WO1990010071A1 - Expression de sequences de nucleotides codant pour des vesicules a gaz - Google Patents

Expression de sequences de nucleotides codant pour des vesicules a gaz Download PDF

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WO1990010071A1
WO1990010071A1 PCT/FR1990/000136 FR9000136W WO9010071A1 WO 1990010071 A1 WO1990010071 A1 WO 1990010071A1 FR 9000136 W FR9000136 W FR 9000136W WO 9010071 A1 WO9010071 A1 WO 9010071A1
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recombinant
gene
nucleotide sequence
sequence
cells
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PCT/FR1990/000136
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Inventor
Nicole Tandeau De Marsac
Thierry Damerval
Paola Vittorioso
Jean Houmard
Catherine Bourgouin
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Institut Pasteur
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to the expression of nucleotide sequences encoding gas vesicles.
  • the invention relates to recombinant cells genetically transformed by the insertion of one or more nucleotide sequence (s) responsible for the formation of structural proteins of gas vesicles (GV), or involved in their development, their composition or their functioning.
  • s nucleotide sequence responsible for the formation of structural proteins of gas vesicles (GV), or involved in their development, their composition or their functioning.
  • the invention also relates to recombinant cloning and / or expression vectors, capable of containing inserts formed by the above sequences, possibly placed under the control of regulatory elements provided with one or more compatible promoter (s) ( s) with the expression of the insert gene (s) in the cells used as host.
  • s compatible promoter
  • the presence of gas vesicles has already been demonstrated in various aquatic prokaryotic microorganisms, in particular in bacteria of the Archaebacteria or Cyanobacteria type.
  • gas vesicles constitute specific cellular inclusions, capable of conferring on the cells, in which they are produced naturally, flotation properties or at least a reduction in their capacity to sediment in an aquatic environment, (this property is sometimes qualified by the term "relief” below).
  • These gas vesicles also known as GV
  • GV have a protein envelope in the form of a molecular layer, they are impermeable to water, but permeable to gases.
  • Their structural protein can result from the expression of a gene belonging to a multigene family. This family can for example be defined by reference to observations made in bacteria of the family of Cyanobacteria. In particular, in a Cyanobacterium, Calothrix, PCC No.
  • qvpC Another qvpC gene. coding for a product different from the previous ones, could be detected and characterized.
  • a representative of this operon-forming gene with qvpA and gvpB (operon qvpABC) has been described in the publication by Damerval et al. (Gene 54) mentioned above.
  • Another representative of this gene has been described by Hayes et al in (Molecular Microbiology (1988) 2 (5) 545-552). Studies carried out so far have revealed the presence of several associated genes in certain bacteria producing gas vesicles and have led to believe that the mechanism of formation of gas vesicles could be complex.
  • the inventors have now developed means making it possible to obtain the expression of the sequences coding for the structural proteins of gas vesicles (GV proteins) in different cells playing the role of host cells.
  • GV proteins gas vesicles
  • the invention relates in this respect different recombinant E. coli cells, genetically transformed, characterized in that they include from the genetic material which replicates with them in successive generations, at least one sequence of heterologous nucleotides vis-à-vis the host cell, corresponding to all or part of the amino acid sequence of a GV protein with the structure of a gas vesicle, placed under the control of regulatory elements allowing the expression of said sequence nucleotides and the production of gas vesicles improving the flotation properties of cells.
  • the nucleotide sequence introduced can also be constituted by a variant of the previous one, modified at the level of certain nucleotides, since it allows the synthesis of gas vesicles having the above properties.
  • the nucleotide sequence introduced into cells can be obtained from organisms having the property of naturally synthesizing the structural protein (s) of gas vesicles.
  • These nucleotide sequences can be obtained using hybridization probes such as those described by Damerval et al. (Gene, 54 (1987) 83-92) or also by chemical synthesis, for example by the automated solid phase synthesis method described by Barone AD et al. (Nucleic Acids Research 12, 4051-4060 (1984)).
  • the invention relates in particular to recombinant cells corresponding to the above definition, characterized in that they comprise a nucleotide sequence derived from the coding sequence of the qypA gene.
  • the qvpA gene sequence can, for example, be obtained by using a qvpA probe corresponding to a Hindi-HindiII fragment of 237pb containing 186pb of the qvpA gene from Calothrix 7601 and 51pb from the terminal region of the downstream sequence of this gene.
  • This probe is described in the article by Tandeau de Marsac et al (-1985 Nucl.Acids Res.13: 7223-7236).
  • the invention also relates to recombinant cells transformed by a variant of the coding sequence of the qvpA gene, consisting of a chosen original sequence modified at the level of certain nucleotides, either by replacement of nucleotides, or by deletion or introduction of nucleotides, to provided that these modifications do not result in the loss of the functional properties of the original sequence, namely its ability to synthesize GV proteins from the structure of gas vesicles.
  • nucleotide sequence (s) indirectly involved in the formation of gas vesicles or the expression of which, together with that of the sequences coding for gas vesicles, is sought.
  • the coding sequence of the chosen gas vesicles will be associated with a gene or with a sequence coding for a product whose expression is sought, in particular a specific protein, for example interleukin.
  • the invention relates for this purpose to a recombinant nucleotide sequence, characterized in that it comprises in combination the coding sequence of the GV protein as described above, and at least one gene or a nucleotide sequence coding for a protein determined, including interleukin.
  • the coding sequence of the qvpA gene is derived from the qvpA gene from Cyanobacteria, in particular from the Pseudanabaena strain, PCC No. 6901 (Pseudanabaena 6901).
  • the insert comes from the qvpA gene of ⁇ rchaebacteria, in particular from Halobacteria.
  • bacteria such as Microcvstis, Oscillatoria. Nostoc or other bacteria for the preparation of the coding sequence suitable for the transformation of selected cells.
  • the invention also relates to recombinant cells comprising an additional distinct nucleotide sequence corresponding to all or part of a gene capable of participating in the formation of gas vesicles, optionally under the control of a regulatory sequence compatible with expression in the cell.
  • This additional distinct nucleotide chain can consist of a sequence coding directly or indirectly for the formation of a product having a role in regulating the production of gas vesicles.
  • This distinct sequence may also consist of a sequence coding for a factor for increasing the solidity of the gas vesicles or for improving the assembly of the structural proteins of the gas vesicles in a functional conformation.
  • This distinct nucleotide chain can for example be derived from the qvpC gene present in several bacteria of the Cyanobacteria family or from any gene functionally analogous to qvpC and present in other bacteria or organisms. The same means as those previously defined may be used to obtain this gene or these genes.
  • the qvpC gene can be obtained in different bacteria using a probe corresponding to a " EcoRI-EcoRI fragment of 263 bp located inside the qvpC gene of Calothrix 7601.
  • the recombinant cells may, in this case, contain the qvpC gene described above or its coding sequence, optionally placed under the control of a regulatory sequence containing at least one promoter .
  • the recombinant cells result from the transformation of bacteria belonging to the family of Bacillaceae.
  • recombinant cells meeting the definitions of the invention are those of Bacillus thurinqiensis (Bt), in particular Bacillus thurinqiensis israelensis (Bti), Bacillus sphaericus or other bacteria present in the aquatic environment and having interesting biological properties such as for example larvicidal activity.
  • Bt Bacillus thurinqiensis
  • Bti Bacillus thurinqiensis israelensis
  • Bacillaceae which are particularly advantageous in the context of carrying out the invention are, for example, sporulating bacteria at least capable of carrying out the first stages of sporulation, necessary for the production of crystals containing the larvicidal toxins of the chosen bacterium.
  • These bacteria can also be asporogenic bacteria blocked in stage II of sporulation, capable of synthesizing larvicidal toxins and allowing the expression of the sequence coding for the protein GV. Under these conditions, the sequence coding for the GV protein is placed under the control of a vegetative promoter compatible with the expression of the sequence in the bacterium.
