUES D'ADN RECOMBINANT
L'isolement des plasmides de E.coli a été réalisé par la méthode de lyse alcaline décrite par Birnboim & BR<
Doly (Nucl.Acid.Res.7 p.1513-1523 (1979)) et les plasmides ont été purifiés, si nécessaire, dans un gradient de densité de chlorure de cesium, alors que les plasmides de B.thurinaiensis ont été isolés selon la description donnée par Bourgouin et al dans l'article précédemment cité (1986).
TECHNIOUES D'ADN RECOMBINANT
L'isolement des plasmides de E.coli a été réalisé par la méthode de lyse alcaline décrite par Birnboim & BR<
Doly (Nucl.Acid.Res.7 p.1513-1523 (1979)) et les plasmides ont été purifiés, si nécessaire, dans un gradient de densité de chlorure de cesium, alors que les plasmides de B.thurinaiensis ont été isolés selon la description donnée par Bourgouin et al dans l'article précédemment cité (1986).
L'ADN du plasmide a été analysé par électrophorèse en gel d'agarose horizontal.
Les expériences de clonage et l'analyse par enzymes de restriction ont été menées de la façon décrite par Maniatis et au.(1982) ; toutes les enzymes ont été utilisées selon les directives du fabricant.
Le linker EcoRI a été utilisé de la façon recommandée par Biolabs.
PROCEDE DE TRANSFORMATION
La transformation des souches de E,coli a été réalisée conformément à la méthode de Lederberg & BR<
Cohen (1974). Les transformants ont été sélectionnés sur milieu gélosé LB comprenant 50pg/ml d'ampicilline et 20pg/ml de tétracycline.
La transformation des souches de E,coli a été réalisée conformément à la méthode de Lederberg & BR<
Cohen (1974). Les transformants ont été sélectionnés sur milieu gélosé LB comprenant 50pg/ml d'ampicilline et 20pg/ml de tétracycline.
La transformation des souches de B.thurinqiensis israelensis a été réalisée par électroporation à l'aide d'un appareil Gene Pulsera (Bio-Rad
Laboratories, Richmond, CA) comme suit
On procède à une culture pendant une nuit dans un milieu BHI (milieu commercialisé par DIFCO) pour inoculer 200ml du même milieu préchauffé, à une densité de départ de 0,04, à 650nm (DO650). Les cultures ont été incubées à 300C, avec agitation, jusqu'à une densité optique DO600 d'environ 0,6 Les cellules ont été récoltées par centrifugation (5,900g, 10 mn), lavées une fois dans lOOml d'eau stérile, puis resuspendues dans 1,5ml de Polyéthylèneglycol 6000 stérile (PEG6000) à 40%.
Laboratories, Richmond, CA) comme suit
On procède à une culture pendant une nuit dans un milieu BHI (milieu commercialisé par DIFCO) pour inoculer 200ml du même milieu préchauffé, à une densité de départ de 0,04, à 650nm (DO650). Les cultures ont été incubées à 300C, avec agitation, jusqu'à une densité optique DO600 d'environ 0,6 Les cellules ont été récoltées par centrifugation (5,900g, 10 mn), lavées une fois dans lOOml d'eau stérile, puis resuspendues dans 1,5ml de Polyéthylèneglycol 6000 stérile (PEG6000) à 40%.
L'ADN plasmidique (0,5 à lpg) resuspendu dans du
TE (lOmM Tris hydrochlorure pH7,6, lmMEDTA), a été ajouté à 0,8ml de cellules et ce mélange a été placé dans une cuvette stérile d'électroporation (distance inter-électrode 0,4cm) et maintenu dans la glace pendant 5mn.
TE (lOmM Tris hydrochlorure pH7,6, lmMEDTA), a été ajouté à 0,8ml de cellules et ce mélange a été placé dans une cuvette stérile d'électroporation (distance inter-électrode 0,4cm) et maintenu dans la glace pendant 5mn.
L'appareil Gene Pulser a été placé sous un voltage de 2,5kV et une capacitance de 25 F immédiatement après l'électroporation, le mélange de cellules et d'ADN a été ajouté à 2ml de milieu BHI et incubé, pendant 1 heure, à 300C, avec agitation douce.
Les clones transformants ont été sélectionnés sur milieu gélosé LB contenant de la tétracycline (20pg/ml), après un temps d'incubation de 24-48 heures à 30 C.
ANALYSE DES PROTEINES DES CLONES RECOMBINANTS ET
IMMUNOBLOTS
Les clones recombinants de E.coli ont été mis en culture pendant 1 nuit, à 370C, dans un milieu BHI contenant de l'ampicilline (50pg/ml) et de la tétracycline (20 g/ml).
IMMUNOBLOTS
Les clones recombinants de E.coli ont été mis en culture pendant 1 nuit, à 370C, dans un milieu BHI contenant de l'ampicilline (50pg/ml) et de la tétracycline (20 g/ml).