  • Transformed Bti bacteria which are particularly advantageous for carrying out the invention are the clones 4Q2-72 / pPGVA28.
  • Other transformed Bacillaceae are the bacteria B. sphaericus made capable of synthesizing GV proteins.
  • these transformed bacteria synthesize the GV protein in the exosporium containing the spore and the larvicidal crystals, in particular those of the crystals naturally produced by B.sphaericus.
  • Cyanobacteria in particular Cyanobacteria naturally devoid of the GV protein or any organism having an economic interest in aqueous or aquatic medium such as for example those which degrade organic waste, those which produce substances of interest medical or agronomic.
  • Other recombinant cells capable of being transformed are, for example, baculoviruses as described in application EP.273.366 or the article in Journal of Virology- (Nov.87 p3617-3620).
  • the recombinant cells are eukaryotic animal or plant cells transformed by the sequences defined above.
  • interesting eukaryotic cells are yeast cells.
  • Other recombinant cells are for example cells from mammals, insects, plants, algae.
  • regulatory sequences recognized by the polyerases of the cell host are placed upstream of the coding sequences.
  • Other advantageous sequences can be placed upstream or downstream. when they are capable of modulating the expression of the genes carried by the insert.
  • regulatory sequences comprising the spac promoters, the promoter of the B. subtilis sacB gene or the bacteriophage T5 or the tac promoter which can be used in various bacteria can be used.
  • the regulatory systems which can be used are, for example, promoters of viral (for example SV40) or bacterial (Aqrobacterium tumefaciens) origin or any sequence capable of modulating the expression of the gene (s) carried ( s) by
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising at least one nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of a protein of structure GV of the vesicles with
  • nucleotide sequence being placed under the control of at least one regulatory sequence comprising a promoter compatible with its expression in a determined cell, at a determined time.
  • the vectors according to the invention are produced at
  • nucleotide sequences corresponding to the definitions given in the preceding pages. They are suitable for the expression of the preceding nucleotide sequences in the cells described above.
  • a vector satisfying the above criteria recombinant is, according to a preferred embodiment of the invention, characterized in that a portion of the nucleotide sequence comprising 5 is obtained from the qvpA gene of a bacterium of the family of Cyanobacteria or Archaebacteria.
  • the recombinant vector is characterized in that the nucleotide sequence is associated with a sequence of nucleotides separate meeting the given criteria 5 in the preceding pages optionally under the control of a promoter whose expression product is capable of participating in the formation of gas vesicles.
  • a particularly advantageous vector is the plasmid vector pPGVA28 which is the subject of the examples which follow.
  • pPGVA28 results from the association of a purified EcoRV-HaelII fragment isolated from the plasmid pCB4 containing the promoter region of the p28 protein (molecular weight of 28Kda) from Bti on the one hand and from the StvI-BamHI fragment from pPM103 containing the Pseudanabaena gvpA gene. This plasmid is shown in Figure 2.
  • the plasmid pPM103 was the subject of a deposit at the National Collection of Cultures of Microorganisms 0 (CNCM) of the Institut Pasteur in Paris, on February 17, 1989 under the number 1-835.
  • the invention also relates to a vector containing a recombinant nucleic acid comprising the coding sequence of the chosen gas vesicles, associated a gene or a sequence coding for a specific protein.
  • association products can be in the form of cellular inclusions or, on the contrary, can be excreted in the medium external to the cell.
  • the invention further relates to compositions comprising recombinant cells according to the invention.
  • compositions include, for example, recombinant Bti bacteria, having larvicidal activity, in particular with regard to the dipteran larvae.
  • compositions can be presented in the form of powder, suspensions, briquettes for their administration in an aquatic medium.
  • Other compositions according to the invention comprise eukaryotic cells of the type of those given above, in particular yeasts. These cells are advantageously usable for carrying out mass culture. They in fact make it possible to reduce the problems of cell sedimentation in the reactors.
  • the invention also relates to. compositions comprising products of association with the gas vesicles formed as well as products whose synthesis is obtained simultaneously in the recombinant cells, described above.
  • the invention also relates to a method for transforming cells, for the production of gas vesicles, comprising the following steps: - contacting a vector rec ⁇ mbinant defined above, Avéo cells determined consistent with the expression of the nucleotide sequence contained in the vector under conditions allowing the 5 transformation of said cells with the recombinant vector, selection and recovery of recombinant bacteria formed, by any appropriate physical or chemical means.
  • the transfer of DNA into cells can be carried out by various techniques such as conjugation, transformation, electroporation, for example according to techniques such as those described by Luchansky et al. (1988 Mol.Microbiol., 5 2: 637-646) transfection or viral infection.
  • FIG. 1 represents the gvpA gene of the strain Pseudanabaena 6901.
  • FIG. 2 represents the plasmids pBU4, pPGVA and pPGVA28.
  • FIG. 3 represents the results of the expression of the qvpA gene in B.thurinqiensis 5 israelensis, with the following indications: A and B: Size markers 1 and 2: Bti strain 4 Q2 81 / pPGVA28
  • FIG. 4 represents the plasmid pPM103 comprising the vector pTZ 18 R (Pharmacia ref. 27-4984-01) 2,871 kb. Cloning at EcoRI and BamHt sites and an insert consisting of a 0.73 kb fragment carrying qvpA of Pseudanabaena 6901. EXAMPLE 1
  • compositions of the media are given in the article by Rippka et al. above
  • gas vesicles are formed only during the differentiation of hormogonies.
  • the cells (2-3 g, mass of fresh material) were resuspended in 5 ml of 10% sucrose (w / vol) / 50 mM Tris-HCl pH8 / 100mM Na 8 EDTA pH8. Lysozyme (10 mg / ml, final concentration) was added and the suspension was incubated for 1 hour at 37 ° C. After addition of sarkosyl (2% w / vol, final concentration) and incubation for 45 min at 50 ° C, the lysate was treated with proteinase K (l00 ⁇ g / ml) for 30 min at 37 ° C.
  • the suspension was extracted twice with the same volume of phenol and once with a volume of phenol / chloroform / isoamyl alcohol 50/48/2 (vol / vol / vol).
  • the volume of the aqueous phase was adjusted to 9 ml and 9 g of sodium chloride and 0.2 ml of ethidium bromide (10 mg / ml) were added.
  • This mixture was clarified by centrifugation at 12,000 g for 10 min at 4 ° C.
  • the aggregates present at the top of the tube were removed and the supernatant was subjected to centrifugation, at 140,000 g, for 24 h at 15 ° C. All of the chemicals were conventional reagents. 3 / Analysis by hybridization (Southern) EcoRI, HindIII, restriction enzymes
  • a 5 qvpC probe consisted of an EcoRI-EcoRI fragment of 263pb internal to the corresponding gene Calothrix 7601 (Damerval et al 1987, Gene 54: 83-92).
  • the DNA fragments were purified by low melting point agarose electrophoresis according to the method described by Maniatis (1982, Molecular Cloning Laboratory Manuel Cold Spring Harbor Laboratory). These DNA fragments were labeled with phosphorus 32 using a cleavage displacement kit and [ ⁇ 32 P] dCTP obtained from Amersham. Before rehybridization, the filters were dehybridized using the SSPE / SDS technique described by Meinkoth et al. (Anal. Biochem. 138: 267-284) and the absence of remaining DNA probes was verified by fluororadiography before the filters were reused.
  • Archaebacteria is approximately 58% identical to the corresponding protein of Cyanobacteria.
  • Desi ⁇ nation (a) Number in Medium of Morphology Hormogonje Vesicles g y pA g y p collection culture (e) à gaz (f) (g) PCC (b) (c)
  • Escherichia col HB101 and JM83 were used for the cloning experiments.
  • 4Q2-72 were used as receptor strains for the transformation experiments. These two strains given by H.D. DEAN, are derived from strain No. 4Q2 (Bacillus Genetic Stock Center the Ohio State University, Columbus, USA).
  • the strain 4Q2-81 is a crystal-deficient strain, from which all resident plasmids have been eliminated, and the strain 4Q2-72 is a crystal-producing strain, which contains only the plasmid of 72MDa, encoding all the proteins of the crystal. from Bti.
  • the plasmid pPM103 is used as a source containing the qvpA gene from Pseudanabaena and the plasmid pCB4 described by Bourgouin et al. (Mol.Gen.Genêt. (1986) 205: 390-397) contains the promoter region of the gene encoding the 28 Kda cytolytic protein from Bti.
  • the plasmids pUC19 and pBC16-1 [derived from pBC16 isolated from B. cereus (Bernhard et al. 1978)] were used for the construction of the bifunctional vector pBU4 (FIG. 2).
  • the plasmid pBU4 was obtained by ligation of the restriction sites Eco0109 of pUC19 and EcoRI of pBC16-1 after having completed the cohesive ends.
  • the relative orientation of the pUC19 and PBC16-1 vectors was determined using their restriction maps.
  • the plasmid formed was used as a vector in the transformation experiments.
  • the isolation of the E.coli plasmids was carried out by the alkaline lysis method described by Birnboim & Doly (Nucl.Acid.Res.7 p.1513-1523 (1979)) and the plasmids were purified, if necessary, in a density gradient of cesium chloride, while the plasmids of B.thurinqiensis were isolated according to the description given by Bourgouin et al in the article previously cited (1986).
  • Plasmid DNA was analyzed by horizontal agarose gel electrophoresis.
  • the EcoRI linker was used as recommended by Biolabs.
  • a culture is carried out overnight in a BHI medium (medium marketed by DIFCO) for inoculate 200ml of the same preheated medium, at a starting density of 0.04, at 65On * (DOeso).
  • the cultures were incubated at 30 ° C, with shaking, to an optical density DO ⁇ o of about 0.6.
  • the cells were harvested by centrifugation (5,900 g, 10 min), washed once in 100 ml of sterile water, then resuspended in 1.5 ml of sterile Polyethylene glycol 6000 (PEG6000) at 40%.
  • the plasmid DNA (0.5 to 1 ⁇ g) resuspended in E (10 mM Tris hydrochloride pH 7.6, ImMEDTA), was added to 0.8 ml of cells and this mixture was placed in a sterile electroporation cuvette (distance 0.4cm inter-electrode) and kept in ice for 5 minutes.
  • the Geneuterer device was placed under a voltage of 2.5kV and a capacitance of 25 ⁇ F; immediately after electroporation, the mixture of cells and DNA was added to 2 ml of BHI medium and incubated for 1 hour at 30 ° C with gentle shaking.
  • the transforming clones were selected on LB agar medium containing tetracycline (20 ⁇ g / ml), after an incubation time of 24-48 hours at 30 ° C.
  • the recombinant E. coli clones were cultured overnight at 37 ° C. in a BHI medium containing ampicillin (50 ⁇ g / __ l) and tetracycline (20 ⁇ g / ml).
  • the transformants B.thurinqiensis israelensis were placed under sporulation conditions in an HC medium (Petit-Glatron and Rapoport, 1975) comprising tetracycline 20 ⁇ g / ml) at 30 ° C .; According to another embodiment these transformants were cultured in BHI medium supplemented with the same concentration of tetracycline, at 37 ° C. Under these latter conditions, cultures of B. Arthurinqiensis are generally not able to sporulate.
  • Hybond C filters (trademark of Amersham Corp.) which were immersed in a solution containing 50mM Tris hydrochloride (pH 7.5) -150mM sodium chloride (NaCl) containing 5% (w / v ) of skimmed milk, then incubated with a rabbit antiserum directed against GV proteins. The incubation was carried out first for 1 hour at 37 ° C., then for 1 hour at room temperature with a specific antiserum diluted 200 times in a solution of Tris NaCl skimmed milk.
  • the filters were incubated for 1 hour at 37 ° C with protein A labeled with iodine (I 1 * 8 ) (specific activity 3.17MBq / ⁇ g; NEN Research Products), washed and autoradiographed for 1 hour or more at -70 ° C with an intensifying screen.
  • I 1 * 8 protein A labeled with iodine
  • a vector pPGVA (FIG. 2) has been constructed to test whether the gvpA gene can express itself with its own promoter in microorganisms other than Pseudanabaena. It was constructed by inserting the BamHI-HindIII fragment from pPM103, containing the gvpA gene and its promoter region, at the BamHI-HindIII site of pBU4. This recombinant plasmid was inserted both in E.coli JM83 and in B.thurinqiensis israelensis 4Q2-81. In all recombinant clones, this plasmid is maintained stably.
  • the vpA gene was placed downstream of the promoter region of the gene coding for the cytolytic protein of 28KDa of
  • the plasmid pPGVA28 (fig. 2) was constructed with an EcoRV-HaelII fragment containing the promoter region of pCB4 and the StvI-BamHI fragment containing the pv103 qvpA gene. After adding an EcoRI cohesive end with a synthetic linker, to the EcoRV blunt end, and completing the Styl cohesive end, these two fragments were inserted into the EcoRI-Ba HI fragment of the vector pBU4.
  • the plasmid pPGVA28 was isolated from recombinant clones of E. coli HB101 and introduced into the strains B.thurinqiensis israelensis 4Q2-81 and 4Q2-72 by electroporation as mentioned above.
  • the proteins of B.thurinqiensis israelensis 4Q2-81 (pPGVA28) and 4Q2-72 (pPGVA28) were also analyzed at several stages of sporulation and the results of this analysis show that the synthesis of the GV protein begins at the tll phase of sporulation and persists during the following phases, at an important level.

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Abstract

La présente invention concerne des cellules recombinantes différentes de E.coli comprenant au moins une séquence de nucléotides correspondant à une protéine GV de structure d'une vésicule à gaz ou d'un variant de cette séquence ayant conservé sa capacité de synthèse de ladite protéine GV. Ces cellules recombinantes permettent l'expression de ladite séquence de nucléotides dans des conditions permettant d'améliorer les propriétés de flottaison des cellules transformées. L'invention concerne aussi un vecteur recombinant contenant les séquences ci-dessus et un procédé de transformation de cellules.

Description

EXPRESSION DE SEQUENCES DE NUCLEOTIDES CODANT POUR DES VESICULES A GAZ.
La présente invention concerne l'expression de séquences de nucleotides codant pour des vésicules à gaz. L'invention vise à cet effet des cellules recombinantes transformées génétiquement par l'insertion d'une ou plusieurs séquence(s) de nucleotides responsables de la formation des protéines de structure de vésicules à gaz (GV) , ou impliquées dans leur élaboration, leur composition ou leur fonctionnement.
L'invention vise également des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression, susceptibles de contenir des insérats formés par les susdites séquences, éventuellement placés sous le contrôle d'éléments de régulation pourvus d'un ou plusieurs promoteur(s) compatible(s) avec l'expression du ou des gènes de l'insérât dans les cellules utilisées comme hôte. On a déjà mis en évidence la présence de vésicules à gaz chez différents microorganismes procaryotes aquatiques notamment chez des bactéries du type Archaebactéries ou Cyanobactéries.
Ces vésicules à gaz constituent des inclusions cellulaires spécifiques, capables de conférer aux cellules, chez lesquelles elles sont produites naturellement, des propriétés de flottaison ou à tout le moins une diminution de leur capacité à sédimenter en milieu aquatique, (cette propriété est parfois qualifiée par le terme "allégement" dans la suite) . Ces vésicules à gaz (également désignées par GV) comportent une enveloppe de protéines sous forme d'une couche moléculaire, elles sont imperméables à l'eau, mais perméables aux gaz. Leur protéine de structure peut résulter de l'expression d'un gène appartenant à une famille multigénique. Cette famille peut par exemple être définie par référence à des observations faites chez des bactéries de la famille des Cyanobactéries. En particulier on a identifié chez une Cyanobactérie, Calothrix, PCC n° 7601, un gène de structure des vésicules à gaz désigné par qvpA (ou parfois qvpAl) . Ce gène a été clone, séquence, puis analysé. La description de la souche Calothrix ci- dessus est donnée dans la publication de Tandeau de Marsac et al (1985-Nucl.Acids Res. 13:7223-7236) dont le contenu doit être incorporé à la présente demande.