Les transformants B.thurinpiensis israelensis ont été placés dans des conditions de sporulation dans un milieu HC (Petit-Glatron et Rapoport,1975) comprenant de la tétracycline 20pg/ml) à 300C ; Selon un autre mode de réalisation ces transformants ont été mis en culture en milieu BHI additionné de la même concentration de tétracycline, à 370C. Dans ces dernières conditions, les cultures de B.thurinqiensis ne sont généralement pas capables de sporuler.
Les cellules concentrées 50 fois dans du fluorure de phénylméthylsulfonyllmM-EDTAlOmM, ont été lysées par désintégration aux ultrasons. Les échantillons ayant subi ce traitement aux ultrasons (10ul) sont repris dans le tampon de dépôt (Laemmli,1970), chauffés pendant îOmn à 1000C, puis soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamidesodiumdodecylsulphate 12% à (p/vol).
Les échantillons ont été électrotransférés sur des filtres Hybond C (marque commerciale de Amersham
Corp.) qui ont été immergés dans une solution contenant 50mM Tris hydrochlorure (pH7,5)-150mM de chlorure de sodium (NaCl) contenant 5%(p/vol) de lait écrémé, puis incubés avec un antisérum de lapin dirigé contre les protéines GV. L'incubation a été réalisée d'abord pendant 1 heure à 370C, puis pendant 1 heure à la température ambiante avec un antisérum spécifique dilué 200 fois dans une solution de lait écrémé Tris
NaCl. Après lavage, les filtres ont été incubés pendant 1 heure à 370C avec la protéine A marquée à l'iode (I1 2 5) (activité spécifique 3,17MBq/ug ; NEN
Research Products), lavés et autoradiographiés pendant 1 heure ou plus à -700C avec un écran intensifiant.
Corp.) qui ont été immergés dans une solution contenant 50mM Tris hydrochlorure (pH7,5)-150mM de chlorure de sodium (NaCl) contenant 5%(p/vol) de lait écrémé, puis incubés avec un antisérum de lapin dirigé contre les protéines GV. L'incubation a été réalisée d'abord pendant 1 heure à 370C, puis pendant 1 heure à la température ambiante avec un antisérum spécifique dilué 200 fois dans une solution de lait écrémé Tris
NaCl. Après lavage, les filtres ont été incubés pendant 1 heure à 370C avec la protéine A marquée à l'iode (I1 2 5) (activité spécifique 3,17MBq/ug ; NEN
Research Products), lavés et autoradiographiés pendant 1 heure ou plus à -700C avec un écran intensifiant.
RéSULTATS
CLONAGE DU GENE gvpA AVEC SON PROPRE PROMOTEUR.
CLONAGE DU GENE gvpA AVEC SON PROPRE PROMOTEUR.
Un vecteur pPGVA- (figure 2) a été construit pour tester si le gène pvnA peut s'exprimer avec son propre promoteur dans d'autres microorganismes que
Pseudanabaena. Il a été construit par insertion du fragment BamHI-HindIII de pPM103, contenant le gène gvpA et sa région promoteur,au site BamHI-HindIII de pBU4.
Pseudanabaena. Il a été construit par insertion du fragment BamHI-HindIII de pPM103, contenant le gène gvpA et sa région promoteur,au site BamHI-HindIII de pBU4.
Ce plasmide recombinant a été inséré à la fois dans E.coli JM83 et dans B.thurinaiensis israelensis 4Q2-81. Dans tous les clones recombinants, ce plasmide est maintenu de façon stable.
L'analyse des protéines des clones de B.thurinaiensis a été réalisée, à la fois pendant la phase de croissance végétative et pendant le processus de sporulation, pour tester si différentes ARN polymérases peuvent reconnaître le promoteur du gène gvpA. L'analyse a montré que le gène avDA est exprimé dans toutes les souches recombinantes mais à un très faible niveau. L'expression du gène qvDA dans les transformants B.thurinaiensis n'a pas été détectée en phase de sporulation.
CLONAGE DU GENE pvDA A LA SUITE DU PROMOTEUR DE LA
PROTEINE de 28KDa de B.thurinaiensis israelensis.
PROTEINE de 28KDa de B.thurinaiensis israelensis.
Pour réaliser la production de vésicules à gaz dans Bt pendant la sporulation, le gène avDA a été placé en aval de la région promoteur du gène codant pour la protéine cytolytique de 28KDa de
B. thuringiensis israelensis.
B. thuringiensis israelensis.
Ce promoteur, exprimé pendant la phase tII de sporulation, a été caractérisé par Ward & Ellar (1986a), qui ont montré qu'il est exprimé dans les cellules de Bacillus subtilis (Ward & Ellar, 1986b) au cours de sporulation.
Le plasmide pPGVA28 (fig.2) a été construit avec un fragment EcoRV-HaeIII, contenant la région promoteur de pCB4 et le fragment StyI-BamHI contenant le gène gvpA de pPM103 Après avoir ajouté une extrémité cohésive EcoRI avec un linker synthétique, à l'extrémité franche EcoRV, et complété l'extrémité cohésive Stol7 ces deux fragments ont été insérés dans le fragment EcoRI-BamHI du vecteur pBU4.