Des analyses ultérieures ont permis d'identifier un autre gène nommé gvpB (ou qvpA2) conduisant à l'expression d'une protéine identique (Da erval et al • Gène, 54 (1987)83-92). Un gène désigné par qvpD a par ailleurs été identifié, dont le produit est voisin (identité d'environ 83%) de la protéine GVPa.
Un autre gène qvpC. codant pour un produit différent des précédents, a pu être détecté et caractérisé. Un représentant, de ce gène formant un opéron avec qvpA et gvpB (opéron qvpABC) a été décrit dans la publication de Damerval et al. (Gène 54) mentionnée ci-dessus. Un autre représentant de ce gène a été décrit par Hayes et al dans (Molecular Microbiology (1988) 2(5) 545-552). Les études effectuées jusqu'alors révélaient la présence de plusieurs gènes associés, chez certaines bactéries productrices de vésicules à gaz et conduisaient à penser que le mécanisme de formation des vésicules à gaz pouvait être complexe.
Les inventeurs ont maintenant mis au point des moyens permettant d'obtenir l'expression des séquences codant pour les protéines de structure des vésicules à gaz (protéines GV) chez différentes cellules jouant le rôle de cellules hôte.
L'invention^ concerne à cet égard des cellules recombinantes différentes de E.coli, génétiquement transformées, caractérisées en ce qu'elles comprennent parmi le matériel génétique qui se réplique avec elles au cours des générations successives, au moins une séquence de nucleotides hétérologue vis-à-vis de la cellule hôte, correspondant à tout ou partie de la séquence en acides aminés d'une protéine GV de structure d'une vésicule à gaz, placée sous le contrôle d'éléments de régulation permettant l'expression de ladite séquence de nucleotides et la production de vésicules à gaz améliorant les propriétés de flottaison des cellules.
La séquence de nucleotides introduite peut également être constituée par une variante de la précédente, modifiée au niveau de certains nucleotides, dès lors qu'elle permet la synthèse de vésicules à gaz ayant les propriétés ci-dessus.
La séquence de nucleotides introduite dans les cellules, encore appelée insérât, peut être obtenue à partir d'organismes ayant la propriété de synthétiser naturellement la(les) protéine(s) de structure des vésicules à gaz. On peut, par exemple, avoir recours à la séquence de nucleotides correspondant à la protéine GV présente chez des Cyanobactéries ou chez des Archaebactéries. Ces séquences de nucleotides pourront être obtenues à l'aide de sondes d'hybridation telles que celles décrites par Damerval et al. (Gène, 54 (1987) 83-92) ou encore par synthèse chimique, par exemple par la méthode de synthèse automatisée en phase solide décrite par Barone A.D et al. (Nucleic Acids Research 12, 4051-4060 (1984)).
L'invention vise en particulier des cellules recombinantes répondant à la définition précédente, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence de nucleotides issue de la séquence codante du gène qypA.
La séquence du gène qvpA peut, par exemple, être obtenue grâce à l'utilisation d'une sonde qvpA correspondant à un fragment Hindi-HindiII de 237pb contenant 186pb du gène qvpA de Calothrix 7601 et 51pb de la région terminale de la séquence en aval de ce gène. Cette sonde est décrite dans l'article de Tandeau de Marsac et al (-1985 Nucl.Acids Res.13:7223-7236).
L'invention concerne aussi des cellules recombinantes transformées par un variant de la séquence codante du gène qvpA, constitué par une séquence d'origine choisie modifiée au niveau de certains nucleotides, soit par remplacement de nucleotides, soit par délétion ou introduction de nucleotides, à condition que ces modifications n'entraînent pas la perte des propriétés fonctionnelles de la séquence d'origine, à savoir sa capacité à synthétiser des protéines GV de structure des vésicules à gaz.
D'autres modifications réalisées peuvent consister en l'adjonction à la séquence codante choisie de séquence(s) nucléotidique(s) indirectement impliquées dans la formation des vésicules à gaz ou dont l'expression conjointement à celle des séquences codant pour les vésicules à gaz, est recherchée. De façon avantageuse, on associera dans un acide nucléique recombinant, la séquence codante des vésicules à gaz choisie à un gène ou à une séquence codant pour un produit dont l'expression est recherchée, notamment une protéine déterminée, par exemple l'interleukine.
L'invention concerne à cet effet une séquence de nucleotides recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend en combinaison la séquence codante de la protéine GV telle que décrite ci-dessus, et au moins un gène ou une séquence de nucleotides codant pour une protéine déterminée, notamment l'interleukine.
Des insérats particuliers adaptés à la transformation de cellules déterminées, répondant aux définitions précédentes, sont par exemple constitués par _ •association en tandem des séquences de nucleotides décrites dans les pages précédentes. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence codante du gène qvpA est issue du gène qvpA de Cyanobactéries, notamment de la souche Pseudanabaena, PCC n° 6901 (Pseudanabaena 6901) .
Dans un autre mode de réalisation de l'invention l'insérât est issu du gène qvpA d'λrchaebactéries notamment d'Halobactéries. on pourra également faire appel à des bactéries telles que Microcvstis, Oscillatoria. Nostoc ou d'autres bactéries pour la préparation de la séquence codante adaptée à la transformation de cellules choisies. L'invention vise également des cellules recombinantes comprenant un enchaînement de nucleotides distinct supplémentaire correspondant à tout ou partie d'un gène susceptible de participer à la formation des vésicules à gaz, éventuellement sous le contrôle d'une séquence de régulation compatible avec l'expression dans la cellule.
Cet enchaînement de nucleotides distinct supplémentaire peut consister en une séquence codant directement ou indirectement pour la formation d'un produit ayant un rôle dans la régulation de la production des vésicules à gaz. Cet enchaînement distinct peut également consister en une séquence codant pour un facteur d'accroissement de la solidité des vésicules à gaz ou d'amélioration de l'assemblage des protéines de structure des vésicules à gaz dans une conformation fonctionnelle.
Cet enchaînement de nucleotides distinct peut par exemple être issu du gène qvpC présent chez plusieurs bactéries de la famille des Cyanobactéries ou de tout gène fonctionnellement analogue à qvpC et présent chez d'autres bactéries ou organismes. Les mêmes moyens que ceux précédemment définis pourront être mis en oeuvre pour l'obtention de ce gène ou ces gènes. Le gène qvpC pourra être obtenu-chez différentes bactéries à l'aide d'une sonde correspondant à un fragment"EcoRI-EcoRI de 263pb situé à l'intérieur du gène qvpC de Calothrix 7601. Cette sonde a été décrite dans la publication de Damerval et al (1987 Gène 54:83-92). Les cellules recombinantes peuvent, dans ce cas, contenir le gène qvpC décrit ci-dessus ou sa séquence codante, éventuellement placée sous le contrôle d'une séquence de régulation contenant au moins un promoteur. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les cellules recombinantes résultent de la transformation de bactéries appartenant à la famille des Bacillacées. De manière avantageuse, des cellules recombinantes répondant aux définitions de 1'invention sont celles de Bacillus thurinqiensis (Bt) notamment Bacillus thurinqiensis israelensis (Bti) , de Bacillus sphaericus ou d'autres bactéries présentes en milieu aquatique et ayant des propriétés biologiques intéressantes telles que par exemple une activité larvicide.
Des Bacillacées particulièrement intéressantes dans le cadre de la réalisation de l'invention sont par exemple des bactéries sporulantes à tout le moins capables d'effectuer les premiers stades de sporulation, nécessaires à la production de cristaux contenant les toxines larvicides de la bactérie choisie. Ces bactéries peuvent aussi être des bactéries asporogènes bloquées au stade II de la sporulation, capables de synthétiser les toxines larvicides et permettant l'expression de la séquence codant pour la protéine GV. Dans ces conditions, la séquence codant pour la protéine GV est placée sous le contrôle d'un promoteur végétatif compatible avec l'expression de la séquence dans la bactérie.
Les Bacillacées ainsi transformées permettent de remédier au problème lié à l'absence de persistance de ces bactéries larvicides natives dans les gîtes larvaires, due à leur trop grande capacité de sédimentation.
Des bactéries Bti transformées particulièrement avantageuses pour la réalisation de l'invention sont les clones 4Q2-72/pPGVA28. D'autres Bacillacées transformées sont les bactéries B.sphaericus rendues capables de synthétiser des protéines GV. De façon avantageuse, ces bactéries transformées synthétisent la protéine GV dans l'exosporium contenant la spore et les cristaux larvicides notamment ceux des cristaux naturellement produits par B.sphaericus.
D'autres bactéries avantageusement transformées sont les Cyanobactéries, notamment les Cyanobactéries naturellement dépourvues de la protéine GV ou tous organismes ayant un intérêt économique en milieu aqueux ou aquatique tels que par exemple ceux qui dégradent les déchets organiques, ceux qui produisent des substances d'intérêt médical ou agronomique. D'autres cellules recombinantes susceptibles d'être transformées sont par exemple les baculovirus tels que décrits dans la demande EP.273.366 ou l'article de Journal of Virology-(Nov.87 p3617-3620).
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention les cellules recombinantes sont des cellules eucaryotes animales ou végétales transformées par les séquences définies plus haut.
A titre d'exemple des cellules eucaryotes intéressantes sont des cellules de levures. D'autres cellules recombinantes sont par exemple des cellules de mammifères, d'insectes, de plantes, d'algues.
Pour obtenir l'expression des séquences de nucleotides insérées dans les cellules ci-dessus décrites, des séquences de régulation reconnues par les poly érases de l'hôte cellulaire, sont placées en amont des séquences codantes. D'autres séquences avantageuses peuvent être placées en amont ou en aval. lorsqu'elles sont susceptibles de moduler l'expression des gènes portés par l'insérât.
A titre d'exemple, lorsque les cellules recombinantes sont des bactéries, on peut utiliser des 5 séquences régulatrices comprenant les promoteurs spac, le promoteur du gène sacB de B.subtilis ou le bactériophage T5 ou le promoteur tac utilisable chez diverses bactéries.
Lorsque les cellules recombinantes sont des " cellules eucaryotes, les systèmes de régulation utilisables sont par exemple les promoteurs d'origine virale (par exemple SV40) ou bactérienne (Aqrobactérium tumefaciens) ou toute séquence capable de moduler l'expression du ou des gènes porté(s) par
I5 l'insérât.
L'invention concerne également un vecteur recombinant comprenant au moins une séquence de nucleotides correspondant à la séquence en acides aminés d'une protéine de structure GV des vésicules à
20 gaz, ladite séquence de nucleotides étant placée sous le contrôle d'au moins une séquence de régulation comprenant un promoteur compatible avec son expression dans une cellule déterminée, à un temps déterminé.
Les vecteurs selon l'invention sont élaborés à
25 partir de l'insertion de séquences de nucleotides répondant aux définitions données dans les pages précédentes. Ils sont adaptés à 1'expression des séquences de nucleotides précédentes dans les cellules décrites ci-dessus.
30 Des vecteurs particulièrement avantageux pour la réalisation de 1'invention sont par exemple des vecteurs multifonctionnels capables de s'exprimer chez plusieurs types de cellules hôte. Un vecteur recombinant satisfaisant les critères ci-dessus est, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, caractérisé en ce que une partie de la séquence de nucleotides qu'il comporte est obtenue à 5 partir du gène qvpA d'une bactérie de la famille des Cyanobactéries ou des Archaebactéries.
Les définitions données plus haut, qui concernent les séquences transformantes des cellules recombinantes selon l'invention, sont applicables à la ° construction des vecteurs ci-dessus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur recombinant est caractérisé en ce que la séquence de nucleotides est associée à un enchaînement de nucleotides distinct, répondant aux critères donnés 5 dans les pages précédentes éventuellement placé sous le contrôle d'un promoteur dont le produit d'expression est capable de participer à la formation des vésicules à gaz.
Un vecteur particulièrement avantageux est le 0 vecteur plasmidique pPGVA28 qui fait l'objet des exemples qui suivent. pPGVA28 résulte de l'association d'un fragment purifié EcoRV-HaelII isolé du plasmide pCB4 contenant la région promotrice de la protéine p28 (poids moléculaire de 28Kda) de Bti d'une part et du 5 fragment StvI-BamHI issu de pPM103 contenant le gène gvpA de Pseudanabaena. Ce plasmide est représenté à la figure 2.
Le plasmide pPM103 a fait l'objet d'un dépôt à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes 0 (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris, le 17 Février 1989 sous le numéro 1-835.
L'invention concerne également un vecteur contenant un acide nucléique recombinant comprenant la séquence codante des vésicules à gaz choisie, associée à un gène ou à une séquence codant pour une protéine déterminée.
Entrent également dans le cadre de 1•invention les produits constitués par l'association des vésicules à gaz formées dans les cellules recombinantes, avec des produits de synthèse propres à ces cellules recombinantes.
De tels produits d'association peuvent être sous forme d'inclusions cellulaires ou au contraire peuvent être excrétés dans le milieu extérieur à la cellule.
L'invention concerne en outre des compositions comprenant des cellules recombinantes selon l'invention.
De telles compositions comprennent par exemple des bactéries recombinantes Bti, ayant une activité larvicide, notamment vis-à-vis des larves de Diptères.
Ces compositions peuvent être présentées sous forme de poudre, de suspensions, de briquettes en vue de leur administration en milieu aquatique. D'autres compositions selon l'invention comprennent des cellules eucaryotes du type de celles données plus haut, notamment des levures. Ces cellules sont avantageusement utilisables pour la réalisation de culture en masse. Elles permettent en effet de diminuer les problèmes de sédimentation des cellules dans les réacteurs.
L'invention vise aussi des . compositions comprenant des produits d'association avec les vésicules à gaz formées ainsi que de produits dont la synthèse est obtenue simultanément dans les cellules recombinantes, décrits ci-dessus.
L'invention vise également un procédé de transformation de cellules, pour la production de vésicules à gaz, comprenant les étapes suivantes : - mise en contact d'un vecteur recσmbinant défini plus haut, aveô des cellules déterminées compatibles avec l'expression de la séquence de nucleotides contenue dans le vecteur, dans des conditions permettant la 5 transformation desdites cellules par le vecteur recombinant, sélection et récupération des bactéries recombinantes formées, par tout moyen physique ou chimique approprié. ° Le transfert d'ADN dans les cellules peut être réalisé par diverses techniques telles que la conjugaison, la transformation, l'électroporation, par exemple selon des techniques telles que celles décrites par Luchansky et al. (1988 Mol.Microbiol., 5 2:637-646) la transfection ou l'infection virale.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont illustrés par les exemples qui suivent et dans les figures.
La figure 1 représente le gène gvpA de la souche ° Pseudanabaena 6901.
La figure 2 représente les plasmides pBU4, pPGVA et pPGVA28.