Le plasmide pPGVA28 a été isolé à partir de clones recombinants d'E.coli HB101 et introduit dans les souches B. thuringiensis israelensis 4Q2-81 et 4Q2-72 par lectroporation comme mentionné ci-dessus.
L'analyse des protéines de E.coli (pPGVA28) n'a pas permis de constater l'expression significative de la protéine GV, alors que les échantillons des souches recombinantes B.thurinaiensis israelensis ont montré un niveau d'expression important de cette protéine pendant la sporulation (figure 3).
Les protéines de B.thurincriensis israelensis 4Q2-81 (pPGVA28) et 4Q2-72 (pPGVA28) ont également été analysées à plusieurs stades de la sporulation et les résultats de cette analyse montrent que la synthèse de la protéine GV commence à la phase tII de la sporulation et persiste durant les phases suivantes, à un niveau important.
De plus, l'étude de l'expression des toxines du cristal des souches recombinantes 4Q2-72 (pPGVA28) montre que la construction réalisée n'interfère pas avec la synthèse du cristal larvicide.
Claims (20)
1/ Cellules recombinantes différentes de E.coli, génétiquement transformées, caractérisées en ce qu'elles comprennent parmi le matériel génétique qui se réplique avec elles, au cours des générations successives, au moins une séquence de nucléotides hétérologue vis-à-vis de la cellule hôte correspondant à tout ou partie de la séquence d'acides aminés d'une protéine GV de structure d'une vésicule à gaz placée sous le contrôle d'éléments de régulation permettant l'expression de ladite séquence de nucléotides et la production de vésicules à gaz améliorant les propriétés de flottaison-des cellules.
2/ Cellules recombinantes selon la revendication 1, caractérisées en ce qu.' elles comprennent une séquence de nucléotides issue de la séquence codante du gène gvpA.
3/ Cellules recombinantes selon la revendication 1 ou revendication 2, caractérisées en ce que la séquence de nucléotides est issue du gène pvpA de
Cyanobacteries, notamment de Pseudanabaena.
4/ Cellules recombinantes selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce que la séquence de nucléotides est issue du gène gvDA d 'Archaebactéries.
5/ Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles comprennent un enchaînement de nucléotides distinct supplémentaire correspondant à tout ou partie d'un gène susceptible de participer à la formation des vésicules à gaz, éventuellement sous le contrôle d'une séquence de régulation compatible avec l'expression dans la cellule.
6/ Cellules recombinantes selon la revendication 5, caractérisées en ce que l'enchaînement de nucléotides distinct est issu de la séquence codante du gène gvpC.
7/ Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, telles qu'obtenues après modification de bactéries appartenant à la famille des
Bacillacées, ou des cyanobactéries, naturellement dépourvues de GV.
8/ Cellules recombinantes selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'il s'agit de Bacillus thurinqiensis BTi ou Bacillus sDhaericus.
9/ Cellules recombinantes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'il s'agit du clone 4Q2-81(pPGVA28) ou du clone 4Q2-72(pPGVA28).
10/ Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, telles qu'obtenues après modification de cyanobactéries naturellement dépourvues de protéine GV.
11/ Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules eucaryotes.
12/ Cellules selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules de levure.
13/ Acide nucléique recombinant caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison au moins une séquence de nucléotides correspondant à la séquence d'acides aminés d'une protéine de structure GV des vésicules à gaz et un gène ou une séquence de nucléotides codant pour une protéine déterminée, notamment l'interleukine.
14/ Vecteur recombinant comprenant au moins une séquence de nucléotides correspondant à la séquence d'acides aminés d'une protéine de structure GV des vésicules à gaz, ladite séquence.de nucléotides étant placée sous le contrôle d'au moins une séquence de régulation comprenant un promoteur compatible avec l'expression de ladite séquence dans une cellule déterminée.
15/ Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides qu'il comporte est obtenue à partir du gène qvnA d'une bactérie de la famille des Cyanobactéries, des Archébactéries ou d'autres organismes.
16/ Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que la susdite séquence de nucléotides est associée à un autre enchaînement de nucléotides, éventuellement placé sous le contrôle d'un promoteur, et, dont le produit est capable de participer à la formation des vésicules à gaz.
17/ Vecteur selon la revendication 16 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pPGVA28 contenant le plasmide pPM103.
18/ Composition caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
19/ Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce que les cellules recombinantes comprennent des bactéries de la famille des
Bacillacées ayant une activité larvicide, notamment vis-à-vis des larves de Diptères.
20/ Procédé de transformation de cellules pour la production de vésicules à gaz comprenant les étapes suivantes - mise en contact d'un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 14 à 17 avec des cellules déterminées compatibles avec l1éxpression de la séquence de nucléotides contenue dans le vecteur, dans des conditions permettant la transformation desdites cellules par le vecteur recombinant, - sélection et récupération des bactéries recombinantes formées par tout moyen physique ou chimique approprié.
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Patent Citations (5)
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