La figure 3 représente les résultats de l'expression du gène qvpA chez B.thurinqiensis 5 israelensis, avec les indications suivantes : A et B : Marqueurs de taille 1 et 2 : Bti souche 4 Q2 81 / pPGVA28
3 : Bti souche 4Q2-81 / pPGVA
4 : Bti souche 4Q2-81 / pBU4. 0 La figure 4 représente le plasmide pPM103 comprenant le vecteur pTZ 18 R (Pharmacia réf.27-4984-01) 2,871 kb .clonage aux sites EcoRI et BamHt et un insert constitué par un fragment 0,73 kb portant qvpA de Pseudanabaena 6901. EXEMPLE 1
ISOLEMENT DE L'ADN DES GENES qvpA et qvpC CHEZ DIFFERENTES SOUCHES DE CYANOBACTERIES. 1/ Souches de Cyanobactéries et conditions de cultures.
Toutes les souches de Cyanobactéries utilisées dans cet exemple sont issues d'une Collection de
Cultures de l'Institut Pasteur (PCC) et sont désignées dans la suite par leur nom suivi de leur numéro de collection.
Les souches et les milieux de culture utilisés sont donnés dans le tableau I, dans lequel les lettres (a) à (g) ont la signification suivante :
(a) Désignation des souches conformément à Rippka et al (1979.J.Gen.Microbiol.111:1-61)
(b) Numéro de dépôt donné par la PCC
(c) Les compositions des milieux sont données dans l'article de Rippka et al. précité
1:BG11 ; 2:BG11 sans NaNOs ; 3:BG11 complété avec 3mM e NasCOa ; 4:ASNIII.
(d) U:souche unicellulaire, F:souche filamenteuse, FH:souche hétérocystée filamenteuse.
(e) La capacité à former des hormogonies est donnée conformément à ce qui est indiqué dans l'article de Ripp a et al ci-dessus.
(f) -:pas de vésicule à gaz ; +:vésicules à gaz polaires ; ++:vésicules à gaz abondantes.
Dans les souches formant des hormogonies, les vésicules à gaz sont formées uniquement pendant la différenciation des hormogonies.
(g):les nombres entre parenthèses indiquent le nombre de gènes, déduit des expériences de Southern après hybridation avec une sonde qvpA de Calothrix (1+: un gène ou deux copies adjacentes) . Les cultures ont été placées dans 40ml d'un milieu choisi conformément à ce qui précède à 25°C, sans agitation, sous une lumière blanche, fluorescente, de 10μEm"as-1. Lorsque c'était nécessaire, 2 litres de culture ont été placés dans le milieu approprié avec 0,2gl* 1Na2COβ sous agitation continue et gazés par un mélange constitué par 1%CÛ2/99% air, sous une lumière de 50μEm-2s_1. 2/ Extraction de l'ADN. L'ADN chromosomique a été purifié de la façon suivante :
-les cellules (2-3g, masse de matière fraiche ) ont été resuspendues dans 5ml de saccharose 10% (p/vol)/50mM Tris-HCl pH8/100mM Na8EDTA pH8. Du lysozyme (lOmg/ml, concentration finale) a été ajouté et la suspension a été incubée pendant 1 heure à 37°C. Après addition de sarkosyl (2%p/vol, concentration finale) et incubation pendant 45mn à 50°C, le lysat a été traité avec de la protéinase K (l00μg/ml) pendant 30mn à 37°C. La suspension a été soumise deux fois à extraction avec un même volume de phénol et une fois avec un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique 50/48/2 (vol/vol/vol) . Le volume de la phase aqueuse a été ajusté à 9ml et 9g de chlorure de c sium et 0,2ml de bromure d'éthidium (lOmg/ml) ont été ajoutés. Ce mélange a été clarifié par centrifugation à 12.000g pendant lOmn à 4°C. Les agrégats présents dans le haut du tube ont été éliminés et le surnageant a été soumis à centrifugation, à 140.000g, pendant 24h à 15°C. Tous les produits chimiques étaient des réactifs conventionnels. 3/ Analyses par hybridation (Southern) Des enzymes de restriction EcoRI, HindIII,
HincII, fournies soit par Boehringer (F-38242,
Meylan) , Genofit (CH-1212, Genève) ou Amersham (F-91943, Les Ulis) ont été utilisées conformément aux 5 instructions du fabricant. L'ADN obtenu après hydrolyse par ces enzymes a subi une électrophorèse en gels d'agarose 0,7%(p/v), dans un tampon Tris-borate comme décrit dans le manuel de Maniatis et al. (1982- olecular cloning : Laboratory Manuel Cold Spring ° Harbor Laboratory) , dénaturé et transféré sur des filtres de nitrocellulose (Southern 1975 J.Mol Biol, 98:503-517). Des expériences de préhybridation et d'hybridation ont été réalisés à 50°C ou 60°C dans une solution contenant 0, 5M de sels de sodium comme 5 décrit par Tandeau de Marsac et al. (1985, Nucl.Acids.Res.13:7223-7236) . Les filtres ont été lavés à température ambiante dans une solution contenant des sels de sodium (0,95M) avant fluoroautoradiographie. 0 une sonde qvpA, correspondant à un fragment HincII-HindiII d'une longueur de 237 paires de bases (237bp) , contenant 186bp du gène qvpA de Calothrix 7601 et 51bp de la région en aval a été utilisée (voir 1'article de Tandeau de Marsac et al. précité) . Une 5 sonde qvpC était constituée par un fragment EcoRI-EcoRI de 263pb interne au gène correspondant de Calothrix 7601 (Damerval et al 1987, Gène 54 : 83-92). Les fragments d'ADN ont été purifiés par électrophorèse à bas point de fusion sur agarose ° selon la méthode décrite par Maniatis (1982,Molecular Cloning Laboratory Manuel Cold Spring Harbor Laboratory). Ces fragments d'ADN ont été marqués au phosphore 32 en utilisant un kit de déplacement de coupure et du [α32P]dCTP obtenu chez Amersham. Avant la réhybridation, les filtres ont été déshybridés en utilisant la technique SSPE/SDS décrite par Meinkoth et al. (Anal. Biochem.138:267-284) et l'absence de sondes d'ADN restantes a été vérifiée par fluoroautoradiographie avant la réutilisation des filtres. RESULTATS
Parmi les 30 souches testées, 20 d'entre-elles permettent la production de vésicules à gaz : Microcvstis 7806GV* et 7820, Oscillatoria 6412 et 6506, toutes les souches Pseudanabaena, Nostoc 6705, 6719, 6720, 73102 et 8009, les souches Calothrix 7504 and 7601. Chacune de ces souches présente un signal de forte hybridation avec le gène qvpA de Calothrix 7601 à 60°C dans des conditions permettant un mésappariement de 35-40%. Aucune hybridation n'a pu être détectée, même dans des conditions de faible stringence (50°C, autorisant des ésappariements de 45-50%) avec l'ADN isolé à partir de souches incapables de former des vésicules à gaz (Synechococcus 6911, Nostoc 7413, Cylindrospermum 73101) .
Dans 12 souches, des copies multiples du gène qvpA ont été détectées : cette observation a été prise en compte dans le tableau I, dans la colonne qvpA.
Les tailles des fragments hybridants avec qvpA après digestion de l'ADN avec HindIII, HincII, EçoRI et après des digestions doubles sont données dans le tableau II. Ce tableau correspond à la représentation schématique des fragments de restriction obtenus après des digestions simples ou doubles de l'ADN total par EçoRI, HindIII, HincII et des hybridations avec une sonde ADN marquée au 32P portant le gène qvpA de Calothrix 7601. Les tailles de ces fragments sont établies suivant une échelle logarithmique et exprimées en kilobase. _) EçoRI, o HindIII, A HincII,
• EcoRI-HindIII, « EcoRI-HincII, HindIII-HincII.
18 des souches examinées n'ont pas permis la détection d'une hybridation avec la sonde qvpC, même en condition de faible stringence (50°C) autorisant
45-50% de mésappariement) . Ce résultat suggère que ces souches ne possèdent pas de séquences homologues au gène qvpC de Calothrix. Toutes les Cyanobactéries capables de synthétiser les protéines GV qui ont été examinées, possèdent au moins un gène fortement homologue au gène qvpA de
Calothrix. La protéine GVPa correspondante semble donc être fortement conservée parmi les organismes susceptibles de synthétiser des vésicules à gaz. Le clonage récent du gène qvpA de Halobacterium halobium
(DasSarma et al.1987 Mol.Microbiol.1:365-370) a montré que la structure primaire de la protéine GVPa des
Archaebactéries est environ 58% identique à la protéine correspondante des Cyanobactéries.
Figure imgf000019_0001
SOUCHES DE CYANOBACTERIES
Desiσnation( a) Numéro dans Milieu de Morphologie Hormogonje Vésicules gypA gypç la collection culture (e) à gaz (f) (g) PCC (b) (c)
Synechococcus 6911 U
Microcystis 7806 GV"1" 3 U ++ +(2) +
7806 GV~ 3 U - +(2) +
7813 3 U - +(2) +
7820 3 U ++ +(2) +
Oscillatoria 6412' 1 F + +(1+)
6506 1 F + +(1+) ••
Pseudanabaena 6406 1 F + +(1+) m
6802 1 ±U + +(1+) -
6901 1 F + +(1+) -
6903 1 F + +(2) -
7367 4 F + +(1+) -
7402 1 F + +(2) -
7403 1 F + +(1+) -
7429 1 F + +(1+) -
7955 1 F + +(1+) -
LPP 7409 +(i+)
TABLEAU 1
TABLEAU 1 (suite)
Anabaena 6411 2 FH ++ +(2) +
7118 2 FH ++
7119 2 FH t(2) + ++ +(2) +
7120 2 FH ++ +(2) +
Nostoc 6705 2 FH + ++ +(2) +
6719 2 FH + ++ +(2) +
6720 2 FH + + +(1)
73102 2 FH + +
7413 2 +(1) FH
8009 1 F(*) +(1)
Cylindrosper ura 73101 v
FH
Calothrix 7504 2 FH + ++
7601 +(3) +
1 F(*) + ++ +(3) +
Figure imgf000022_0001
EXEMPLE 2 : Transformation de cellules de Bti avec la séquence codante du gène gvpA de Pseudanabaena 6901.
SOUCHES BACTERIENNES ET PLAMIDES
Escherichia col HB101 et JM83 ont été utilisées pour les expériences de clonage.
B.thuringiensis israelensis (Bti) , 4Q2-81 et
4Q2-72 ont été utilisées en tant que souches réceptrices pour les expériences de transformation. Ces deux souches données par H.D.DEAN, sont dérivées de la souche n° 4Q2 (Bacillus Genetic Stock Center the Ohio State University, Columbus, USA). La souche 4Q2-81 est une souche cristal-déficiente, de laquelle on a éliminé tous les plasmides résidants, et la souche 4Q2-72 est une souche produisant un cristal, qui contient uniquement le plasmide de 72MDa, codant pour toutes les protéines du cristal de Bti.
Le plasmide pPM103, décrit ci-après, est utilisé comme source contenant le gène qvpA de Pseudanabaena et le plasmide pCB4 décrit par Bourgouin et al. (Mol.Gen.Genêt. (1986)205:390-397) contient la région promoteur du gène codant pour la protéine cytolytique de 28 Kda de Bti. Les plasmides pUCl9 et pBC16-l [dérivé de pBC16 isolé à partir de B.cereus (Bernhard et al.1978)] ont été utilisés pour la construction du vecteur bifonctionnel pBU4 (figure 2) . Le plasmide pBU4 a été obtenu par ligation des sites de restriction Eco0109 de pUC19 et EcoRI de pBC16-l après avoir complété les extrémités cohésives.
L'orientation relative des vecteurs pUC19 et PBC16-1 a été déterminée grâce à leurs cartes de restriction. Le plasmide formé a été utilisé comme vecteur dans les expériences de transformation.
TECHNIQUES D'ADN RECOMBINANT
L'isolement des plasmides de E.coli a été réalisé par la méthode de lyse alcaline décrite par Birnboim & Doly (Nucl.Acid.Res.7 p.1513-1523 (1979)) et les plasmides ont été purifiés, si nécessaire, dans un gradient de densité de chlorure de césium, alors que les plasmides de B.thurinqiensis ont été isolés selon la description donnée par Bourgouin et al dans l'article précédemment cité (1986).
L'ADN du plasmide a été analysé par électrophorèse en gel d'agarose horizontal.
Les expériences de clonage et 1'analyse par enzymes de restriction ont été menées de la façon décrite par Maniatis et al. (1982) ; toutes les enzymes ont été utilisées selon les directives du fabricant.
Le linker EcoRI a été utilisé de la façon recommandée par Biolabs.
PROCEDE DE TRANSFORMATION
La transformation des souches de E.coli a été réalisée conformément à la méthode de Lederberg &
Cohen (1974). Les transformants ont été sélectionnés sur milieu gélose LB comprenant 50μg/ml d'ampicilline et 20μg/ml de tétracyûline.
La transformation des souches de B.thurinqiensis israelensis a été réalisée par électroporation à l'aide d'un appareil Gène Puiser™ (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) comme suit :
On procède à une culture pendant une nuit dans un milieu BHI (milieu commercialisé par DIFCO) pour inoculer 200ml du même milieu préchauffé, à une densité de départ de 0,04, à 65On* (DOeso). Les cultures ont été incubées à 30°C, avec agitation, jusqu'à une densité optique DOββo d'environ 0,6. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (5,900g, 10 mn) , lavées une fois dans 100ml d'eau stérile, puis resuspendues dans 1,5ml de Polyéthylèneglycol 6000 stérile (PEG6000) à 40%.
L'ADN plasmidique (0,5 à lμg) resuspendu dans du E (lOmM Tris hydrochlorure pH7,6, ImMEDTA) , a été ajouté à 0,8ml de cellules et ce mélange a été placé dans une cuvette stérile d'électroporation (distance inter-électrode 0,4cm) et maintenu dans la glace pendant 5mn. L'appareil Gène Puiser a été placé sous un voltage de 2,5kV et une capacitance de 25μF ; immédiatement après l'électroporation, le mélange de cellules et d'ADN a été ajouté à 2ml de milieu BHI et incubé, pendant 1 heure, à 30°C, avec agitation douce. Les clones transformants ont été sélectionnés sur milieu gélose LB contenant de la tétracycline (20μg/ml) , après un temps d'incubation de 24-48 heures à 30°C.
ANALYSE DES PROTEINES DES CLONES RECOMBINANTS ET IMMUNOBLOTS
Les clones recombinants de E.coli ont été mis en culture pendant 1 nuit, à 37°C dans un milieu BHI contenant de l'ampicilline (50μg/__l) et de la tétracycline (20μg/ml) .
Les transformants B.thurinqiensis israelensis ont été placés dans des conditions de sporulation dans un milieu HC (Petit-Glatron et Rapoport,1975) comprenant de la tétracycline 20μg/ml) à 30°C ; Selon un autre mode de réalisation ces transformants ont été mis en culture en milieu BHI additionné de la même concentration de tétracycline, à 37°C. Dans ces dernières conditions, les cultures de B.thurinqiensis ne sont généralement pas capables de sporuler.
Les cellules concentrées 50 fois dans du fluorure de phénylméthylsulfonyllmM-EDTAlOmM, ont été lysées par désintégration aux ultrasons. Les échantillons ayant subi ce traitement aux ultrasons (lOμl) sont repris dans le tampon de dépôt (Laemmli,1970) , chauffés pendant lOmn à 100°C, puis soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide- sodiumdodecylsulphate 12% à (p/vol) .
Les échantillons ont été électrotransférés sur des filtres Hybond C (marque commerciale de Amersham Corp.) qui ont été immergés dans une solution contenant 50mM Tris hydrochlorure (pH7,5)-150mM de chlorure de sodium (NaCl) contenant 5%(p/vol) de lait écrémé, puis incubés avec un antisérum de lapin dirigé contre les protéines GV. L'incubation a été réalisée d'abord pendant 1 heure à 37°C, puis pendant 1 heure à la température ambiante avec un antisérum spécifique dilué 200 fois dans une solution de lait écrémé Tris- NaCl. Après lavage, les filtres ont été incubés pendant 1 heure à 37°C avec la protéine A marquée à l'iode (I1*8) (activité spécifique 3,17MBq/μg ; NEN Research Products) , lavés et autoradiographiés pendant 1 heure ou plus à -70°C avec un écran intensifiant.
RESULTATS
CLONAGE DU GENE qvpA AVEC SON PROPRE PROMOTEUR.
Un vecteur pPGVA (figure 2) a été construit pour tester si le gène gvpA peut s'exprimer avec son propre promoteur dans d'autres microorganismes que Pseudanabaena. Il a été construit par insertion du fragment BamHI-HindIII de pPM103, contenant le gène gvpA et sa région promoteur,au site BamHI-HindIII de pBU4. Ce plasmide recombinant a été inséré à la fois dans E.coli JM83 et dans B.thurinqiensis israelensis 4Q2-81. Dans tous les clones recombinants, ce plasmide est maintenu de façon stable.
L'analyse des protéines des clones de B.thurinqiensis a été réalisée, à la fois pendant la phase de croissance végétative et pendant le processus de sporulation, pour tester si différentes ARN polymérases peuvent reconnaître le promoteur du gène gvpA. L'analyse a montré que le gène qvpA est exprimé dans toutes les souches recombinantes mais à un très faible niveau. L'expression du gène gvpA dans les transformants B.thurinqiensis n'a pas été détectée en phase de sporulation.
CLONAGE DU GENE vpA A LA SUITE DU PROMOTEUR DE LA PROTEINE de 28KDa de B.thurinqiensis israelensis.
Pour réaliser la production de vésicules à gaz dans B_t pendant la sporulation, le gène vpA a été placé en aval de la région promoteur du gène codant pour la protéine cytolytique de 28KDa de
B.thurinqiensis israelensis.
Ce promoteur, exprimé pendant la phase tll de sporulation, a été caractérisé par Ward & Ellar
(1986a), qui ont montré qu'il est exprimé dans les cellules de Bacillus subtilis (Ward & Ellar,1986b) au cours de sporulation.
Le plasmide pPGVA28 (fig.2) a été construit avec un fragment EcoRV-HaelII, contenant la région promoteur de pCB4 et le fragment StvI-BamHI contenant le gène qvpA de pPM103. Après avoir ajouté une extrémité cohésive EcoRI avec un linker synthétique, à l'extrémité franche EcoRV, et complété l'extrémité cohésive Styl, ces deux fragments ont été insérés dans le fragment EcoRI-Ba HI du vecteur pBU4.
Le plasmide pPGVA28 a été isolé à partir de clones recombinants d'E.coli HB101 et introduit dans les souches B.thurinqiensis israelensis 4Q2-81 et 4Q2-72 par électroporation comme mentionné ci-dessus.
L'analyse des protéines de E.coli (pPGVA28) n'a pas permis de constater l'expression significative de la protéine GV, alors que les échantillons des souches recombinantes B.thurinqiensis israelensis ont montré un niveau d'expression important de cette protéine pendant la sporulation (figure 3).
Les protéines de B.thurinqiensis israelensis 4Q2-81 (pPGVA28) et 4Q2-72 (pPGVA28) ont également été analysées à plusieurs stades de la sporulation et les résultats de cette analyse montrent que la synthèse de la protéine GV commence à la phase tll de la sporulation et persiste durant les phases suivantes, à un niveau important.
De plus, l'étude de l'expression des toxines du cristal des souches recombinantes 4Q2-72 (pPGVA28) montre que la construction réalisée n'interfère pas avec la synthèse du cristal larvicide.
Figure imgf000028_0001

Claims

REVENDICATIONS
1/ Cellules recombinantes différentes' de E.coli, génétiquement transformées, caractérisées en ce qu'elles comprennent parmi le matériel génétique qui se réplique avec elles, au cours des générations successives, au moins une séquence de nucleotides hétérologue vis-à-vis de la cellule hôte correspondant à tout ou partie de la séquence d'acides aminés d'une protéine GV de structure d'une vésicule à gaz placée sous le contrôle d'éléments de régulation permettant l'expression de ladite séquence de nucleotides et la production de vésicules à gaz améliorant les propriétés de flottaison des cellules.
2/ Cellules recombinantes selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence de nucleotides issue de la séquence codante du gène qvpA. 3/ Cellules recombinantes selon la revendication 1 ou revendication 2, caractérisées en ce que la séquence de nucleotides est issue du gène qvpA de Cyanobactéries, notamment de Pseudanabaena. 4/ Cellules recombinantes selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce que la séquence de nucleotides est issue du gène qvpA d'Archaebactéries.
5/ Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles comprennent un enchaînement de nucleotides distinct supplémentaire correspondant à tout ou partie d'un gène susceptible de participer à la formation des vésicules à gaz, éventuellement sous le contrôle d'une séquence de régulation compatible avec 1'expression dans la cellule.
6/ Cellules recombinantes selon la revendication 5, caractérisées en ce que l'enchaînement de nucleotides distinct est issu de la séquence codante du gène gvpC. 7/ Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, telles qu'obtenues après modification de bactéries appartenant à la famille des Bacillacées, ou des cyanobactéries, naturellement dépourvues de GV.
8/ Cellules recombinantes selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'il s'agit de Bacillus thurinqiensis BTi ou Bacillus sphaericus. 9/ Cellules recombinantes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'il s'agit du clone 4Q2-81(pPGVA28) ou du clone 4Q2-72.(pPGVA28) . 10/ Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, telles qu'obtenues après modification de cyanobactéries naturellement dépourvues de protéine GV.
11/ Cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules eucaryotes. 12/ Cellules selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules de levure.
13/ Acide nucléique recombinant caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison au moins une séquence de nucleotides correspondant à la séquence d'acides aminés d'une protéine de structure GV des vésicules à gaz et un gène ou une séquence de nucleotides codant pour une protéine déterminée, notamment 1'interleukine.
14/ Vecteur recombinant comprenant au moins une séquence de nucleotides correspondant à la séquence d'acides aminés d'une protéine de structure GV des vésicules à gaz, ladite séquence de nucleotides étant placée sous le contrôle d'au moins une séquence de régulation comprenant un promoteur compatible avec 5 l'expression de ladite séquence dans une cellule déterminée.
15/ Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qu'il comporte est obtenue à partir du gène qvpA d'une bactérie de la 0 famille des Cyanobactéries, des Archébactéries ou d'autres organismes.
16/ Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que la susdite séquence de nucleotides est associée à un 5 autre enchaînement de nucleotides, éventuellement placé sous le contrôle d'un promoteur, et, dont le produit est capable de participer à la formation des vésicules à gaz. 17/ Vecteur selon la revendication 16 caractérisé en
20 ce qu'il s'agit du plasmide pPGVA28 contenant le plasmide pPM103.
18/ Composition caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
2519/ Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce que les cellules recombinantes comprennent des bactéries de la famille des Bacillacées ayant une activité larvicide, notamment vis-à-vis des larves de Diptères.
3020/ Procédé de transformation de cellules pour la production de vésicules à gaz comprenant les étapes suivantes -:
- mise en contact d'un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 14 à 17 avec des cellules déterminées compatibles avec l'expression de la séquence de nucleotides contenue dans le vecteur, dans des conditions permettant la transformation desdites cellules par le vecteur recombinant, sélection et récupération des bactéries recombinantes formées par tout moyen physique ou chimique approprié.
Figure imgf000032_0001
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